（制糖工程专业论文）测蔗糖用酶生物传感器的制作研究与性能探讨.pdf

华南理工大学 煅 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 奔亚致 1 日期：叶年石月2 广日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 保密囱，在二l 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“。) 作者签名：新显镟 导师签名：杏谚 日期：阳尹年月妒日 日期：乞硼严月2 严日 摘要 摘要 在制糖工业过程中，对糖厂锅炉给水中糖分的监控，一直是备受关注 和期待解决的问题。目前国内传统的检测方法一般是人工采样再采用化 学法作比色分析，这种方法对经验和检测者个人依赖程度高，且与现在 的数字化时代和生产过程自动化不相适应。 本研究采用制作的生物传感器酶电极将反应过程中的生物化学变化 最终转变成电信号，并对电信号作进一步的放大处理。 本文研究的内容包括酶电极中固定化酶膜的制作，制作的酶膜组装 的酶生物传感器的性能测试和传感器后续电信号的放大处理三部分。对 影响固定化酶膜活力的因素进行了探索，研究了酶电极中固定化酶膜制 作的最佳条件：基膜材料选用聚乙烯醇，最佳固定化p h 为5 5 ，最佳温 度为2 5 ，交联剂戊二醛的浓度用3 ，酶浓度选用0 2 m g m l ，酶偶联 时间1 2 小时以上。用制作好的固定化酶膜与碘离子选择电极组成酶电极， 并与参比电极组成酶生物传感器，对该酶电极生物传感器用离子计来测 试水中糖分，确定了传感器的最佳工作条件为p h 6 0 ，温度为3 0 ，碘离 子浓度为1 1o 。4 m o l l 。测试了传感器的线性范围为0 2 0 0 m g l ，响应时 间为3 分钟，传感器的十次连续测定重现性的相对标准偏差为1 8 2 。 寿命可达两个星期。对传感器后续信号的处理设计了可以调节放大倍数 的放大电路，测试了放大电路的放大线性，在放大倍数设计为10 0 0 倍时， 实际测量8 次放大倍数的平均值为1 0 01 5 ，放大线性度良好，误差满足 放大电路的要求。 关键词生物传感器；酶电极；糖分；检测；固定化酶 华南理工大学工学硕士学位论文 _ _ l l _ _ l _ i l _ _ _ l _ _ _ l _ l - l i _ i i - - l _ _ _ l i _ _ _ - _ _ - _ l _ l l _ _ _ _ _ _ 、 a bs tra c t i ns u g a ri n d u s t r y ，t h ed e t e c t i o na n dc o n t r o lo fs u g a ri nt h ew a t e r f l o w i n gi n t ot h e b o i l e ri sd i f f i c u l ta n da t t r a c t sal o to fa t t e n t i o n i n d o m e s t i c ，t h ec h e m i c a lm e t h o di st r a d i t i o n a l l yu s e dt o d e t e c tt h es u g a r p e r c e n t t h i sh i g h l yd e p e n do nt h e h u m a ne y e sa n da l s od e p e n d so nt h e i n s p e c t o r s e x p e r i e n c e u s i n gb i o s e n s o r ，s u c ha se n z y m ee l e c t r o d e ，t h es i g n a lw a st r a n s f e r r e d t oe l e c t r i cs i g n a l a m p l i f y i n ga n dt r e a t i n gt h ee l e c t r i cs i g n a l ，w ec a ng e t d i g i t a li n s t r u m e n ta n dt h ep r o d u c i n gp r o c e s sc a ne a s i l yb ec o n t r o l l e d t h i ss t u d yc o v e rt h r e ep a r t s ，i n c l u d i n gf a c t u r eo fi m m o b i l i z e de n z y m e m e m b r a n e ，t h ep e r f o r m a n c eo