（农产品加工及贮藏工程专业论文）固定化米根霉发酵生产L乳酸的研究.pdf

固定化米根霉发酵生产l 一乳酸的研究 摘要 传统游离发酵由于米根霉菌丝发达，易形成凝块和结团，造成了发酵周期长、 生产速率慢、得率低等缺点。采用固定化米根霉发酵生产l 乳酸，可大大缩短 发酵周期，解决菌丝结团问题，且固定化细胞可以重复稳定使用。 通过对聚氨酯泡沫吸附法和海藻酸钙包埋法两种固定化方法的比较可以得 出，聚氨酯泡沫吸附法虽能缩短发酵周期，但固定化细胞的重复使用性较差，只 有前3 批能维持较高水平，而海藻酸钙包埋法既能缩短发酵周期，又解决了固定 画细胞的重复使用性问题，固定化细胞可重复使用1 4 批次，提高了发酵效率， 因此，实验选用海藻酸钙包埋法作为固定化米根霉发酵生产l 一乳酸的最佳工艺。 并在此基础上对海藻酸钙固定化米根霉发酵生产l 一乳酸的工艺、产酸速率以及 发酵过程动力学模型进行了研究，得出结论如下； 1 运用正交实验确定了固定化米根霉发酵生产l - - 孚l 酸的最适培养基为 第一批培养基：葡萄糖8 0g l ，尿素1g l ，k h 2 p 0 40 1 5g l ，z n s 0 4 7 h 2 0 0 6 6g l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5g l 。 补料培养基：葡萄糖8 0g l ，尿素0 5g l ，k h 2 p 0 4 0 0 7 5g l ，z n s 0 4 7 h 2 0 0 4 4g l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5g l 。 固定化细胞接种量2 0 ，3 2 。c 下培养2 4h ，l 乳酸累积浓度为6 7 5g l ，对 糖转化率为8 4 4 ，固定化细胞重复使用至1 4 批，产酸不降低。 2 考察了接种量、颗粒直径、糖浓度、通气量、温度等对产酸速率的影响 实验表明，在固定化凝胶珠颗粒直径2 4 m m ，接种量2 0 ，温度3 2 。c ，糖 浓度1 0 - 1 0 0g l 之间，转速8 0r m i n ，通气量1 0l l r a i n ，产酸速率稳定在1 5 5 g l h 左右， 3 建立了乳酸发酵过程的动力学模型，验证结果表明，所建立的动力学模 型能较好地描述实验过程。 关键词：固定化米根霉l 一乳酸发酵聚氨酯泡沫海藻酸钙产酸速率 动力学模型 p r o d u c t i o no fl - l a c t i ca c i db yi m m o b i l i z e dr h i z o p u so r y z a e a b s t r a c t t h ec o n v e n t i o n a lb a t c hf e r m e n t a t i o nt op r o d u c el l a c t i ca c i df r o mg l h c o s cb y r h i z o p u so r y z a ec a u s e dm a n yd i s a d v a n t a g e ss u c ha sl o n gf e r m e n t a t i o i lt i m e l o w l 1 a c t i ca c i dy i e l da n du n s t a b i l i t yo f f e r m e n t a t i o nb e c a u s eo f m y c e l i a lc l u m p s o nt h e o t h e rs i d e ，t b ei m m o b i l i z e d c e l lf e r m e n t a t i o np r o v i d e dm a n ya d v a n t a g e so v e r c o n v e n t i o n a lf e r m e n t a t i o np r o c e s s e s ，s u c ha ss h o r t e rf e r m e n t a t i o nt i m e ，h i g h e r l 1 a c t i ca c i dy i e l da n dr e u s a b l ea b i l i t y t h el 1 a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yi m m o b i l i z e dr h i z o p u so r y z a ei nc a l c i u m a l g i n a t eb e a d sa n ds p o n g ef o a mw e r ei n v e s t i g a t e d r e s u l t si n d i c a t e dt h a ti m m o b i l i z e d c e l l si nc a l c i u ma l g i n a t eb e a d sw e r er e u s e ds u c c e s s f u l l yf o rm o r eb a t c h e s ( 1 4 ) t h a ni n s p o n g ef o a l r lf 3 1 o p t i m a lf e r m e n t a t i o nt e c h n i c s ，f e r m e n t a t i o nr a t ea n dk i n e t i cm o d e l s o f l 1 a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yi m m o b i l i z e dr h i z o p u so r y z a ei nc a l c i u ma l g i n a t eb e a d s w e r ea l s oi n v e s t i g a t e da n dt h ec o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h eo p t i m a lm e d i u mf o rl 1 a c t i ca c i df e r m e n t a t i o nw e r ed e v e l o p e db y o r t h o g o n a ld e s i g nt h e o r y m e d i u mo ft h e1s tb a t c h ( g ，l ) ：g l u c o s e8 0 ，u r e a1 ，p o t a s s i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e0 1 5 ，z i n cs u l p h a t e0 6 6 ，m a g n e s i u ms u l p h a t e0 2 5 m e d i u mo ft h e2 n db a t c h ( g l ) ：g l u c o s e8 0 ，u r e ao 5 ，p o t a s s i u md i h 3 ，d r o g e n p h o s p h a t e0 0 7 5 ，z i n cs u l p h a t e0 4 4 ，m a g n e s i u ms u l p h a t e0 2 5 w 1 1 e ni n o c u l a t i o no f b e a d sw a s2 0 ，t h ec u l t u r et e m p e r a t u r ew a s3 2 ，l l a c t i c a c i dp r o d u c t i v i t y ，c o n v e r s i o nr a t ew e r e6 7 5g l ，8 4 4 ，r e s p e c t i v e l ya f t e r2 4 ha n d h a l ff e r m e n t a t i o nt i m ew a sd e c r e a s e db yt h i st e e h n i q u e r e s u l t sa l s oi n d i c a t e dt h a t i m m o b i l i z e dc e l l sw e r er e u s e ds u c c e s s f u l l yf o r1 4b a t c h e sa n ds t i l lr e t a i n e dt h e i r f e r r n e n t a t i o na c t i v i t i e s 2 t h ee f f e c t so ft h ed i a m e t e ro fi m m o b i l i z e dc e l l s ，i n o c u l a t i o no fb e a d s ， c o n c e n t r a t i o no f g l u c o s e a n d t e m p e r a t u r e o nf e r m e n t a t i o nr a t e w e r e i n v e s t i g a t e d w h e nt h ed i a m e t e ro f i m m o b i l i z e dc e l l sw a s2 4 m m ，t h ei n o c u l a t i o no f b e a d sw a s2 0 ，恤ec o n c e n t r a t i o no f g l u c o s ew a s1 0 1 0 0g l ，t h ec u l t u r et e m p e r a t u r e w a s3 2 ，t h ea g i t a t i o ns p e e dw a s8 0r r a i na n dt h ea e r a t i o nw a s1 ol l m i n ，t h e p r o d u c t i v i t yc o u l dr e a c h15 5 空l h 3 k i n e t i cm o d e l so fl l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yr