（发酵工程专业论文）乳糖发酵短杆菌发酵生产l异亮氨酸控制策略的研究.pdf

摘要 摘要 l 一异亮氨酸足人体必需的八种氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，是合成 人体激素、酶类的蝣i 料，具有促进蛋门质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中 起着重要作j t j 1 i 。l 片亮氨酸现已被广泛运于生物医药、组织工程、光化学、电化学、 食品工业、化妆t i 等领域1 2 , 3j ，在国外，还将其大量用于乳牛催乳以及饲料添加剂【4 j ，以 及将l 一异亮氨睃添j j i l 到饮料中尘产功能饮料等【5 j 。 本论义以。株能在胞外大量积累l 一异亮氨酸的乳糖发酵短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m a c t o l o r m e n t a t i o 脚为生产菌株，以l 一异亮氨酸的高产量，高得率和高生产强度为目标， 对l 一异亮氦酸n 勺发酵过程进- j 二了一系列的优化。主要研究结果如下： l 研究了溶氧埘b r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t a t i o n 分批发酵生产l 一异亮氨酸( 1 i e ) 的影 响，提出了自订1 2h 恒7 0 0r m i n 以维持溶氧在3 5 以上，1 2h 后调至6 0 0r m i n 以 维持溶氧在1 5 2 0 的两阶段供氧控制模式。与对照相比，获得了较高的产率( 0 0 9 4 g ) 和糖耗速度( 4 7 6g l h ) ，在较短时问内( 5 6h ) 获得较高的i l e 产量( 2 3 3 l ) ， 比单一搅拌转速( 6 0 0r m i n ) 时的产量提高了1 1 6 。生产强度( 0 4 4 8g l h ) 比 恒定搅拌转速( 5 0 0 、6 0 0 、7 0 0 、8 0 0r m i n ) 控制下的过程分别提高了8 3 6 、2 8 7 、4 4 9 、3 5 7 。为了确定溶氧分阶段和p h 分阶段相结合的控制方式是否可以 提高异亮氨酸的产量，对不同的控制模式进行了比较，结果表明，溶氧与p h 相结合 的控制效果并非简单加和性，溶氧分阶段与恒定p h7 2 的控制方式更适合异亮氨酸 的生产，在5 2h 时产量达到2 3 9 l 。 2 不同初始葡萄糖浓度下，细胞生长和异亮氨酸的合成具有显著差异：较高的初始葡 萄糖浓度( 1 4 0g l ) 可延长细胞生长持续时间，但降低了异亮氨酸对葡萄糖得率( o 。1 3 1 曲；较低的初始葡萄糖浓度( 1 0 0g l ) 能提高异亮氨酸的得率( 0 1 4 8g l ) ；通过分批 补料流加不同量的葡萄糖，合适的补糖( 6 0g l ) 可以延长菌体的生长时间，提高菌体 的浓度( o d 5 6 2 为1 2 7 3 ) ，增加异亮氨酸的产量( 2 3 l ) ，但过高和过低的补糖量的异亮 氨酸生产强度较低；通过恒定速率流加可以有效控制菌体浓度，避免菌体生长过盛， 使最终碳流较多流向异亮氨酸产量( 2 4 5 l ) ，并得到较高得率( o 1 5 4g 曲。在上述分 析基础上，提出了恒速流加策略：当残糖浓度低于1 5 l 时，控制恒定流速3 3 3 g l - i h ，补糖量为6 0g l 。 3 研究了不同温度下b i a c t o f e r m e n t a t i o n 对异亮氨酸分批发酵的影响，综合分析发酵过 程各动力学参数，得到异亮氨酸分批发酵的最佳温度控制策略：在发酵初始阶段( 0 1 2 h ) 发酵温度控制在3 1 以维持较高的菌体生长速率和异亮氨酸合成速率；发酵中期 ( 1 3 - 4 8h ) 将发酵温度降到2 8 ( 2 以获得代谢流强化和细胞衰亡之间的最佳平衡；发酵 后期( 4 9h 后) 维持2 6 c 直至发酵结束。采用这一最佳温度控制轨迹，异亮氨酸产 量( 2 7 7g l ) 、对葡萄糖产率( o 7 8g g ) 矛h 生产强度( 0 4 6 2g l h ) 则分别提高了1 1 3 、 21 9 j f t ll8 8 。并对不同温度及温度三阶段控制方式下异亮氨酸生物合成代谢网络 的通最分布进行分析，发现低温时通过t c a 循环的代谢流量减少，流向副产物氨基 酸的流量增加。随着温度的升高，通过t c a 循环的代谢流增加，流向副产物氨基酸 的最减少。但温度过高又会造成t c a 途径的流量过大，流向l 异亮氨酸的流量减少， 导致异亮氨酸的产量不高。三阶段温度转速控制时，更多的碳通量流向e m p 途径和 t c a 循环，经过a s a 进入t h r 的碳通量也相应有所增加，直接导致了流向异亮氨酸 的碳通量的增加，进而提高了异亮氨酸的产量( 提高幅度达1 1 3 ) 。 