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浙江工业大学硕士学位论文 湖羊瘤胃未培养微生物中木聚糖酶基因的克隆和表达 摘要 环境宏基因组文库的构建是开发未培养微生物资源的有效途径。 本研究通过构建湖羊瘤胃未培养微生物的宏基因组文库，共获得 1 2 ，0 0 0 个克隆，文库外源d n a 总容量为3 6 x 1 0 8b p ，筛选得到2 个表达 内切1 ，4 p 木聚糖酶活性的克隆。选择其中表达木聚糖酶活性较强的 克隆u m x y l 2 作为进一步研究的对象。通过亚克隆及测序得到3 个木 聚糖酶基因u m x y l 2 1 1 、u m x y l 2 1 2 和u m x y l 2 6 1 ，分析结果 表明都是新的木聚糖酶基因，为进一步研究木聚糖酶的降解机理及构 建能降解各种不同饲料来源木聚糖的酶库打下基础。 u m x y l 2 1 1 基因由1 0 8 6 个核苷酸组成，( g + c ) 含量为 5 3 7 8 ，熔点为8 6 4 9 ，可编码一个含3 6 1 个氨基酸的蛋白质，蛋 白预计分子量为3 8 ，9 7 4 2 道尔顿，等电点p i 为8 5 6 。u m x y l 2 1 2 基因由8 4 9 个核苷酸组成，( g + c ) 含量为5 2 4 1 ，熔点为8 5 8 0 ， 可编码一个含2 8 2 个氨基酸的蛋白质，蛋白预计分子量为31 , 0 3 9 2 道 尔顿，等电点p i 为8 5 2 。u m x y l 2 6 1 基因由1 2 7 8 个核苷酸组成， ( g + c ) 含量为5 0 2 3 ，熔点为8 5 1 1 ，可编码一个含4 2 5 个氨 基酸的蛋白质，蛋白预计分子量为4 5 ，7 7 7 8 道尔顿，等电点p i 为8 7 2 。 u m x y l 2 1 1 、u m x y l 2 1 2 和u m x y l 2 6 1 蛋白均为来自糖 基水解酶家族11 的木聚糖酶，编码产物都与产琥珀酸丝状杆菌 浙江工业大学硕士学位论文 f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e s ( a c c e s s i o nn o a a a 218 4 8 1 ) 的内切一1 ，4 一p 一木 聚糖酶同源性最高，u m x y l 2 1 1 的编码产物与其有6 7 的相似性， u m x y l 2 1 2 的编码产物与其有4 5 的相似性，u m x y l 2 6 1 的编 码产物与其有6 2 的相似性，它们可能有着共同的来源。氨基酸序列 比较发现三条序列中间部分相似度非常高，推测该区域可能为蛋白的 活性中心；并且u m x y l 2 1 1 、u m x y l 2 1 2 来自同一个阳性亚克 隆u m x y l 2 1 ，间隔仅为2 0 5 b p ，推测该木聚糖酶基因可能是以基因 簇的形式存在的。系统进化分析也表明u m x y l 2 1 1 、u m x y l 2 1 2 和u m x y l 2 6 1 可能都是来自产琥珀酸丝状杆菌或丝状杆菌属一个 未培养的种。 p c r 扩增木聚糖酶基因并连接到表达载体p e t2 8 a ( + ) 上，将 u m x y l 2 。1 1 和u m x y l 2 1 2 基因分别在b l 2 1 中实现了表达。对 u m x y l 2 1 2 蛋白的表达条件和酶学特性做了初步研究，结果表明： 在2 5 条件下诱导最佳，u m x y l 2 1 2 蛋白的最适p h 值在4 5 左右， 最适温度在4 0 左右，最适条件下测定木聚糖酶酶活为2 4 6 3u m l 。 关键词：瘤胃，宏基因组，内切1 ，4 一p 一木聚糖酶，克隆，表达 浙江工业大学硕士学位论文 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fx y l a n a s eg e n e o fu n c u i j u r e dm i c r o o r g a n i s mf r o m h us h e e pr u m e n a b s t r a c t m e t a g e n o m e h a sb e e nam o s t i n t e r e s t i n g a r e as i n c em o s t m i c r o o r g a n i s m s a r eu n c u l t u r a b l e af o s m i dm e t a g e n o m i cl i b r a r yo f u n c u l t u r e dm i c r o o r g a n i s mf r o mh us h e e pr u m e nw a sc o n s t r u c t e d ，w h i c h c o n t a i n e d12 ，0 0 0c l o n e sa n dt h ec a p a c i t yo fi n s e r t e dd n aw a s3 6x10 8 t w oc l o n e se x p r e