（发酵工程专业论文）利用白地霉提高低发芽率大麦溶解性能的研究.pdf

捅要 捅要 大麦是啤酒酿造的重要原料之一，占据啤酒原料成本相当重要的一部分。本论文针 对部分国产低发芽率大麦溶解性能较差的缺点，利用白地霉提高其溶解性能。 在制麦过程中分别接种5 株具有高水解酶活的白地霉，均能提高麦芽的溶解，特别 是胚乳细胞壁的降解；接种gc a n d i d u mj n - 4 其成品麦芽的溶解指标最佳，gc a n d i d u m j n - 4 液态培养表明：以5 。p 麦汁为培养基，初始p h 值为5 5 ，接种孢子浓度为2 ， 装液量为5 0m l 2 5 0m l ，摇床转速为2 0 0r m i n ，3 0 培养4 0h ，菌体浓度可以达到5 1 0 8 个m l 的最大值。 研究了制麦过程中真菌的变化。在浸麦和发芽阶段，所有的真菌微生物的总量都有 明显的增加，发芽最后一天达到最大值。在焙燥阶段，真菌菌群水平下降，但并没有完 全消失；制麦过程中添加白地霉能明显改变真菌群落的构成。初步探讨了微生物制麦的 作用机制：浸麦初期，白地霉菌株利用接种时的菌体浓度优势，自身吸附到麦芽表面； 随着制麦进行，白地霉菌株利用自身的生长优势，占据大麦表面，从而抑制其他微生物的 生长代谢。发芽期间，利用自身菌丝体穿透大麦表皮，增强大麦的穿透性，并协助大麦 胚乳细胞壁的降解。 以gc a n d i d u mj n - 4 为接种微生物，对甘肃省高海拔种植区的低发芽率大麦甘啤3 号进行了微生物制麦工艺的研究。结果表明：第1 次浸麦时接种1 0 4 个儋大麦的菌体， 提高浸麦水温度至2 0 ，浸麦方式采用浸5 断l o 浸3 断6 浸1 ，发芽采用升温发芽( 1 4 2 4h ，1 6 2 4h ，1 8 2 4h ，2 0 2 4h ) ，焙焦条件为3 0 5h ，4 5 5h ，5 0 c 4h ， 6 0 6h ，7 0 2h ，8 3 3h 工艺明显促进微生物的作用，微生物麦芽中能反应大麦 胚乳细胞壁降解的粗细粉差、粘度和卢葡聚糖3 个指标得到明显改善，与对照相比分别 下降：1 0 0 ，2 2 4 ，3 6 4 。 关键词：低发芽率大麦，麦芽，制麦，白地霉，溶解 a b s t r a c t ab s t r a c t b a r l e yw a st h em a j o rr a wm a t e r i a lu s e df o rb e e rb r e w i n ga n di tw a sa l s oq u i t eam o s t i m p o r t a n tp a r to ft h ec o s t d o m e s t i cb a r l e yh a di n f e r i o rc h a r a c t e r w a s t i c si nb o t hg e r m i n a t i o n r a t ea n dm a l tm o d i f i c a t i o n 。i m p r o v i n gt h es o l u b i l i t yo fl o wg e r m i n a t i o nr a t em a l tb yu s i n g g e o t r i c h u mc a n d i d a um i c r o o r g a n i s m m a l t i n gw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r f i v es t r a i n so fg e o t r i c h u mc a n d i d aw i t hh i g he x t r a c e l l u l a rh y d r o l a s ew e r ei n o c u l a t e di n t h em a l t i n gp r o c e s s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l lt h es t r a i n sm e n t i o n e da b o v ew e r eb e n e f i c i a l t ot h es o l u b i l i t yo fm a l t ，e s p e c i a l l yt h ed e g r a d a t i o no fe n d o s p e r mc e l lw a l l gc a n d i d u m _ 4 w a sc h o s e na st h eb e s tf o rm i c r o o r g a n w a s m m a l t i n g t h eo p t i m i z i a t i o no fc o n d i t i o nf o rs p o r e p r o d u c t i o nw a ss t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o nw e r e ：t h em e d i u mw a s5o pw o r t t h ei n i t i a