关键词：异亮氨酸，b r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t a t i o n ，溶氧，p h ，温度，代谢通量 a b s t r a c t a b s t r a c t l - i s o l e u c i n e ( i l e ) i so n eo ft h et h r e eb r a n c h e dc h a i na m i n oa c i d st h a ta r ee s s e n t ia lt o h u m a n i ti so n eo ft h ei m p o r t a n ta m i n oa c i d st os y n t h e s i z es o m eh o r m o n e sa n de n z y m e s 1 i ec a ne n h a n c et h ep r o t e i ni n t e g r a t i o na n di n h i b i tt h ep r o t e i nf r o md e g r a d a t i o n 【2 j | i l ea l s o p l a y sav e r yi m p o r t a n tr o l ei nh u m a nl i f e i l eh a sb e e nw i d e l yu s e da sa d d i c t i v ei nb i o l o g i c a l m e d i c i n e ，s t r u c t u r i n gp r o j e c t ，p h o t o c h e m i s t r y , e l e c t r o c h e m i s t r y , f o o di n d u s t r ya n dc o s m e t i c s 【4 刊i ti sa l s ob eu s e da sf e e da d d i c t i v e 【7 】a n da d d e dt of u n c t i o n a lb e v e r a 2 e f 8 1 i i lt h i s p 印e r , t h eb r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t a t i o ns t r a i nw a su s e dt op r o d u c e l - i s o l e u c i n e as e r i e so ff e a s i b l ea p p r o a c h e so rs t r a t e g i e sw e r ec a r r i e do u tt oa c h i e v eh i g h p r o d u c tc o n c e n t r a t i o n ，h i g hy i e l da n dh i g hp r o d u c t i v i t yo fi s o l e u c i n ei nt h eo p t i m i z a t i o no f b 1 a c t o f e r m e n t a t i o nc u l t i v a t i o np r o c e s s e s 。i n c l u d i n g ： 1 n ee f f e c to fd i s s o l v e do x y g e na n dp ho nl i s o l e u c i n ep r o d u c t i o nb yb r e v i b a c t e r i u m l a c t o f e r m e n t a t i o nw a si n v e s t i g a t e di nb a t c hf e r m e n t a t i o np r o c e s s ，at w o s t a g ea g i t a t i o ns p e e d c o n t r o ls t r a t e g yw a sd e v e l o p e d ，i nw h i c ht h ea g i t a t i o ns p e e dw a sc o n t r o l l e da t7 0 0r m i ni n t h ef i r s t1 2ht oa c h i e v ead ol e v e lo f u pt o3 5 a n dt h e ns w i t c h e dt o6 0 0r m i na f t e r1 2ht o m a i n t a i nad ol e v e la t15 - 2 0 ar e l a t i v eh i g h p r o d u c t i v i t y ( 0 0 9 4e g g ) a n dg l u c o s e c o n s u m p t i o nv e l o c i t y ( 4 7 6g l - l h 1 ) w e r eg a i n e d ，t h eh i g hi s o l e u c i n ep r o d u c t i o n ( 2 3 3 l ) w a sa c h i e v e di nar e l a t i v es h o r tt i m e ( 5 6h ) ，w h i c hw a si n c r e a s e db y1 1 6 c o m p a r e dt ot h e s i n g l ea g i t a t i o ns p e e d ，a n dt h ei s o l e u c i n ep r o d u c t i v i t yr e s p e c t i v e l yi n c r e a s e db y8 3 6 、2 8 7 、4 4 。