（发酵工程专业论文）l苏氨酸发酵过程优化.pdf

本人 研究成果 集体已经 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月日 专利权声明 一 ， 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打“”) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密“请在方框内打“ ) 。 作者签名：甚- 免屯 导师签名： 日期：矽? 年仁月 日 日期：年月日 摘要 本文以代谢工程理论为指导，重点研究了l 苏氨酸高产菌发酵条件的优化。主要 研究内容和结果如下： ( 1 ) 研究了t r f c 高产菌株的摇瓶发酵条件。应用单因素试验、正交实验和响应 面设计等方法对种子培养基和发酵培养基进行优化，并对种子培养条件和发酵条件进 行了研究。在优化条件下，t r f c 菌株摇瓶补料分批发酵4 8 小时，l 苏氨酸达5 1 9 9 9 l 。 ( 2 ) 根据代谢计量分析、途经分析理论，对l 苏氨酸高产菌在稳态时发酵生产l 苏氨酸进行了代谢计量分析及途径分析，提出了l 苏氨酸合成的总生物量、能量平衡 方程和最佳代谢途径、理论转化率8 6 ，为进一步发酵研究提供理论指导。 ( 3 ) 在1 0 l 发酵罐补料分批发酵试验中，确定了补料分批发酵生产l - 苏氨酸的最 佳条件：初糖浓度7 0 9 l 、p h 维持在7 1 、流加方式为脉冲流加补料。研究了分阶段 供氧控制方式对发酵过程的影响。最佳的溶氧控制方式o 1 2 h 溶氧3 0 ，1 2 3 8 h 溶氧 5 0 ，3 8 - 4 2 h 溶氧2 0 。在最佳条件下补料分批发酵4 2 小时，可产l 苏氨酸1 0 7 4 7 9 l 。 ( 4 ) 研究了酵母抽提物及甜菜碱添加对发酵过程的影响。确定了酵母抽提物最佳 流加浓度为2 9 l ，最佳流加方式为2 4 - 4 0 小时脉冲恒速连续流加，甜菜碱最佳添加浓 度为5 0 。 ，j j ( 5 ) 在不同温度下，进行发酵试验，提出并验证了l 苏氨酸发酵的变温控制最佳 模式为0 1 2 h 、3 7 ；1 2 2 4 h 、3 9 ；2 4 - 4 0 h 、3 9 。j o ：，： ( 6 ) 研究了l 苏氨酸的分离提取工艺。采用金属膜过滤方法，在6 0 、操作压力 0 5 m p a 条件下对发酵液进行处理，并采用粉末活性炭常温下进行脱色、强酸性阳离 子树脂交换提取，l m o f l 氨水作为洗脱剂以4 5 倍体积h 的流速进行洗脱。l _ 苏氨酸 提取率最高达8 1 8 5 。： 关键词：l 苏氨酸；代谢工程；补料分批发酵；途径分析 a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n , t h ed i s s e r t a t i o nf o c u s e so n t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fl - t h r e o n i n ep r o d u c i n gs t r a i n t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t s a n dr e s u l t sa r ea sb e l l o w s ： ( 1 ) t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fs t r a i nt r f ci ns h a k i n gf l a s k si ss t u d i e di nt h i s d i s s e r t a t i o n t h ep r o p o r t i o n so fs e e dm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nm e d i u ma r eo p t i m i z e db y o r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n ta n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i so fs a ss o f t w a r e t h es e e d c u l t u r ec o n d i t i o n sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r ea l s os t u d i e d i nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n , t h el - t