（分析化学专业论文）稀土离子药物络合物与生物大分子相互作用的研究及其应用.pdf

独创声明 y 5 9 8 8 l l 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得一 ( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位 或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：罗黎 导师签字 签字日期：2 0 0 4 年幺月2 9 日 签字日期：20 0 4 # 惫可日 稀土离子一药物络合物与生物大分子相互作用的研究及其应用 ( 中文摘要) 人血清蛋白是血液中含量最为丰富的蛋白质，不仅为生命活动规律提供物 质基础，关于它的研究也为众多疾病机理的阐明及攻克提供理论依据和解决途 径。某些蛋白质种类和含量的多少，在临床上可以用来诊断病症。 溶菌酶是分子量为1 4 6 0 0 的单链氨基酸，正常人体内的溶菌酶含量极低， 很难检测出来，但在一些患者如白血病患者，肾功能衰竭者的体内，溶菌酶的含 量增加，另外，一些生活在受重金属污染环境中人体内溶菌酶的含量也很高，可 以利用溶菌酶的定量测定为某些疾病的诊断提供参考依掘。 核酸的研究在生物化学、生物技术及药物研究等方面都有着非常重要的意 义。近来以荧光探针作为研究手段，对核酸的研究取得了蓬勃发展。 本文以分子光谱( 荧光、紫外) 作为研究手段，分别对药物一金属离子络 合物与生物大分子人血清蛋白、溶菌酶及核酸的相互作用及其分析应用进行了研 究，共分为三章。 第一章，以铕离子一四环素类药物为荧光探针，研究与人血清蛋白的相互 作用及其分析应用。四环素类药物具有8 一二酮结构，是铕离子的理想配体，加 入人血清蛋白后，铕离子的特征荧光得到显著增强，根据这一性质，建立了测定 人血清蛋白的新方法，同时探讨了作用机理，该方法成功的用于实际样品中人血 清蛋白的测定。 第二章，以稀土离子铕一四环素类药物作为荧光探针，研究了与溶菌酶的 相互作用及其分析应用。以溶菌酶作为研究主体，以四环素类药物强力霉素、美 他环素、四环素作为研究客体，利用非辐射能量转移和荧光狞灭理论，研究了药 物对溶菌酶的猝灭机制，求出了二者的结合常数，又根据热力学函数，讨论了二 者的相互作用类型。同时，往铕一四环素类体系中加入溶菌酶后，铕的特征荧光 得到数倍的增强，根据这一性质，建立了一种新的测定溶菌酶的方法。浚方法简 单可行，灵敏度高，干扰少，成功的用于实际样品r j , 0 n 定。 第三章，氧氟沙星与稀土金属离子铽存在分子能量转移，发射出铽的特征 荧光，因此可以将其配合物作为荧光探针检测dna ，另外d n a 独特的疏水性 微环境显著的敏化了氧氟沙星一铽配合物的荧光。本文利用荧光光度法和紫外吸 收分光光度法研究了核酸对氧氟沙星一铽体系的荧光增强效应及其影响因素，探 讨了作用机理，并建立了d n a 的测定方法，并将其成功的用于合成样及血清中 d n a 含量的测定。另外，我们还研究了铝一柔红霉素和d n a 的相互作用及定量 测定，同时探讨了其作用机理。 关缮j 识荧光光度法，荧光探针，荧光猝灭理论，非辐射能量转移 山东口i l i 北人学坝i f i j | 宄生毕、f k 睑义 t h es t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nr a r ee a r t hi o n - - - - - d r u gc o m p l e x a n db i o m o l e e u l ea n di t sa p p l i c a t i o n ( a b s t r a c t ) h u m a ns e r u ma l u b m i ni st h em o s to fa b u n d a n c ep r o t e i ni nb l o o d t h es t u d yo fi t i s n o to n l yo f f e r st h em a t e r i a lb a s i sf o rt h el a wo fl i f e c y c l e ，b u ta l s oo f f e r st h et h e o r e t i c a l b a s i sa n dr e s o l v e n tf o r t h ei n t e r p r e t a t i o no fm a n ym o r b i dm e c h a n i s m s t h e r ei sa c o n n e c t i o nb e t w e e nt h ec o n t e n to fh s ai nu r i n ea n ds o m ed i s e a s e s ，s ot h ed e t e r m i n a t i o no f h s ai sv e r yi m p o r t a n ti nc l i n i c a ld i a g n o s i s l y s o z y m ei sa1 4 6 - k d as i n g l ec h a i