（制糖工程专业论文）超声场影响大肠杆菌细胞膜通透性的研究.pdf

摘要 摘要 超声新技术的出现引起了人们的浓厚兴趣，已广泛应用于生物和医学领域， 特别在对细胞膜的影响方面成为研究热点。提高膜通透性在获取胞内产物或使胞 外大分子进入胞内方面有重要的应用意义。传统用于提高细胞膜通透性的是化学 法具有处理时间长、效率低、试剂用量大、成本高、后处理麻烦等缺点。本论文 以基因工程上常用的大肠杆菌为研究对象，研究了不同超声参数对细菌细胞膜通 透性的影响。在此基础上，对超声作用参数进行优化，选择合理的超声条件，确 定超声提高大肠杆菌细胞膜通透性的最适工艺条件。进而与化学方法进行比较。 研究中应用荧光探针法考察细胞膜通透性、膜电压，胞内活性氧( r o s ) 、游离钙 ( c a 2 + ) 的变化并且利用扫描电镜、透射电镜观察，从微观角度分析超声场提高大 肠杆菌细胞膜通透性的机理。建立超声作用大肠杆菌细胞膜变化的动力学模型。 研究表明g 变幅杆浸入式超声的功率、作用时间、间隙时间( 频率为2 5 k h z ) 对大肠杆菌膜 的通透性及生存率均有影响。对这三个参数进行三因素三水平正交实验，其结果 显示，超声的电功率、作用时间对大肠杆菌生存率的影响极显著，间隙时间对大 肠杆生存率的影响不显著；超声波的电功率、作用时间对大肠杆菌的细胞膜通透 性影响极显著，间隙时间对大肠杆菌细胞膜通透性的影响显著。影响大肠杆菌细 胞膜通透性大小先后次序为：作用时间 电功率 间隙时间。优化提高大肠杆菌 细胞膜通透性的最佳作用参数为：作用电功率为3 0 0 w 、作用时间为9 0 s 、间隙时 间为4 s 。 化学方法与超声方法比较。实验表明：化学方法可以提高细胞膜的通透性， 但是对细胞活性的影响很大，经过处理后的大肠杆菌的存活率很低。该方法提高 细胞膜通透性时用的化学试剂消耗量大、费用高，试剂残留造成环境污染，而且 后处理过程复杂，不易实现生产连续化。适当超声处理不仅可以提高细胞膜对代 谢产物的通透性，使细胞仍保持定的活性，而且操作参数易控制、目标产物易 分离、无残余毒性、与环境友好、高效、价廉、无污染、适用性强、易于实现自 动化、连续化、具有极大的应用潜力，显示出超声方法的优越性。 利用荧光探针f d a 检测来反映细胞膜通透性的变化。f d a 负载入大肠杆菌后发 出黄绿色荧光，说明利用f d a 荧光探针染色法标记可行。结果显示：在2 5 k h z 、3 0 0 w 、 9 0 s 内，荧光强度渐渐降低，9 0 s 时下降到6 6 7 ，即细胞膜通透性增加3 3 3 ，此时 细胞生存率为7 9 4 ，再随作用时间延长，f d a 明显下降，是由于细胞生存率明显下降 引起。 利用荧光探针d i b a c 。( 3 ) 检测来反映细胞膜电压的变化。d i b a c 。( 3 ) 载入大肠杆菌 华南理工大学博士学位论文 后发出亮绿荧光，利用d i b a c 。( 3 ) 荧光探针染色法标记可行。结果显示：在2 5 k h z 、3 0 0 w 、 3 0 s 一9 0 s 内荧光强度逐渐下降，9 0 s 时降为7 3 2 ，即膜电压下降2 6 8 。随着时间的延 长d i b a c 。( 3 ) 明显降低。在9 0 s 时细胞的存活率为7 9 4 。超声作用9 0 s 内后膜电压下 降，胞内外离子浓度差加大，促进了分子交换速度。超声波场引起的细胞膜电压比较 大，使得c a 2 + 内流量较大时，k + 大量外流占优势，结果导致细胞膜电压进一步超 极化，膜电压探针荧光下降。导致膜电压依赖的c a ”、n a + 以及大分子物质离子 通道都打开，膜两侧离子交流加速，即膜的通透性增加。 利用荧光探针d c f h - d a 法检测来反映胞内活性氧的变化。大肠杆菌经o c f h - d a 负 载发出绿色荧光，d c f h d a 荧光探针染色法标记可行。结果显示：经2 5 k h z 、3 0 0 w ，3 0 9 0 s 超声作用后d c f h - d a 增加，说明一定超声作用后大肠杆菌细胞内活性氧水平提高。在超 声作用的空化效应特别易产生活性氧( 包括自由基) ，使脂双分子层过氧化而有破 坏膜结构。膜变脆易穿孔，流动性也变差。r o s 水平上升导致r o s 依赖性的钙离子 通道打开，进而钙离子依赖性的其它( k + ，n a + 等) 通道也打开，膜两侧物质交流 加速，即膜通透性增加。 利用荧光探针f u r a 2 d v 法检测来反映胞内钙离子的变化。大肠杆菌经f u r a - 2 , m v l 负载后发出亮蓝色荧光，f u r a - 2 d v i 荧光探针染色法标记可行。结果显示：经2 5 k h z 、 3 0 0 w 。3 0 6 0 s 超声作用后f u r a - 2 d v i 荧光强度增加，说明一定超声作用后大肠杆菌经 胞内钙离子水平提高。r o s 水平增加，在信号传导中可导致钙高子通道打开，离子内流， 胞内钙浓度增加，实验证实胞内钙离子浓度是增加了，即膜通透性增加。 扫描电镜、透射电镜观察显示：未经超声处理的细胞结构完整，细胞核、表面光滑， 细胞膜清晰，膜没有变化，没有损伤。经2 5 k h z 、3 0 0 w 、3 0 s 超声处理后细胞形态特征 表现为细胞结构完整，细胞膜形态开始改变，细胞内部结构完整。经2 5 k h z 、3 0 0 w 、6 0 s 超声处理后细胞膜完整脂双分子层开始变模糊，经2 5 k h z 、3 0 0 w 、9 0 s 显示表面有小孔 的地方，内容物向外渗透。经3 0 0 w 、1 5 0 s 细胞膜受严重，细胞质外渗，细胞开始自溶。 经2 5 k h z 、3 0 0 w 、2 7 0 s 显示随超声处理时间的延长细胞核破裂，细胞膜破坏，细胞变成 碎片。在一定超声作用下大肠杆菌膜通透性改变和膜穿孔。超声空化产生自由基 使膜脂过氧化，因而对细胞膜产生破坏作用，使膜结构破坏、崩解而影响其通透 性。超声作后细胞膜的电特性( 电压、电导和膜电容等) 、机械特性( 膜的损伤或修 复等) 和分子运输能力( 透过膜的微粒数量等) 产生变化，使细胞膜穿孔而影响其通 透性。 