h r e o n i n ep r o d u c t i o na c h i e v e s51 9 9 9 la f t e rf e r m e n t a t i o nf o r4 8h o u r s ( 2 ) a c c o r d i n gt ot h es t o i c h i o m e t r i ca n a l y s i sa n dp a t h w a ya n a l y s i s ，t h e r ea r en e a r l yt h e b e s tp a t h w a yo fl t h r e o n i n eb i o s y n t h e s i sa n dt h ee q u a t i o nb e t w e e nb i o m a s sa n de n e r g y , b o t ho fw h i c hc o n t r i b u t et ob et h e o r e t i c a ls u p p o r t i n gf o rt h ep u r p o s eo fo p t i m i z i n gt h e f e r m e n t a t i o np r o g r e s s t h et h e o r e t i c a lr a t e sa c h i e v e s8 6 。，、： ( 3 ) t h e10 一l i t e rf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o ni ss t u d i e da c c o r d i n gt ot h ed e t e r m i n e do p t i m u n a , c o n d i t i o no fb a t c hf e r m e n t a t i o n ：i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e7 0 9 l ；p h7 1 ；a d d i t i o n a l m o d eo fc o n t i n u o u si n p o u r i n g t h ed i s s o l v e do x y g e nc o n t r o l l i n gm o d ei st h a t0 - 1 2 h o u r s 3 0 ；1 2 - 3 8 h o u r s5 0 ；3 8 - 4 2 h o u r s2 0 t h el - t h r e o n i n ep r o d u c t i o na c h i e v e s1 0 7 4 7 9 l a f t e rf e r m e n t a t i o nf o r4 2h o u r s ：i ： ( 4 ) a na d d i t i o no fy e a s te x t r a c ta n du l t r a f i l t r a t i o na r es u r e l yi m p o r t a n tr o l e sc o n d u c i v et o e n h a n c et h ep r o d u c t i o n t h ec o n c e n t r a t i o n sa n da d d i t i o n a lm e t h o d so fy e a s te x t r a g t , t h a ti s 2 9 lb e t w e e n2 4h o u r sa n d4 0h o u r s ，a r eu l t i m a t e l yd e t e r m i n e df a c t o r sb yf e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t s f u r t h e r , a d d i t i o n a l u l t r a _ f i l t r a t i o nc o n c e n t r a t i o ni s a l s o e s t i m a t e d 5 ( 5 ) t h ed i f f e r e n t i a lt e m p e r a t u r e - s h i f tc o n t r o lm o d e l s ，t h a ti s o 12 h o u r s 3 9 c ；2 4 - 4 0 h o u r s3 9 c ，a r es u p p o s e da n dl a t e rt e s t i f i e db ye x p e r i m e n t s 一， 3 7 c ；1 2 2 4 h o u r s , ( 6 ) t h ep