np r o t e i no fa m i n oa c i d s i ti sp r e s e n ti ns e v e r a l b o d yf l u i d s ，i n c l u d i n gs e r u m ，u r i n ea n dt e a r s t h ed e t e r m i n a t i o no fl y s o z y m ei sv e r yu s e f u l i nc l i n i c a l d i a g n o s i s ，t o x i c o l o g i c a le x p e r i m e n t sa n di n v e s t i g a t i o no ft h ei n f l u e n c eo f e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o no nh u m a nh e a l t hf o rt h e r ei sac o n n e c t i o nb e t w e e nt h ec o n t e n to f l y s o z y m ei nb o d yf l u i d sa n ds o m ed i s e a s e s f o re x a m p l e ，l y s o z y m ei sf o u n da tam u c h h i g h e rc o n c e n t r a t i o ni ns e r u ma n du r i n eo fs o m ep a t i e n tt h a no fh e a l t h ys u b j e c t ，e s p e c i a l l y t h o s ew h os u f f e r e df o rl e u c o c y t h e m i aa n dn e p h r o p a t h yo rf o rm a n yh e a v ym e t a li o n s i n c l u d i n gc a d m i u ma n dm e r c u r y s oi t i s o fs p e c i a lv a l u et od e t e r m i n a t i o nl y s o z y m ei n c l i n i c a ld i a g n o s i s t h es t u d yo fn u c l e i ca c i di so fg r e a ti m p o r t a n c ei nb i o c h e m i s t r y ，b i o t e c h n o l o g y , a n d p h a r m a c o d y n a m i ca n do t h e ra r e a s t o d a y , t h es t u d yo fn u c l e i ca c i du s i n gf l u o r e s c e n c e p r o b eh a sa t t r a c t e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n i nt h i sp a p e r , u s i n gm o l e c u l es p e c t r o s c o p y ( f l u o r e s c e n c ea n du v v i ss p e c t r o s c o p y ) ， w es t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd r u g m e t a li o nc o m p l e xa n db i o m o l e c u l es u c ha sh s a ， l y s o z y m ea n dd n aa n di t sa p p l i c a t i o n ，t h e r ea r et h r e ec h a p t e r s f i r s t ，u s i n ge u 3 + t e t r a c y c l i n e sc o m p l e xa sf l u o r e s c e n c ep r o b e ，s t u d yt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nt h ec o m p l e xa n dh s aa n di t sa p p l i c a t i o n t e t r a c y c l i n e sc o n t a i n e d1 3 一d i k e t o n a t e c o n f i g u r a t i o n ，t h e ya r ei d e a ll i g a n d sf o re u ”i o na n di t i sp o s s i b l et os e n s i t i z et h e 1 山东州j 北人学坝i ：l o i 宄生毕、f k 睑义 f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fe u hi o n ，i ai n t r a m o l e c u l a re n e r g yt r a n s f e r a d d i n gh s at o s y s t e m ，t h ec h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fe u 3 + c o u l db ee n h a n c e dg r e a t l y , a n dt h e e n h a n c e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fh s a a c c o r d i n gt o t h i s ，w ec o n s t r u c t e dan e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh s a s e c o n d ，u s i n ge u 3 + _ t e t r a c y c l i n e sc o m p l e xa sf l u o r e c e n c ep r o b e ，s t u d yt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nt h ec o m p l e xa n dl y s o z y m ea n di t s a p p l i c a t i o n ，t h i st e t r a c y c l i n e si n c l u d i n g d o x y c y c l i n e ，m e t a c y c l i n ea n dt e t r a c y c l i n e a p p l y i n gf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gm e t h o da n d e n e r g yt r a n s f e rt h e o r y , w eh a v es t u d i e dt h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mo f p r o t e i na n dd r u g s t h e b i n d i n gc o n s t a n t sw e r eo b t a i n e di nt h ea b s e n c eo fm e t a li o n s a c c o r d i n gt ot h e t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ，t h em a i ns o r t so fb i n d i n gf o r c ec a nb ek n o w n a f t e ra d d i t i o n l y s o z y m et oe u 3 + _ d r u gs y s t e m ，t h ec h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fe u 3 + c o u l db e e n h a n c e dg r e a t l y , a n dt h ee n h a n c e df l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i si n p r o p o r t i o n t ot h e c o n c e n t r a t i o no fl y s o z y m e a c c o r d i n gt ot h i s ，w ec o n s t r u c t e dan e wm e t h o df o r t h e d e t e r m i n a t i o no fl y s o z y m e t h ed e v e l o p e dm e t h o dw a sp r a c t i c a l ，s i m p l e ，s e n s i t i v ea n d r e l a t i v ef r e ef r o mi n t e r f e r e n c ec o e x i s t i n gs u b s t a n c e sa n dh a db e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt o t h ed e t e r m i n a t i o no f l y s o z y m ei ns e r u l la n du r i n es a m p l e s t h i r d ，t h e r ei se n e r g yt r a n s f e rb e t w e e no f l a x i