s s i n ge n d o 一1 ，4 一b e t a - x y l a n a s ea c t i v i t yw e r ei s o l a t e d a n do n ec l o n ed e s i g n a t e du m x y l 2w a sc h a r a c t e r i z e db ys u b c l o n i n ga n d s e q u e n c i n g t h r e en e wp u t a t i v ee n d o 一1 ，4 一b e t a - x y l a n a s eg e n ew e r ec l o n e d w h i c hw e r en a m e da su m x y l 2 1 1 ，u m x y l 2 1 2a n du m x y l 2 - 6 - 1 r e s p e c t i v e l y ，f o rf u r t h e rs t u d yo ft h ed e g r a d a t i o nm e c h a n i s m o fx y l a n a s e a n dt ob u i l dax y l a n a s el i b r a r yf o rd i f f e r e n ts o u r c e so fx y l a n t h eu m x y l 2 - 1 - 1g e n ew a sc o m p r i s e do f1 , 0 8 6b pw i t hag+c c o n t e n to f5 3 7 8 a n dam e l t i n gt e m p e r a t u r ea t8 6 4 9 i te n c o d e sa p r o t e i no f3 6 1a m i n oa c i d sw i t ham o l e c u l a rm a s so f3 8 ，9 7 4 2d a l t o n s ， 3 浙江工业大学硕士学位论文 a n di t sp ii s8 5 6 t h eu m x y l 2 1 2g e n ew a sc o m p r i s e do f8 4 9b pw i t h ag + cc o n t e n to f5 2 4 1 a n dam e l t i n gt e m p e r a t u r ea t8 5 8 0 i t e n c o d e sap r o t e i no f2 8 2a m i n oa c i d sw i t ham o l e c u l a rm a s so f31 , 0 3 9 2 d a l t o n s ，a n di t sp ii s8 5 2 t h eu m x y l 2 6 1g e n ew a sc o m p r i s e do f 1 , 2 7 8b pw i t hag+cc o n t e n to f5 0 2 3 a n dam e l t i n gt e m p e r a t u r ea t 8 5 11 i te n c o d e sa p r o t e i no f4 2 5a m i n oa c i d sw i t ham o l e c u l a rm a s s o f4 5 ，7 7 7 8d a l t o n s ，a n di t sp ii s8 7 2 d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i so ft h r e eg e n e si n d i c a t e dt h a t a l lo ft h e mw e r ef r o mg l y c o s y lh y d r o l a s e sf a m i l y11 t h ea m i n oa c i d s e q u e n c e h a v es i g n i f i c a n ts i m i l a r t yw i t hx y l a n a s ef r o mf i b r o b a c t e r s u c c i n o g e n e s ( a c c e s s i o nn o a a a 2 18 4 8 1 ) ，w i t hi d e n t i e so f6 7 ，4 5 a n d6 2 r e s p e c t i v e l y t h e ys h a r e dg r e a ts i m i l a r i t yi nt h em i d d l er e g i o n o ft h es e q u e n c e ，a n dw a si d e n t i f i e da st h ea c t i v i t yc e n t e r s i n c eg e n e i 眦y l 2 1 1a n dim x y l 2 1 2w e r e f r o mt h es a m es u b c l o n e u m x y l 2 1a n dt h e yw