r o t e i ni nb r o t hi sr e m o v e db ym e t a lm e m b r a n ei n6 0 a n d0 5 a a c t i v e c a r b o na s s u m em e r e l yc r u c i a lf a c t o ri nd i s c o l o r i n gp r o g r e s s ，p o s i t i v ei o nr e s i ni n ， l - t h r e o n i n ee x t r a c t i n g a m m o n i as o l u t i o ni su s e da se l u t i o nr e a g e n t ，m a i n t a i n i n g c o n c e n t r a t i o nlm o l la n df l o wr a t e4 5t i m e sv o l u m e h o u r t h ee x t r a c t i n gr a t i oo f l - t h r e o n i n ea c h i e v e s81 8 5 k e y w o r d s ：l - t h r e o n i n e ，m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ，f e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n ，p a t h w a ya n a l y s i s 1 1 1 1 3 l 苏氨酸的测定方法 1 3 1 纸层析法 1 3 2 高效液相色谱法 1 4 l 苏氨酸生产方法 2 2 1 4 1 蛋白质水解提取法 1 4 2 化学合成法 3 3 1 4 3 微生物发酵法 1 5 l 苏氨酸的生物合成途径 1 6 代谢工程在工广苏氨酸发酵生产中的运用 1 6 1 途径分析理论 1 6 2 代谢流分析理论 1 6 3 代谢工程理论指导下的l 苏氨酸基因工程菌的构建 1 6 4 苏氨酸操纵子 1 7 l 苏氨酸的发酵过程控制优化 1 7 1 发酵过程的理论分析 1 7 2 发酵过程的优化 1 8 l 苏氨酸的分离提取 。7 1 9 l - 苏氨酸国内外生产概况 9 1 1 0 论文立题背景及主要研究内容：1 4 2 材料与方法 2 1 实验材料1 4 2 1 1 菌种。1 4 2 1 2 主要仪器1 4 2 1 3 主要试剂1 5 2 1 4 培养基1 6 2 1 5 相关溶液1 7 2 2 方法1 8 2 2 1 发酵液预处理 2 2 2 发酵液中i ，苏氨酸的定性定量测定方法 2 2 3 培养方法 2 2 4 分析测定方法 1 8 2 0 2 2 5 l - 苏氨酸分离提取 3 结果与讨论 3 1 i ，苏氨酸摇瓶发酵条件研究 3 1 1 种子培养基的优化 2 0 2 1 3 1 2 种子培养条件研究。 3 1 3 发酵培养基的优化： 3 1 4 发酵培养条件的优化 3 1 5 优化条件与初始条件的比较 3 1 6 摇瓶补料分批发酵过程曲线 3 2 l - 苏氨酸发酵理论分析 3 2 1 i 广苏氨酸发酵代谢计量分析 3 2 2 l 苏氨酸生物合成途径分析 2 4 2 6 3 0 3 5 3 8 3 8 3 8 3 8 4 1 3 3 l 广苏氨酸1 0 l 发酵罐补料分批发酵研究。 3 3 1 初糖浓度对l 苏氨酸发酵的影响 3 3 2 不同流加方式 4 4 4 4 3 3 3 酵母抽提物流加对l 苏氨酸发酵的影响 3 3 4 温度控制模式对l 广苏氨酸发酵的影响 3 3 5 葡萄糖酸钠对l 苏氨酸发酵的影响 4 5 3 3 6 甜菜碱对i ，苏氨酸发酵的影响 3 3 7 无机盐对i ，苏氨酸发酵的影响 3 3 8 p h 对l 苏氨酸发酵的影响 4 9 3 3 9 溶氧对l 苏氨酸发酵的影响。 3 3 1 0 发酵罐补料分批发酵过程曲线的绘制。 3 4 i 厂苏氨酸提取工艺研究 3 4 1 l 苏氨酸提取工艺的提出 3 4 2 金属膜过滤 3 4 3 发酵液的脱色 3 4 4 等电结晶 3 4 5 离子交换树脂对l 苏氨酸的交换吸附 3 4 6 小结 4 结论 5 7 5 7 4 1 研究了菌株t r f c 的摇瓶发酵条件 6 1 6 2 9 o 1 1 3 4 4 4 6 钞卯n n船弘舛舛铂 4 2 l - 苏氨酸发酵代谢计量分析、途径分析6 2 4 3 在i o l 发酵罐规模进行了补料分批发酵的研究。6 2 4 4 l 苏氨酸提取工艺研究6 3 5 展望6 4 6 参考文献6 5 7 研究生期间论文发表情况7 1 8 豸【谢。