ft h em a d e u pb i o s e n s o ra n dt h ea m p l i f y i n g c i r c u i to ft h ee l e c t r i cs i g n a l t h eb e s tc o n d i t i o no fm a k i n gi m m o b i l i z e d e n z y m em e m b r a n ei ss t u d i e d p o l y v i n y la l c o h o l ( p v a ) i sc h o o s e dt om a k i n g b a s em e m b r a n e t h eb e s tp ha n dt e m p e r a t u r et oi m m o b i l i z e de n z y m ea r e5 5 a n d 3 0 r e s p e c t i v e l y t h e b e s t g l u t a r a d e h y d e ( g a ) c o n c e n t r a t i o n t o i m m o b i l i z e de n z y m ei s3 t h eb e s te n z y m ec o n c e n t r a t i o ni s0 2 m g m l ，o n w h i c hg o o di m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t ya n dr e s c o v e r yc a nb eg o t t h e c o u p l i n gt i m et oi m m o b i l i z e de n z y m es h o u l db eo v e r 12h o u r s u s i n gt h e i m m o b i l i z e de n z y m em e m b r a n et oa s s e m b l e t h eb i o s e n s o r t h eb e s t c o n d i t i o nf o rt h ee l e c t e o d eb i o s e n s o rt ow o r ki sa tp h6 0a n da t3 0 c t h e r e s p o n s et i m ei st h r e em i n u t e s t h el i n e a ls c o p eo ft h e b i o s e n s o rc a nb e r e a c h e df r o mz e r ot o2 0 0 m g m 1 t h er s do ft e nc o n s e q u e n c ed e t e c t i o ni s 1 8 2 w h i c hs h o w sg o o dr e c u r r e n c eo f t h eb i o s e n s o r t h e a m p l i f y i n g c i r c u i tt oa m p l i f y i n gt h ee l e t r o n i cs i g n a lf r o mt h eb i o s e n s o ri sd e v i s e d t h e a m p l i f y i n gt i m ec a nb ea d j u s t e d w h e nt h ea m p l i f y i n gt i m ei s s e ta t1 0 0 0 ， t h ea v e r a g eo fp r a c t i c ei s 10 01 5 ，w h i c hm e e t st h er e q u i r e m e n t so ft h e p r e c i s i o n k e yw o r d s b i o s e n s o r ： e n z y m ee l e c t r o d e ；s u g a rp e r c e n t ；d e t e c t ； i m m o b i l i z e de n z y m e 2 3 1 固定化的优点9 2 3 2 固定化方法原理9 2 3 3 各种固定化方法简介。1 0 2 3 4 各种固定化方法比较1 2 2 4 生物传感器的应用1 3 2 4 1 在临床医学中的应用1 3 华南理工大学工学硕士学位论文 2 4 2 在食品工业中的应用。