9 、3 5 7 i no r d e rt om a k es u r ew h e t h e rt h ec o m b i n a t i o no fd oa n dp hc o n t r o lc a n b o o s tt h ep r o d u c t i o nb yam u t u a le f f e c t ，d i f f e r e n tc o n t r o lm o d e sw e r ec o n d u c t e d ，b a s e do nt h e d a t ao b t a i n e df r o mt h et w o s t a g ea g i t a t i o ns p e e dc o n t r o ls t r a t e g ya n dt h ea n a l y s i so fk i n e t i c s p a r a m e t e r sa td i f f e r e n tp hv a l u e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o d eo fc o m b i n i n gt w o s t a g e d ow i t hc o n s t a n tp h 7 2c o n t r o ls t r a t e g yw a st h eo p t i m a l ，t h ei s o l e u c i n ep r o d u c t i o nr e a c h e d 2 3 9 罾l 2 u n d e rd i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s e ，t h ec e l l g r o w t ha n dt h ei s o l e u c i n e p r o d u c t i o nw e r ed i f f e r e n c e ：t h eh i g h e rt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e ( 14 0g um a y e v e n t u a l l ye n h a n c et h ed u r a t i o no fc e l lg r o w t h ，b u ti s o l e u c i n er e d u c e dt h ey i e l do fg l u c o s e ( o 13l g ) ；t h el o w e rt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e ( 10 0g l ) c a ni m p r o v et h e i s o l e u c i n ey i e l d ( o 14 8g l ) ；t h r o u g hf e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw i t ha n a p p r o p r i a t e c o m p l e m e n to fg l u c o s e ( 6 0g l ) m a y b ei m p r o v ec e l lc o n c e n t r a t i o n ( o d 5 6 2w a s1 2 7 3 ) ，a n d i n c r e a s ei s o l e u c i n ep r o d u c t i o n ( 2 3g l ) h o w e v e r , t o oh i 曲a n dt o ol o wa m o u n to fg l u c o s e w e r en o tg o o df o ri s o l e u c i n es y n t h e s i s ac o n s t a n tf l o wr a t ec a ne f f e c t i v e l yc o n t r o lb a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o nt oa v o i de x c e s s i v ec e l lg r o w t hs ot h a te v e n t u a l l yi m p r o v ei s o l e u c i n ep r o d u c t i o n ( 2 4 5g l ) a n dh i g h e ry i e l d ( o 15 4 曲o nt h eb a s i so ft h ea b o v ea n a l y s i s ，ac o n s t a