7 2 i i i 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1l 一苏氨酸的理化性质 苏氨酸( t h r e o n i n e ) 化学名称为伍一氨基一d 一羟基丁酸，19 3 5 年由w c r o s e 在纤维蛋 白水解物中分离和鉴定出来。1 9 3 6 年，m e g e r 对它的空间结构进行了研究，因结构与 苏糖相似，故将其命名为苏氨酸。苏氨酸有4 种异构体，天然存在并对机体有生理作 用的是l 一苏氨酸【2 1 。其化学结构式为： 其理化性质如下： 化学名 分子式 相对分子质量 熔点 比旋光度 颜色 晶系日日力专 呈 味性 解离常数 等 电 点 溶 解度 o h 毗一出一c h i 二c o o hc n h 2 h n h 2 图1 1l 一苏氨酸结构式 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo f l t h r e o n i n e o h 口- 氨基一p 一羟基丁酸 c 4 h 9 n 0 3 1 1 9 1 2 2 5 5 2 5 6 【a 】d 2 0 _ 2 5 o 至2 9 0 。( 5 m o l lh c i ) 白色晶体或结晶性粉末 无色针状结晶 微甜 p k c o o n = 2 1 5 , p k n l - 1 2 = 9 1 2 p i ( 2 5 c ) - - 5 6 4 每1 0 0 克水中：2 0 9 ( 2 5 c ) ，不溶于乙醇、乙醚、 氯仿等有机溶剂 1 2l 一苏氨酸用途 在人体和动物所需的八种必需氨基酸中，苏氨酸是仅次于蛋氨酸、赖氨酸、色氨 酸的第四种氨基酸【3 】。苏氨酸在人的生长发育中发挥越来越重要的作用，被广泛应用 于食品业、饲养业、以及医疗等方面。 1 2 1 在食品方面的应用 在食品方面，由于当前食品加工度高、生产量大、保存期长、流通领域广，营养 素容易受到破坏和损失，需要加以补充。因此，食品强化剂在食品工业中的重要性日 益突出，氨基酸类强化剂在食品强化剂生产中占有重要的地位。苏氨酸是重要的食品 l 前言 之一，添加于食品中，可提高蛋白质的营养价值，使食品营养成分更加充足合 氨酸与葡萄糖共热可产生焦香味，有增香作用。一般与其他氨基酸合并用于强 ，有时也用于糕点、乳儿食品、牛奶中，起抗氧化作用【4 】。 在饲料方面的应用。 饲料添加剂方面，苏氨酸和赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸一起列为四大饲料添加剂， 于末成年仔猪和家禽等。苏氨酸是畜禽饲料中的重要元素，在畜禽饲料中添加 苏氨酸，能提高饲料蛋白质的生物学价值，平衡各种氨基酸，促进蛋白质沉积，降低 动物氨的排泄，减轻环境污染，改善饲养条件f 5 】。 1 2 3 在医药方面的应用 苏氨酸在医药行业中的应用也十分广泛，其铁盐可作抗贫血药，可用于配置氨基 酸输液和综合氨基酸制剂，同时其自身还具有促进人体发育和抗脂肪肝的药用疗效， 也是制造高效抗生素单酰胺菌素的中间体，以及用于生化研究。在临床上苏氨酸还具 有提高免疫的功能：苏氨酸有促进骨髓t 淋巴细胞前体分化发育成为成熟t 淋巴细胞的 作用。苏氨酸是谷蛋白中第二限制性氨基酸，它的分子结构中含有羟基，对人体皮肤 有保湿作用。在膜蛋白中苏氨酸的羟基能与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用。 此外，苏氨酸代谢生成甘氨酸，提供一碳单位【6 】。 + 另外，苏氨酸是1 1 种、1 4 种、1 7 种、1 8 种、2 0 种氨基酸大输液的主要成分之一。 氨基酸大输液常用于手术前后、创伤、烧伤、骨折、营养不良、慢性消耗性疾病等的 辅助治疗，是临床用量很大的品种 7 1 。 j - 1 3l 一苏氨酸的测定方法 目前，l 苏氨酸的测定方法主要有纸层析法【8 叫和高效液相色谱法【埘。 。： 1 3 1 纸层析法 纸层析法是以滤纸为惰性支持物，利用各种物质不同的分配系数，使混合物随流 动相通过固定相时予以分离的方法。由于其设备简单、价廉、所需样品少、操作方便、 分辨能力一般能达到要求等优点而被广泛采用。在l 苏氨酸的分析中，展开剂常用“正 丁醇：甲酸：水= 4 5 ：9 ：6 一，先用o 5 茚三酮丙酮溶液喷雾显色，色斑显出后根据 色斑r f 值定性。 1 3 2 高效液相色谱法 高效液相色谱的特点是采用长而细的层析柱，柱内填充物的粒度较细，在3 0 1 0 0 k g c m 2 的高压下操作，具有灵敏( 可测至 5 6 4 时，苏氨酸的羧基离解，带负电荷，呈阴离 子状态，能被阴离子交换树脂交换吸附。当p h 酵母粉 蔗糖 硫酸镁，其中蔗糖、硫酸铵和酵母粉高度显著。由实验结果确定的各因素的最优水平 为a 2 b i c i d 2 ，即：蔗糖2 0 9 l ，硫酸铵1 5 9 l ，酵母粉2 9 l ，硫酸镁1 0 9 l 。