l p hw a s5 5 ，t h es p o r e so fi n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s2 ，t h ev o l u m eo fm e d i u mw a s5 0 m li n2 5 0m lf l a s k ，t h es h a k i n gs p e e dw a s2 0 0r m i na t3 0 a n dt h ec u l t u r et i m ew a s4 0h t h es p o r ey i e l dh a sb e e nr e a c h e d 5x10 8 m l t h ec h a n g e so ff u n g ic o n t a m i n a t i o nd u r i n gm l a t i n gp r o c e s s ew e r es t u d i e d t h ea m o u n t o fa l lf u n g ii n c r e a s e dd u r i n gt h es t e e p i n ga n dg e r m i n a t i o ns t a g e ，1 i t hi t sm a x i m u mo nt h e f i a n ld a yo fg e r m i n a t i o n ，a n dp a r t l yd e c r e a s e dt oac e r t a i nl e v e la tb a k i n gs t a g e a d d i n g g e o t r i c h u mc a n d i d ai nm a l t i n gc o u l dc h a n g et h ec o m p o s i t i o no ff u n g ic o m m u n i t i e s t h e m e c h a n i s mo fm i c r o o r g a n i s m - m a l t i n gw a sp r e l i m i n a r ys t u d i e da sf o l l o w s ：g e o t r i c h u m c a n d i d aw a sa d s o r b e dt ob a r l e ys u r f a c ef i r s t l yd u et oi t sh i 曲i n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o n t h e n g e o t r i c h u mc a n d i d ai n c r e a s e dr a p i d l ya n do c c u p i e dt h eb a r l e ys u r f a c e a sac o n s e q u e n c e ，t h e g r o w t ho fo t h e rm i c r o o r g a n i s m sw a si n h i b i t e d d u r i n gg e r m i n a t i n g s t a g e , g e o t r i c h u m c a n d i d ap e n e t r a t e db a r l e ys u r f a c ew i t hi t sm y c e l i u m ，w h i c hi n c r e a s e dp e n e t r a b i l i t yo fb a r l e y a n dh e l p e dd e g r a d a t i o no fe n d o s p e r mc e l lw a l l t h em i c r o o r g a n i s m m a l t i n gt e c h n i q u eh a db e e na p p l i e dt od o m e s t i cb a r l e yg a n p i 一3 w h i c hh a dl o wg e r m i n a t i o nr a t e i tw a ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a li n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o no f g e o t r i c h u mc a n d i d as p o r ew a s10 4 gd r yb a r l e yi nt h ef i r s ts t e e p i n gw a t e ra t2 0 l o n g s t e e p i n gt e c h n o l o g yw a sa sf o l l o w s ：5h o u r so fw a t e rs t e e p i n g ，10h o u r so fa i rr e s t ，3h o u r so f w a t e rs t e e p i n g ，6h o u r so fa i rr e s ta n d1h o u ro fw a t e rs t e e p i n g c a l e f a c t i v eg e r m i n a t i o n gt e c h n o l o g y ：1 4 * ( 2 2 4h ，1 6 2 4h ，1 8 。