h i z o p u so r y z a ew e r ea l s o e s t a b l i s h e d n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o d e l sc o u l dd e s c r i b el l a c t i ca c i d f e r m e n t a t i o ne x a c t l ya n dp r e c i s e l y k e yw o r d s ：i m m o b i l i z e dr h i z o p u so r y z a e ；l - l a c t i ca c i d ；f e r m e n t a t i o n ；s p o n g e f o a m ：c a l c i u ma l g i h a t e ；p r o d u c t i v i t y ；k i n e t i cm o d e l 插图清单 图1 1 乳酸的结构式” 图1 2 米根霉发酵l 一乳酸代谢流程 图2 。1 游离米根霉细胞的稳定性实验一 图2 2 不同批次游离发酵动力学实验 图2 3 碳源浓度对聚氨酯泡沫固定化米根霉发酵的影响- 图2 4 聚氨酯颗粒大小对发酵的影响一 图2 5 聚氨酯泡沫添加量对发酵的影响” 图2 6 聚氨酯泡沫固定化米根霉细胞的稳定性实验” 图2 - 7 不同批次固定化发酵动力学实验“ 图3 1 不同尿素浓度对发酵的影响” 图3 2 不同硫酸铵浓度对发酵的影响 图3 3 补料培养基中尿素浓度对发酵的影响一 图3 4 固定化细胞的稳定性实验” 图3 5 不同批次固定化细胞的发酵情况， 图4 1 接种量对产酸速率的影响” 图4 2 凝胶珠颗粒直径对发酵的影响” 图4 3 凝胶珠颗粒直径对产酸速率的影响一 图4 4 海藻酸钠浓度对发酵的影响“ 图4 5 装液量对发酵的影响一 图4 - 6 装液量对产酸速率的影响” 图4 7 糖浓度对产酸速率的影响一 图4 - 8 搅拌对发酵的影响 图4 9 通气量对产酸速率的影响一 图4 1 0 温度对产酸速率的影响 图5 1 乳酸发酵动力学曲线 图5 2 乳酸比生长动力学曲线 图5 3 拟合度验证实验一 。叫於m硒掩体勉拍卯如”叭砣弛驺”弘弘甜 表格清单 表3 1 不同初糖浓度对发酵的影响 表3 2 不同固定化细胞凝胶珠添加量对对发酵的影响 表3 3 不同无机哉浓度对发酵的影响( 第1 批) 表3 4 方差分析表( 第1 批) 表3 5 不同无机盐浓度对发酵的影响( 第2 批) 表3 6 方差分析表( 第2 批) 表5 1 米根霉发酵实验数据( 第1 批) 表5 2 米根霉发酵实验数据( 第2 批) 表5 3 模型参数估算结果 2 l 2 1 2 4 2 5 2 5 2 6 3 9 4 0 “4 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得金胆王些盎堂或其他教育机构的学位或证书而使刖过 的材料。与我一同丁：作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文作者签名签字日期；勰g 月蹈 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金壁王些盍堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 盒匿王些友堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 签字日。6 年妇户岫。 学位论文作者毕业后去向： 工作单位 通讯地址 导师签名 易堑 签字目期。月严日 eb v 7 电话j 彳。f p 7 。 蕊虢l 矿jp ，。f 谢辞 本次设计是在姜绍通教授的悉心指导下通过自己的刻苦努力完成的，从实验 方案的制定、实验过程的实施、论文的完稿，都得到了姜老师无微不至的关怀和 帮助，他们严谨求实的治学作风、扎实的专业理论知识和丰富的实践经验，使我 受益匪浅，在此向姜老师表示衷心的感谢和崇高的敬意。 我还要感谢潘丽军老师、郑志老师、罗水忠老师、李兴江等老师，感访f 他们 给我提供的指导和帮助：感谢付萍同学、许彬同学在实验过程为我提供的宝贵意 见；感谢同实验室朱羽同学、陈晓晖同学、胡锦艳同学、吴曼曼同学为我提供的 各方面帮助，特别感谢他们为我创造了融洽的实验氛围。 最后，我还要特别感谢我的父母、弟弟及其他亲人这些年来在生活和精神上 给予了我的支持和鼓励。 作者：陆香庆 2 0 0 6 年5 月1 2 日 1 1 乳酸的结构与性质 第一章前言 乳酸( 1 a c t i ca c i d ) ，又名a 一羟基丙酸( 旺一h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ) ，分子式为 c 3 h 6 0 3 ，分子量9 0 0 8 ，是种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植 物和微生物中。