na n dt b 3 + a n dt h ec o m p l e xcane m i tt h e c h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c eo ft b ，s ot h ec o m p l e xc a nh eu s e dt od e t e r m i n ed n aa sak i n d o ff l u o r e s c e n tp r o b e i na d d i t i o n ，t h eh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n tcand r a m a t i c a l l yi n c r e a s e t h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo fc o m p l e x i nt h i sp a r t ，w es t u d i e dt h ef l u o r e s c e n c ei n c r e a s e d e f f e c to fn u c l e i ca c i do nt h ec o m p l e xs y s t e m ，e x p l a i n e dt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m w ea l s o s t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na i d a u n o b l a s t i n aa n dd n aa n di t sa p p l i c a t i o n k e y u ，o r d s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t r y , f l u o r e s c e n c ep r o b e ，f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gt h e o r y , n o n r a d i a t i v ee n e r g yt r a n s f e rt h e o r y 4 英文缩写 中英文对照 英文全文中文全文 h u m a ns e r u ma l b u m i n 人血清蛋白 b o v i n es e r u ma l b u m i nl i ：j 缸清蛋白 t e t r a c y c l i n e 四环素 d o x y c y c l i n e 强力霉素 m e t a c y c l i n e 美他环素 l y s o z y m e 溶菌酶 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 o f l x a c i n氧氟沙星 d a u n o b l a s t i n a 柔红霉素 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 胺基甲烷 a c r i d i n eo r a n g e吖啶橙 瞰 瞰 代 m 屹 吣 帆 l 堇 耋 加 第一章铕离子一四环素类药物络合物研究与人血清蛋白相互 作用的研究及其分析应用 第一节概述 人体真f 发挥作用的是蛋白质，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声， 蛋白质将是今后的重点研究方向之一。很多药物本身是蛋白质，而很多药物的靶分子 也是蛋白质，因此研究药物与血清蛋白的结合，是药物动力学及临床药理学的重要内 容，它对阐明药物在人体内的运输和药理作用具有重要的意义。另外，某些蛋白质种 类和含量的多少，反映出人体的疾病类型，因此，蛋白质的定量测定在临床上可以有 效地诊断病症。 1 药物与蛋白质的相互作用 根据f 6 r s t e r 非辐射能量转移理论，能量转移效率取决于供体发射光谱和受体吸 收光谱的重叠程度j 以及受体分子i b j 的距离r 。 2 实验条件的优化 实验条件的优化包括酸度的确定，反应时间的影响，加入顺序的影响，共存物质 的影响，通过一系列的实验确定最佳实验条件。 3 蛋白质的定量测定 在最佳实验条件下，铕位于6 1 2 n m 处的荧光强度与人血清蛋白的加入量成正比， 根据这一性质，建立了测定人血清蛋白的方法，该法简单实用，成功的用于人血清和 尿样中人血清蛋白的测定。 本论文根据以上的理论和方法，研究以强力霉素一铕、四环素一铕作为荧光探针 定量测定人血清蛋白。 第二节强力霉素铕络合物与人血清蛋白相互作用的研究及其应 用 摘要本文以强力霉素e u ”作为荧光探针，提出了一种新的荧光光度法方法测量人 血清蛋白( h s a ) ，检测限可达纳克级。在p h = 1 0 2 的最佳酸度条件下，h s a 能 使强力霉素( d c ) - - 铕( e u 3 + ) 位于6 1 2 n m 处的特征荧光显著增强，根据这一性质， 利用荧光光谱建立了一种测量人血清蛋白的新方法，线性范围为0 9 2 p g m l 和 9 2 3 4 5 1 x g m l ，检测限分别为6 4 n g m l 和1 1 5 n g m l 。