c 2 4h ，2 0 * ( 2 2 4ha n d k i l n i n g t e c h n o l o g y ：3 00 c 5h ，4 5 * c 5h ，5 0 * c 4h ，6 0 c 6h ，7 0 * c 2h ，8 30 c 3h w e r e a d o p t t h ep r o c e s sc o u l do b v i o u s l yp r o m o t ee f f e c to fg e o t r i c h u mc a n d i d ao nb a r l e ya n d e s p e c i a l l yf ce x t r a c td i f f e r e n c e ，v i s c o s i t ya n d3 6 4 w h i c hw e r et h ei n d e xr e f l e c t i n gt h e d e g r a d a t i o no f b a r l e ye n d o s p e r mc e l lw a l l c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，t h e yd e c r e a s e db y1 0 0 ，2 2 j 4 a n d3 6 j 4 r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：l o wg e r m i n a t i o nr a t eb a r l e y , m a l t ，g e o t r i c h u mc a n d i d u m ，m o d i f i c a t i o n i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机柏的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：压蔓， 日 期： 勿口譬2 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 注南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：茄蔓)导师签名：p 池 日 期： 2 - o f 多- 乙 第一章绪论 第一章绪论弟一早三百了匕 1 1 国产啤酒大麦的现状 我国啤酒年生产量己居世界第一，目前啤酒产量仍继续增长，大麦麦芽是啤酒酿造 的主要原料，是啤酒生产成本的重要部分。由于进口啤酒大麦质量较好，国内制麦企业 大量使用来自澳大利亚、加拿大和法国的进口啤酒大麦，年进口量约在2 0 0 万吨，占国 内啤酒大麦市场的5 0 以上。但是进口啤酒大麦的价格较高，市场波动也很大。例如： 国际大麦产区受到天气因素影响而减产，会导致进口啤酒大麦价格大幅度上升，给国内 啤酒生产厂家带来了极大的成本压力【l 】。显然，对国际啤酒大麦市场的高度依赖不利于 国内啤酒酿造业的发展。近年来，国产啤酒大麦的种植和加工业有了较大程度的发展。 进一步提高国产啤酒大麦的使用比例，可以有助于促进大麦种植加工产业链的良性快速 发展，有助于降低啤酒企业对国际啤酒大麦的依赖程度，降低啤酒生产成本。 目前，国产啤酒大麦仍存在一定的问题【2 i 。首先，我国啤酒大麦品种的更新速度比 较慢。其次，和国外大规模种植相比，我国的各农户、农场的分散种植缺乏统一管理， 部分地区片面地追求产量。甘肃省作为我国四大啤酒大麦主产区之一，生态条件十分复 杂，河西走廊地区东西跨度1 8 0 0k m 以上，海拔从l1 0 0m 到2 5 0 0m 【3 l 。其中海拔2 0 0 0m 以上的地区大麦往往存在质量缺陷，主要表现在品质均一性差、水敏性较强、发芽率比 较低。并且某些重要的麦芽品质指标不达标或有缺陷，增加了制麦过程的水耗与能耗， 延长了制麦周期，降低了麦芽制成率，并最终影响到啤酒质量。 1 2 麦芽的溶解 1 2 1 麦芽的溶解过程 麦芽的溶解指在制麦过程中大麦胚乳的细胞壁和蛋白质矩阵在酶的作用下被降解， 使原来胚乳坚硬致密的结构变成疏松和易粉碎，大麦的胚乳是由许多蛋白质联结的胚乳 细胞所构成。这些胚乳细胞的细胞壁主要是由半纤维素所组成，细胞内包含着大小不同、 包埋在致密的蛋白质支撑物之间的淀粉颗粒f 4 1 。发芽开始后，由糊粉层所分泌的蛋白酶 先溶解了连接胚乳细胞的蛋白质薄膜，使胚乳细胞分离，并使胚乳细胞壁暴露出来，得 以与半纤维素酶接触。在半纤维素酶分解了胚乳细胞壁后，蛋白酶进一步分解包围淀粉 颗粒的蛋白质支撑物，使淀粉颗粒和淀粉酶能够得以接触而分解，在一系列酶的分解作 用下，胚乳中所含的淀粉、蛋白质和半纤维素等高分子物质逐步分解，可溶性的低分子 糖类和含氮物质不断增加，整个胚乳结构由坚韧变为疏松。 