乳酸分子中有一个不对称碳原子，具有光学异构现象，从而具有 d 型和l 一型两种构型 1 1 。l - 乳酸为右旋性，d 乳酸为左旋性，其结构式见图1 ， 当l ( + ) 一乳酸和d ( 一) 乳酸等比例混合时，即成为消旋的d l 乳酸。 哆 删嚏 c o o h 夕洲 l ， 鼍 吼 碍嗷 图1 1 乳酸的结构式 f i g i lt h es t r u c t u r eo f l a c t i ca c i d 由于人体只含有l 乳酸脱氢酶，因而只能利用自体产生或摄入的l 乳酸， 若过量食用d 或d l 乳酸则会引起代谢紊乱，因此世界卫生组织( w h o ) 提倡 在食品、医药等领域用l 乳酸替代目前广泛使用的d l 乳酸。同时，人们研究发 现用l 乳酸聚合物制成的塑料薄膜可1 0 0 生物降解。这些都给l 乳酸的发展带 来了巨大的促进作用1 卜甜。 纯净的无水l 乳酸是白色的晶状固体，熔点1 6 8 ，沸点1 2 2 ( 2 k p a ) ， 相对密度1 2 4 9 【1 1 。乳酸易与水互溶，不易结晶。在6 7 1 3 3 p a 真空条件下反复 分馏，可毗得到纯品的乳酸结晶。6 0 浓度以上的乳酸，已有很高的吸湿性，所 以，商品l - 乳酸通常为6 0 的乳酸溶液，药典级乳酸含量为8 5 9 0 ，食品 级乳酸含量8 0 以上。 l 哥l 酸通常是乳酸和乳酰乳酸的混合物，为无色通明或浅黄色糖浆状的粘稠 液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸，与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙 酮混溶，几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯。 由于l 乳酸分子内有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应，如 氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应。充分脱水而形成的聚合乳酸中，聚 合体的一般形式可以表示为 n c h 3 c h o h c o o h h o c h c h 3 c o o 。+ ( n 0 1 ) h 2 0 1 2 乳酸的应用 乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，它的用途极为广泛。作为一种古老而 重要的有机酸，乳酸及其盐类和衍生物广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领 域【1 3 一。 由于l 哥l 酸的酸性柔和且稳定，有助于改善食品的风味，在食品工业上广 泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。可用于清亮饮料、糖果、糕点的生产，也可用 于鱼、肉、蔬菜的加工和保藏。与柠檬酸、苹果酸等食用酸相比，具有很强的竞 争力。在软饮料方面，l 哥l 酸在很大程度上取代了柠檬酸和磷酸等，在啤酒制造 上，美国禁止使用磷酸等无机酸调节p h ，而全部使用l - $ l 酸。 l 乳酸的聚合物聚l 一乳酸( p l a ) 是无毒高分子化合物，具有生物相容性， 在人体内可以被分解为l 乳酸，为人体所代谢，不会引起变态反应。因此聚l - 乳酸可用于生产缓释胶囊制剂，从而使血液循环中药物浓度相对降低，从而大大 提高疗效，降低副作用：出聚l 一乳酸制成的手术缝合线，可随伤臼的愈合而被 机体分解吸收，不需拆线，这特别适合机体深部组织的缝合，减少病人的痛苦和 提前康复。 近年来，许多国家为消除“白色污染口】，进行了大量的工作，发现聚l 乳酸在 空气、水和普通细菌存在下可完全分解成水和二氧化碳，形成良好的生态循环。 聚l 乳酸具有良好的机械性能，熔点约1 7 0 ，其膜材对氧、水汽有良好的透过 性，又有较好的透明性，另外还有较好的抗菌、防霉性，使用寿命可达2 3 年， 因此，成为良好的绿色材料。聚l - $ l 酸除在医药行业中使用外，聚乳酸或与其 它材料共聚制成的生物降解塑料可用于生产缓释农药，延长农药的使用时间；用 聚l 乳酸和淀粉制造的生物地膜，细菌分解后可被土壤吸收，因而可以取代塑 料薄膜，减少白色污染。 聚l 乳酸在可生物降解塑料方面的应用，对于减少“白色污染”，实现可持续 发展战略具有极其重要的意义。据国外资料预计，不久的将来将有数百万吨级的 塑料被聚l 一乳酸所取代。 由于乳酸用途不断扩大，用乳酸为原料生产的系列产品也逐年增加，所以， 世界上乳酸需求量递增很快，增长率高达1 5 1 6 1 ，到1 9 9 4 年已突破1 2 万吨。主 要生产厂家有美国的s t e r l i n g 化学公司、a d m 公司和c a r g i l l 公司、荷兰 的c c a 生化公司及其在巴西和西班牙的分厂以及日本的武藏野化学研究所等。 乳酸发展潜力很大，被称为“化工产品中沉睡的巨人”。 我国生产乳酸的历史较长，解放前，我国就用大米发酵来生产乳酸，该法在 无锡第二制药厂和苏州第四制药厂一直沿用至今。由于当时生产工艺落后，加之 粮食供应不足，其产量一直徘徊在数百吨水平。