运用传递理论以及质量守恒原理，建立了超声作用大肠杆菌膜变化的动力学模型： 、，k 3 t 一_ j 1 、一( k 2 + 七3 1 f k 2 t 一七l e u ，2o 丽j 叩。十丽 通过与实验结果模拟表明，该模型对膜变化过程具有很好的预测功能，能反映膜变 化的实际过程。 摘要 超声在溶液中产生空化现象，超声作用主要归结于超声的空化效应和机械效 应。促进溶质的扩散，提高了传质系数，增大了传质界面积，传质推动力变大， 从而在整体上对细胞膜通透性有增加效应。 实验检测与详细的理论探讨表明：超声可提高细胞膜通透性，主动力是超声的空化 效应及机械效应。电镜观察膜变化过程有脂双分子层变形效应、有穿孔效应。利用 所建立的拟合方程推算出超声作用提高膜的传质速率常数，进一步证实超声提高膜通透 性的机理。 本论文将新兴的超声技术应用于生物医学领域，对超声影响大肠杆菌细胞膜 通透性的因素、作用效果、与化学方法的比较、膜变化过程的动力学模型及其机 理进行系统的研究，并优化了最佳的工艺参数，对进一步深入研究物理场影响细 胞膜通透性具有重要的理论意义与实际意义。 关键词：超声场；大肠杆菌；细胞膜；通透性 i i l 华南理工大学博士学位论文 a b s t r a c t t h ee m e r g e n c eo f t h en e w - t e c hu l t r a s o u n db e c o m e sah e a t e dt o p i ce x c i t e sp u b l i ci n t e r e s t s i t i su s e di nb i o t e c h n o l o g ya n dm e d i c i n ew i d e l y , e s p e c i a l l yi nt h ee f f e c to nc e l lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y i ti so fs i g n i f i c a n ta p p l i c a t i o nt oi n c r e a s et h ep e r m e a b i l i t yo fc e l lm e m b r a n ef o r t r a n s p o r t i n gs u b s t a n c ei n s i d e o ro u t s i d et h ec e l l t h ew a d i t i o n u lm e t h o d , o fi n c r e a s i n gt h e p e r m e a b i l i t yi sc h e m i c a ln e a t i a g h o w e v e l , i th a sl o t so fd i s a d v a n t a g e ss u c ha sl o n gt i m eo f t r e a t i n g , l o we f f i c i e n c y , l a r g ed o s a g eo fc h e m i c a l s ，h i g hc o s t , u n e a s yt op o s t - t r e n ta n dd i f f i c u l t t ob eu s e dc o m m o n l y t h i st h e s i s t a k i n ge s e h e r i c h i ac o l i ( ec o i l ) a st h eo b j e c t , s t u d i e dt h ee f f e c to f d i f f e r e n t p a r a m e t e r so fu l t r a s o u n do nec o l ip e r m e a b i f i t y b a s e do nt h i s ，u l t r a s o u n dp a r a m e t e r sf o r i n c r e a s i n gt h ep e r m e a b i l i t yw e r eo p t i m i z e d , t h er e a s o n a b l et e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so f i n c r e a s i n ge c o l ip e r m e a b i l i t yb yu l t r a s o u n dw e r ei d e n t i f i e d , p a r a m e t e r so fu l t r a s o u n dw e r e c h n s e mc h e m i c a lm e t h o d sw e r ed i s c u s s e d , a n dc o m p a r e dw i t hu l l r a s u u o di r r a d i a t i o n i nt h e s t u d y , t h e a l t e r a t i o n s o f m e m b r a n e p o t e n t i a l ，i n t r a c e l l u l a r r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a n d i n t r a c e u u l a rc 矿w e r ee x a m i n e db yf l u o r e s c e n tp r o b em e t h o d , a n dt h eec o l iw a so b s e r v e db y s