麦芽的溶解在浸麦和发芽过程中非常重要，大麦中大部分的酶存在于糊粉层中，而 细胞壁恰恰阻碍了这些酶与存在于胚乳细胞中的物质的接近，因此快速的细胞壁降解不 论对大麦的萌发还是大麦的溶解都至关重要f 5 1 。溶解性能的提高很大程度上取决于胚乳 细胞壁的降解。 1 2 1 影响麦芽溶解的原因 影响麦芽溶解的主要原因1 6 j 包括：( 1 ) 大麦颗粒的吸水能力和速度。颗粒吸水能力强 江南大学硕士学位论文 和吸水速度快的大麦溶解会比较迅速和彻底。一些大麦对过量的水产生敏感，会导致大 麦在浸麦阶段出现缺氧死亡。大麦在种植期的气候会影响颗粒的吸水能力和速度。干早 气候的大麦吸水的速度会比较快，但也会比较容易产生水敏性。( 2 ) 大麦颗粒的组分和结 构。大麦颗粒是粉状者溶解快，玻璃质粒者溶解慢；大麦中蛋白质含量低的溶解快，蛋 白质含量高的溶解慢。( 3 ) 制麦工艺条件。相同品种和年份的大麦、浸麦水温高、浸麦 度高的麦芽通常溶解更好；浸麦，发芽过程中供氧充足的麦芽溶解更好；干燥期间凋萎 的时间较长、温度较低的麦芽溶解更好。 1 3 微生物对麦芽品质的影响 1 3 1 大麦中微生物的种类 麦芽表面的微生物主要来自田间大麦和贮藏过程中。田间大麦微生物的种类主要是 细菌、酵母菌和丝状真刮7 l 。其中细菌包括欧文氏菌、黄单孢菌、微球菌和芽孢杆菌的 某些属，放线菌比较少见。酵母菌主要为掷拟酵母和红酵母。丝状真菌是以活菌丝或者 孢子的形式存在于谷粒的外层。交联孢霉和芽枝霉麦芽表皮最常见的污染霉菌。此外， 田间大麦微生物的种类也受大麦产地的影响。 贮藏过程中，大麦微生物还会有很大的消长过程，和麦芽贮藏的条件密切相关。大 麦的贮藏条件中，大麦的含水量最重要。但是其它一些相关因素，包括温度、通风情况、 大麦中夹杂物以及寄生虫、螨类等都会对大麦贮藏微生物的繁殖有一定的影响【引。 1 3 2 制麦过程中微生物的生长 大麦微生物除了在田间和制麦之前的储存过程中会在谷粒表面生长外，在制麦过程 和麦芽存储中也会生长。制麦条件，如温度、湿度和通风量会影响微生物在大麦表面的 生长。一些微生物( 大多数为真菌) ，如镰刀霉在浸麦和发芽过程中数量急剧增长，但 大多数菌体会在麦芽焙焦过程被杀灭。尽管大部分细菌会在洗麦与浸麦过程中被冲洗 掉，但在制麦过程中细菌的总数仍增加6 0 0 倍。因此，这些能在麦芽中存活的细菌将比 原来在大麦中的数量增加2 0 倍以上【9 】。真菌的大小或数量虽不能简单与细菌类比，但仍 具有相似的增长关系( 表1 1 ) 。 表1 1 制麦过程中每克麦芽粒上微生物的菌落数 t a b 1 - 1t h ea m o u n to f m i c r o o r g a n i s md u r i n gm a l t i n g ( c e l l g ) 在浸麦和发芽阶段，所有的微生物群菌的总量都有一个大的增加，乳酸菌达1 0 6 个 儋绿麦芽，是原始大麦的的4 0 0 0 0 倍，酵母增加近1 0 0 0 倍。在焙燥阶段，微生物菌群 水平下降了，但并没有消失，生长和下降幅度取决于大麦的污染程度和制麦方法。一般 2 第一章绪论 成品麦芽上的总菌量为1 4 x 1 0 6 7 o 1 0 6 个儋麦芽。其中乳酸菌的最大量为1 4 x 1 0 4 个g 麦芽，酵母数量为7 2 x 1 0 2 1 1 x 1 0 4 个儋麦芽，制麦过程中微生物的相互作用非常复杂， 只有那些最终获得生长优势的微生物或微生物菌群才能在麦芽表面大量存在。 1 3 3 污染微生物对麦芽质量的不良影响 微生物污染过的大麦或麦芽对啤酒会造成危害已形成共识。大麦和麦芽微生物对啤 酒质量的影响最常见的情况是引发啤酒的喷涌现象。已有文献【1 0 1 报道十几种霉菌都能诱 发啤酒的喷涌。这些微生物之所以能够引起啤酒的喷涌，是这些霉菌代谢产生一些多肽 类物质，这些多肽是啤酒喷涌现象的诱导物。另外，受到背镰孢霉、黑曲霉、少根根霉 等微生物污染过的麦芽，能够明显的增加啤酒中的可溶性氮含量，从而造成啤酒颜色的 加深和降低啤酒胶体的稳定性。霉菌对啤酒质量的影响主要表现在对啤酒风味的影响 上。黑曲霉、赭曲霉、芽枝霉、葡萄白腐霉、镰孢霉和少根根霉能够使啤酒产生强烈的 异味，如焦糖味、果香味和口味粗燥等f l 。被微生物污染后的麦芽引发的食品安全问题 是当今研究的另一热点。据文献报道，微生物污染能形成多种真菌毒素，有些毒素具有 强烈的致癌性。为了保证消费者的利益，许多国家和地区都对这些真菌毒素的含量作出 了严格的规定l l2 。 1 3 4 微生物对麦芽质量的有益影响 近年来有关微生物对麦芽质量的有益影响也屡有报道。虽然大麦自身的发芽作用是 制麦过程中的一个重要环节，但是微生物对麦芽质量的有益影响也同样不可小视。y i n l l 3 1 等报道了从大麦表皮分离获得的许多微生物都具有降解1 3 葡聚糖的作用。f l a n n i g a n 【1 4 ，”】 等报道了大麦表皮的许多微生物菌群能够降解阿拉伯木聚糖。h o l1 1 6 1 等发表文章认为发 芽过程中产生的半纤维素酶体系绝大部分来自微生物而不是来自麦芽本身。文献指出大 麦表皮自身存在的微生物菌群的种类和数量与制麦过程中大麦1 3 葡聚糖的降解程度有 关。 