（发酵工程专业论文）二苯并噻吩单加氧酶催化特性及其催化吲哚合成靛类化合物的研究.pdf

山东大学博士学位论文 摘要 在生物脱硫的“4 s ”途径中，有4 个酶参与，其中二苯并噻吩单加氧酶 ( d i b e n z o t h i o p h e n em o n o o x y g e n a s e ，d s z c ) 是该途径第一个起作用的酶，连续两 步氧化二苯并噻吩( d i b e n z o t h i o p h e n e ，d b t ) 生成二苯并噻吩砜 ( d i b e n z o t h i o p h e n es u l f o n e ，d b t 0 2 ) 。d s z c 活力的发挥需要n a d h ：黄素氧化还 原酶( n a d h ：f l a v i no x i d o r e d u c t a s e ，d s z d ) 为其提供还原黄素。d s z c 和d s z d 构 成黄素依赖型双组分单加氧酶体系。d s z c 是该体系的单加氧酶组分，d s z d 是该 体系的还原酶组分。黄素依赖型双组分单加氧酶体系的单加氧酶组分一般是黄素 专一性的，一些酶专一性利用f m n h 2 ，另外一些酶则是专一性利用f a d h 2 。既 能够利用f m n h 2 又利用f a d h 2 的单加氧酶组分是非常稀少的，目前只有两个单 加氧酶组分报道有此能力。一个是a c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i i 的p 羟基苯乙酸羟化酶 ( p h y d r o x y p h e n y l a c e t a t eh y d r o x y l a s e ) 的c 2 组分，另一个是s t r e p t o m y c e s v i r i d i f a c i e n s h a v e m g 4 5 6 h f10 的异丁胺- 羟基化酶( i s o b u t y l a m i n e n - h y d r o x y l a s e ) 。d s z c 禾l j 用黄素的专一性尚未明确，该酶是否能利用f a d h 2 尚无 确切结论。此外，黄素依赖型双组分单加氧酶体系也是体内活性氧的重要来源， 过量活性氧的存在会对菌体造成毒害，因而抗氧化蛋白的表达对保持细胞内活性 氧的平衡和细胞的正常活力有重要意义。目前尚无与“4 s ”途径脱硫相关的抗氧化 蛋白的报道。生物降解和生物催化互相关联，d s z c 的底物谱不仅限于d b t 类化 合物，该酶在生物催化领域的应用潜力尚需挖掘。 本实验室长期从事生物脱有机硫的研究，筛选到多株有价值的脱硫菌株。本 文以来自一株嗜热脱硫菌m y c o b a c t e r i u mg o o d i ix 7 b 的d s z c 为研究对象，详细研 究了该单加氧酶对还原黄素利用的特点及黄素对酶活力的影响。考察了多株菌株 中脱硫基因的表达与菌体的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶表达的关系。探讨了 d s z c 在生物催化吲哚羟基化从而合成靛类化合物中应用的潜力。 从一株嗜热脱硫菌mg o o d i ix 7 b 克隆了d s z c 基因，并在大肠杆菌中大量表 达后进行纯化，获得了在s d s p a g e 电泳上表现为单一条带( 4 5k d a ) 的纯酶。 全波长扫描表明该酶在2 8 01 3 1 1 1 处有明显光吸收，在3 0 0 7 0 0n l t l 没有光吸收，说 明该酶不结合血红素或黄素。通过使用既能催化f m n 还原又能催化f a d 还原的 山东大学博士学位论文 d s z d ，证明d s z c 既能够使用f m n h 2 ，也能使用f a d h 2 作为底物催化d b t 生 成d b t 0 2 。d s z c 的活力受到黄素种类、浓度、d s z c 与d s z d 之比的影响。使用 f m n h 2 时的d s z c 比活力比使用f a d h 2 时的比活力高，无论向d s z c d 的耦联体 系中添加f m n 或f a d ，低浓度的黄素都会增强酶活力，但是高浓度的黄素强烈 抑制d s z c 的活力。在d s z c d 耦联体系发挥作用时，还原态的黄素需要从d s z d 传递到d s z c ，在这个传递过程中，还原态黄素容易被自氧化，自氧化的发生削 弱了流向d s z c 的还原态黄素，同时还原态黄素自氧化产生的大量过氧化氢会使 d s z c 和d s z d 失活，造成活力下降。提高黄素的浓度会加强这种自氧化作用， 提高d s z c 的比例在一定程度上可以缓解这种自氧化造成的活力下降，通过向 d s z c d 体系中添加过氧化氢酶及时移走过氧化氢，可以将d s z c 的活力提高一倍。 研究了原始脱硫菌株和基因工程菌株中脱硫基因表达和超氧化物歧化酶 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、过氯化氢酶( c a t a l a s e ) 表达之间的关系。分别 使用n a 2 s 0 4 、二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) 和d b t 作为唯一硫源， 考察原始脱硫菌中s o d 表达图谱的变化。在红平红球蕊r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 1 a w q 中，发现了一个和脱硫基因共同表达的超氧化物歧化酶，该诱导型酶在其 他几株缀始脱硫菌株中不存在。冒莆，还没有关于和脱硫基因共表达的s o d 的 报道。测定原始脱硫菌株和基因工程菌中过氧化氢酶活力的变化，发现脱硫基因 的异源表达会造成宿主菌窦身的过氧化氢酶活力严重下降，但是在原始脱硫菌株 中没有这种情况发生。 