1 9 8 0 年上海工业微生物研究所 选育出乳酸杆菌j 8 4 1 2 ，用于山芋粉发酵生产乳酸，随之乳酸生产厂蓬勃兴起。 7 0 8 0 年代，经历了较长的技术开发和市场开拓历程，9 0 年代以来，我国乳酸 生产技术和消费得到了快速的发展，已成为世界重要的乳酸生产国。目前，我国 现有乳酸生产能力约3 万吨年，乳酸消费可以达到2 万吨年以上，其中啤酒和 其他食品工业可达l 万吨年以上，其他工业消费l 万吨年以上，出口l 万吨年 以上。 1 3 乳酸的生产方法 1 3 1 发酵法生产乳酸 发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为原料，接种微生物经发酵 生成乳酸。按乳酸菌发酵糖类经由的过程和生成产物的不同，可将细菌乳酸发酵 分为同型乳酸发酵( h o m o f e r m e n t a t i o n ) 、异型乳酸发酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o n ) 和混合 酸型乳酸发酵( m i x e da c i df e r m e n t a t i o n ) 7 1 。 ( a ) 同型乳酸发酵 在同型乳酸发酵中，乳酸是葡萄糖代谢的唯一产物，采用的是e m p 途径， 经过这种途径，l m o l 葡萄糖可生成2 m o l 乳酸，理论转化率为1 0 0 ，但由于发 酵过程中微生物有其它生理活动存在，实际转化率不可能达到1 0 0 ，一般转化 率在8 0 以上者，即视为同型乳酸发酵。 ( b ) 异型乳酸发酵 在异型乳酸发酵中，发酵产物包括乳酸、c 0 2 、乙醇( 或乙酸) 等，其产物 中乙醇和乙酸的比例取决于微生物体系中的氧化还原作用。兼性异型乳酸发酵菌 如l a c t o b a c i l l u s c a s e i 发酵戊糖，或专性异型乳酸发酵如l e u c o n o s t o c 发酵己糖或 戊糖均采用这种方式。其乳酸对糖的转化率理论上只有5 0 。 ( c ) 混合酸发酵 混合酸发酵是同型乳酸发酵菌在特殊的情况下，如葡萄糖浓度受到限制、p h 提高或温度降低，而采用的一种乳酸发酵机制，经由e m p 途径但丙酮酸的代 谢途径却发生了改变，除了生成乳酸外，还生成其他有机酸副产物。 传统意义上的同型乳酸发酵或异型乳酸发酵是针对乳酸细菌而言，米根霉作 为好氧真菌，靠呼吸产能并提供合成菌体的中间体，就发酵产物而言，其发酵类 型属混合酸发酵，它经由e m p 途径生成丙酮酸，然后途经几个分支，既有在乳 酸脱氢酶作用下生成乳酸的部分，也有进入三羧酸循环的部分，甚至还有乙醇等 少量副产物的存在，而这些副产物是乳酸的前提物质丙酮酸在一些酶的作用 下生成的。w r i g h t 等【鄙应用1 4 c 放射性同位素标记的方法确定了米根霉体内的代 谢网络如图1 - 2 所示。 图1 2 米根霉发酵l - 乳酸代谢流程 f i g 1 - 2t h em e t a b o l i cp a l h w a yo f r h i z o p u so r y z a e 从代谢流程中可以看出，葡萄糖从细胞外转入细胞内后，首先经过葡萄糖酵 解( e m p ) 途径，转化为6 磷酸葡萄糖( g 一6 口) ，进而转化为为1 ，6 一二磷酸果 糖( f 一1 ，6 2 p ) ，再转化为磷酸烯醇丙酮酸( p e p ) ，然后转化为丙酮酸盐( p y r u v a t e ) 。 至此，丙酮酸可走4 条路线：其一，就是生成a c e t y l c o a 乙酰辅酶a ，进入三羧 酸( t c a ) 循环，在这个循环里会生成延胡索酸盐( f u m a r a t e ) 、苹果酸盐( m a l a t e ) 、 草酰乙酸盐( o x a l o a c e t a t e ) ；其二，就是转化为乙醛( a c e t a j d e h y d e ) ，而后生 成乙醇；其三，就是丙酮酸在( l d h ) 乳酸脱氢酶下，生成乳酸；其四，就是生 成草酰乙酸盐( x a l o a c e t a t e ) ，而后转化为苹果酸盐( m a l a t e ) 和延胡索酸盐 ( f u m a r a t e ) 。 1 3 2 化学合成法生产乳酸 由化学合成法生产乳酸可通过多种途径，如乳腈法，是乙醛与氢氰酸经碱性 催化作用生成乳腈，然后通过蒸馏回收纯化，并用硫酸水解为乳酸，粗乳酸用甲 醇酯化得到乳酸甲酯。精馏后水解生成乳酸。还包括糖的碱性催化水解，丙烯乙 二醇氧化，乙醛、一氧化碳和水在高温高压下反应和乙二醇的硝酸氧化等反应过 程。 1 3 3 酶法生产乳酸 日本东京大学的本崎【2 】研究了2 一氯丙酸酶法转化生产乳酸，他分别从恶臭假 单孢菌p s e p u t i d a 和假单孢菌1 1 3 细胞中提取纯化出l 2 。卤代酸脱卤酶( 简称l 酶) 和d l 2 卤代酸脱卤酶( 简称为d l 酶) ，使之作用于底物d l 2 - 氯丙酸，即 可制得l 乳酸或d 乳酸。