c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e v o f u q h e r m o r e , t h e k i n e t i cm o d e lo ft h em e m b r a n ea l t e r a t i o nb yu l t r a s o u n dt r e a t i n gw a ss e tu p t h ec o n c l u s i o n s w e r em a d ea sf o l l o w s t h eec o l im e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dv i a b i l i t yw e e f f e c t e db yd i f f e r e n tp a r a m e t e r so f p r o b eu l t r a s o u n di n c l u d i n g e l e c t r i cp o w e r , t r e a t i n gl i m ea n di n t e r v a lt i m e ( f r e q u e n c y = 2 5 k h z ) b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n to nt h et h r e ef a c t o r s ：t h ep o w e ra n dt r e a t i n gt i m eo fu l t r a s o u n d b o t hh a ds i g n i f i c a n te f f e c to nec o l iv i a b i l i t y , b u tt h ei n t e r v a lt i m eh a dn or e m a r k a b l ee f f e c t o nec o l iv i a b i l i t y t h ee l e c t r i cp o w e ra n dt r e a t i n gt i m eo f u l t r a s o u n dw a f ev e r ys i g n i f i c a n to n ec o l i sm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y , b u tt h ei n t e r v a lt i m eo f u l t r a s o u n dw a ss i g n i f i c a n to nec o l i s m e m b r a n ep e r m e a b i l i t y e f f e c t i v e n e s so fe a c hf a c t o ro nm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yb yu l t r a s o u n d w a si nt h ef o l l o w i n go r d e r ：t r e a t i n gt i m e e l e c t r i cp o w e r i n t e r v a lt i m e t h eo p t i m a l p a r a m e t e r sw e r e ：u l t r a s o u n dp o w e r3 0 0 w , t r e a t i n gt i m e 9 0 sa n di n t e r v a lt i m e4 s u n d e r t h e s ep a r a m e t e r s ，u l t r a s o u n dc o u l dn o to n l yi m p r o v et h e p e r m e a b i l i t yo fy e a s tc e l l m e m b r a n e s ，b u ta l s ok e e pa l m o s ta l lt h ec e l l sa l i v e e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tc h e m i c a lm e t h o d sh a ds e r i o u se f f e c to nt h es u r v i v a lr a t i o o fec o l ia l t h o u g ht h e yc o u l di n c r e a s ep e r m e a b i l i t yo ft h em e m b r a n e a tt h es a n l et i m e t h e yw e r en o te a s yt oo p e r a t ec o n t i n u o u s l y , a n dt h ec o s tw a sh i g h ，t h ep o s t - t r e a t i n gw a s c o m p l i c a t e d c h e m i c a lm e t h o dw a st h a tt h et o x i c a n tm e d i c i n er e m a i n e d , t r e a t m e n tt i m ew a s l o n gw i t hl o we f f i c i e n c y c o m p a r e dw i t ht h a t ，a p p r o p r i a t eu l t r a s o u n dc o u l di n c r e a s ec e l l i v a b s t r a c t m e m b r a n ep e r m e a b i l i t yw i t h o u tk i l l i n