最近十年，研究人员己经发现了大量的黄素依赖型单加氧酶。这些单加氧酶 可以高效而专一性氧化有机化合物，而且这类氧化反应通常难以用化学方法催 化。然恧，到冒前为止，科研人员只研究了少数几种单加氧酶在催化合成中的应 用。造成这种状况的主要原因有两个：单加氧酶难以表达和分离；另一个原因就 是这些单加氧酶需要昂贵鲶n a d ( p ) h ，不麓以化学计量添加。力此，从桔草芽 孢杆菌1 6 8 菌株克隆葡萄糖脱氢酶( g l u c o s ed e h y d r o g e n a s e ，g d h ) 基因转入大 肠杆菌大量表达。利焉从大肠杆菌纯化得到的g d h 构建了n a d h 静再生体系， 经证明该体系可以代替n a d h 的直接加入，为d s z c d 耦联体系提供源源不断的 n a d h 来催纯d b t 的氧化。该项结果为d s z c 用于生物催化奠定了基础。 d s z c 可以催化吲哚生成被广泛应用的蓝色染料一靛蓝，该化合物具有重 h 山东大学博士学位论文 要的工业应用价值。以吲哚作为底物，研究了g d h 的加入和d s z c 的催化活力 之间的关系。g d h 加入量的提高可以为d s z c d 体系提供在单位时间内提供更多 的n a d h ，增强d s z c d 的表观催化能力，但是g d h 的加入量仍然需要和d s z d 的活力保持一个平衡。g d h 提供的n a d h 可以增强d s z d 的催化能力，体系中 产生了更多的f m n h 2 ，f m n h 2 固然可以增加d s z c 的活力，然而f m n h 2 的增 加也会导致其自氧化的增强，并最终导致d s z c d 催化体系活力的下降。该辅因 子再生体系的建立为利用黄素依赖型双组分单加氧酶进行体外催化奠定了基础。 全细胞催化体系可以减少还原黄素自氧化对催化活力的影响，提高催化效 率，因此研究了重组大肠杆菌全细胞催化吲哚合成靛蓝的应用潜力。将d s z d 和 d s z c 共表达可以大大提高细胞催化吲哚羟基化生成靛蓝的能力，但是在此基础 上再共表达g d h 则会削弱d s z c d 的表达，从而使细胞的催化能力下降。研究 表明，当菌体生长至指数生长中期，加入1m mi p t g ，转入2 7 继续培养8h 后收集细胞，可以得到催化能力最高的菌体。转化反应适宜在p h6 - 7 之间进行， 增高p h 会降低靛蓝产量，可能是影响了中间体向靛蓝的转化。细胞浓度对于终 产物的浓度影响较大，控制装液量为反应器体积的2 0 时，理想的细胞浓度为 o d 6 0 0 在2 0 左右。在1 4m m 范围内增加吲哚的浓度可以提高靛蓝的浓度，但是 相对于底物的转化率则在降低，更高浓度的吲哚导致靛蓝浓度降低大幅降低。这 可能是吲哚破坏细胞膜造成的，可以考虑使用有机溶剂耐受菌株作为宿主来进行 该催化反应。 在重组大肠杆菌全细胞催化引哚过程中检测到一个紫红色物质，初步鉴定为 靛玉红。靛玉红已被证明是有效的癌症治疗药物，多项研究表明该化合物在诸多 疾病的治疗中都能起到作用，因而靛玉红的规模生产具有重要意义，通过取代基 的变化，可以制作更适合药用的靛玉红类化合物。实验证明，表达d s z c 的全细 胞也能够以多种5 位取代吲哚作为底物，生成蓝色和红色化合物，推测为相应的 靛蓝和靛玉红取代物，说明d s z c 和表达d s z c 的全细胞在催化合成靛玉红类化 合物中具有很大的应用潜力。 物 关键词：二苯并噻吩单加氧酶，超氧化物歧化酶，n a d h 再生，靛类化合 i i i 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t f o u r e n z y m e sa r e i n v o l v e di nt h e b i o c a t a l y t i c d e s u l f u r i z a t i o nv i a t h e 4 s p a t h w a y d i b e n z o t h i o p h e n em o n o o x y g e n a s ei n i t i a t e s t h ed e s u l f u r i z a t i o nb y c a t a l y z i n gd i b e n z o t h i o p h e n e ( d b t ) t od i b e n z o t h i o p h e n es u l f o n e ( d b t 0 2 ) t h r o u g h t w oc o n s e c u t i v eo x i d a t i o n s d s z c r e q u i r e s a i l i n d e p e n d e n t n a d h ：f l a v i n o x i d o r e d u c t a s e ( d s z d ) t op r o v i d er e d u c e df l a v i n st os u s t a i ni t sa c t i v i t y d s z ca n d d s z dc o n s i s to faf l a v i n d e p e n d e n tt w oc o m p o n e n tm o n o o x y g e n a s es y s t e m d s z c i st h em o n o o x y g e n a s eu n i t ，a n dd s z di st h er e d u c t a s eo n e u s u a l l y t h e m o n o o x y g e n a s eu n i ti ss t r i c t l yd e p e n d e n to nf m n h 2o rf a d h 2 u n t i ln o wo n