1 4 微生物制麦提高麦芽质量的研究 1 9 世纪初，人们发现人为接种一些有益微生物的培养物( s t a r t e rc u l t u r e ) ，能够与 有害微生物形成竞争，控制有害微生物的数量，消除对麦芽质量的不利影响。制麦过程 实际上是麦芽逐渐溶解的过程。制麦过程中通过引入有益的微生物菌株，用来提高麦芽 的质量是一种新兴的制麦技术，其被定义为微生物制麦技术【1 7 】。目前用于微生物制麦的 有益微生物主要有白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u m ) ，乳酸菌( l a c t i ca c i d b a c t e r i a ) ，根 霉( 尺h i z o p u s ) 等。 1 4 1 根霉 利用根霉制麦被证明是改善麦芽溶解性的一个有效办法，制得的麦芽被为根霉麦 芽。i r w a sn o o t s 1 9 - 2 0 等在2 0 0 1 年首先展开了利用根霉改善麦芽品质的研究。2 0 0 3 年又 连续报道了该课题的研究成果。结果显示将根霉添加到发芽第天中能够显著地提高麦 芽质量。朱俊勤等以华根霉( a s3 9 4 8 ) 接种麦芽，研究了其对制麦工艺，成品麦芽的影 响。结果表明根霉麦芽中的许多指标都发生明显改变，如粗细粉差、库值、粘度、b 葡 3 江南大学硕士学位论文 聚糖含量和滤液体积。库值的提高说明根霉麦芽得到了更加充分的溶解，隆丁区分的变 化显示根霉对蛋白质溶解的帮助主要体现在可溶性氮中的中分子氮部分，麦汁中0 【氨基 氮的提高也证实了根霉麦芽中蛋白质加速溶解的现象，麦汁的总酸含量也有一定的提 高。但是，麦汁的浊度、色度的提高是对啤酒酿造不利的一面。 1 4 2 乳酸菌 对啤酒工业而言，很多乳酸菌是有害的( 如l a c t o b a c i l l u sl i n d n e r , l a c t o b a c i l l u s b r e v w a s , l a c t o b a c i l l u sc a s e i 等) ，但也有些乳酸菌是无害的。应用于啤酒酿造工业中的乳 酸菌主要是乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) ，如嗜酸乳杆菌犯a c i d o p h i l u s ) 、德氏乳杆菌 d e l b r u c k i i ) 、嗜淀粉乳杆菌a m y l o p h i l u s ) 、食淀粉乳杆菌犯a m y l o v o r u s ) 和胚芽乳杆菌 p l a n t a r u m ) 等。乳酸菌产乳酸可以用来生产酸化麦芽和酸化麦汁。欧洲各国自2 0 世纪6 0 年代以来就己经开始采用乳酸菌的生物酸化技术来调节糖化醪的p h 值以制造口味柔和 淡爽的淡色啤酒。h a i k a r a 2 1 】通过生物酸化可以增强原料中各种酶的活性，使所有的物质 分解过程进行的更快更适宜，提高原料的利用率，改善麦汁的组成和麦汁与啤酒的过滤 性能，提高啤酒的最终发酵度及啤酒的生物和非生物稳定性。l o w e 2 2 1 等研究了接种不 同乳酸菌对成品麦芽的影响，研究表明通过添加不同的乳酸菌株可以改善大麦麦芽的品 质，特别是麦芽中酶系的活力。但对麦芽中总氮含量，浸出物含量的提高不明显。 1 4 3 白地霉 白地霉被分类为“类酵母”，这种酵母是软干酪和绿麦芽及焙燥麦芽中自然菌群的组 成之一。毒理学研究表明，其不合成真菌毒素，没有毒素遗传性，白地霉菌株被认为是 安全的1 2 引。在以前的研究中，将白地霉菌株添加到微型制麦中抑制霉菌生长，尤其是制 麦过程中的镰刀霉菌。而且，工业化生产试验中也得到了同样的结果。在第一次浸麦水 中添加白地霉抑制了不需要真菌的生长。白地霉这种抗真菌效果是因为一种竞争作用， 它生长得快，阻止其它微生物的生长。研究表明，白地霉添加到浸麦水中可以抑制玉米 赤霉烯酮，一种链刀真菌毒素( z e a r a l e n o n e ，z e a ) 的合成。在工业化试验中发现，存 在于大麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d e o x y n i v a l e n o l ，d o n ) 在浸麦时减少，发芽和焙燥 阶段又被镰刀霉菌部分合成，麦芽中含量低于大麦，而白地霉麦芽中未检测到。 表1 2 制麦过程中添加白地霉启动子培养物d o n 含量 t a b 1 2t h ed o nc o n t e n ti nm a l ti n o c u l a t e dg c a n d i d u me u l t u r e 样品don(弘g绝) 大麦 对照麦芽 启动子麦芽 b o i v i np 【17 2 铊6 1 等研究了白地霉启动子对成品麦芽质量的影响，研究表明在浸麦水 中添加白地霉后可改善麦芽的品质，特别是粗细粉差、b 葡聚糖含量和库值。粗细粉差 的提高，d 葡聚糖含量的下降表明了白地霉麦芽的细胞壁得到了充分的降解。麦汁中库 值的提高说明了白地霉麦芽中大分子蛋白质加速溶解，其他理化指标也均有不同程度的 提高。 4 7 8 经裟揪 第一苹绪论 1 4 4 微生物在工业应用上的可行性 利用根霉作为制麦菌种，它对麦芽的溶解有很大的潜力，特别是对高蛋白含量的大 麦效果明显。