h u m m e l 等 2 1 从d 乳酸脱氢酶活力最高的l a c c o n f u s u s d s m 2 0 1 9 菌体中得到d 乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物得到 d 乳酸。 1 ，3 4 乳酸的生产方法的比较 化学合成法的缺点是产品为外消旋d l 乳酸，并且其原料是乙醛和剧毒物氢 氰，使得人们对其产品的安全性不放心，况且其成本也较高，因丽化学合成法生 产乳酸大大受到了限制。酶法生产乳酸虽可以获得单一光学纯度乳酸，但工艺比 较复杂，难于工业化。微生物发酵法生产乳酸，可以通过菌种和培养条件的选择 而获得具有立体专一性d 一乳酸或l 乳酸或两种异构体以一定比例混合的消旋 体。另外发酵法生产乳酸能以葡萄糖、乳糖等单糖为碳源，还能利用淀粉、纤维 素等为原料发酵生产乳酸，因此微生物发酵法生产乳酸因其原料来源广泛，生产 成本低，产品光学纯度高，安全性高等优点而成为生产乳酸重要的方法。 1 4 国内外发酵生产l 一乳酸的研究现状 1 7 8 0 年瑞典化学家s c h e e l e l 9 】最早在酸牛乳中发现乳酸，1 8 4 7 年，b l o n d e a u 2 1 确认种发酵过程的最终产物是乳酸。在食品的发酵生产过程如乳酪、香肠、泡 菜的加工制造过程中使用酸乳和大规模生产乳酸还要追溯1 8 8 1 年的美国，1 8 9 9 年，b o u l l a n g e r 【2 】申请了由乳酸霉即现在的根霉( r h i g o p o s ) 或毛霉( m u c o r ) 生产乳酸 的专利，1 9 11 年斋藤口确认根霉所产乳酸为l 型。乳酸发酵于本世纪5 0 至6 0 年代在生物化学方面取得了较大的进展，现在正开始着手在遗传工程方面改良乳 酸生产菌。 自然界中可产生乳酸的微生物很多，但产酸能力强、可以应用到工业上的只 有霉菌中的根霉属( r h i z o p u s ) 和细菌中的乳酸菌类。根霉属中常用的菌种有米根 霉、行走根霉、小麦曲根霉和美丽根霉。用于工业生产的乳酸菌主要有以下四个 属中的四十余种，即乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、足球菌属。也有用嗜热 脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌生产l 哥l 酸的报道。 1 4 1 细菌发酵生产乳酸的研究 大多数乳酸菌都是革兰氏阳性菌( 0 3 ，无孢子，不运动，兼性厌氧。由于乳 酸菌自身合成b 族维生素和氨基酸的能力有限，使得其营养要求很高，在合成 培养基上难以生长。大多数l 碍l 酸产生菌属于乳杆菌或链球菌属，一般乳酸菌 只生成一种构型的乳酸l 哥l 酸或d 乳酸，但有时也会生成极少量的另一种 构型的乳酸。乳酸脱氢酶( l d h ) 具有立体特异性，乳酸菌体内乳酸脱氢酶的同分 异构形式决定了产物乳酸的同分异构现象。 目前，许多研究者对不同的乳酸发酵生产过程申请了专利，例如：利用5 种 乳杆菌的混合物发酵马铃薯淀粉残渣的边糖化边发酵，并采用电渗析技术分离提 纯产物的工艺过程；以乳清渗透物为底物，采用细胞循环和电渗析技术的连续发 酵过程；能发酵木糖的乳杆菌重组菌利用木质纤维素原料生产乳酸的工艺过程； 纯净d 乳酸或l 乳酸的发酵生产技术；另外，利用电渗析技术、膜分离技术和 酯化技术从发酵液中分离乳酸的工艺过程也申请了专利。 1 4 2 米根霉发酵生产l 一乳酸的研究 国内外对于高产乳酸的米根霉的选育工作做了一定的报道。国际方面，y u r c 等1 1 0 】对米根霉直接发酵玉米淀粉生产l ( + ) 一乳酸进行了研究，每千克玉米淀粉可 生成3 5 0 9 以上的l ( + ) 乳酸，并申请了美国专利j ：s u n t o r n s u k 等通过紫外线 诱变，得到3 种l ( + ) 乳酸的米根霉菌株，产酸分别为1 7 6 、1 7 6 和1 9 8 9 l ，比原 始菌株提高5 7 。y i n 等【】采用气升式发酵罐接种米根霉发酵，由玉米淀粉直接 生产l 一乳酸，产酸1 0 2 9 l ，得率8 5 。 国内方面，曹本昌等 14 】选育了根霉菌株j s m i r 7 3 ，并对该菌的性能及产酸 条件进行了研究，用5 0 0 升发酵罐进行扩大实验，当口服葡萄糖浓度为1 0 0 l 时产酸7 0g l 以上，1 3 0g l 时产酸1 0 1 9 l ，该菌能适应玉米粉作培养基，当玉 米粉浓度为1 2 0 l 时产酸7 0 l 以上，2 0 0g l 时产酸1 0 5g l 以上，其中l 乳酸纯度最高可达9 9 。蒋明珠等 1 5 】筛选出根霉r 4 7 ，产酸11 8 4 9 l ，对糖的 质量转化率达7 8 9 。杨虹等【i6 利用淀粉酸性培养基富集培养，并结合高锰酸钾 溴化钾平板检出的方法筛选出产乳酸为8 1 9 l 的根霉r 2 ，再经紫外线诱变，从 琥珀酸平板上获得了变异株r 2 9 1 ，其乳酸产率为1 0 3 9 l ，转化率为6 8 9 。杨 子培等【i ”使用米根霉t l ( + ) 5 2 7 9 菌株，以玉米淀粉深层发酵生产l ( + ) 一乳酸，在 3 m 3 发酵罐中，当玉米淀粉浓度为1 3 0 9 l 时，产酸9 4 1 e , l ，转化率为7 9 5 5 。 