e r eo n l y2 0 5 b pa w a y ，t h e yw e r ep r o p e r l ye x i s t e d a st h ef u n c t i o n a l g e n ec l u s t e r p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s s h o w st h a t u m x y l 2 1 1 ，u m x y l 2 1 2a n du m x y l 2 6 1m i g h tc o m ef r o m f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e s ，o rau n c u l t u r e ds p e c i e so ff i b r o b a c t e r d n a s e q u e n c e sc o n t a i n i n gt h ed n ar e g i o ne n c o d i n gt h ec a t a l y t i c d o m a i no fu m x y l 2 - 1 - - 1a n du m x y l 2 - 1 - 2w e r ea m p l i f i e db yp c r , c l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp e t2 8 a ( + ) r e s p e c t i v e l y ，a n ds u c c e s s f u l l y e x p r e s s e di ne c o l ib l 2 1 t h ec o n d i t i o n sf o ru m x y l 2 1 2e x p r e s s i o ni n 4 浙江工业大学硕士学位论文 b l 21a n di t se n z y m ep r o p e r t i e sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w s i t so p t i m a lt e m p e r a t u r ef o ri n d u c t i o nw a s2 5 t h eo p t i m a lp hw a s4 5 ， a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s4 0 t h ee n z y m ea c t i v i t ya tp h4 5 a n d4 0 w a s2 4 6 3u m l k e yw o r d s ：r u m e n ；m e t a g e n o m i c ；e n d o 一1 ，4 一b e t a - x y l a n a s e ；c l o n e ； e x p r e s s i o n 5 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名：易因村、 日期砂7 年亨月7 日 f， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密日j f v ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：歹马j 虱衡、 导师躲碉酗 日日 7 1 y 1 月月矿f 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 生物酶类是一种高效的生物催化剂。使用生物催化剂进行工业生产具有高 效、节能、环保等特剧1 1 。木聚糖酶是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖 和木糖的一组酶的总称，在饲料、食品、造纸、纺织和能源等工业中显示出广阔 的应用前景1 2 ，3 】。然而目前木聚糖酶由于产量不高或耐受性不够等问题，使其在 工业上的应用存在局限性，解决这一问题的方法主要有：l 、对现有的木聚糖酶 进行遗传改造；2 、从极端环境筛选优良的木聚糖酶产生菌；3 、通过构建未培养 微生物的宏基因组文库以获取优良理化性质的木聚糖酶基因 4 1 。考虑到目前多数 微生物仍难以实现单独培养，该方法是获得新型木聚糖酶的一条有效途径f 5 一。 1 宏基因组学简介 1 1 未培养微生物与宏基因组学 微生物是自然界分布最广的生物。自1 6 6 3 年，a n t o n i ev a nl e e u w e n h o c k 通过 自制的显微镜首次观察到细菌细胞之后近三百年的时间里，人们对于微生物的研 究主要是建立在纯培养基础上的。后来，人们发现纯培养微生物并不能代表研究 样品中微生物的全部，其中一个例子就是细菌殖数异常( g r e a tp l a t ec o u n ta n o m a l y ) 现象【7 1 ，即指通过稀释涂平板法计算的样品中微生物的数量和通过显微镜观察计 数所得结果不相符。