n tf l o w s t r a t e g yw a sc a r r i e do u t ：w h e nt h er e s i d u a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a sl e s st h a n15g l ，t h e c o n s t a n tf l o wr a t eo f 3 3g l - 1 h w a sc o n t r o l l e dt ot h ee n do f f e r m e n t a t i o n a b s t r a c t 3 t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，v a r i e df r o m2 6 t o3 4 ，o np r o d u c t i o no fi s o l e u c i n ew a s i n v e s t i g a t e d b a s e do nk i n e t i cp a r a m e t e r sa n a l y s i s ，at e m p e r a t u r e s h i f t i n gs t r a t e g y w a s p r o p o s e d ，i nw h i c h ，a t0 - 1 2h ，c u l t u r ew a sp e r f o r m e da t31 t oo b t a i nah i g hs p e c i f i cc e l l g r o w t hr a t e ，a n d12hl a t e r ，t h et e m p e r a t u r ew a sd e c r e a s e ds t e pb ys t e pf r o m3 l t o2 8 。ct o k e e pah i g hi s o l e u c i n ep r o d u c t i o nr a t e ，a n dt h e ns w i t c h e dt e m p e r a t u r e t o2 6 。cu n t i lt h ee n d a h i 曲c o n c e n t r a t i o n ( 2 7 7g l ) ，y i e l d ( 0 7 8g g ) a n dp r o d u c t i v i t y ( 0 4 7 5 - j ( l h ) ) o fi s o l e u c i n e w e r ea c h i e v e db ya p p l y i n gt h i ss t r a t e g y w h i c hw e r e1 1 3 、21 9 a n dl8 8 h i g h e rt h a n b a t c hf e r m e n t a t i o nw i t hc o n s t a n tt e m p e r a t u r e31 r e s p e c t i v e l y s t u d i e do nt h ei s o l e u c i n e b i o s y n t h e s i sm e t a b o l i cf l u xu n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ，w i t ht o o l o wt e m p e r a t u r e ，t h e m e t a b o l i cf l u xt ot c ac y c l ew o u l dr e d u c ew h i l et h em e t a b o l i cf l u xt ob y p r o d u c t sw o u l d i n c r e a s e w i t ht h ei n c r e a s i n go ft e m p e r a t u r e t h em e t a b o l i cf l u xt ot c a c y c l ew i l li n c r e a s e w h i l et h em e t a b o l i cf l u xt ob y p r o d u c t sw o u l dd e c r e a s e b u tt o oh i g hd o ，t h em e t a b o l i cf l d x t oi s o l e u c i n ew o u l db ef e wa st h em e t a b i o l i cf l u xt ot c ac y c l ew a sa b u n d a n t t h et h r e e s t a g e t e m p e r a t u r ec o n t r o ls t r a t e g yc a nl e dm o r ec a r b o nf l o wt ot h ee m pa n dt c ac y c l ew h i c h w o u l di n c r e a s em e t a b o l i cf l u