浚法用于血清与尿样中人血 清蛋白的测定，与吖啶橙方法相比，该法的相对标准偏差在1 1 3 6 ，结果令人 满意。 关詹i 吼强力霉素，e u h ，荧光光度法，人血清蛋白 i 引言 人血清蛋白( h s a ) 是血浆中最为丰富的蛋白质，它能与许多内源及外源性化合 物结合，起到存储与转运的作用“3 。蛋白质某些种类含量的大小，可以反映器官功能 的f 常与否，如血清中蛋白几乎都由肝细胞合成。球蛋白由单核巨噬细胞系统产生。 它们在血中含量的变化，可反映肝脏核免疫系统的疾病，所以蛋白质种类及其含量的 测定，对疾病的诊断十分重要。 迄今为止，已有许多方法用于测定人血清蛋白，如l o w r y ，b r a d f o r d ， b r o m o d h e n o lb l u e 和b r o m o c r e s o lg r e e n 吲。但这些方法大多为染料测蛋白，存在 着一些缺陷限制了：实际应用。近年来有一些新的方法提出，如分光光度法e 6 荧光法 m 和化学发光法 83 ，主要以络合物作为荧光探针测定蛋白，如吖啶橙作为荧光探针 测定h s a 嘲，以2 , 6 ，7 一t r i h y d m x y 一9 一( 4 - c h l o r o p h e n y l ) 一3 h x a n t h e n 一3 一o n e m o l y b d e n u m 络合物测定h s a 1 0 3 但是至今尚未见到关于强力霉素- - e u ”- - h s a 报道。 强力霉素( d c ，结构见下图) 是一种较好的抗菌素药物，抗菌作用机理与四环素 相同。强力霉素可与e u 3 + 形成二元络合物，出现e u h 位于6 1 2 n m 处的特征峰，d c 也 能与人血清蛋白作用，加入人血清蛋白( h s a ) 后，该特征峰得到极大的增强。同时 峰形变窄，根据这一性质，本文以d c e u ”作为荧光探针，建立了一种测量h s a 的 新方法。浚方法灵敏度高，选择性好，干扰较少，操作简单，用于实际样品的测定， 结果令人满意。 nhhc。，2 c 。h 。h ，：h ：。 d c 的结构式 2 实验部分 2 1 试剂 人血清蛋白储备液( h s a ，卫生部上海生物制品研究所) ：准确称取0 3 6 3 3 9 h s a ， 溶解定容至1 0 0 m t ，浓度为3 4 5 m g m l ，使用前以石英亚沸蒸馏水稀释即得工作液。 牛血清蛋白储备液( 北京红兴化学试剂分装厂) ：准确称取o 0 5 4 4 9 9 b s a 溶解定 容至1 0 0 m l ，浓度为5 3 4 9 9 m l ，使用前以石英亚沸蒸馏水稀释即得工作液。 强力霉素储备液( d c ) ：准确称取0 1 0 0 6 9 强力霉素( 中国药品生物制品检定所) ， 以石英亚沸蒸馏水溶解定容至1 0 0 m l ，得1 6 9 1 0 一m o l l 的储备液，使用时以石英亚 沸蒸馏水稀释。 以上储备液与工作液坶需置于0 4 。c 的生化培养箱内保存。 e u 3 十储备液：准确称取0 3 5 2 0 9 e u 。0 ( 9 9 9 9 ，上海跃龙有色金属有限公司) ，加 入少量浓盐酸，加热使其溶解，并挥发近至于，然后用0 1 m o l l 的稀鼎酸稀释至 1 0 0 m l ，作为储备液，使用时以石英亚沸蒸馏水稀释。 0 1 0 m o l ln h i c l 一n h ；h 2 0 缓冲溶液，p h = 1 0 2 。 0 1 0 m o l lt r is h c l 缓冲溶液，p h = 7 4 。 2 2 仪器 r f 一5 4 0 型荧光分光光度计( 日本岛津公司) ；u v 一2 6 5 型紫外可见分光光度计( 开 本岛津公司) ；p f l s 一3 c 型酸度汁( 上海雷磁仪器厂) 。 2 3 实验方法 于1 0 m l 比色管中依次加入2 m l 缓冲，d c ，e u 3 + 和h s a 二次亚沸蒸馏水稀释定 容至刻度放置3 0 r a i n ，测定吸收光谱和荧光光谱。同时在入e x e l l l = 3 8 5 n m 6 1 2 n m ， 测定荧光强度f 。同时测定试剂空白( d c e u ”) 的荧光强度f 。af = f f 。于1 0 m l 比色管中依次加入a 0 ，s d s ，h s a ，2 m l 缓冲溶液，在 e x e m = 4 9 6 5 3 8 处测定荧 光强度。 3 结果与讨论 3 1 荧光光谱 f i g 1h s a 的荧光光谱( a ) 和d c 的吸收光谱( b ) 的重叠光谱 e x p e r i m e n tc o n d i t i o n ：h s a ，1 7 0 1 0 6 t o o ll t , d c ，i 7 0 1 0 。6 t o o ll 1 根据f s r s t e r 非辐射能量转移理论，能量转移效率取决于供体发射光谱和受体吸 收光谱的重叠程度j 以及受体分子间的距离r 。