1 3 2 4 3 在环境检测中的应用1 4 2 4 4 在军事领域中的应用1 4 2 4 5 生物传感器在流动注射中的应用1 4 2 5 生物传感器的发展前景1 5 2 6 本章小结1 5 第三章固定化酶膜的制作探讨16 3 1 本课题中酶电极设计原理：1 6 3 2 实验部分1 7 3 2 1 实验仪器与试剂1 7 3 2 2 实验溶液配制1 8 3 3 影响固定化酶活性的主要因素1 8 3 4 固定化酶膜的制作1 9 3 4 1 固定化载体和活化方法的选择1 9 3 4 2 酶膜制作步骤2 0 3 4 3 固定化酶膜效果评价2 l 3 5 固定化载体对固定化酶活力的影响2 2 3 5 1 不同醇解度聚乙烯醇膜对固定化酶活力的影响2 2 3 5 2 不同聚合度的膜对固定化酶活力的影响2 3 3 5 3 不同浓度的聚乙烯醇膜对固定化酶活力的影响2 3 3 6 固定化条件的研究2 4 3 6 1 戊二醛浓度对固定化酶活力的影响。2 4 3 6 2 酶浓度对固定化酶活力的影响2 5 3 6 3p h 对固定化酶活力的影响2 6 3 6 4 固定化温度对固定化酶活力的影响。2 6 3 6 5 酶偶联时间对固定化酶活力的影响。2 7 3 7 酶固定化条件的优化2 8 3 8 酶膜的保存稳定性3 0 3 9 本章小结3 0 第四章酶电极工作条件的优化及对糖分的测量3 1 4 1 实验试剂和仪器3 1 4 1 1 实验试剂31 4 1 2 实验仪器3 1 i v 第五章传感器后放大电路的初步设计与制作4 1 5 1 二次部分硬件需求分析4 1 5 2 放大电路的设计工作原理4 l 5 3 放大电路的设计4 2 5 3 1i ( = l 7 6 5 0 的选择4 2 5 3 2 前级放大电路的原理图。4 5 5 3 3 后级放大电路的设计4 6 5 4 放大电路系统的噪声抑制与抗干扰设计4 7 5 4 1 电源的选择。4 7 5 4 2 电阻和电容的选择4 7 5 4 3 反馈电阻的选择4 7 5 4 4 减小电路漏电流4 8 5 4 5 电路制作工艺4 8 5 5 系统硬件装配4 8 5 6 放大电路元件一览表4 9 5 7 测试结果与讨论5 0 5 7 1 测试结果5 0 5 7 2 测试讨论5 0 v 华南理工大学工学硕士学位论文 5 8 本章小结5 0 结论与展望5 1 参考文献5 3 攻读学位期间发表的与学位论文相关的学术论文5 8 致谢5 9 式和直管式加热器，它们的冷凝水都是非常重要的锅炉给水来源。糖份 可能通过汁气的雾沫夹带或通过加热表面的缺损处泄漏到冷凝水里面， 从而带入锅炉。从表面上看，这些回收冷凝水所带的糖份是微不足道的， 但因为蒸发器和结晶罐的冷凝器以及其它各工序制糖和精炼操作都要用 到大量的水，这样微不足道的糖份也会积少成多。糖份能使水在锅炉内 产生泡沫，从而导致事故的发生。即使糖的分量尚不足以引起泡沫进而 危及锅炉，但糖会因热分解形成一些有害锅炉壳体和加热管的产物，造 成凹痕和引起受热不均。纵使糖份的分量微不足道，但这些痕量的糖份 将最后成为有害而危险的炭质沉积物逐渐增积在锅炉的加热管上。另外， 糖份还会降解为有害的有机酸类。所以进入锅炉的水源都应当连续取样 且每隔一个短时间就要化验一次。其中蔗糖份测量就是一项主要的指针。 锅炉水中如含有明显的糖份，就会在蒸汽中产生一种明显的气味，在这 种情况下，应立即将已受污染的水排入污积) 来接受直接使用的汽凝水， 以便应付蒸汽耗量波动时锅炉供水的要求。在槽里的锅炉给水中，水渠， 并把锅炉彻底排空。建议用一个大的给水槽( 每小时榨甘蔗吨数乘以 1 13 6 5 m 3 容加n a o h 或n a 。c o 。使p h 值保持8 或更高是可取的，并在水进 入锅炉前，检测其中的蔗糖分，以使其符合制糖行业的标准。 1 2 传统的化学检测方法 1 2 1 用a 一萘酚检验水中的糖份 q 一萘酚试验是冷凝水，锅炉给水，糖厂排放废水和其它可能是有 害的水等方面应用最广的含糖检测方法心1 。其检测的基本原理： 浓的无机酸对糖有脱水作用，戊糖，己糖，聚戊糖及聚己糖等可用浓硫 酸使之脱水而生成糠醛或其衍生物，所生成的糠醛或糠醛衍生物可以与 a 一萘酚缩合而生成紫色的化合物。如果检测是在同样的条件下进行并用 华南理工大学工学硕士学位论文 标准溶液作对照试验也能得出粗略的定量估计。在试管内的2 m l 经过冷 却的水源，加5 滴2 0 q 一萘酚乙醇溶液，然后用一根吸液管将5 m l 浓硫 酸慢慢地沿试管壁注入，这时管内地水就会浮在浓硫酸上面，如果水中 有蔗糖存在，则在水和硫酸这两种液体的分接口处将会显出一个紫色的 横断面或圆环，紫色环的深浅随蔗糖含量的改变而变，即含蔗糖量越高， 紫色环的颜色越深。 