l y t w oe n z y m e sh a v eb e e nr e p o r t e dt oh a v et h i su n u s u a la b i l i t y o n ei st h ec 2 c o m p o n e n to fp - h y d r o x y p h e n y l a c e t a t eh y d r o x y l a s ef r o ma c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i i ， a n dt h eo t h e ri st h ei s o b u t y l a m i n en - h y d r o x y l a s ef r o ms t r e p t o m y c e sv i r i d i f a c i e n s h a v e m g 4 5 6 - h f10 h o w e v e r , u t i l i z a t i o no ff a d h 2b yd s z ch a sn e v e rb e e ne l u c i d a t e d c l e a r l y f l a v i nd e p e n d e n tm o n o o x y g e n a s ei so n eo ft h es o u r c e so fr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ( r o s ) o v e r p r o d u c t i o no fr o s w o u l dc a u s ed a m a g et ot h ec e l l t h e r e f o r , a n t i o x i d a n tp r o t e i n sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nk e e p i n gt h er o sa tp r o p e rl e v e l sa n d t h ec e l l sw o r kw e l l a n ya n t i o x i d a n tp r o t e i nr e l a t e dt o “4 s p a t h w a yh a sn e v e rb e e n r e p o r t e d b i o d e g r a d t i o na n db i o c a t a l y s i s i s a l w a y sr e l a t e d d s z ch a sb r o a d e r s u b s t r a t et h a nd b t s ，a n di ti sap o t e n t i a lb i o c a t a l y s ti ns y n t h e s i so fv a l u b l ep r o d u c t s b i o c a m l y t i cd e s u l f u r i z a t i o nh a sb e e ns t u d i e df o ral o n gt i m ea to u rl a b o r a t o r y , a n ds e v e r a lv a l u a b l es t r a i n sw e r ei s o l a t e d i nt h i ss t u d y , d s z cf r o mat h e r m o p h i l i c b i o d e s u l f u r i z i n gs t r a i nm y c o b a c t e r i u mg o o d i ix 7 bw a sc l o n e da n de x p r e s s e di n e s c h e r i c h i ac o l i ，a n dd s z cw a sp u r i f i e d p r e f e r e n c et or e d u c e df l a v i n sb yt h i sd s z c a n df a c t o r st h a ta f f e c t e dt h ed s z ca c t i v i t yw a sd i s c u s s e d r e l a t i o n s h i pb e t w e e n d e s u l f u r i z i n ge n z y m e se x p r e s s i o na n da n t i o x i d a n tp r o t e i n se x p r e s s i o nw a ss t u d i e d r e s e a r c hw a sa l s oc o n d u c t e dt oe s t i m a t et h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o no fd s z c ( m i c r o o r g a n i s mc o n t a i n i n go f ) i nt h eb i o c a t a l y t i cs y n t h e s i so fi n d i g o i d s p u r i f i e dd s z cs h o w e das i n g l eb a n do fa b o u t4 5k d ao nt h es d s p a g e v 山东大学博十学位论文 w a v e s c a no ft h ee n z y m es h o w e dt h a td s z ch a ds t r o n ga b s o r b a n c ea t2 8 0 