从图1 可以看出能量转移很容易在d c 和h s a 之间发生因为供体( h s a ) 的荧光光谱和受体( d c ) 的吸收光谱有较大的重叠。 e 2 高 ，2 鬻箸 e _ l 一寄 ( 3 )r 0 8 8 1 0 2 3 k x 1 1 - 4 叫( 4 ) 根据方程( 4 ) ，可以得到e = 0 3 2 ，j - - 5 2 5 x 1 0 。5 c m 3 l m o l 一，在实验条件下得到 9 r o = 2 2 6 n m ( 耿k 2 = 2 3 ，n = 1 3 6 ，中。= o 1 l8 ) ，求得r = 2 1 2n m 。由于r o 和r 都在理 论范围内，这就证明了d c 和h s a 之洲的非辐射能量转移。 比较图2 中的曲线3 和曲线5 可以看出，加入h s a 后d c 位于5 1 5 n m 处的荧光 强度显著增强，这表明d c 能和h s a 形成基态络合物j 司时伴有从h s a 到d c 的能量 转移。 比较曲线l 和2 可知，在d c h s a 体系中加入e u 3 + 离子后，从d c h s a 基态 络合物到e u 3 + 离子的分子内能量转移比d c 到e u 3 + 离子更容易发生，这就解释了为 什么h s a d c e u 3 + 体系中6 1 2 n m 处的荧光强度远远大于d c e u 3 + 体系的。荧光增强的 程度与h s a 的加入量成正比，据此建立了一种测量h s a 的新方法。 f i g 2 荧光光谱 i ：d c ，e u 3 + ，h s a2 ：d c ，e u 3 + 3 ：，d c ，h s a4 ：e u 3 + ，h s a5 ：d c6 ：b u f f e r , h s a7 ：e u 3 + e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ：d c ：i 6 9 1 0 一m o l l ，e u 3 + 1 6 1 0 一m o l l ，h s a ：3 4 5 9 9 m l ， b u f f e r ：p h = 1 0 2 e x = 3 8 5 n m ( 对于d c 以及d e + e u ”体系，凡e x = 3 7 5 n m ) 3 2 实验条件的优化 3 2 1 酸度的影响 酸度对体系的荧光强度有很大的影响，见图3 。由图3 可以看出，在p h 8 8 1 1 0 之i 铷，体系的af 先增大后降低，在p h = 1 0 2 时体系的f 达到最大，故本文选择 p h = l o 2 的0 1 m o l l n i t r i ：o - n h ，c 1 缓冲体系进行进一步的研究。同时做了缓冲溶液 用量的影响，发现当缓冲溶液加入2 m l 时，体系的荧光强度最大，故本文选择缓冲溶 液加入量为2 m l 。 0 8 89 09 29 49 69 8 1 0 0 0 2 1 “1 0 61 。8 d f i g 3 酸度的影响 e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ：d c ：1 6 9 1 0 m o l l ，e u 3 + 1 6 1 0 m o l l ， h s a ：3 4 5 1 a g m l ，b u f f e r ：p h 2 1 0 2 ， e x e m23 8 5 n m 6 1 2 n m 3 2 2 反应时间的影响 由图4 可以看出，d c - - e u 3 _ 一h s a 体系在2 5 m i n 后达到最大值并保持稳定，所 以本文选择3 0 m i n 作为反应时间。 。蒜。8 f i g 4 反应时i 训的影响 e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ：d c ：1 6 9x 10 - 6 m o l l ，e u ”1 6 l0 - 6 m o l l ， h s a ：3 4 5 i _ t g m l ，b u f f e r ：p h = 1 0 2 ， e x e m = 3 8 5 n m 6 1 2 n m 3 2 3 加入顺序的影响 不同的加入顺序对体系的荧光强度有不同的影响，结果见表l 。 山东口i l i 北人学坝i f i j | 宄生毕、f k 睑义 e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ：d c ：i 6 9 x1 0 一m o l l ，e u 3 + 1 6 x1 0 m o l l ，h s a ：3 4 5 “g m l ， b u f f e r ：p h = 1 0 2 ，九e x e m = 3 8 5 n m 6 1 2 n m 由表l 可以看出，按5 的顺序加入体系的荧光强度f 值最大，但是考虑到体系荧 光强度增强的程度，选择7 的顺序加入最好，该顺序加入af 最大且具有较大的f 值。 故本文选择的加入顺序为先加入缓冲溶液，然后是d c ，e u ”，最后加入h s a 。 