xt oi s o l e u c i n ea n di m p r o v et h ei s o l e u c i n ep r o d u c t i o n ( i n c r e a s e d b y “3 ) k e y w o r d s ：i s o l e u c i n e ，b 1 a c t o f e r m e n t a t i o n ，a g i t a t i o ns p e e d ，p h ，t e m p e r a t u r e ，m e t a b o l i cf l u x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 叠盘坚 日 期：2 塑幺厶垒翌 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：鸟耋：垒导师签名：工舀f 萤砖 e l 期：洫仝6 ，趁 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 1 9 0 1 年，f i s c h e r 在由蛋白水解液分离的亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸更大 的物质，此为有关l 异亮氨酸的最早报道【6 j 。l 异亮氨酸，化学名为伊甲基a 氨基戊酸， 由于在反位和罗位具有两个不对称的碳原子，因而存在d 、l 、d 别、l 别四种旋光异 构体，自然界中主要为l 异亮氨酸7 加】。研究表明，其余三种均无营养价值1 。此外， l 异亮氨酸是人体八种必需氨摹酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，在人体的生长 代谢中占有十分重要的地位，若人体中长期缺乏异亮氨酸，可影响到机体的生理机能， 导致代谢紊乱、机体抵抗力下降等【1 2 13 1 。 1 2l 异亮氨酸的性质及用途 1 2 1l 异亮氨酸的理化性质 名称：l - 异亮氨酸 相对分子质量：1 3 1 1 7 分子式：c 6 h 1 3 n 0 2 比旋光度：【q 2 0 d _ + 4 1 1 ( 6 m o l l h c l ，c = 4 ) ，温度系数：o 0 9 熔点：2 8 5 2 8 6 ( 分解) 结晶形状：从乙醇中结晶，白色菱形叶片或片状晶 溶解性：溶于水，难容于乙醇、乙醚，几乎不溶于其他有机溶剂，在水中的溶解度 随着温度的升高而增大( 从0 * c 时的3 7 7 1 0 0g 水上升到1 0 0 时的8 2 5 影l o og 水) 。 1 2 2l 异亮氨酸的用途 哺乳动物体本身不能合成l 一异亮氨酸，所以，作为人体必需的8 种氨基酸之一，成年 人每天需要从外界摄取2 0m g k g ( 体重) 的l 一异亮氨酸。l 一异亮氨酸是合成人体激素、酶 类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用， 因此，在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。其用途如表1 1 所示。 表1 1l 异亮氨酸( 盐) 及其衍生物的用途 t a b l el 一1a p p l i c a t i o no fl i s o l e u c i n ea n di t sd e r i v a t i v e s 用途示例 医药工业 食品、饲料 工业 化妆品 配制各种复合氨基酸制剂，除营养型氨基酸输液外，特别应用j ：高支链氨基酸 输液( t f l 3 h 输液等) 及口服液( 如肼安干糖浆等) ，对维持人、婴儿、儿童的生长 发育有重要作用，对治疗肝昏迷、肾脏病、肌肉萎缩等症有显著疗效【5 1 4 】。 为营养增补剂添加于缺乏l 异亮氨酸的食品中，以提高其营养价值；近年来， 异亮氨酸还普遍应用于能量氨基酸饮料之中【l 列：在国外，还将其人量用于乳牛 催乳以及饲料添加剂【i4 。 l 一异亮氨酸等氨基酸和高级脂肪酸制成的表面活性剂、抗凶剂具有毒性低、刺 激小、柔软、抗静电、杀菌等性能，用丁制成护肤品、护发剂等化妆品【l5 1 。 江南人学硕十学何论文 1 3l 异亮氨酸的生产方法 l 异亮氨酸生产方法有提取法、合成法和生物发酵法三类。提取法是应用离子交换 技术从混合氨基酸中分离l 异亮氨酸，分离效率高，提取操作简单，生，虹j 上j 期短，f | 足 成本高且不易提取分离，没有应用于现代化大工业生产【i6 | 。 合成法主要有化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，但足由于异亮氨酸4 ：a 位和p 位具有两个不对称碳原子，且存在这四种旋光异构体，故很难廉价制造纯度i ：矗的 l 异亮氨酸，大多数合成法所得均为外消旋体，须经外消旋拆分，生产成本高，反应复 杂，步骤多，且有许多副产物。但近年来，通过甘氨酸酯s c h i f f 碱衍生物羟基化反应， 合成q 氨基酸的研究工作引人注目。以甘氨酸为原料，与无水乙醇及氯化亚砜作川， 制得甘氨酸乙醋盐酸盐。再在二氯甲烷介质中，与三乙胺、苯甲醛反应生成苯亚甲氨琏 乙酸乙酯( 以下简称s c h i f f 碱) 。