因此， 最佳种子培养基配方确定为( g l ) - 蔗糖2 0 ，州h 4 ) 2 s 0 41 5 ，k h 2 p 0 4 3 h 2 01 0 ，m g s 0 4 1 0 ，酵母粉2 ，l i l e0 0 2 5 ，链霉素5 0 g n 1 l 。 3 1 1 2 试验数据的回归分析+ | j 、。j 。一 图3 1 正交试验设计直观分析图 f i g 3 - lv i s u a l i z e dd i a g r a mo fo r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t 3 1 1 3 验证试验 表3 3 验证实验结果 t a b l e3 - 3r e s u l t so fi d e n t i f i c a t i o ne x p e r i m e n t 为验证并确认正交实验所确定的最佳条件和计算结果，按最佳条件进行了验证试 验，结果见表3 3 。平均产酸量为2 9 1 9 l ，实验获得了比较理想的结果。 3 7 0 5 8 9 2 l l o 6 l 5 8 9 2 l l 7 l 3 5 9 9 2 l l 2 4 6 5 8 8 2 l l 2 3 l 3 l 2 l 2 3 3 3 3 烈复扣伯侣住伯8 6 2 o 3 结果与讨论 3 1 2 种子培养条件研究 对于种子培养来说，p h 、转速、温度等摇瓶培养条件都应尽可能地控制在菌体生 长的最适范围内。为此，将不同p h 、转速、温度等条件下培养的种子，按相同的接 种量接入同成分的发酵培养基中，根据菌体生长状况及发酵产酸水平，选择并确定最 佳种子培养条件。 3 1 2 1 种子培养温度对l 一苏氨酸发酵的影响 微生物的生长和目的产物的合成都是在各种复杂酶系的催化下进行的，而温度对 于酶催化微生物各种代谢反应的生物活性及反应速率具有重要作用，并直接影响代谢 流量分配。虽然从酶促反应动力学来看，温度升高，酶促反应速度加快，生长繁殖快， 但温度越高，酶失活越快，菌体易于衰老，影响产物生成，且不同酶或酶系催化反应 的最适温度不同，因而必须寻求并确定微生物生长及产酸的最适温度。结果如图3 2 所示。 图3 - 2 温度对l 一苏氨酸发酵的影响 f i g 3 - 2e f f e c to fs e e db yd i f f e r e n tt e m p e r a t u r eo ns e e dg r o w t ha n dl - t h r e o n i n ef e r m e n t a t i o n 由图3 2 可知，分别于3 l 、3 4 c 、3 7 ( 2 、3 9 c 、4 1 振荡培养( 2 0 0 r m i n ) ，转 接发酵培养基进行发酵试验，结果表明：较低( 3 1 ) 和较高( 4 3 1 2 ) 的温度均不利 于菌体生长和产酸，t r f c 菌株的种子培养最适温度为3 7 1 2 。 3 1 2 2 种子培养初始p h 对l - 苏氨酸发酵的影响 微生物的生长及产物的形成必须进行多种多样的酶催化反应，p h 的变化会引起 各种酶活力的改变，对菌体形态和代谢途径影响很大。因此，p h 是影响细胞及产物 形成的重要环境因素【6 1 】。种子培养基的不同初始p h 值对种子生长及产酸的影响如图 3 3 所示。 由图3 - 3 条件。 3 1 2 3 溶氧 溶氧是种子生长的重要影响因素。测定了溶氧对种子生长的影响，结果如图3 - 4 所示。 图3 - 4 溶氧对菌体生长的影响 f i g 3 - 4e f f e c to fd i s s o l v e do x y g e no ng r o w t ho ft r f c 由图3 4 可知，3 0 溶氧是种子培养过程中佳条件，种子o d 达到1 1 2 。过高或 过低的溶氧均不利于菌体的生长及保持活性。通过调节转速、通风量等手段维持溶氧 水平。 3 结果与讨论 3 1 2 4 摇瓶种子生长曲线 在最佳种子条件下，绘制菌体生长曲线，结果如图3 5 所示。 图3 5 摇瓶种子生长曲线 f i g 3 - 5g r o w t hc u r v eo fs t r a i nt r f c 从图3 5 可以看出，培养6 h 后进入对数生长期，2 2 h 结束对数生长，转入稳定期。 3 1 2 5 种龄对l - 苏氨酸发酵的影响 分别将7 h 、1 0 h 、1 2 , h 、1 4 h 、1 7 h 和2 0 h 不同种龄的种子转接至发酵培养基中， 3 7 1 2 、2 0 0 r m i n 振荡培养4 8 h ，试验结果如图3 - 6 所示。 + o d 嘲 t i m e ( h ) 图3 _ 6 种龄对菌体生长和发酵的影响 f i g 3 - 6e f f e c to f s e e dc u l t u r i n gt i m e 0 1 1s e e dg r o w t ha n df e r m e n t a t i o n 由图3 - 6 可知，菌体培养时间、种子的活力是发酵生产的关键。