3 2 4 铕离子浓度的影响 v r m i l f i g 5 铕离子浓度的影响 e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ：d c ：1 6 9x 10 击m o l l e u 3 + 2 10 南m o l l h s a ：3 4 5 1 x g m l 、b u f f e r ：p h = 10 2 ，凡e x e m 2 3 8 5 n m 612 n m 铕离子浓度对体系荧光强度的影响见图5 。存在h s a 时，随着铕离子浓度的增加， 体系的荧光强度先增大后减小，当e u 。+ 浓度达到1 6 x1 0 “时，即e u l + ：i ) c = l ：1 时，体 系的荧光强度f 达到最大，同时荧光增强程度f 也大最大，故d c 与e u l + 的最佳配比 为l ：i 。本文选择1 ：l 的配比进行下一步的研究。 3 2 5 温度的影响 温度对体系的荧光强度有很大影响，随着温度的升高，体系的荧光强度急剧降低， 由于h s a 的变性温度较低，故实验应选在室温条件下进行。 3 3 共存物质的影响 在最佳实验条件下研究发现，不同的共存物质包括金属离子、氨基酸等，在与 h s a 相近或者更大的浓度范围内都不影响测定，结果见表2 。故本方法可在这些物质 存在的情况下测定h s a 。 表2 共存物质的影响 4 分析应用 、。 4 1 线性范围和检测限 表3h s a 和b s a 的线性范围和检测限 在选定的最佳条件下，利用本方法测定h s a 和b s a ，具有较好的线性范围平u 较 低的检测限，结果见表3 。 与其它一些h s a 的测定方法相比，本方法的灵敏度更高，同时反应较迅速，稳 定性好。结果见表4 。 表4 h s a 的测定方法比较 4 2 实际样品中人血清蛋白的测定 表5 血清和尿样中h s a 的测定 样品本方法( n = 5 ) a o a o 试剂【9 】( n = 5 ) f o u n d ( m g m 1 ) r s d ( ) f o u n d ( m g m 1 )r s d ( ) a ：m g l ，c o n c e n t r a t i o n ：d c ：1 6 9 1 0 一m o l l ，e u ”1 6 1 0 一m o l l ，b u f f e r ：p h = 1 0 2 ， 凡 e x c m = 3 8 5 n m 6l2 n m ： 对于a o a o 试剂， e x e m = 4 9 6 5 3 8 n m ，a 0 ：6 1 0 8 m o l l ，s d s ：6 1 0 娟m o l l ，p h = 7 4 。 将血样稀释至合适的浓度，用本方法测定血样中人血清蛋白的含量，同时测定了 尿样中人血清蛋白的含量与a o a o 试剂法对比，结果令人满意。 4 3 结合常数和结合点数的求算 r o s e t h a n l 建立了一种用绘图法计算蛋白质与配合物结合常数( k ) 与结合点数( n ) 的方法。简言之，当体系中蛋白的含量p 为一常数时，而c b ，c 与c 分别表示与蛋白 质结合的，游离的以及络合物总浓度，得到如下方程： 罟= 一( c 皿+ n p k ( 1 ) 而c = c b + c b故 昙：一( c c ，) k + 印k + l ( 2 ) l 在体系中，若c 和c f 都在线性范围内，就能得到如下方程： i f o ：一f l 一尝忸+ 印k + 1 ( 3 ) f lf o f ，f 。分别代表加入h s a 和不自i ih s a 体系的荧光强度。以等对( 1 一去) c 作图即可 求得k 和n 。求得、k 和n 分别为3 7 1 1 0 5 l t o o l 和1 8 。 5 结论 含有b 一二酮结构的强力霉素和生物大分子h s a 都是铕离子的理想配体，而且通 过分子内能量转移可以敏化铕的特征荧光。通过非共价键d c 能和h s a 形成基态络合 物，而且此基态络合物可以和铕离子形成稳定的三元络合物，该络合物具有紧密的刚 性结构。由于芳环堆积和减少了卜h 振动的能量损失，这而者的共同作用使铕离子 位于6 1 2 n m 处的特征荧光增强了数倍。该方法成功的应用于血清和尿样中h s a 含量的 测定。 山东口i l i 北人学坝i f i j | 宄生毕、f k 睑义 r e f e ：r e n c e s 1 u l r i c hk h ，p h a r m a c 0 1 r e v ，1 9 8 i 3 3 ( 1 ) ：i7 2 o h l o w r y , n j r o s e b r o u g h ，a l f a n - a n dr j r a n d a l l ，j b i 0 1 c h e m ，19 51 ，1 9 3 ，2 6 5 3 m m b r a d f o r d ，a n a l b i o c h e m ，1 9 7 6 ，7 2 ，2 4 8 4 r f l o r e s ，a n a l b i o c h e m ，19 7 8 ，8 8 ，6 0 5 5 e 1 r o d k l e y , c l i m c h e m 1 9 6 5 ，1 1 , 4 7 8 6 a a w a h e e da n de d g u p t a ，a n a