啪b u tn o s p e c i f i ca b s o r b t i o ni nt h er a n g eo f3 0 0 7 0 0 姗，i n d i c a t i n gt h a tn oh e m eo rr a v i nw a s b o u n d e d a sam o n o o x y g e n a s eu n i to ft h ef l a v i n d e p e n d e n tt w o c o m p o n e n t m o n o o x y g e n a s e ，d s z ca c t i v i t y i s s i g n i f i c a n t l yd e p e n d e n to nt h er e d u c e df l a v i n s p r o v i d e db yd s z d u s i n gad s z dt h a tr e d u c e de i t h e rf m n o rf a d ，d s z cw a s p r o v e dt ob ea b l et ou t i l i z ef a d h 2 a sw e l la sf m n h 2t oc a t a l y z ed b tt od b t 0 2 。 d s z ca c t i v i t yi sd e p e n d e n to nt h et y p ea n dc o n c e n t r a t i o no ft h er a v i n ，a n dt h er a t i oo f d s z ct od s z d d s z cw a sm u c hm o r ea c t i v ew i t hf m n h 2t h a nt h a tw i t hf a d h 2 。 e i t h e rf l a v i na tl o wc o n c e n t r a t i o ns t i m u l a t e st h ed s z ca c t i v i t yb u ta th i g h c o n c e n t r a t i o n si n h i b i t st h ea c t i v i t yo fd s z cd u et ot h ea u t o c a t a l y t i co x i d a t i o no f r e d u c e df l a v i n s a u t o o x i d a t i o nd e p r e s s e dt h ef l o wo fr e d u c e dr a v i nt od s z c ，a n d h y d r o g e np e r o x i d ef o r m e dd u e t ot h ea u t o o x i d a t i o n ，w h i c hc a u s e dt h ei n a c t i v a t i o no f d s z ca n dd s z da n dl e dt ot h ed e c r e a s ei nd s z ca c t i v i t y t h ea u t o o x i d a t i o nw a s e n h a n c e dw h e nf l a v i n sc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d ，a n dr e l e a s e db yt h ei n c r e a s eo fd s z c a m o u n ti nt h ed s z c ds y s t e m a d d i t i o no fc a t a l a s ed e s t r u c t e dh 2 0 2a ss o o na si t f o r m e da n dt h u si n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo fd s z c 。 r e l a t i o n s h i p sb e t w e e ne x p r e s s i o n so fd e s u l f u r i z i n ge n z y m e sa n dt h ea n t i o x i d a n t p r o t e i n sw e r ei n v e s t i g a t e di nb o t hw i l dt y p e so fd e s u l f u r i z i n gs t r a i n sa n de n g i n e e r i n g s t r a i n s u s i n gu n d e n a t u r i n gg e le l e c t r o p h o r e s i sa n da c t i v es t a i n i n g ，as u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) i n d u c e db yd b t o rd i m e t h y ls u l f o x i d ew a sf o rt h ef i r s tt i m e d i s c o v e r e di nr h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s1a w q e x p r e s s i o no fd e s u l f u r i z i n gg e n e si n h e t e r o g e n e o u se n g i n e e r i n gs t r a i n sw o u l d c a u s eas