gt h ec e l l s f u r t h e r m o r e ，i t sa ne f f e c t i v e ， l o w - p r i c e d ，p o l l u t i o n - f r e e ，a p p l i c a b l e a n d e a s y - t o - a u t o m a t ew a y s o ，u l t r a s o u n d i r r a d i a t i o ns h o w e dm a n ya d v a n t a g e so v e rt r a d i t i o n a lc h e m i c a lm e t h o d s u s i n gf d a f l u o r e s c e n tp r o b et 0r e f l e c t i o nt h ea l t e r a t i o no fm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y , f d a s e n do u t k e l l yf l u o r e s c e n ta f t e rl o a d e di nec o i l , e x p l a i n i n gt h ef d a f l u o r e s c e n tp r o b e m e t h o dw 器f e a s i b l e t h er e s u l ts h o w e dt h a tf d af l u o r e s c e n tr a t i ow a sd e c r e a s e dg r a d u a l l y a r e rt r e a t m e n t 、】v i t l lu l t r a s o u n df r o m3 0st o9 0sa t3 0 0w ：a t9 0sd e c r e a s e dt o6 6 7 ，t h e m e m b r a n ep e r m e a b i l i t yi n c r e a s e d3 3 3 ，钆a n dh e r et h es u r v i v a lr a t i ow a g7 9 4 a n dt h e nf d a w a so b v i o u s l yd e c r e a s e dw h e np r o l o n g i n gt h et r e a t m e n tt i m e ，b e c a u s et h es u r v i v a lc e l lr a t i o w a s o b v i o u s l yd e c r e a s e d u s i n gd i b a c 4 ( 3 ) f l u n r e s c e n tp r o b et or e f l e c t i o nt h ea l t e r a t i o no fm e m b r a n ep o t e n t i a l ， d i b a c 4 ( 3 ) s e n to u ts h i n i n gg r e e nf l u o r e s c e n t 醯髓l o a d e di ne c o i l , e x p l a i n i n gt h ed i b a c 4 ( 3 ) f l u o r e s c e n tp r o b em e t h o dw a sf e a s i b l e t h er e s u l ts h o w e dt h a td i b a c 4 ( 3 ) d e c r e a s e dg r a d u a l l y f o rt r e a t m e n tw i t hu l t r a s o u n df r o m3 0st o9 0s ，a t3 0 0w ，d e c r e a s e dt o7 3 2 a t9 0 s , n a m e l y t h em e m b r a n ep o t e n t i a ld e c r e a s e db y2 6 8 a n dt h es u r v i v a lr a t i ow 鹳7 9 6 f u r t h e rt h e d i b a c 4 ( 3 ) f l u o r e s c e n ti n t e n s i t yw a go b v i o u s l yd e c r e a s e da f t e rp r o l o n g i n gt r e a t m e n tt i m e m e m b r a n ep o t e n t i a lc h a n g e do b v i o u s l yb yu l t r a s o u n d , i n d u c i n gl a r g ec a ri n d r a f ff a g t l ya n d l a r g ek + o u t s i d e f i n a l l ym e m b r a n ep o t e n t i a lw a sm o r ep o l a r i z a t i o n , d i b a c 4 ( 3 ) f l u o r e s c e n td e c r e a s e da n dr e s u l t e di nt h ei o nc h a n n e ld e p e n d e n tm e m b r a n ep o t e n t i a lo p e n , i o n e x c h a n g eo f m e m b r a n ea c c e l e r a t i n g , n a m e l ym e m b r a n ep e r m e a b i l i t yi n