但是它存在以下几点不足：一方面霉菌接种是以孢子形式进行的，孢子的 培养大多采用固态发酵获得，收集比较困难。另一方面孢子常常是过敏物的重要来源， 直径大于1 0l x m 的孢子大部分沉积在鼻、喉的粘膜上，直径小于4p m 的孢子，绝大部 分沉积在人们呼吸作用进行气体交换的终末端细支气管和肺泡里面，会对制麦车间员工 的健康产生不利影响，从而制约了根霉在工业应用上的发展。 乳酸菌在行业中研究最多，但大多数局限于生物酸化麦芽方面的研究，制麦过程中 添加乳酸菌可有效改善麦芽自身的酶系，提高麦芽的糖化力等指标。但是乳酸菌在啤酒 发酵期是不受欢迎的，它会对啤酒酵母的纯种发酵产生不利的影响。在工业化制麦过程 中，制麦菌株不能生成双乙酰、胺类物质等影响啤酒口味与风味的不利成分；必须进行 纯乳酸菌菌种培养，培养过程中如果带入杂菌，其代谢产物会给成品啤酒带来不良的味 道。 被微生物污染后的麦芽引发的食品安全问题是当今研究的一大热点。据文献报道 1 2 7 1 ，微生物污染能形成多种真菌毒素，有些毒素具有强烈的致癌性。为了保证消费者的 利益，许多国家和地区都对这些真菌毒素的含量作出了严格的规定。使用白地霉能够明 显抑制不需要的霉菌生长和真菌毒素的生成，在制麦过程中添加白地霉菌株，能明显提 高大麦细胞壁的降解，提升麦芽的质量和整齐度。菌体含有丰富的蛋白质、脂肪、维生 素和大量的核酸并能代谢产生大量的水解酶系【2 引。它具有适应性强、生长快、产量大、 培养方法简单等特点，制麦过程也易于控制，是进行工业化制麦的潜在的有效菌株。 1 5 立题背景与研究意义 2 0 0 7 年我国啤酒的年产量超过3 9 0 0 万千升。但是国产啤酒大麦年产量不足2 0 0 万 吨，据不完全统计，我国当前每年需进口啤酒大麦约2 5 0 万吨，耗资约8 亿美元。国产 麦芽不能占据市场的原因有很多。部分国产大麦由于生长环境造成的不良溶解性能是其 中之一。普遍来讲，这些大麦水敏感性偏高、发芽率较低，溶解性能较差，成品麦芽 d 一葡聚糖含量高、粘度大、过滤慢。如何提高低发芽率大麦的制麦性能，提高其在啤酒 行业的使用比例，已成为发展我国的啤酒大麦种植业一个亟待解决的问题。 利用微生物的方法提高麦芽的质量被视为近年来制麦工业的新进展。微生物麦芽具 有经济和技术上的可行性。制麦过程中添加有益微生物能改善麦芽的品质。在国外己被 研究多年，德国的乳酸菌麦芽、比利时的根霉麦芽都己成功进入了中试生产阶段，但不 同的大麦品种需选择不同的微生物制麦工艺以及不同培养微生物的收集方法不一，导致 了进行微生物制麦的产业化道路还有相当多的工作需要完成。而我国的研究还处于新开 发阶段：筛选适合的制麦用微生物菌种；研究适当的微生物制麦工艺；利用微生物麦芽 进行发酵的啤酒生产工艺；研究微生物麦芽对啤酒品质的影响等。 采用微生物制麦技术来提高甘肃高纬度地区大麦的溶解性能，提高成品麦芽在啤酒 酿造中的使用比例，一方面可以降低啤酒生产成本，取得明显的经济效益，同时也可以 5 江南大学硕士学位论文 极大地推动我国啤酒大麦的种植与发展，这将产生十分深远的社会意义。 1 6 课题研究思路、主要内容和目标 本课题着眼于利用白地霉提高低发芽率大麦溶解性能的研究，通过对白地霉制麦菌 株的筛选和微生物制麦机理的研究，以成品麦芽指标为响应值，系统考察各项制麦参数 对白地霉提高低发芽率大麦溶解性能的影响及白地霉麦芽酿造性能的研究。 本课题的研究内容和目标为： ( 1 ) 有目的性地选择几株白地霉制麦菌株，接种于制麦过程中，根据微生物麦芽 的溶解指标，初步确定适合进行微生物制麦的菌株；并研究适合于培养菌体生长与收集 的培养条件。 ( 2 ) 研究制麦过程中真菌微生物的变化，考察白地霉菌株对制麦过程中真菌微生 物变化的影响，并初步探索微生物制麦的机理。 ( 3 ) 研究白地霉制麦工艺对低发芽大麦溶解性能的影响以及白地霉麦芽酿造过程 的研究。 6 第二章白地霉制麦菌株的选择及培养条件的研究 第二章白地霉制麦菌株的选择及培养条件的研究 2 1 引言 微生物菌株是微生物制麦技术的核心，筛选合适的菌株是成功进行微生物制麦的前 提。由于大麦表皮上自然存在的微生物菌群及其在制麦过程中的相互作用十分复杂，因 此很难从理论上给出一个微生物选择的依据。国外微生物制麦菌种的主要来源是从麦田 微生物、贮存大麦微生物、制麦车间微生物和实验室保藏的一些已知特性的微生物菌株 中筛选获得。通过培养基筛选出获得的高水解酶( 伊葡聚糖酶，糖化酶，木聚糖酶，纤维 素酶，蛋白酶) 活力的微生物菌株被视为目的菌株。研究表明许多微生物都可以用于制 麦，近年来对白地霉菌株的研究居多，认为其能够有效地协助麦芽的溶解和保障麦芽的 安全性。能够工业化大生产是微生物制麦技术得以推广必须要解决的问题。 f o s z c z y n s k a t 2 9 峙旨出白地霉菌体孢子浓度应达到1 0 8 1 0 9 个m l ，并长时间( 3 - - 6 月) 保 藏才能有效地保障接种的正常进行。 本章对适合于制麦的白地霉制麦菌株进行了筛选，并研究了不同培养条件对白地霉 生长的影响。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要材料 大麦样品甘啤3 号( 甘肃省高海拔种植区的低发芽率大麦) ，其理化指标见表2 1 。 