e r i o u sd e c r e a s ei nc a t a l a s ea c t i v i t y ； s u c hp h e n o m e n o nw a sn o to b s e r v e di nt h ew i l ds t r a i n s a l t h o u g h m o r ea n d m o r er a v i nd e p e n d e n tm o n o o x y g e n a s eh a v eb e e n d i s c o v e r e di nt h ep a s td e c a d e ，s e l d o mo ft h e mw a sa p p l i e di nt h eb i o c a t a l y t i c s y n t h e s i so fv a l u a b l ec o m p o u n d st h a tw e r eh a r dt oo b t a i nw i t ht r a d i t i o n a l l yc h e m i c a l c a t a l y s t s t w oo b s t a c l e se x i s to nt h ew a yt oe x p l o r es c a l e d - u pp r o d u c t i o nb yt h e f l a v i nd e p e n d e n tm o n o o x y g e n a s e f i r s t , m o n o o x y g e n a s ei su s u a l l yd i f f i c u l tt o e x p r e s sa n dp u r i f y , a n ds e c o n d ，e x p e n s i v ec o f a c t o r so fn a d ( p ) h i sr e q u i r e dt od r i v e t h er e a c t i o n ，a n ds t o i c h e m s i t r o i ca d d i t i o no ft h e s ec o f a c t o r sa r en o te c o n o m i c a l v i 山东大学博士学位论文 g l u c o s ed e h y d r o g e n a s e ( g d h ) g e n ew a sc l o n e df r o mb a c i l l u ss u b t i l i ss u b s p s u b t i l 西 s t r 16 8a n dt r a n s f e r r e dt oe c o l if o ro v e r e x p r e s s i o n u s i n gg d hp u r i f i e df r o mt h e e n g i n e e r e de c o l i as y s t e mf o rr e g e n e r a t i o no fn a d hw a sc o n s t r u c t e d i tc o u l d p r o v i d en a d hc o n t i n u o u s l yt ot h ed s z c dc o u p l i n gr e a c t i o nt oc a t a l y z ed b t t o d b t 0 2 e f f e c to fg d ho nt h ed s z ca c t i v i t yw a si n v e s t i g a t e dw i t hi n d o l ea st h e s u b s t r a t eo fd s z c i n c r e a s eo fd s z cp r o v i d e dm o r en a d ht od s z c d ，h e n c e d s z c da c t i v i t yw a se n h a n c e d h o w e v e r , g d hs h o u l db ek e p ta tap r o p e rr a t i ot o d s z d d s z da c t i v i t yc a nb ee l e v a t e db yn a d hs u p p l y , a n dt h u sm o r ef m n h 2i s f o r m e d a sd e s c r i b e dp r e v i o u s l y , e x c e s s i v ef m n h 2w o u l di n e v i t a b l yl e a dt o d e c r e a s eo fd s z c da c t i v i t y y i e l do fi n d i g of r o mi n d o l ew a si m p r o v e dw h e nw h o l ec e l l so fr e c o m b i n a n te c o l iw e r eu s e di n s t e a do fi s o l a t e de n z y m e s ，i nw h i c hc a s et h ea u t o o x d i a t i o no f r e d u c e df l a v i n sw a sd e p r e s s e dg r e a t l y c o - e x p r e s s i o n o fd s z da n dd s z c s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo ft h eb i o c a t a l y s