发酵液经分离、提取和精制，l ( + ) 乳酸纯度达9 8 以上。虞东胜等1 1 8 在6 0 吨 发酵罐中使用米根霉r s 9 2 8 ，当总糖浓度为1 7 4g l 产l ( + ) 一乳酸1 4 0g l ，转化 率为8 0 4 ，l ( + ) 一乳酸纯度9 7 9 。夏黎明等0 9 1 研究了利用纤维素酶与米根霉同 时发酵生产l 一乳酸。 此外，在固定化米根霉细胞发酵生产l 乳酸方面也进行了许多研究。h a n g 【2 叫 和h a m a m c i 2 h 等分别对海藻酸钙和海藻酸钠固定化米根霉生产乳酸进行了研究。 t a m a d a 等【2 2 j 将米根霉固定化到以聚二甲基丙烯酸乙二醇酯为单体用y 射线诱导 得到的高分子载体上，乳酸得率大于6 5 ，产酸速率比游离菌高1 8 倍。刘祖同等 1 2 3 1 在葡萄糖浓度为1 5 ，利用固定化米根霉z l 5 6 发酵，l 乳酸产量达1 1 3 3g l ， 转化率为7 4 2 3 ，残糖接近零，在连续9 批发酵中，固定化细胞发酵活力基本 保持较高水平。林建平等 2 4 】对转盘反应器固定化米根霉的l ( 乳酸发酵进行了 研究，发酵速度快、l ( + ) 碍l 酸得率高及既能用于连续发酵又能用于间歇发酵， 同时他们利用发酵与离子交换分离耦合技术进行乳酸发酵研究，简化了后续分离 6 步骤。孙彦等【2 5 】采用聚氨酯泡沫法固定化米根霉发酵生产l - k 酸，速率比游离菌 提高了3 倍，固定化方法简单易行 所制得的细胞稳定性强，容易扩大生产。 在菌体形态研究方面也作了大量的研究，象其它丝状真菌属的微生物一样， 米根霉表现出很复杂的生长形态，主要有菌丝、菌球和大块聚集物。其生长形态 主要受到以下一些因素的影响：菌种本身的特性，营养供应情况，培养基的p h 值，搅拌，通气，接种量和基质浓度等。k o s a k a i f 2 6 】等在米根霉培养液中加入无 机载体和聚乙烯氧化物形成菌丝絮凝体增加了l 乳酸的产量，l - 乳酸的浓度为 1 0 3 6g l ，得率8 6 ，此种絮状体在气升式反应器中，产l 一乳酸的浓度为1 0 4 6 g l ，得率8 7 。y i n t 2 ”等研究了不同接种量对菌体形态及产酸的影响。发现当种 子培养基中孢子浓度为2 1 0 6 个m l 时，菌丝在发酵培养基中会生长成为2 6 r a m 左右的小球体，且产酸量最高，产l 乳酸9 8 2g l ，得率为8 1 8 。d u 【2 驯等通过 控制c a c 0 3 的添加时间使米根霉呈直径1m m 2m m 的小球体形态，与菌丝体形 态的米根霉乳酸发酵相比，得率由8 0 提高至8 6 ，乳酸得比生成速率由1 4 6 g l h 提高为1 5 3g l - h 。随后，z h o u l 2 9 】等研究一种小球体形态的米根霉在泡罩 塔反应器中的发酵特性，在最优营养条件下，对糖的得率为8 8 ，乳酸的最大生 成速率为2 5 8 l h 。 目前，在米根霉发酵生产l 乳酸研究中，通过控制菌体形态使之自聚集成 为定大小的球体进行乳酸发酵，因其操作简便、费用低而成为研究的热点。但 影响菌体形态的因素较多，而每个研究单位只是研究了单一的因素对菌体生长形 态和产酸的影响，各种因素对菌体形态的协同影响还未进行过研究。 乳酸发酵过程中存在的主要问题是产物乳酸对菌体生长和产酸的抑制作用， 影响了产物浓度的提高，造成了后续分离过程的复杂，尤其值得注意的是，目前 乳酸的分离提取技术是乳酸生产的瓶颈技术。为了提高乳酸产翠，控制发酵液 p h 值，传统的方法是使用c a c 0 3 、n a o h 、n i - h o h 来中和生成的乳酸，以维持 最优的p h 值。但乳酸钙使乳酸提取过程复杂化，且乳酸赫对细胞代谢有抑制作 用。因此，近几年来，i s p r ( i ns i t up r o d u c tr e m o v a l ，简写为i s p r ) ，即原位产物 分离技术叫引起了广泛关注，溶剂萃取发酵法 3 0 1 、吸附发酵( 离子交换树脂 3 “、 活性炭【3 2 1 、高分子树脂【3 3 】等) 、电渗析发酵3 4 i p5 1 、膜法发酵3 6 1 1 3 7 1 ) 等，通过从培 养介质中及时移走乳酸，达到减少产物抑制、控制p h 值的目的，对于连续过程 的实现具有重要意义。 1 4 3 细菌和米根霉发酵生产乳酸的比较 细菌营养要求复杂，而根霉营养要求简单。根霉菌菌丝体比细菌大，易于分 离，有利于得到高质量的乳酸产品。尤其是根霉属发酵可得到光学纯度很高的 l 乳酸，这对进一步生产乳酸聚合物极为重要，而乳酸菌发酵乳酸常因消旋作用 而得到d l 乳酸。 1 5 本课题研究的主要内容 1 5 1 课题研究的意义 由于l 乳酸广泛应用于食品、医药等领域，尤其是近年来利用l - 乳酸聚合 生产生物降解塑料并发展迅速，向世界展示了l 乳酸的巨大的发展前景，从而 使微生物发酵法生产l 乳酸日益受到重视，而我国的乳酸产量和质量都不能满 足市场日益增长的需求。因此，对微生物发酵法生产l 乳酸进行系统的研究， 既可以为发酵法生产l 一乳酸的放大提供理论上的依据，同时又可为缩短我国与 世界先进水平的差距作出贡献。 目前乳酸生产技术主要集中在菌种选育、发酵和分离工艺等方面。