l b i o c h e m ，19 9 6 ，2 3 3 ，2 4 9 7 j y u a n ，a n dk m a t s u m o t o ，j b i o m e d a n a l 1 9 9 7 ，1 5 ，1 3 9 7 8 t h a r aa n dk t s u k a g o s h i ，a n a l s c i ，1 9 9 0 ，6 ，7 9 7 ，a n dc i t e dt h e r e i n 9 y j l u o ，h x s h e n ，a n a l ，c o m m u n ，19 9 9 ，3 6 ，13 5 1 0 z x g u o ，h x s h e n ，t h ea n a l y s t ，1 9 9 9 ，1 2 4 ，1 0 9 3 1i t z o ra n dz s e l i n g e r , a n a l b i o c h e m ，1 9 9 6 ，2 3 6 ，3 0 2 12 i m o r i ，k t a g u c h i ，y f u j i t aa n dt m a t s u o ，a n a l l e t t ，19 9 5 ，2 8 ，2 2 5 1 3 y f u j i t a ，i m o r ia n dt m a t s u o ，a n a l s c i ，1 9 9 7 ，1 3 ，5 1 3 6 山东州j 北人学坝i f i j | 宄生毕、f k 睑义 s p e c t r o n u o r i m e t r i cd e t e r m i n a t i o no fh u m a ns e r u ma l b u m i nu s i n g ad o x y c y c l i n e e u r o p i u mp r o b e a b s t r a c t ：an e ws p e c t r o f l u o r i m e tr i cm e t h o di s p r o p o s e df o rd e t e r m i n a t i o no fh u m a n s e r u m a l b u m i n ( h s a ) w i t ht h el i m i to fd e t e c t i o n a t n a n o g r a ml e v e l s u s i n g d o x y c y c l i n e ( d c ) - e u r o p i u m ( e u 3 + ) a saf l u o r e s c e n tp r o b e ，i nt h eb u f f e rs o l u t i o no f p h 2 1 0 2 ，h s acanr e m a r k a b l ye n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f t h ed c e u 抖c o m p l e x a ta , = 6 1 2 n ma n dt h ee n h a n c e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fe u 3 + i o ni si n p r o p o r t i o nt ot h e c o n c e n t r a t i o no fh s a o p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh s aa l ea l s o i n v e s t i g a t e d t h el i n e a rr a n g e sf o rh s aa r e0 9 2g gm l a n d9 2 3 4 5g gm l 。1w i t hl i m i t s o f d e t e c t i o na r e6 4n gm l a n d1 1 5n gm l ，r e s p e c t i v e l y t h i sm e t h o di s s i m p l e ，p r a c t i c a l a n dr e l a t i v e l yf r e ei n t e r f e r e n c ef r o mc o e x i s t i n gs u b s t a n c e s ，a sw e l la sm u c hm o r es e n s i t i v e t h a nm o s to ft h ee x i s t i n ga s s a y s t h ed e t e r m i n a t i o nr e s u l t so fh u m a ns e l r l ma n du r i n e s a m p l e sa r ei d e n t i c a lt ot h o s eb yt h ea o a om e t h o d ，w i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o