t s ，b u tf u r t h e rc o - e x p r e s s i o no f g d hl e dt oad e c r e a s ei nt h ey i e l do fi n d i g o i tc o u l db ea t t r i b u t e dt ot h a tt h eo v e r e x p r e s s i o no fg d h m a d eas h a r pd e c r e a s ei nt h ee x p r e s s i o no fd s z ca n dd s z d w h e nt h ec e l l sg r e wt ot h ee x p o n e n t i a lp h a s e ，1m mi p t gw a sa d d e da n dt h ec e l l s w e r ef u r t h e ri n d u c e da t2 7 f o r8h t h eb i o t r a n s f o r m t i o nw a sc a r r i e do u ta tp h 6 7 ；h i g h e rp hw o u l dr e d u c et h ei n d i g op r o d u c t i o n c e l ld e n s i t yh a da no b v i o u s e f f e c to nt h ep r o d u c t i o n ；a no p t i m i z e dc e l ld e n s i t yw a so d 6 0 0a ta b o u t2 0w h e nt h e r e a c t i o nv o l u m ew a so n ef i f t ho ft h et o t a lv o l u m e i nt h er a n g eo f1 - 4m m ，i n c r e a s e o fi n d o l ec o n c e n t r a t i o nl e dt oi n d i g op r o d u c t i o ni n c r e a s e ，b u tt h ey i e l do fp r o d u c tt o s u b s t r a t ed e c r e a s e d h i g h e ri n d o l ec o n c e n t r a t i o nt h a n4m md e c r e a s e dt h ef i n a l c o n c e n t r a t i o no fi n d i g o ，w h i c hw a sp o s s i b l yd u et ot h ec e l lt o x i c i t yo fi n d o l e a p i n kc o m p o u n dw a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e da si n i r u b i n ，w h i c hw a sp r o v e da sa l l e f f e c t i v ea n t ic a n c e rd r u g ，a n dm i g h tb ea p p l i e di nt h et h e r a p e u t i c so fs e v e r a ld i s e a s e s w h o l ec e l l se x p r e s s i n gd s z ca l s oc o u l dc a t a l y z ev a r i o u ss u b s t i t u t e di n d o l ea tt h ec 一5 s i t et of o r mt h eb l u ea n dp i n kc o m p o u n d s ，a s s u m e dt ob ed e r i v a t i v e so fi n d i g oa n d i n d i r b i n i ts u g g e s t e dt h a td s z c ( w h o l em i c r o o r g a n i s mc o n t a i n i n g0 0h a dg r e a t p o t e n t i a li nt h ep r o d u c t i o no fv a r i o u sv a l u a b l ei n d i g o i d s i 山东大学博十学位论文 k e yw o r d s ：d i b e n z o t h i o p h e n em o n o o x y g e n a s e ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e s ，r e g e n e r a t i o n o fn a d h ，i n d i g o i d 山东大学博士学位论文 缩略表 a b t s 2 , 2 - a z i n o - b i s ( 3 一e t h y l b e n z t h i a z o l i n e 6 s u 2 , 2 连氮基- 双一( 3 一乙基苯并二 d a d d b t d b t 0 2 d s z d s z c d s z d f a d f a d h ， f m n f m f n h 2 g d h h p l c h r p i p t g n a d n a d h n b t p c r p m s f r o s s o d t l c l p h o n i ca c i d ) 氢噻唑啉- 6 一磺酸) 二铵盐 d i o d e a r r a yd e t e c t o r二极管阵列检测器 d i