c r e a s e d u s i n gd c h 一d af l u o r e s c e n tp r o b et or e f l e c t i o nt h ea l t e r a t i o no fi n t r a c e l l u l a rr o s d c f h - - d as e n to u tg r e e nf l u o r e s c e n ta r 盯l o a d e di nec o i l , e x p l a i n i n gt h ed c f h - - d a f l u o r e s c e n tp r o em e t h o d w a gf e a s i b l e t h er e s u l ts h o w e dt h a td c f h - d ai n c r e a s e da f t e rt r e a t e d f o r9 0 s ，e x p l a i n i n gi n t r a e e l l u l a rr o sl e v e lw a gi n e r e a g e d t h er o sw o u l dc h a n g es t r u c t u r eo f m e m b r a n e ，i n d u c i n g t h a tt h el i p i d b i l a y e rw a so x i d a t e de a s i l y t o l i p i dp e r o x i d a t i o n c o n s e q u e n t l y , ec o i lm e m b r a n ew a gc h a n g e dl i q u i d i t y , w a gd e s t r o y e da n dw a go c c u r r e d p u n c h i n ge f f e c t e a s i l y , n a m e l ym e m b r a n ep e r m e a b i l i t yi n c r e a s e d u s i n gf u r a - 2 a mf l u o r e s c e n tp r o b et or e f l e c t i o nt h ea l t e r a l i o no fi n t r a e a l l u l a rc 矿十 f u r a - 2 a ms e n to u tb l u ef l u o r e s c e n ta f i c rl o a d e di nec o i l , e x p l a i n i n gt h ef u r a - 2 a m f l u o r e s c e n tm e t h o dw a sf e a s i b l e n er e s u l ts h o w e dt h a ti n t r a c c l l u l a rt c a 2 qi n c r e a s e da f t e rt h e a - e a t m e n to fu l t r a s o u n df r o m3 0st o6 0s t h ei n c r e a s i n gr o sl e v e lc o u l da c t i v a t ef r e e d o m c a l c i u ms i g n a l i n gc h a n n e l s ，o p e n i n gc a 2 + c h a n n e l s ，r e s u l t i n gc a 2 + i n d r a l ln a m e l ym e m b r a n e p e r m e a b i l i t yi n c r e a s e d u n d e rt h eo b s e r v a t i o no f t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ea n ds c a nt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e ，ec o i ? ss t r u c t u r ew a gi n t a c t , ec o i lw a l l ，c y t o p l a s md e m a r c a t i o nl i n ea n d t h el i l ：i i d v 华南理工大学博士学位论文 b i l a y e rw e r ec l e a rw r h o u tu l t r a s o u n d 仃i 组吨ec o i f ss t r u c t u r es t i l lk e p ti n t a c tb u tn u c l e o l u s b e g a nm e t a m o r p h o s i n ga r e rt h e t r e a m l e n to f u l t r a s o u n da t2 5 k h z 、3 0 0 w 、3 0s t h ec o l o ro f l i p i db i l a y e rw a sd 髓w e n e dg r a d u a n ya f t e rt h et r e a t m e n to f u l t r a s o u n df r o m6 0s t h er e v e r s i b l e a l x 省t u l ea p p e a r so nt h em e m b r a n ea n di n t r a c o l l u l a rc o n s e n ts q u i r tf r o ma p e r l r eo b v i o u s l ya f t e r t h