由图3 6 结果可以 看 由 龄 f i g 3 - 7s e c dc o n f i g u r a t i o no f 14 h 从图3 7 可以看出，1 2 h 时菌体形态均匀一致，呈短杆状分布，生长的同步性 较好。 3 1 2 6 接种量对l - 苏氨酸发酵的影响 种子接种量的大小对发酵结果影响较大。接种量太小，菌体增长缓慢，培养时间 长，发酵周期延长。接种量过大，虽然缩短了菌体生长的时间，但菌种易衰老，也不 利于发酵产酸。适宜的接种量，保证了适当的发酵周期，及较高的发酵产酸水平【6 4 j 。 因此，进行了不同接种量的发酵试验，将种龄为1 2 h 的种子按不同接种量接入发酵培 养基中进行发酵实验，结果如图3 - 8 所示。 4 0 3 5 3 3 0 言2 5 ：2 0 o 皇1 5 土1 0 5 o 5 7l o i n o c u l a t e dv o l u l e ( 薯) 图3 8 接种量对l - 苏氨酸发酵的影响 f i g 3 - 8e f f e c to fi n o c u l a t e dv o l u m eo nl - t h r e o n i n e f e r m e n t a t i o n 3 结果与讨论 由图3 8 可知，当接种量为5 时，l 苏氨酸产量最高，接种量太大和太小对发 酵都对产酸不利，因此最佳接种量应为5 。 3 1 3 发酵培养基的优化 3 1 3 1 碳源对l 一苏氨酸发酵的影响 分别在发酵培养基中添加5 0 9 l 的不同碳源，考察对l 一苏氨酸产量的影响， 摇瓶发酵2 4 h ，其结果如表3 4 所示。 表3 _ 4 不同碳源对l 苏氨酸产量的影响 t - a b l e3 - 4e f r e c to fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e so nl t h r e o n i n e 由表3 _ 4 可以看出，使用蔗糖作为唯一碳源，l 苏氨酸产量较高。由于葡萄糖作 为碳源，渗透压过高，抑制菌体的正常生长代谢，且造成了副产物乙酸等的生成及 t c a 无效循环【6 5 1 。蔗糖是二糖，分解为葡萄糖和果糖，而被菌体利用，由于对细胞 膜渗透压相对较低，且使代谢流缓慢通过糖酵解途径，大量进入苏氨酸合成代谢途径， 因此成为最佳发酵碳源。 3 1 3 2 碳源混合比例对l 一苏氨酸发酵的影响 以葡萄糖和蔗糖按不同比例混合作为碳源进行l 一苏氨酸发酵试验，结果如表 3 5 所示。 表3 5 不同比例碳源混合添加对l 苏氨酸产量的影响 t f l b l e3 5e f f - e c to fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e sm i x t u r es c a l eo ni - t h r e o n i n e 蔗糖葡萄糖比例 l - 苏氨酸产量( g l ) 蔗糖 4 ：l 3 ：1 2 ：l 2 3 5 2 5 7 1 7 1 1 1 3 如3 5 表所示，以4 ：1 的比例添加葡萄糖有助于发酵前期，微生物迅速利用葡萄 糖合成生长所需的初级代谢产物及生长因子。因此，按4 ：1 比例混合碳源为l 苏氨酸 的发酵培养基碳源最优结果。 3 1 3 3 氮源对l 一苏氨酸发酵的影响 、 氮源对于微生物的生长相当重要。采用硫酸铵、醋酸铵、氯化铵、玉米浆、豆饼 水解液作为氮源进行发酵试验，结果如表3 - 6 所示。 豆饼水解液 3 1 40 7 7 0 由表3 - 6 所示，硫酸铵作为氮源，菌体生长和产酸均达到最优效果。有机氮源 为菌体生长提供必需的氮源及生长因子，且产酸水平接近最优结果，但大部分生长 因子都可由菌体自身代谢合成，与硫酸铵相比，不能迅速促进刺激菌体生长，积累 菌体达到高产酸，且后期分离提取困难。虽然醋酸铵、氯化铵也可为菌体提供n h + ， 但硫酸铵中s 0 2 是菌体合成甲硫氨酸、半胱氨酸等细胞组成物质及辅酶因子，如辅 酶a 、焦磷酸硫胺素、硫辛酸等合成，以维持正常代谢的重要物质。因此选择硫酸 铵作为发酵氮源m 侧。 3 1 3 4 响应面分析法摇瓶发酵培养基优化试验 响应面分析( r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，r s a ) e 7 0 - 7 4 j 是b o x 及其合作者于2 0 世纪5 0 年代创立的一种优化试验条件的数学统计方法。每个因素取3 个水平，以( 1 ，0 ，+ 1 ) 编码。根据相应的实验表进行实验后，对数据进行二次回归，得到一定水平范围内的 响应面，最后分析响应面，求出最优值。在此基础上用响应面分析试验法来寻找上述 3 个因素( 自变量) 的最优浓度水平，以l 苏氨酸产量( g l ) 为响应值，对应于因变量y 。 