1 2 2 钼酸铵法 该方法的基本原理是：水溶液中若含有蔗糖，在加酸加热的情况下， 蔗糖就被水解成葡萄糖与果糖，而葡萄糖和果糖这两种糖均具有还原性， 它们把钼酸铵与盐酸所生成的钼酸还原成钼蓝，反应如下： ( n h 4 ) 2 m 0 0 4 + 2 h c l = = = 2 n h 4 c l + h 2 m 0 0 4 3 h 2 m 0 0 4 + c 6 h l2 0 6 = = = = m 0 2 0 5 m 0 0 3 + cs h l l 0 5 c o o h + 3 h 2 0 所生成钼蓝的数量( 即钼蓝的深度) 与蔗糖浓度成正比，通过与标准比 色管相比较，则可测出蔗糖的含量。在制作标准色管的时候，配制一系 列从1o p p m ，2 0 p p m ，3 0 p p m 直至8 0 p p m 的不同浓度的标准微量糖份溶液， 取规格一致( 包括玻璃色泽，厚度，直径) 的试管7 支，各加入不同浓 度标准的微量糖份溶液5 m l ，加入纯盐酸两滴，4 钼酸铵溶液l m l ，在 沸腾水浴内准确加热3 分钟，取出将管口封闭备用。 1 2 3 蒽酮比色法 糖分可与硫酸起反应，脱水生成羟甲基呋喃甲醛，再与葸酮缩合成 蓝色化合物，其呈色的深浅与溶液中的糖分的浓度成正比。本法在2 0 2 0 0 m g l 含糖范围内呈良好的线性关系1 。 1 3 国外对糖份检测的一些先进的方法及其原理 1 3 1 电导仪 早在19 2 8 19 2 9 年间，霍尼( h o n in g ) 和尼古拉( n ic o la ) 便进行 了系统的研究，发现蔗糖溶液的浓度和电导率之间存在某种关系。纯蔗 糖溶液是不导电的，蔗糖溶液的导电性主要是由非糖份物质的电离情况 所决定的。r eid 和d u n o m o r e 研究开发一种电导仪，该电导仪在锅炉水经 过足够的预处理后，在这样的条件下用这个仪器检测电导值，对保护原 2 第一章绪论 糖厂的锅炉是可行的，但是对于精糖厂的冷凝水，由于其含糖的水体含 盐分不够提供测定电导值，故而这种仪器不适合。总的来说，由于电导 仪的本质是测量非纯糖液的电阻，所以其测量值不仅液糖份与水的比例 有关，还与水中的杂质成分以及温度有关，干扰，可变的因素较多。 1 3 2 酶柱法分析仪 另一个新的糖份检测仪是l ee d s n o r th r o p 公司制造的酶柱法分析 仪。该分析仪是用高纯度的酶作催化反应柱，各种酶( 葡萄糖氧化酶， 转化酶和变旋酶) 均固定在珠状载体的反应柱中。反应产生过氧化氢， 随即反映到电化学安培计检测器实行报警监测。该分析仪可对锅炉给水 或生产过程用水含糖份的监测。 1 3 3 酶膜法自动检糖仪 美国y el1o ws p r in g 公司制造的自动检糖仪上使用的探测技术是 根据d r l e la n dc 1a r k 提出的原理发明的，在该装置上发明使用了固定 化酶膜并获得了专利。该检糖仪的探测器装有三层膜片，固定化酶膜位 于中间层，由膜覆盖在表面的探测器位于充满缓冲液的样品室中。样品 被注入该室，一些由酶作用的物质穿过膜而扩散。被酶氧化产生过氧化 氢，然后过氧化氢在铂电极上被氧化产生电子。为了阻止降低作用力的 其它物质到达阳极产生干扰，膜内加有一层极薄的醋酸纤维。这种检测 仪可用于分析糖，淀粉和酒精。测定几乎不受样品的物理特性如颜色， 混浊度的影响。用这种仪器检测糖份精度可达1o m g l 。在糖厂这种检测 仪可以用于连续冷凝水中的蔗糖分。 1 4 本课题的立题背景及研究内容 对锅炉给水中糖分的控制一直是制糖工业中人们渴望解决的问题。 在我国的制糖工业中，采用的传统的取样分析法，一方面容易受到检测 人员个体主观差异的影响，一方面因为天气的晴朗度也会影响到人的肉 眼对颜色的敏感度。传统的检测方法与现代化的生产不相适应。现代化 的制糖工业迫切需要一种智能型的检测控制仪，它不仅要融入生产程控 系统中，而且还要尽可能多地消除人工参与传递信息。这就是本课题的 立题背景。 本课题的研究内容包括对生物传感器酶电极的设计与制作，主要在 固定化酶膜制作条件的优化和传感器性能的探讨。本课题的目标是生物 3 华南理工大学工学硕士学位论文 传感器的酶反应系统能在一个浓度范围内有良好的线性关系和重现性， 为放大电路提供具有线性关系的电信号，以便后续的放大和可编程控制。 4 器 境 析 或 生物传感器是一种由生物学、医学、电化学、光学、热学及电子技 术等多学科相互渗透而成长起来的分析检测装置3 ，具有选择性高、分 析速度快、价格低廉等特点，而且又能进行连续测定、在线分析，甚至 活体分析，因此引起了世界各国的极大关注。生物传感器具有专一性好、 酶可以重复多次使用、分析速度快、准确度高、操作系统比较简单等特 点。 2 1 生物传感器的基本组成 d口 分析物 被测物的输出 定化生物敏感 质 电，光热，磁传感器 图2 1 生物传感器示意图 f i g u r e2 _ 。i s c h e m a t i cd i a g r a mo fb i o s e n s o r 生物传感器是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构 5 华南理工大学工学硕士学位论文 成的分析工具或分析系统。