et t e a l m e h l to fu l t r a s o u n df r o m9 0s m e m b r a n ew a sd e s m ) y e d , c y t o p l a s mb r e a ko u ta n d b e g a na n t l o y z i n ga f t e rt h et r e a l m e n to f u l t r a s o u n df r o m1 5 0s e c o i lt u r n e di n t oc h i p sa f a rt h e t r c a t m e n to f u l t r a s o u n df r o m2 7 0s t h ef u n c t i o no f u l t r a s o u n da l t e r e dec o i lp e r m e a b i l i t ya n d m e m b r a n ep u n c h i n g u l t r a s o n i cc a v i t a t i o nl e dt of l e er a d i c a la n dp e r o x i d a t i o nh a p p e n e d , c a u s i n gc e l lm e m b r a n es t r u c t u r et od e s t r o y , c o l l a p s ea n da f f e c ti t sp e r m e a b i l i t y a f i c rt h e u e a t m e n to fu l t r a s o n i cf u n c t i o n , c e l lm e m b r a n ee l e c t r i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ( r o l t a g e ，c o n d u c t i o n , m e m b r a n ec a p a c i t ya n ds 0 伪1 ) ，m e c h a n i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ( m e m b r a n ed a m a n ga n dr e p a i r ) , a n d m o l e c u l et r a n s p o r to x - n e u a t i o nm e m b r a n ec o r p u s c u l a rq u a n t i t y ) a l lc h a n g e d , t h e nt h e p e r m e a b i l i t yo f c e l lm e m b r a n ei n t h ep r o c e s so f p u n c h i n gw a se f f e e t e d t h ek i n e t i cm o d e lo fec o l im e m b r a n ea l t e r a t i o nw a sg o ta sf o l l o w s b a s e d0 1 1t r a n s f e r t h e o r ya n dp r i n c i p l eo f m a s sc o n s e r v a t i o n e ( f ) = ( 等) e - ( k 2 + k 3 ) t + 等 t h ep r e d i c t i o nr e s u l t so ft h i sm o d e lf i tt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e l l ，a n di tc o u l d p r e s e n tt h ep r a c t i c a le x t r a c t i o np r o c e s s u l t r a s o n i cc a v i t a t i o nt o o kp l a c ei ns o l v e n t s t h em e c h a n i s mo fu l t r a s o n i ce f f e e t i n gc e l l w a sm a i n l yg o i n gt ot h eu l t r a s o n i cc a v i t a t i o na n dm e c h a n i s m u l t r a s o u n da c c e l e r a t e dt h e d i f f u s i o no f s o l u t e ，i n c r e a s e dm a s sw a u s f e rc o e f f i c i e n t ，e n l a r g e dl a y e ra r e ao f m a s st r a n s f e r , a n d a l s oi n c r e a s e di t sd r i v ef o r c e , s oa c t i v a t e dm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y e x p e r i m e n t a lr e s u l t sa n dt h e o r e t i c a la n a l y s i si n d i c a t e dt h a tm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yc o u l db e i n c r e a s e db yu l t r a s o u n d , a t t r i b u t i n gt ot h eu l t