表2 1 甘啤3 号的理化指标 t a b 2 1t h es p e c i f i c a t i o n so fg a n3 指标甘啤3 号 水分( ) 千粒重q ) 蛋白质( ) 发芽率( ) 水敏感性( ) 1 3 2 3 7 6 1 1 6 7 6 1 3 2 2 2 主要试剂 伊葡聚糖，木聚糖标样为s i g m a 公司产品，其它常规试剂均为分析纯，均购于上海 国药集团化学试剂有限公司。 2 2 3 仪器设备 微型制麦仪( 德国s e e g e r 公司) ，恒温恒湿生化培养箱( 上海新苗医疗器械制造有限公 司) ，电热恒温鼓风干燥箱( 上海跃进医疗器械厂) ，p h s 3 c 型精密p h 计( 上海雷磁科学仪 器公司) ，m p 2 0 0 0 d 型电子天平( 上海精科天平厂) ，m e t t l e r - t o l e d o 电子天平( 梅特勒托利多 上海仪器有限公司) ，e b c 磨( 德国b uh l e r - m i a g 公司) ，k q 3 2 0 0 d b ( 型数控超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司) ，8 1 2 型磁力搅拌器( 上海司乐仪器有限公司) ，t g l 一1 6 c 型 台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) ，u v - 2 1 0 0 型紫外可见分光光度计( u n i c o 仪器有限公 7 江南大学硕士学位论文 一j ) 。 2 2 4 实验方法 ( 1 ) 白地霉菌株水解酶系活性检测 b 一葡聚糖蒯3 0 】 酶活定义：1m l 酶液于5 0 p h5 0 条件下每分钟水解1 伊葡聚糖溶液产生1 岭 葡萄糖的酶量定义为一个伊葡聚糖酶活力单位。 糖化酶川 酶活定义：在4 0 ，p h4 6 条件下，每小时水解淀粉产生1 毫克葡萄糖作为一个 酶活力单位。 木聚糖酬3 2 】 酶活定义：在5 0 、p h4 8 的条件下，酶每分钟水解l 毫克木聚糖生成lg m o l 的木糖为一个酶活单位。 纤维素酶的测定3 3 】 酶活定义：在4 0 、p h3 8 的条件下，酶每分钟l 毫克分解羧甲基纤维素生成1g m o l 的葡萄糖为1 个酶活单位。 蛋白蒯3 3 l 酶活定义：在4 0 ，p h4 6 条件下，每分钟水解酪素产生1 毫克酪氨酸为1 个酶 活力单位。 ( 2 ) 实验室普通制麦工艺 浸麦( 2 3h ) - 浸4h 断8h 浸4h 断6h 浸lh ；浸麦温度：1 5 ；通氧量：8 次i l ， 4m i n 次； 发芽( 9 6h ) ：1 6 ，湿度控制：9 5 ； 焙燥( 2 2h ) ：4 5 5h ，5 0 6h ，6 0 6h ，7 0 c 2h ，8 3 3h 。 ( 3 ) 常规指标测定 大麦，麦芽理化指标的测定参考文酬3 4 】进行。 ( 4 ) 白地霉菌株的活化和培养 4 低温冷藏。使用前，连续两次转接到土豆培养基培养进行活化，转接至麦芽汁 平板上培养过夜，取一环菌种加入酵母浸膏种子培养基中。 ( 5 ) 白地霉孢子计数 液态培养物稀释一定的倍数后用血球计数板计数，结果换算成对每毫升的孢子个 数。重复3 次，取平均值。 2 3 结果与讨论 2 3 1 微生物制麦菌株的收集 白地霉是地霉属中常见的一个种。裂殖。节孢子单个或连接成链，长筒形、方形， 也有椭圆形，末端钝圆。在5 。p 麦芽汁中，2 8 3 0 培养一天，生白色璞。毛绒状或 粉状，为有效地筛选出适宜制麦菌株，通过外购及对4 0 多种分离源( 大麦，小麦，麦 8 第= 章自地霉制麦菌株的选择及培养条件的研究 芽) 进行了分离，得到的白地霉菌株。 2 3 2 微生物制麦菌株的初步筛选 利用显微镜观察结合菌株生理生化实验，获得了6 0 多株白地霉菌株，为获得适宜 的制麦菌株，对得到的白地霉菌株进 亍了筛选，选择了和制麦营养环境相近的5o p 麦汁 培养基【3 5 1 1 5 ，4 天后产水解酶系( 包括蛋白酶、卢葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和 融淀粉酶等) 活性高的菌株为目的菌株，最终筛选出gc m x l i d u mj n 1 ，gc a n d i d u mj n - 2 ， gc a n d i d u mj n 一3 ，gc a n d i d u m j n _ 4 ，gc a n d i d u mj n - 5 ，分别以g 1 g 5 表示，其水解 酶活性见表2 2 。 表2 - 2 白地霉茵株分世的水解酶活- 性 t a b2 - 2 t h ea c t i v i t i e s o f h y d r o l a s eb y g c a n d ，d u m 2 3 3 最适制麦微生物的获得 为了获得最佳的微生物制麦菌株，进一步对以上初选菌株进行了筛选。在微生物菌 株筛选工作中，n o o t s 【】”等首先在人工培养基上进行筛选，产高水解酶活力的菌株被视 为理想菌株。但是在其后的工作研究中又指出：从人工培养基上筛选获得的微生物菌株 并不一定适合实际制麦，两者之间并没有一定的相关性。