它的工作原理以图2 1 表示：待测物质经扩 散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物化学反应，产 生的信息继而被相应的化学或物理换能器转化为可定量和可处理的电信 号，再经仪表的放大和输出，便可知道待测物的浓度 1 。 2 1 1 生物分子识别组件 分子识别组件又称生物敏感膜，是生物传感器的关键组件。它是由 对待测物质( 底物) 具有高选择分子识别能力的膜构成的，因此直接决 定了传感器的功能和质量。生物敏感膜依所选的材料不同，可以是酶膜、 细胞膜、免疫膜、细胞器膜等，各种膜相应的内容见表2 1 。 表2 1 生物传感器的分子识别组件 t a b l e2 1s e n s i t i v ec o m p o n e n t so ft h eb i o s e n s o r 分子识别组件生物活性材料 酶膜 全细胞膜 组织膜 细胞器膜 免疫功能膜 各种酶类 细菌，真菌，动植物细胞 动植物组织切片 线粒体，叶绿体 抗体，抗原，酶标抗原等 2 1 2 换能器( t r a n d u c e r ) 生物传感器的另一个重要组成部分是换能器，它可以感知生物活性 单元与待测物质特异性结合产生的微小变化，并能把这种变化转变成其 它可以记录的信号，如检测电化学变化，如电位，电流等；光信号，如 吸收光，散射光，折射光，荧光，化学发光，电化学发光等；密度和质 量的变化；振幅和频率和声波相位的改变；或用热敏感组件测量热学的 改变。把这些信号送到放大装置中，输出并记录结果。换能器质量的好 坏，决定了传感器的灵敏度的高低。 生物化学反应过程中产生的信息是多元化的，它可以是化学物质的 消耗或产生，也可以是光和热的产生，因为对应的换能器的种类也是多 样的( 表2 2 ) 。目前生物传感器中研究的最多的是电化学生物传感器， 在这类传感器中，换能器主要有电流型和电位型两类。 6 生物传感器在最近十余年来发展非常迅速，大致可分为四大类：酶传 感器，微生物传感器，免疫传感器，组织传感器等。 2 2 1 酶生物传感器 酶生物传感器又简称酶电极，它是问世最早、成熟度最高的一类生 物传感器9 j 引。由于酶蛋白具有高度的分子识别功能，固定化酶又具有 能被重复使用的优点，因而可以被广泛地应用于生产分析和临床化学检 测。自6 0 年代酶电极问世以来，酶传感器获得了巨大的发展，已成为酶 法分析中一个日益重要的组成部分。它是利用酶的催化作用，在常温常 压下将糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通过 换能器将反应过程中化学物质的变化转变为电信号记录下来，进而推出 相应的生物分子浓度或待测物浓度。因此，酶传感器是间接型传感器， 它不是直接测定待测物质，而是通过对反应有关物质的浓度测定来推断 底物的浓度。目前国际上已研制成功的酶传感器有2 0 余种。 2 2 2 微生物传感器 微生物传感器是应用细胞固定化技术，将各种微生物固定在膜上的生 物传感器。它主要分为两大类，一类是利用微生物的呼吸作用，另一类 是利用微生物体内所含有的酶。微生物生物体与组织一样含有许多天然 的生物分子，能对酶起协同作用，因此传感器寿命也较长。此外，微生 物传感器还特别适用于发酵过程中物质的测定，因为它不受发酵液体中 7 华南理工大学工学硕士学位论文 酶干扰物质的影响。至今，已研制出可以测定葡萄糖，酒精，氨，谷氨 酸，生化耗氧量等微生物传感器。 2 2 3 组织传感器 组织传感器是利用动植物组织中多酶系统的催化作用来识别分子。 由于所用的酶存在于天然组织内，无需进行人工的提取纯化，因而比较 稳定，制备成的传感器寿命较长。例如可将猪肾组织切片覆盖在氨气敏 电极上制成可测定谷氨酰胺的传感器。这是因为猪肾组织内含有丰富的 谷氨酰胺酶，这种电极的稳定性可保持一个月以上。至今已研制出利用 猪肝，兔肝，鼠脑，鼠肠，鸡肾，鱼肝，大豆，土豆，生姜，马兰等动 植物组织的各类传感器。 2 2 4 免疫传感器 免疫传感器是利用抗体与抗原之间的高选择性而研制的。目前已有 几种免疫传感器已获得了初步的成功。绒毛促性腺激素( h g g ) 传感器便 是其中的一种，h g g 是鉴定怀孕与否的主要化合物。其传感器的制备是将 h g g 抗体固定在二氧化钛电极的表面制成工作电极，通过它与固定尿素的 参比电极之间形成一定的电位差，当电解液中加入含h g g 的抗原时，工 作电极的电位立即发生变化，从电位变化测可求出h g g 的浓度n 。 2 3 生物活性单元的固定化 在生物传感器内，生物活性材料是固定在换能器上的，为了将分子 或器官固定化，已经发展了各种固定化方法。