影响l 苏氨酸产量的重要因素是碳源、氮源和磷盐。因此把糖、硫酸铵、磷酸二 氢钾作为试验考察的主要因素。响应面分析因素水平及结果分别见表3 7 、表3 8 。 表3 - 7 试验因素水平表( g l ) t a b l e3 - 7t a b l eo ft e s tf a c t o r sa n dl e v e l so fr e s p o n ds u r f a c ea n a l y s i s 3 结果与讨论 3 6 6 2 6 4 3 2 1 2 4 4 4 2 7 4 0 6 3 8 6 3 6 6 3 2 5 3 0 1 2 8 4 2 6 4 4 0 6 3 6 6 3 4 5 2 6 4 3 2 2 2 8 4 3 0 。7 2 4 4 4 2 7 3 8 6 3 6 6 3 2 7 4 4 3 4 4 2 4 3 8 s a s 分析的结果，经整理后如表3 - 9 。根据b o x b e h n k e n 的中心组和设计原理4 因素各取3 水平，设计了4 因素3 水平共2 7 组响应面分析实验，中心值重复3 次。 所得数据分析见表，可见一次项、二次项对y 有显著影响，交叉项用一定影响；数据 中没有异常点，不需引入更高次的项，模型恰当。 o o o 0 0 0 l d 0 0 0 0 0 0 0 o 0 d d o 0 0 0 o o 0 d d 0 o 0 0 dd以0 l o o o 0 o 0 0 以以o 0 0 o 0 o o 0以以0 o 0 o 0 0 0 0 o 以0 0 o 0 o 0 d o o o 0 0 0 o o o 0 o o o 2 3 4 5 6 7 8 9 m 他 b m ：2 怕 掩 侉 加 射 挖 筋 m 笱 弱 卯 天津科技大学硕士学位论文 表3 - 9 回归方程方差分析 t a b l e3 - 9a n a l y s i so fv a r i a n c ef o rr e g r e s s i o nm o d e l 方差来源自由度 偏差平方和平均偏差平方和f 值p r f x l x 2 x 3 ) ( 4 x 1 2 x l x 2 x i x 3 x 1 ) ( 4 x 2 2 x 2 x 3 x 2 ) ( 4 x 3 x 3 x 3 x 4 ) ( 4 2 m o d e l ( 模型) 一次项 二次项 交叉项 误差- 失拟项 纯误差 13 3 4 8 5 0 23 3 4 8 5 0 29 8 8 3 2 0 6 0 0 0 8 4 7 3 1 1 7 7 1 3 5 81 7 7 1 3 5 85 2 2 8 2 1 6 0 0 0 0 l 17 5 3 4 1 37 5 3 4 1 3 2 2 2 3 7 2 l0 0 0 0 5 0 1 2 1 4 3 0 4 12 1 4 3 0 4 l 6 3 2 5 2 5 20 0 2 7 1 5 7 1 6 8 8 1 5 4 46 8 8 1 5 4 42 0 3 1 1 0 90 0 0 0 l 11 0 0 4 5 5l l - 0 0 4 5 5l0 2 9 6 4 9 60 5 9 6 0 61 i1 0 0 4 5 5l1 0 0 4 5 5l 0 2 9 6 4 9 60 5 9 6 0 61 l 3 1 6 e 3 03 1 6 e - 3 09 3 1 e - 3 ll l11 2 5 4 6 911 2 5 4 6 93 3 2 l8 5 5 0 0 0 0 l l 4 0 1 8 2 0 24 0 1 8 2 0 21 1 8 5 9 8 50 2 9 7 5 2 8 l 1 2 6 e 2 91 2 6 e - 2 93 7 3 e - 3 01 1 8 9 3 3 0 68 9 3 3 0 62 6 3 6 6 20 0 0 0 2 4 7 1 0001 1 2 9 1 6 9 1 72 9 1 6 9 1 78 6 0 9 3 70 0 1 2 5 0 7 1 4 1 0 2 4 1 5 87 3 1 5 4 1 42 1 5 9 1 6 7 0 0 0 0 l 43 0 7 3 9 2 47 6 8 4 8 0 9 2 2 6 8 1 9 40 0 0 0 l 4710 7 3 7 9l7 7 6 8 4 5 5 2 4 4 4 0 80 0 0 0 l 66 0 2 7 3 0l 1 0 0 4 5 50 2 9 6 4 9 60 9 2 7 0 0 6 l2 4 0 6 5 6 8 73 3 8 8 0 7 3 1 04 0 5 1 6 94 0 5 1 6 95 7 8 8 1 2 8 0 0 1 7 0 9 9 20 1 4 0 0 7 所有项 2 6 1 0 6 4 8 1 5 建立的回归方程为： y = 4 4 1 1 6 7 0 4 5 5 x i 3 8 4 2 0 4 5 x 2 2 5 0 5 6 8 2 x 3 1 3 3 6 3 6 4 x 4 - 1 1 3 5 9 0 9 x 1 上+ o 5 0 1 1 3 6 x i x 2 0 5 0 1 1 3 6 x l x 3 + 8 8 8 e 1 6 x l x 4 - 4 5 9 3 7 5 x 2 2 - 1 0 0 2 2 7 3 x 2 x 3 + 1 7 8 e - 1 5 x 2 x 4 - 4 0 9 2 6 1 4 x 3 2 2 3 3 8 6 3 6 x 4 2 模型可信度分析见表3 1 0 ，其中复相关系数为0 9 1 7 3 ，且可信度0 8 0 3 3 ，模型 拟和度良好。 