再采用微波辐射，相转移催化技术，使苯亚甲氨雏乙酸 乙酯与仲溴丁烷形成烷基化产物。酸性水解，分离纯化后得片亮氨酸。合成的异亮氨酸 产率为5 6 2 ，纯品产率为2 3 7 ，纯度为8 9 1 。采用6m o l l 盐酸代替稀、浓豁酸历 步水解法，简化烷基化物后处理步骤，使该合成法具备工业应用前景1 1 7 j 。 微生物发酵法生产l 异亮氨酸具有原料成本低，反应条件温和、环境污染较小及易 实现大规模生产等优点，故目前在工业生产上被广泛实施【l 引。生物发酵法包括添加前体 物发酵法和直接发酵法等。添加前体物发酵法，又称微生物转化法。是以葡萄糖作为发 酵碳源、能源，再添加以氨基丁酸、a 羟基丁酸、口酮基丁酸租r ) 苏氨酸等前体物质， 经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸 1 9 垅j ，由于前体物质稀少且价格昂贵，目前已 很少被采用。直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定 微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调 节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。国内外大多数厂家 均采用直接发酵法生产l 异亮氨酸。目前，国内尚处于研究与小规模生产阶段，菌株产 酸水平不高，生产水平和产量远不能e _ , 碉, q 4 - 足市场需求。因此，以微生物发酵法生产l 异亮 氨酸的研究具有重要的意义。 1 4l 异亮氨酸的发酵过程优化 1 4 1 营养环境的优化 研究发现，发酵培养基的成分和配比是决定菌体代谢的主要因素，对异亮氨酸的产量 及提取收率有很大的影响【2 3 1 。葡萄糖是最常见、最主要的碳源，糖蜜、仅溴丁酸等也可 作为碳源。仅氨基丁酸、a 羧基丁酸、d ，l 苏氨酸、仅酮丁耐2 4 】常作为发酵前体物。氮 源般以硫酸铵、尿素等为无机氮源，玉米浆、豆饼水解液等作为有机氮源。异亮氨酸 产生菌大都是葡萄糖缺陷型，因此，培养基中加入适量的v h 、v b l 等葡萄糖，可提高产量。 而磷酸盐的加入有利于代谢流转化，强化电子传递系统，使n a d ( p ) h 生成和消耗更快。 金属离子如镁离子、锰离子和钾离子是作为某些酶的激活剂【2 5 】；铁离子是细胞色素、细 胞色素氧化酶、过氧化氢酶的活性基的组成成分；钠离子则在培养基中起调节渗透压的 作用，因此适量浓度的金属离子在异亮氨酸生物生产中有着重要的作用。 2 第一学绪论 1 4 2 发酵条件的优化 微生物发酵的牛产水平不仪取决于，i - j 汜i 辇i l t 本身的性能，而且还要赋予合适的环境 条件才能充分发挥出发菌株对日标产物的乍产能川2 6 j 。冈此必须通过各种研究方法以了 解有关生产菌种对培养环境( 如温度、p h 、溶解氧等) 的要求，为合理的生产工艺的提 出和实现提供理论依据，同时为了掌握随干巾住发酵过程中的代谢变化规律，可以通过取 样来测定d c w 、底物浓度和产物浓度随时川的变化，以及采用各种传感器来适时跟踪 发酵罐中温度、p h 、溶解氰等参数并。r 以仃效的控制，使生产菌株始终处于优化的环境 中以最大限度地合成目标产物【2 ”。 首先，好氧发酵过程中的溶解氧既足币：要的环境凶素，还是参与菌体生长、细胞代 谢的维持和产物形成不可或缺的营养i 犬l 素。l 异亮氨酸发酵处于一类( 供氧充足的谷氨酸 族氨基酸发酵) 和三类( 在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸发酵) 发酵之间的二类发 酵。l 异亮氨酸碳7 胃架由丙酮酸提供，而| 人j 酮睃到异亮氨酸的合成必须经过t c a 和 h e t p p 两个途径，前者要求溶氧高，后者要求溶氧尽量低一些，因此，如何保证异亮氨 酸发酵中氧的供给以满足生产菌株对氧的需求，使氧的供、需矛盾不成为发酵生产的限 制因素是稳定和提高生产、降低成本的关键【2 引。常高峰等【3 8 1 通过测定不同罐分压、转速、 通气量影响下的体积传递系数k 。q 值发现，过高的k i ，q 使发酵中后期代谢流发生迁移，产 生副产物如丙氨酸、谷氨酸等杂酸；k q 过低时，产生缬氨酸等杂酸，导致l 异亮氨酸产 量低，同时产生有棚、酸如乳酸、丙酸等财菌体产生抑制作用，而且不利于菌体产异亮氨 酸。溶氧的大小通常很容易受到温度、搅拌转速、通气量以及发酵液的性质等诸多因素 的制约，因此要想了解发酵过程是否受溶氧的限制，就需要实地检测发酵液中溶解氧浓 度的大小，从浓度的变化情况来了解氧的供需规律以及对生产的影响。 其次，发酵过程中培养基的p h 值也是一项重要的控制参数，是菌体细胞在一定环 境条件下代谢活动的综合指标【2 9 3 0 】：( 1 ) p h 因影响细胞质膜的电荷而使其发生变化，引 起质膜对个别离子渗透性的改变，从而影响细胞对培养基中营养物质的吸收利用以及代 谢产物的排出，进而影响到菌体生长和新陈代谢的正常进行。由于胞内大多数生化反应 都与质膜的表面作用有着密切的关系，所以培养基的p h 对细胞的生长发育和其他生理 作用都会产生极为显著的影响。