但无论使用何种方法，都 应尽可能不破坏生物材料的活性。理想的固定化方法，应能延长材料的 活性。一般情况下，用常规方法嵌入的酶，其活性可维持3 4 周或5 0 2 0 0 次测定；而以化学方式结合的酶，其活性常能提高到10 0 0 次测定 【1 1 ，1 2 ，l 3 o 生物活性单元的固定化技术是生物传感器制作的核心部分，它既要 保持生物活性单元的固有特性，又要避免自由活性单元应用上的缺陷。 生物活性单元的固定化技术决定着生物传感器的稳定性、灵敏度和选择 性等主要性能，也决定着生物传感器是否有研究和应用价值。 8 第二章生物传感器简介 2 3 1 固定化的优点 早期的生物活性物质测量法，如酶分析法，是在水溶液状态下进行 的，由于酶在水溶液中一般不太稳定，且酶只能和底物作用一次，因此， 使用起来很不方便。要使酶作为生物敏感膜使用，必须研究如何将酶固 定在各种载体上，这称为酶的固定化技术。同常规方法相比n 引，使用限 制在电极表面的固定化酶膜具有很多诱人的特征： a 固定化酶可以很快从反应混合物中分离，并能重复使用： b 通过适当控制固定化酶的微环境，可获得很多所需要的性质，如高稳 定性、高灵敏度、快速的响应等： c 在选择电极尺寸和形状方面具有较大的灵活性，易于微型化或采用 复杂的表面，如网状玻碳： d 可防止溶液中其它物质的干扰和对电极表面的玷污等。 2 3 2 固定化方法原理 目前，被广泛研究的固定化技术主要有吸附法、包埋法、交联法、 共价键合法等，见图2 2 所示。现对它们介绍如下。 ( a ) 包埋法( b ) 吸附法 ( c ) 共价键合法( d ) 交联法 图2 2 酶的固定化方法 f i g u r e2 - 2m e t h o d so fi m m o b i l i z i n ge n z y m e 9 华南理工大学工学硕士学位论文 2 3 3 各种固定化方法简介 2 3 3 1 吸附法 生物活性单元在电极表面的物理吸附是一种较为简单的固定化技 术。酶在电极上的吸附一般是通过含酶缓冲溶液的挥发进行的，通常温 度为4 ，因此，酶不会发生热降解n 卜2 引。吸附后，还可以通过交联法来 增加稳定性。物理吸附具有无需化学试剂、极少的活化和清洗步骤，很 少发生酶降解，对酶分子活性影响较小等优点。但对溶液的ph 值变化、 温度、离子强度和电极基底较为敏感，需要对实验条件进行相当程度的 优化。该方法由于存在吸附过程的可逆性，生物活性单元易从电极表面 脱落，而且同其它固定化技术相比，生物活性单元的寿命较短。酶分子 直接吸附于不溶性载体电极上，操作简单，酶电极的响应速度快( 一般不 超过3 0 秒) ，但是吸附的酶易于脱落，因此这种酶电极的操作和储存稳 定性差，最多能使用一周，不适合实用化的要求。此法用得不多。 2 3 3 2 物理包埋法 迄今为止，应用最为普遍的固定化技术是采用凝胶聚合物包埋， 它能将酶分子或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构中 卜2 9 l ，最为常用的聚合物是聚丙烯酰胺。该技术的特点是：a 可采用温 和的试验条件及多种凝胶聚合物：b 大多数酶可很容易地掺入聚合物 膜中，一般不产生化学修饰：c 对酶活性影响较小：d 膜的孔径和几 何形状可任意控制：e 包埋的酶不易泄漏，并可采用其它固定化技术如 共价键合法和交联法进一步改进包埋的稳定性：f 可固定高浓度的生 物活性单元。此外，包埋法还具有过程简单、可对多种生物活性单元进 行包埋的优点。这种固定技术在某些方面也具有一定的局限，如：必须 控制很多试验因素：聚合物形成过程中产生的自由基对生物活性单元可 能产生失活作用：聚合物的空间结构使之局限于测定较小尺寸的物质： 而且，由于大的扩散排阻使响应时间增加。采用这种固定化技术时，通 常采用物理的方法将凝胶聚合物限制在电极表面，这使得传感器难以 微型化。包埋法包括基质包埋法和微胶囊包埋法两种。利用微胶囊法对 酶进行包埋固定是一种新的固定化技术，它是将生物分子或细胞悬浮在 水凝胶的小水舱内，膜阻碍了它们的泄漏，但允许小分子底物和产物的 渗透。将脲酶包埋固定于二十六烷基硫酸钠在适当溶剂中形成的反相胶 束内，与玻璃电极共同组成脲传感器。用于临床血样品中尿酸的测定， 其结果与常用方法的结果一致。包埋法是较常用的方法。该方法较温和， 1 0 第二章生物传感器简介 酶被包埋在聚合物中，不发生化学键的联接。酶不断地从膜中渗漏脱落， 储存稳定性和热稳定性差。铂电极和酶膜的粘附性不强，产生酶膜脱落 现象。酶膜与外层限制膜的不同膨胀性质，产生酶膜和外层限制膜的开 裂。响应信号与接近感应器件的活性酶的数量有关，由于在包埋法中， 大多数酶包埋在较厚的聚合物膜中，增大了传感器的响应时间。 