r a s o n i cc a v i t a t i o na n dm e c h a n i s m t h e r ew e r e m e m b r a n em e t a m o r p h o s i n ga n dp u n c h i n ge f f e c t kw a so b t a i n e db ye q u a t i o nf o rm e m b r a n e a l t e r a t i o n , f l l r t h f f ft e s t i f y i n gt h em e c h a n i s m i nt h ed i s s e r t a t i o n , u l t r a s o n i ct e c h n i q u ew a su s e di nb i o t e c h n o l o g ya n dm e d i c i n e t r e a t i n ge c o l ie f f e e t i v e l 弘s y s t e m a t i c a l l ys t u d y i n gf a c t o r s ，e f f e c t , c o m p a r i n gw i t hc h e m i s t r ym e t h o d ， s t u d y i n gt h ek i n e t i cm o d e lo fm e m b r a n ea l t e r a t i o np r o c e s sa n di t sa c c e l e r a t e dm e c h a n i s m i t h a si m p o r t a n tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c ei n - d e p t hr e s e a r c h k e yw o r d s ：u l t r a s o u n d ；e s c h e r i c h i ac o l i ( ec o l i ) ：c e l lm e m b r a n e ；p e r m e a b i l i t y v i 符号和物理量名称 t m a x p m 缸 t m i n p m i n p g p m r 只 符号和物理量名称 瞬态空化泡崩溃最高温 度 瞬态空化泡崩溃压力 空化泡的最低温度 空化泡的最低压力 空化泡内压力 空化泡的总压力 气体绝热系数 声压幅值 p o 超临界流体环境压力 r 。泡核稳定半径 i x 流体的密度 泡核的表面张力 泡核的自然共振频率 液体的比热比 胞内渗透物浓度 胞外渗透物浓度 细胞死亡引起的渗透物 损失常数 渗透物从胞内渗出胞外 的传质速率常数 渗物从胞内渗出胞外后 又反渗回胞内的传质速 率常数 时间s 户 f七e，h b b 华南理工大学博士学位论文 e c o l i f d a r 1 2 3 d c f h d a f u r a 2 r o s d m s 0 c a 2 + l b s e m t e m e g t a t r i t o nx 1 0 0 其它符号说明 x 大肠杆菌 二乙酸荧光素 罗丹明1 2 3 二氯荧光黄双乙酸盐 荧光素 钙荧光素 活性氧 二甲基亚砜 游离钙 l u r i a - b e r t a n i 扫描电子显微镜 透射电子显微镜 乙二醇( 2 一氨基乙基) 醚四乙酸 曲拉通一1 0 0 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名尹旃沙多日期年7 月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校有权 保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被 查阅( 除在保密期内的保密论文外) ；学校可以公布学位论文的全部或部分 内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。 b 不保密。 学位论文全文电子版提交后： 口同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 本人签名： 导师签名： 日期：些型：2 ：! ! 第一章绪论 第一章绪论 1 1 大肠杆菌简介 大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) ，分类于肠杆菌科，归属 于埃希氏菌属。本课题选用的是基因工程上常用的大肠杆菌菌株d h 。a ，本菌种 无致病性。大肠杆菌菌体大小为( 0 4 0 7 ) 微米( 1 o 3 0 ) 微米，无芽孢， 有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类胞膜，革兰氏阴性杆菌。由于此菌合成 代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温 度为3 7 ，在4 2 4 4 条件下仍能生长，生长温度范围为1 5 4 6 。在普通营养 琼脂上生长表现3 种菌落形态：( 1 ) 光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿 润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。( 2 ) 粗糙型：菌落扁平、干涩、边 缘不整齐，易在生理盐水中自凝。( 3 ) 粘液型：常为含有荚膜的菌株。 此菌属兼性厌氧菌，在有氧条件下生长良好，最适生长p h 为6 8 - 8 0 ，所用 培养基p h 为7 0 - 7 5 ，若p h 值低于6 0 或高于8 0 则生长缓慢。 大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、