乳酸发酵 方面主要分为乳酸菌发酵和根霉菌发酵两大类，根霉发酵的特点是：营养要求简 单、发酵温度适中，所产l 乳酸的光学纯度高，但易染杂菌，对无菌操作要求 严格，且没有乳酸菌对糖的利用率高。对于这些缺点可以通过改善操作环境和调 控发酵工艺予以克服。要想制得高质量的聚乳酸，其直接原料l 乳酸必须具有 高的光学纯度。所以利用米根霉发酵获取高光学纯度l 乳酸的研究有着重要意 义。 在实际生产方面，目前还基本上采用分批式的游离发酵，由于米根霉菌丝体 必较发达，悬浮液中的菌丝体经常出现凝块和结团现象，而且菌丝体的凝块还会 在搅拌轴、p h 计d o 电极和反应器壁上生长，使反应器无法控制p h 值d o 值。 另外悬浮的菌丝体会增大发酵液的粘度并形成大的空气泡，减少了氧气的传递。 这些都导致了游离发酵存在以下几方面问题【3 0 】： 1 发酵周期长：每批都需要经过菌种的增殖培养过程，一般需要2 0 2 4h ， 一方面浪费了大量时间。因为在这段时间内菌体处于生长阶段，基本上不产酸或 产酸极少：另一方面菌种的生长也消耗了培养基中的碳源、氮源等营养物质，造 成乳酸得率低。 2 资源浪费严重：分批式发酵中达到发酵终点时需要将菌种灭活以便于下游 处理，正处于活性旺盛时期的菌种只使用次便废弃造成了很大的资源浪费，同 时也污染环境。 3 得率低、生产不稳定：由于米根霉的菌丝发达，在罐内易缠绕在搅拌轴和 罐壁上，使搅拌阻力增大，影响氧传质，并且米根霉菌丝在罐中易形成结团，包 埋碳酸钙和碳源，使碳源得不到充分利用，这些都造成了得率低、生产不稳定等 缺点。 针对存在的这些问题，采用固定化技术发酵生产l 乳酸便被人们加以研究。 固定化方法可以采用多空材料的吸附性来俘获米根霉菌丝体使其依附在固体表 面来解决，也可以通过包埋法将米根霉菌丝体包裹在通透性较好的载体中实现， 还可以通过控制培养基营养成分和通气搅拌等条件来使米根霉菌丝体自动生长 成一定大小的小球体来克服，即无载体固定化。由于固定化后培养基悬浮液中不 存在米根霉菌丝体，发酵液的粘度很低，近似水，因此发酵过程中搅拌阻力小， 氧的传递更容易实现。与游离发酵相比，固定化发酵的乳酸产率可大幅度提高， 成而大大缩短生产周期，另外还解决了发酵过程中米根霉菌丝体出现的凝块和结 团现象，并且固定化米根霉细胞重复使用多次后依然保持较高的活性【4 l “l ，为乳 酸的长时间连续化发酵提供了可能。 1 5 t 主要研究内容 本实验主要研究内容为以下三个方面： ( 1 ) 固定化米根霉发酵生产l 一乳酸的工艺研究。 通过对聚氨酯泡沫吸附法固定米根霉细胞和海藻酸钙包埋法固定米根霉细 胞发酵生产l 乳酸的研究，以乳酸产量和固定化细胞的重复利用率为主要指标， 进行培养基成分优化和发酵条件优化，得出海藻酸钙包埋法固定米根霉细胞发酵 生产l 乳酸既具有产量高，又具有固定化细胞重复使用性好的优点。 ( 2 ) 固定化米根霉发酵生产l 乳酸产酸速率的研究。 在海藻酸钙包埋法固定米根霉细胞发酵生产l 一乳酸的基础上，以乳酸产率 为考察指标，通过控制接种量、固定化细胞直径以及发酵条件等因素使乳酸产率 达到最大，即产酸速率最快。 ( 3 ) 固定化米根霉发酵生产l 乳酸发酵动力学研究。 通过测定发酵过程中米根霉菌丝体量、乳酸生成量署葡萄糖消耗量，通过测 得的数据进行模型的参数估算，得出海藻酸钙固定化米根霉细胞发酵生产l 一乳 酸的动力学模型。 第二章聚氨酯泡沫固定化米根霉发酵生产l 一乳酸 工艺研究 2 1 引言 米根霉a s3 8 1 9 的高产特性不仅由其遗传特性决定，也由其所处的环境条 件决定。发酵法生产乳酸产量的高低除了受生产菌种的影响外，培养基的组成和 培养条件对产量也有很大的影响。为了最大限度的发挥菌种的生产能力，必须提 供最适的培养基和培养条件。 本章以及第三章主要进行固定化米根霉发酵生产l 一乳酸的工艺研究，首先 通过游离发酵的实验说明游离发酵的缺点与不足，引出采用固定化细胞发酵的必 要性。固定化方法主要分为吸附法和包埋法两种，吸附法是指利用载体本身的吸 附性，将细胞吸附在载体表面进行发酵；包埋法是将细胞包埋在载体内部，载体 内部一般具有非常疏松的结构，这样在载体内形成满足细胞生长、代谢等生理活 动的内空间： 本章主要研究聚氨酯泡沫法固定化米根霉发酵生产l 哥l 酸，属于吸附法， 通过聚氨酯泡沫的吸附性使米根霉细胞固定在其表面。以乳酸产量和固定化细胞 的重复利用率为主要指标，进行发酵工艺研究。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验试剂和设备 2 2 1 1 试剂 试剂名称 乙醇 氢氧化钠 硫酸铵 磷酸二氢钾 氯化钙 硫酸亚铁 硫酸镁 硫酸锌 酒石酸钾钠 硫酸铜 葡萄糖 蛋白胨 规格 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 厂家 上海化学试剂厂 上海新华化工厂 广东汕头市西陇华工厂 上海科昌精细化学品公司经济 上海化学试剂厂 广州化学试剂厂 杭州化学试剂厂 上海试剂一厂 上海化学试剂厂 杭州化学试剂厂 广东汕头市西陇华工厂 杭州化学试剂厂 牛肉膏 苯甲醇 正丁醇 溴酚蓝 盐酸 硫酸 氯化钠 琼脂 海藻酸钠 甲醛 e d