2 3 3 3 共价键合法 共价键合法是将生物活性单元通过共价键与电极表面结合而固定的 方法称为共价键合法，通常要求在低温( 0 ) 、低离子强度和生理p h 条件 下进行，并加入酶的底物以防止酶的活性部位与电极表面发生键合作用 而失活。当共价键在生物分子的非活性部位键合时，被固定的分子仍能 保持较高的活力。电极表面的共价键合比吸附困难，但固定酶稳定性较 好，因此应用广泛。当向电极表面共价键合生物活性单元时，需考虑很 多因素。附着过程通常包括三个步骤：基底电极表面的活化，酶的偶联 及除去键合疏松的酶。这些步骤中每一步合适的试验条件都取决于生物 活性单元及偶联剂的特性。共价键合法可分为重氮法、叠氮法、缩合法、 溴化氢法、烷化法等嵋引。通过对电极进行化学修饰再利用酶蛋白分子 中可以进行键合的，n f i 、- o h 、一s h ，一c o o f i 等活性基团与电极连接，该方 法形成的酶膜厚度与吸附法相似，且酶电极的响应速度快、稳定性好， 酶紧密结合在电极上，酶的损失很少，无酶膜脱落和开裂现象。由于酶 分子与载体材料表面形成较大的多点结合接口，共价法的结合力较强， 结合效率较高，使酶的活性降低。该方法的操作比较复杂，影响固定的 因素较为复杂，酶、载体材料表面和连接试剂官能团的性质及其相互作 用对结合效率有较大的影响。由于共价键法固定酶具有结合力较强，电 极表面覆盖均匀，传感器具有重复性好等优点，薄膜传感器的制备一般 均采用该方法。但该方法的操作比较复杂，影响固定酶的因素较多，电 极表面的性能对酶电极的性能有很大的影响。另外，在共价键固定酶过 程中，有大量非共价键结合的酶吸附在电极上，存在连续的解吸，影响 传感器的性能。 2 3 3 4 交联法 通过采用双功能团试剂，在生物活性单元之间、生物活性单元与凝 胶聚合物之间交联形成网状结构而使生物活性单元固定化的方法称为 交联法。最常用的交联试剂为戊二醛，它能在温和的条件下与蛋白质的 华南理工大学工学硕士学位论文 自由氨基反应。其原理反应式如下： 载体一n h 。+ 0 h c 一( c h 2 ) 。一c h o + n h ：一酶一一载体一n h c h ( o h ) 一( c h 2 ) 3 一c h ( o h ) 一n h 一酶 采用交联法的局限是膜的形成条件不易确定，需仔细地控制p h 值、 离子强度、温度及反应时间，酶膜的厚度及戊二醛的浓度对传感器的响 应具有重要影响。当酶膜较厚时，由于扩散受到阻碍致使响应信号下降， 响应时间延长：戊二醛的浓度较低时，对固定化酶的失活作用较弱，但 固定化酶的量也少，而戊二醛的浓度较高时，酶的固定量虽然增大，但 对固定化酶的失活作用也大：同时，双功能团试剂也可能不是选择性的， 既可能发生分子间键合又可能发生分子内键合。交联法分为酶交联法、 辅助蛋白交联法、吸附交联法、载体交联法。酶依靠双功能团试剂造成 分子间交联而成为网状结构。一般采用戊二醛为交联剂，牛血清蛋白为 辅助蛋白质，操作简单，不需要太多的试剂，而且制备的酶电极可以很 快用于测试，但是辅助蛋白质的加入使酶膜变厚，反应底物的扩散阻力 增加，使响应时间增加。酶与反应性强的交联剂作用使酶活性损失较大， 灵敏度较低，寿命大多为l0 天口卜川。 2 3 4 各种固定化方法比较 表2 3 酶的固定方法的比较“4 4 5 3 t a b le2 3c o m p a risio no fim m o bilizin g e n z y m em e th o d s 由表2 3 可见，没有一个方法是十全十美的，几种方法各有利弊。 包埋法、共价结合法、交联法三种方法虽然结合力较强，但不能再生、 回收；吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但结合力差，在受到离 子强度、p h 变化影响后，酶会从载体上游离下来，包埋法各方面较好， 但不适合大分子底物和产物。在比较了各种固定化酶的一些突出优缺点 后，然而做出最佳额选择还要依据于特定的技术需要和资金考虑。总而 1 2 第二章生物传感器简介 言之，酶的固定化可以节省花费并且有许多技术优点。因为不同的酶种 类具有不同的特性，对于不同的靶物质需要不同的反应技术，所以，有 必要开发出更有效的酶固定化的方法和技术。 2 4 生物传感器的应用 在工农业生产、环境保护、临床检验以及食品工业等领域，每天都有 大量的样品需要分析检验，而且往往要求在很短的时间内完成样品检测， 有的要求现场分析，有的要求进行在线或活体内直接测定。传感器的高 度自动化、微型化和集成化，减少了对使用者环境和技术的要求，其便 携式的特点尤其适合于野外现场分析的需要。生物传感器具有选择性高、 分析速度快、操作简易、仪器价格低廉、可以进行在线甚至活体分析等 特点，因此生物传感器己在临床医学、食品工业、环境检测、和军事领 域h 引得到了广泛的应用。 2 4 1 在临床医学中的应用 廉价、快速、现场甚至在体检测是临床检验追求的目标。