为此，在本实验中进一步把以 上白地霉菌株接种f 制麦过程柬进行微生物的筛选。使用普通制麦工艺进行发芽实验， 在第一次浸麦水中添加不同微生物菌株的萌发孢子，添加量为1 0 3 1 0 4 个幢大麦。测定 成品麦芽的相关理化指标。对白地霉麦芽综合指标进行测定，结果见2 3 ，发现添加以 上的白地霉茼株可以确效改善低发芽率大麦的溶解性能，其中添加自地霉菌株g 4 的效 果尤为明显，与对照组相比，无水浸出率从6 96 提高到了7 53 ，库值从3 0 1 增加 到3 78 ，芦- 葡聚糖从2 6 7 m g l 下降到1 5 7 m g l ，麦汁粘度从19 8 m p as 下降到15 3 m p as 。可见，初步筛选得到的白地霉菌株对提高低发芽率大麦的麦芽品质都有明显效 果，特别是添加门地霉卣株g 4 后，麦芽品质改善提高幅度最大。因此在后来的研究中 江南大学硕士学位论文 选择g 4 作为微生物制麦菌株。 表2 3 添加不同白地霉进行微生物制麦后麦芽的理化指标 t a b 2 3t h es p e c i f i c a t i o n so fm a l t sb ya d d i n gv a r i o u sgc a n d i d u m 2 3 4 白地霉培养条件的研究 能够工业化大生产是微生物制麦技术得以推广所必须要解决的问题。其前提是菌体 浓度需达到1 0 7 1 0 8 个m l ，并能够长时间( 3 - - 6 月、l 保藏以有效地保障接种的正常进行。 除发酵培养基组成外，温度、初始p h 值、初始接种量、装液量、摇床转速等培养条件 对白地霉培养也有很大影响【2 3 1 ，并最终影响发酵液孢子量。本部分研究着眼于工业化的 大生产，确定了在麦芽厂易得到的麦汁作为培养基后，通过对温度、初始p h 值、初始 接种量、装液量、摇床转速等条件的研究，综合发酵液中白地霉的菌体量及孢子形成所 需时间等指标，确定了最佳培养条件。 ( 1 ) g 4 生长曲线的测定 取斜面菌种1 环，接种于种子培养基中，在摇床上于1 8 0r m i n ，3 0 培养2 0h ， 作为种子液。按5 的接种量接种培养基中，在摇床上于2 0 0r m i n ，3 0 下培养，每2 h 取出2 瓶，稀释到适当浓度，充分混匀后计数，绘制成曲线，结果见图2 1 。 图2 - 1 白地霉菌g 4 的生长曲线 f i g 2 - 1t h eg r o w t hc u l w e o fgc a n d i d u m4 1 0 第二苹自地霉制麦西株的选择及培养条件的研究 由图可知，接种时菌体浓度为1 0 3 个m l ，培养到4 0h 时菌体浓度达到1 0 8 个m l ， 菌浓增长近1 0 0 0 0 倍，期间白地霉菌g 4 快速生长，处于对数生长期，菌浓迅速增加。 培养到4 0h ，此时芽孢形成率达1 0 0 。培养到5 0h 后，菌浓开始逐渐下降，( 3 4 进入 稳定期，从而确定4 0h 为最适培养时间。 ( 2 ) 温度对白地霉菌g 4 菌体浓度的影响 取斜面菌种1 环，接种于种子培养基中，在摇床上于1 8 0r m i n ，3 0 条件下培养 2 0h ，作为种子液。取2 5m l 发酵培养基于2 5 0m l 三角瓶中，调其初始p h 值到7 5 ， 灭菌。接种4 的种子液；分别在不同的培养温度t ( 2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 ) 以2 0 0r m i n 的转速进行培养4 0h ，测菌浓。结果见图2 2 。 图2 2 温度对白地霉菌g 4 茵体浓度的影响 f i g 2 - 2t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e so nth egc a n d i d u m4c e l lc o n c e n t r a t i o n 由图可知，温度对菌体的生长有显著影响，培养温度在3 0 时，自地霉的产孢量 最大，低于或高于3 0 时，菌体浓度均有所下降。故选择3 0 作为白地霉的最适培 养温度。 ( 3 ) 初始ph 值对白地霉菌g 4 菌体浓度的影响 取斜面菌种l 环，接种于种子培养基中，以p h 3 5 、4 5 、5 5 、6 5 和7 5 为初始p h 进行实验。取2 5m l 发酵培养基于2 5 0m l 三角瓶中，接种4 的种子液；以3 0 的 培养温度，2 0 0r m i n 的转速进行摇床内培养4 0h ，测其浓度。培养基的不同初始p h 值 对白地霉菌g 4 菌体浓度的影响见图2 3 。 毳 霞蓁囡 34567s p h 图2 - 3 初始ph 值对白地霉菌g 4 菌体浓度的影响 f i g 2 - 3t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n ti n i t i a lp hv a l u e so nt h egc a n d i d u m4c e l lc o n c e n t r a t i o n 1 1 ， 4 3 2 l o 一1iuo。_一型嶷基掘 5 4 3 2 l o 一1iil。_一世矮拉悃 江南大学硕士学位论文 由图可知，初始p h