( 2 ) p h 直接影响到细胞内酶的活性，只有在合适的p h 范围内，细胞中的酶系才能表现出最大的活性。( 3 ) p h 还通过改变培养基中营养物质和 中间代谢产物的离解形式而影响细胞的正常代谢过程，从而对代谢产物的质量和产量产 生影响。控制p h 值有流加氨水和流加尿素【3 1 】等方法：流加氨水的浓度通常为1 4 、2 5 、2 8 ，氨水调p h 值作用快，流加尿素要求少量多次，但可使p h 值比较稳定。本 文将利用发酵罐的泵自动流加2 5 的氨水调节p h 。 再次，在发酵过程中需要保持菌体生长和产物合成所需的最适温度。菌体生长和产 物合成代谢都是在各种酶的催化下进行的，而温度又是保证酶活性的重要条件，因此在 发酵过程中对温度的控制非常关键【2 4 ，3 2 ，删：( 1 ) 温度对菌体细胞的影响不仅表现为改变 细胞生活的外部环境，还可以热量的形式传递到胞内并对胞内结构物质产生作用。温度 和菌体生长的关系，一方面在其最适温度范围内，菌体的生长速度随温度的升高而增加， 3 i i ：南人学硕十学位论文 发酵周期也棚应缩矩；，j 厅面，不i 司生长阶段的菌体对温度的反应有所不同。( 2 ) 细 胞的生命活动是棚- j ：连续的酶反应过程，温度升高则酶反应速度加快，产物生成提前； 同时高温会使酶 艮快欠上活性，表现出菌体细胞容易衰老，从而影响发酵产物的最终产 量。( 3 ) 温度可以通过改变发酵液的物理性质( 如溶解氧浓度、氧传递速度等) 和细胞 对营养物质的吸收利川速度，从而问接影响到微生物细胞的生长及产物合成代谢。( 4 ) 温 度还会影响到微乍物细胞的乍物合成方向。( 5 ) 对于同种微生物细胞，细胞生长和代 谢产物积累的最适拈矗皮i l ：f l ：也是不同的。( 6 ) 对于基因工程菌来说，温度更是影响基因 工程菌生长、质粒稳定，f 卜和重组产物的重要凶素。虽然在较高的温度下，生物体比生长 速率较高，但在发酵过稚i ，容易积累代谢副产物，反过来会抑制细胞的生长和目的产物 的表达。低温条件卜营养物质的吸收和生长速率都会降低，也就会减少有害副产物的形 成和代谢产热，会减少细胞需氧量，并且产物表达得更好，这对较低温度下降低比生长 速率、减少产物失活j 改善质粒稳定性有很大好处、外源蛋白稳定性和可溶性也会有一 定的提高存在着密切的关系。宋文军等【37 】提出了变温控制理论，前期温度控制在3 1 ， 可以有效的缩短菌体生长的迟滞期，有利于菌体生长；后期控制在2 8 ，菌体内产l 一 异亮氨酸合成酶系活性较强，利于l 一异亮氨酸的合成并减少其它杂氨基酸的形成。但是 异亮氨酸产生菌在前期中期后期对温度的要求各不相同，两阶段温度控制策略不能最大 限度的满足异亮氨酸生产的需要，对此有必要深入的考察温度对异亮氨酸发酵的影响 【3 引，制定出更好的温度控制策略。 1 4 3 异亮氨酸发酵过程的补料方式 b 1 a c t o f e r m e n t a t i d 门发酵生产l 异亮氨酸是一个要求有较高菌体浓度的发酵过程，过高 和过低的菌体浓度都不利于后期异亮氨酸的合成。在培养过程中通过流加补料可以使菌 体在较长时间内保持较高的生长速率，从而提高菌体的浓度，最终提高目的产物的生产 强度。l 异亮氨酸发酵过程的流加补料方式主要有： 一：非反馈补料 非反馈补料主要有恒速流加、变速流加、指数流加等方法。 恒速流加法：补充的营养按预先设定的速率流加，培养过程中细菌的比生长速率逐 渐下降，菌体总量呈线性增加。陈坚等【4 i 】利用恒速流加法高密度培养大肠杆菌生长谷胱 甘肽，培养4 1 5 d , 时获得7 7 5 l 的d c w 。 变速流加法：在菌体密度较高时营养物的流加速率不断增加，以满足细胞生长的营 养需求。李民等【4 2 】在高密度培养温度诱导的大肠杆菌时，利用三阶段式葡萄糖流加法获 得o d 6 0 0 为5 3 的菌体密度。 指数流加法：营养物的流加速率呈指数增加，菌体总量可在恒定的比生长速率下呈 指数增加，该法简便易行，前提是要预先设定比生长速率等过程参数。陈坚i 4 z j 等用此法 流加葡萄糖，设定比生长速率为0 2g g - 1 h ，培养2 5h 即获得8 0g l 的d c w 。而根据尾 气分析或其它参数通过模型计算，反馈控制补料速度以维持一个低于代谢副产物产生的 比生长速率，或维持在对表达最有利的比生长速率r i e s e n b e r g 【4 3 】等用这种方法控制比生 长速率为0 1 1g g - 1 h - l ，得到了1 1 0e d l 的d c w 。用相似的方法控制后期比生长速率在0 1 5 4 第一章绪论 g g - i h 。1 完成了i f n2 a i 程菌的高密度培养，得到了6 0g l 的d c w 。 二：反馈补料 反馈补料的反馈指标主要有基质浓度、p h 、溶氧、比生长速率等反馈补料的优点是 控制准确，操作重复性好，技术要求较低。但所需在线测量设备较多，控制复杂。 残糖浓度反馈法：利用葡萄糖浓度的离线或在线数据，维持培养基中较低的残糖浓 度。但化学法、酶法分析葡萄糖耗时过长，葡萄糖电极技术也尚未成熟，对流加的控制 较为滞后，菌体密度不够理想。b e i l e y 4 4 j 等控制残糖浓度在0 2 1 2 l 时培养非重组大 肠杆菌得到3 0g l 的d c w ，培养重组大肠杆菌得到了1 2gd c w l 的菌密度。