生物传感 器因其体积小，操作简便等特点弥补了大型仪器的不足，因而在临床医 学中应用广泛，尤其是在危重病房，手术或急诊室进行检测及病人的自 我监测。到目前为止，电流型的电化学生物传感器是一类重要的临床诊 断生物传感器己有商业化产品。测定的对象包括酶的底物，如葡萄糖、 尿素、尿酸、乳酸、胆碱、半乳糖、谷氨酸、多肽等；抗原、抗体：酶的 活性：酶抑制剂和各种药物的代谢等。 2 4 2 在食品工业中的应用 食品的组成往往比较复杂，制造过程需对某些成分进行监测，控制 产品质量。要在众多成分共存的条件下测定某一种成分，通常的方法一 般需要复杂的前处理过程。因此食品检验需要选择性好、简便、快速、 可靠的检测方法，这就为生物传感器在这一领域的应用提供了广阔的前 景。目前，生物传感器主要用于食品质量的评估及发酵过程的在线检测。 应用于食品领域的生物传感器有葡萄糖传感器、谷氨酸传感器、乙醇传 感器、乳酸传感器等h 7 1 。 1 3 华南理工大学工学硕士学位论文 2 4 3 在环境检测中的应用 环境保护问题越来越被人们所重视。环境保护需要使用快速、准确、 可靠的分析方法来检测空气、水、土壤样品中的有毒气体、有机污染物 和重金属等。生物传感器因其自身特点而成为环境检测中一种很有用的 工具，并己取得了一些成功，其应用范围还将继续扩大。自前己发表的 用于环境检测的生物传感器包括胆淄烷醇生物传感器，在水质检测中用 于测定硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、硫酸根、酚、b o d 、氰化物、m n 、农 药残留物的生物传感器等卜5 0 1 。 2 4 4 在军事领域中的应用 在军事领域，如何迅速与有效的检测环境中可能存在的化学与生 物毒剂是保证部队战斗力的重要因素之一。由于战时的特殊条件，对能 做定性及半定量现场检测的小型装备的需要就显得更为迫切。与现有的 生化战剂侦检鉴定的技术和仪器相比，生物传感器具有快速灵敏、选择 性好、无需试剂、简便易于携带等优点，是化学和生物战剂侦检技术和 仪器发展的一个重要方向。因此，生物传感器在发达国家的军事领域已 得到了充分的重视与开发。检测各种化生毒剂的生物传感器不断有报道， 其所采用的生物识别物质大多为乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶，依据毒 剂对酶活性的抑制进行定性或定量分析。 2 4 5 生物传感器在流动注射中的应用 流动注射分析与酶传感器联用可以充分利用流动注射的在线取样、 分离技术( 如渗析、过滤、超滤等) ，预先对试样进行处理，纯化基体， 减少或消除对传感器的污染，毒化或干扰作用：另一方面，也可利用流 动注射固有的自动校正基线变化的特点，或在检测过程中采用间隔一定 时间注入标准溶液的方法在线检查传感器灵敏度的变化，并加以校正， 因而极大的改善了传感器的某些分析性能，如扩大线性范围、增强抗干 扰能力、延长工作寿命、提高其实用性和可靠性等。s c h u h m a n n 等采用 顺序注入酶电极法进行生物发酵过程的监测。该系统被用于4 0h 酵母发 酵过程中葡萄糖的在线监测，每测定2 h 校正一次酶电极灵敏度。由于采 用在线校正灵敏度的方法，在酶电极灵敏度下降己超过3 0 的情况下，测 定仍可得到准确的结果。如采用较高的校正频率，甚至可以保证酶电极 在灵敏度下降近9 0 a 的情况下仍然可以继续使用。 1 4 同时结合分子电学和生物电子学，以期制作各种更灵敏的新颖的生物传 感器卜5 83 ，如： 1 )专业化的生物传感器 2 )一次性的生物传感器 3 )微型生物传感器 4 )集成式的生物传感器 5 )生物兼容性( bio c o m p a tible ) 生物传感器 6 )生物可理解的( bio a c ce ssib 1e ) 生物传感器 7 )智能化的生物传感器 2 6 本章小结 纵观生物传感器发展的历史可知，生物传感器的发展史就是固定化 技术和生物活性载体不断改进和完善的历史，固定化技术的研究就是对 固定化方法和生物活性载体的研究和开发。目前使用的固定化载体、方 法或技术存在着这样或那样的问题，难于从根本上提高生物传感器的稳 定性、选择性、灵敏度、准确度和响应速度等性能。因此，使用更简单、 更实用的新型固定化技术和性能更优异的载体材料以促进固定化生物活 性单元获得更多的实际应用仍是该领域今后研究的重要方向之一。 1 5 华南理工大学工学硕士学位论文 第三章固定化酶膜的制作探讨 3 1 本课题中酶电极设计原理 酶电极型生物传感器( 以下简称酶电极) 是一种在基础电极的敏感 面上装有生物敏感膜( 酶膜) 的传感器。其原理是：当把这种酶电极插入 待测溶液时，酶膜中发生的酶催化反应产生某种离子或气体等电极活性 物质，再由基础电极对之响应，转换成电信号，然后经过放大、处理即