b e n z o t h i o p h e n e d i b e n z o t h i o p h e n es u l f o n e d e s u l f u r i z a t i o n 二苯并噻吩 二苯并噻吩砜 脱硫 d i b e n z o t h i o p h e n em o n o o x y g e n a s e二苯并噻吩单加氧酶 n a d h ：f l a v i no x i d o r e d u c t a s e f l a v i na d e n o s i n ed i n u c l e o t i d e r e d u c e df l a v i na d e n o s i n ed i n u c l e o t i d e f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e r e d u c e df l a v i nm o n o n u c l e o t i d e g l u c o s ed e h y d r o g e n a s e h j 曲p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h o r s er a d d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y l 一1 3 一d 一1 - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 1 3 - n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e n 如h ：素氧化还原酶 黄素腺嘌呤二核苷酸 还原态黄素腺嘌呤二核苷酸 黄素单核苷酸 还原态黄素单核苷酸 葡萄糖脱氢酶 高压液相色谱 辣根过氧化物酶 异丙基1 3d 硫代半乳糖苷 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 1 3 - n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ，还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷 r e d u c e d n i t r o t r e t r a z o l i u mb l u ec h l o r i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 酸 氯化硝基四氮唑蓝 聚合酶链式反应 苯甲基磺酰氟 活性氧 超氧化物歧化酶 薄层层析色谱 i x 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：蕉曩庭 日 渺艿、i 、l 乙 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盔堕导师签名：日期：望堕2 山东大学博士学位论文 第一章前言 1 1 黄素依赖型双组分单加氧酶简介 黄素依赖型双组分单加氧酶广泛参与了生物荧光发生( l e ie ta 1 1 9 9 4 ；l e ie t a 1 2 0 0 5 ；l ie ta 1 2 0 0 6 ) ，抗生素合成( b l a n ce ta 1 1 9 9 5 ；h o j a t ie ta 1 2 0 0 2 ；k e n d r e w e ta 1 1 9 9 5 ；m a r t i n e z c o s t ae ta 1 1 9 9 9 ；p a r r ye ta 1 1 9 9 7 ；r u d da n dh o p w o o d1 9 8 0 ； t h i b a u te ta 1 19 9 5 ) 和d n a 合成( e l i a s s o ne ta 1 19 9 2 ；l o u i ee ta 1 2 0 0 2 ；n i v i 6 r ee t a 1 ，1 9 9 9 ) 等生物代谢过程，此外，该类酶在一些污染物，包括乙二胺四乙酸钠 ( t e t r a s o d i u me t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t a t e e d t a ) ( w i t s c h e le ta 1 19 9 7 ) 、次氮基 三乙酸( n i t r i l o t r i a c e t a t e ，n t a ) ( e i c h h o me ta 1 1 9 9 9 ) 、偶氮类染料( c h e ne ta 1 2 0 0 5 ；d e l l e re ta 1 2 0 0 6 ) 和4 一羟基苯乙酸( 4 一h y d r o x y p h e n y l a c e t a t e ) ( g a l f i ne ta 1 2 0 0 0 ；k e r t e s ze ta 1 1 9 9 9 ) 等的生物降解过程中起重要的作用。 图l 黄素依赖型双组分单加氧酶催化反应的概图 f i g 1 s c h e m eo f r e a c t i o nc a t a l y z e db yf l a v i nd e p e n d e n tt w o c o m p o n e n tm o n o o x y g e n a s e 山东大学博士学位论文 与黄素依赖型单组分单加氧酶不同，黄素依赖型双组分单加氧酶的还原酶组 分和氧化酶组分豳两个或更多的基因分别转录，表达为两个互相独立的蛋白。这 两个组分在功能上相互配合( g a l 缸e ta 1 2 0 0 0 ) ，完成图1 所示的催化过程( b a l l o u e ta 1 2 0 0 5 ) 。首先，还原酶组分催化电子供体的电子转移给黄素，生成还原态