p h s t a t 法： 培养过程中当葡萄糖耗尽时，培养基的p h 会升高，因此在p h 上升时反馈流加一定量葡 萄糖，利用葡萄糖代谢产生的有机酸代替通常调节p h 的酸液，使培养基p h 保持恒定。 该方法缺点是p h 变化并不完全是葡萄糖代i 舅 的结果，容易造成补料的错误。p a r k1 4 5 】等 利用p h s t a t 法培养b a c i l l u ss u b t i l i s 达到l8 4 l 。 d o s t a t 法：培养过程中葡萄糖浓度降低到一定程度时，菌体代谢强度下降，消耗氧 能力降低，反映为培养基中溶解氧浓度急剧上升，因此可在溶氧上升时反馈流加葡萄糖。 h k l i m 4 6 】等利用d o s t a t 法培养重组毕赤酵母达至l j l 4 0 9 l ，谷胱甘肽达至1 j 4 5 0i u l 。 补氨关联补糖法：依据菌体每消耗1g 氨氮的同时需要消耗1 5g 葡萄糖的数量关系， 可在培养过程中用氨水控带l j p h ，根据补氨量反馈确定补糖量，e p p s t e i n 【47 j 等采用此方案， 结合富氧培养的方法，曾得到1 11 4g l 大肠杆菌的干重。 由于微生物生长代谢的复杂性，非反馈补料方式很难达到需要的控制精度。而反馈 控制方式中，无疑是残糖浓度反馈补料法的控制精度和效果最好，但是由于葡萄糖电极 难以承受高温灭菌，且价格昂贵，所以很少用于工业化生产中。目前在工业化生产中应 用的最多是p h s t a t 和d o s t a t 法。虽然这两种控制方法能很好地控制发酵罐中的营养 物质不过量，但是其使得发酵罐中的营养物质长期处于一种匾乏状态所以两这种流加方 式是以牺牲微生物的生长速率来控制代谢副产物的积累。也就是说这两种流加方式并没 使得发酵罐中的营养物质处于c r a b t r e e 效应的临界值，而是远远低于这个临界值，所 以使用这两种补料方式使得微生物长期处于基质匾乏状态，且由于d o 和p h 的很大 的波动，所以这两种流加方式也不能达到很高的菌体浓度。 考虑到葡萄糖是b 1 a c t o f e r m e n t a t i o n 发酵生产l 一异亮氨酸的主要底物以及实验设备 的限制，本论文主要考察非反馈补料的方法生产l 异亮氨酸。 1 5 代谢工程与l 异亮氨酸生产 代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 是生物工程的一个新的分支。代谢工程把量 化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子 生物学综合技术结合起来，以上述“分析综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方 式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。 近年来，l 异亮氨酸的代谢工程方面的研究都是围绕生产菌种的选育和发酵代 谢过程的优化而展开的。以葡萄糖为原料的异亮氨酸合成途径如图1 1 所示： 江南人学硕十学位论文 ? 1 l 抑制：l l l 阻鼍：二_ 叫j 丙 ：天冬氨酸 图l l l 一异亮氨酸的生物合成途径及调：剜几制 f i g1 1m e t a b o l i s mp a t h w a ya n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fi s o l e u c i n e 根据异亮氨酸的代谢途径，近年来选育的l 异亮氨酸高产菌株主要如表1 2 所示： 表1 2 国内外用诱变育种技术选育的l 一异亮氨酸产生荫 t a b l e1 - 2s e l e c t i o no fl - i s o l e u c i n ep r o d u c i n gs t r a i nb ym u t a t i o nb r e e d i n gt e c h n o l o g y 6 第。幸绪论 分析l - 异亮氨酸的发酵代谢过程，对建立：和改进发酵模掣起者一f 常重要的作用。由 于l 异亮氨酸属天冬氨酸族，又是分支链氨基酸，决定了j 乍物合成存在严格的细胞内 反馈调节机制，不可能过量积累，因此必须通过再种f 段解除反馈渊节控制，才能够大 量积累过量l 一异亮氨酸。这种复杂的调控机制使得l 一片亮氨酸的发酵产物中有有机酸和 其它氨基酸。常高峰等【3 剐通过研究得知，在l 片亮氨酸发酵后期，副产氨基酸的碳架流 相应增加，约占总碳架流的l8 3 ，而理想的碳架流约i i i 总碳架流的8 0 ，因此，通过 发酵控制方面的优化使副产氨基酸的生成减少，使社j 代谢流迁移，分配合理，进而增大 合成异亮氨酸的代谢流。 本文通过分析l 异亮氨酸发酵的代谢过程，在3l f 控发酵罐上发酵，制定有效控 制策略优化l 异亮氨酸发酵过程，提高l 异亮氨酸的，扯量。 1 6 立题意义 l 异亮氨酸是二十种氨基酸中最昂贵的一种。目前，l 异亮氨酸的生产，国际上同 本处于领先地位，生产厂家主要有味之素、协和发酵、丌1 边制药以及德国d e g u s s a 等4 家 公司，都以发酵