3 结果与讨论 。一 表3 1 0 模型可信度分析 t a b l e3 10f i ts t a t i s t i c sf o ry 名称预估模型 m e a n 均值 r - s q u a r e 复相关系数平方 a d j r - s q u a r e 复相关系数 r m s e 模型误差的平方根 c v 变异系数 3 4 1 5 1 5 2 0 9 6 1 8 0 9 1 7 3 1 8 4 0 6 7 2 5 3 8 9 7 2 2 响应面分析的立体图和等高线图见图3 - 9 图3 1 1 。 _ - i i m _ , 0i i r i - e- i i i m 蚪- | i i i m l - 0 图3 - 9 葡萄糖和硫酸镁的响应面立体图和等高线 f i g 3 - 9g l u c o s ea n d b i t t e rs a l t e rc u b i cg r a p ha n dc o n t o u rl i n eg r a p ho f r e s p o n s es u r f a c e i i 啊- 0 _ - 0 图3 1 0 硫酸铵和磷酸二氢钾的响应面立体图和等高线 f i g 3 - 1 0a m m o n i u ms u l f a t ea n dp o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t ec u b i cg r a p ha n dc o n t o u rl i n eg r a p ho f r e s p o n s es u r f a c e 天津科技大学硕士学位论文 图3 1 1 葡萄糖和硫酸铵的响应面立体图和等高线 f i g 3 - 11g l u c o s ea n da m m o n i u ms u l f a t ec u b i cg r a p ha n dc o n t o u rl i n eg r a p ho f r e s p o n s es u r f a c e 由图3 - 9 至图3 1 l 可以看出x l 、x 2 、x 3 和x 4 存在极值点。由响应面规范分析可 知，4 个主要因素的最佳水平值，分别为葡萄糖7 0 9 l ，硫酸镁1 3 9 l ，磷酸二氢钾 2 4 9 l ，硫酸铵2 3 6 9 l ，最高产量4 5 4 9 l 。 表3 1 l 响应面的规范分析 t a b l e3 i12c a n o n i c a la n a l y s i so fr e s p o n s es u r f a c ef o rh i s t i d i n ep r o d u c t i o n 根据实际应用情况，分别取5 组实验进行了验证试验，摇瓶发酵4 8 h 的结果列于 表3 1 2 。 表3 - 1 2 验证试验结果 t a b l e3 1 2r e s u l t so f p r o o f t e s t 表3 1 2 结果表明，由回归方程所得出的最高产酸量的预测值与验证实验的平均值 很接近，说明回归方程能够比较真实地反映各筛选因素对l 苏氨酸发酵产酸的影响， 对于发酵条件的研究具有较强的指导意义。 3 1 4 发酵培养条件的优化 对于发酵培养条件来说，与种子培养不同，p h 、通风量、温度等培养条件都应尽 可能的控制在最适于菌体产酸、积累l 苏氨酸的范围内。在参考相关研究资料的基础 上，对发酵培养条件进行优化。 3 1 4 1 温度对l 一苏氨酸发酵的影响 温度对l 苏氨酸发酵发酵前期菌体的生长及发酵中后期产酸发酵的影响主要表 3 结果与讨论 现在。因此设置不同的温度，考察t r f c 菌株的最适发酵温度，试验结果如图3 1 2 所示。 3 l3 43 74 04 3 t ( ) 一l - 苏氨酸( g l ) - - * - - o d 1 2 1 0 8 g 0 6 古 o o 4 0 2 o 图3 - 1 2 温度对l - 苏氨酸发酵的影响 f i g 3 - 12 e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nl - t h r e o n i n ef e r m e n t a t i o n