之后，人们对环境样品中微生物的1 6 sr d n a 和1 8 sr d n a 基 因序列的分析，进一步描述了环境样品中未培养微生物的多样性以及不同环境中 微生物的分布情况，证明了未培养微生物占了自然界微生物的大多数【8 9 】，而且 研究表明这些未培养微生物是可以被开发和利用的【l 们。 未培养微生物的研究方法主要包括两种：一是对未培养微生物进行可培养研 究，主要集中在原位培养、培养条件的优化、单细胞的微操作等方面【1i , 1 2 1 l ，但是 这些研究往往需要特殊的环境和仪器，而且对数量巨大的未培养微生物进行可培 养研究耗时耗力；二是通过构建和筛选未培养微生物的宏基因组文库 ( m e t a g e n o m i cl i b r a r y ) ，即通过对未培养微生物的宏基因组分析( m e t a g e n o m i c 肌a l y s i s ) 来利用未培养微生物的基因资源【i l l 4 ，这一方法可以不经过对未培养微 浙江工业大学硕士学位论文 生物的纯培养过程，而直接在基因水平上开发利用未培养微生物【1 s , 1 6 。 反刍动物和人类有着悠久的历史的渊源，是人类畜产品的主要来源之一。反 刍动物瘤胃微生物的复杂的消化代谢过程能将大量的粗饲料，非常经济有效地转 化为营养丰富的畜产品，因而在很早就开展了对其功能的研究与开发。最主要的 成果是对于无机氮的利用、青贮饲料推广、过瘤胃蛋白技术改进上。对于微生物 所起的作用，研究所取得的成果非常有限，这一难点主要是由瘤胃微生物纯培养 困难及体系复杂这两点上，因此9 0 年代之后，除了依靠传统方法在代谢生理方面 的一些应用研究外，新的成果非常少，几近停滞状态。随着1 6 sr r n a 等新型分 子生物技术的应用，对瘤胃微生物的分类、定量研究技术有了质的变化。免培技 术及宏基因组学，由最初对土壤、海水等环境微生态的研究，开始逐步渗透到反 刍动物瘤胃微生物的研究中。应用宏基因组技术研究瘤胃微生物，将古老的瘤胃 及微生物知识与正在应用的现化分子生物学技术进行结合，重新认识瘤胃微生态 被提上了日程。 1 2 宏基因组文库的概念及分类 由于微生物形体微小，肉眼不可见及用传统的培养方法难以获得纯培养等原 因造成环境中绝大多数的微生物还未被研究。1 9 8 5 年，p a c e 等【1 7 】首先提出可以 直接从环境样品中提取微生物群体基因组d n a 从而绕过传统微生物研究方法所 必需的培养阶段对其进行研究，并利用这一方法成功的获得了大量的前所未知的 微生物信息。1 9 9 1 年，s c h m i d t 等f l8 】进一步利用这一方法构建了来自海水样品 d n a 的九噬菌体文库，并进行了1 6 sr r n a 基因的筛选分析。1 9 9 6 年，d e l o n g 等1 1 9 j 开展了一项在这一领域里具有里程碑意义的工作，他们克隆了一段来自一 种未知海洋古细菌的4 0 k b 的基因组片段并进行了测序分析。1 9 9 8 年，h a n d e l s m a n 等【2 0 】对这一新的研究方法进行了定义：一种以环境样品中的微生物群体基因组 为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结 构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的 微生物研究方法，并第一次使用了m e t a g e n o m i c s 这个名词，中文文献中将其译 为“宏基因组学 【2 1 。2 3 1 。虽然在有的文献中使用了环境d n a 文库( e n v i r o n m e n t a l d n a l i b r a r i e s ) 、土壤d n a 文库( s o i ld n al i b r a r i e s ) 、e d n a 文库( e d n al i b r a r i e s ) 、 重组环境文库( r e e o m b i n a n te n v i r o n m e n t a ll i b r a r i e s ) 、全基因组文库( w h o l eg e n o m e 2 浙江工业大学硕士学位论文 t r e a s u r e s ) 、群体基因组( c o m m u n i t yg e n o m e ) 、全基因组鸟枪法测序( w h o l eg e n o m e s h o t g u ns e q u e n c i n g ) 等，但在大部分的工作中都以“宏基因组学”作为其正式名称 【2 4 】。在随后的几年里，宏基因组学经历了飞跃式的发展。首先是以获得基因编 码产物为目的的研究普遍展开。 根据文库中插入片段的平均大小可将宏基因组文库分为小插入片段文库( 通 常采用质粒作为载体，插入片段小于1 5k b ) 和大插入片段文库( 采用c o s m i d 、 f o s m i d 或b a c 作为载体，插入片段大于4 0k b ) 。在构建文库时需根据分离得到 的d n a 质量，载体拷贝数量，宿主和所采用的筛选方法选择构建相应大小的文 库。小插入片段宏基因组文库适用于分离单个基因或者长度较小的编码新的代谢 功能的启动子，大插入片段宏基因组文库更适用于发现由大基因簇或大d n a 片 段编码的复杂的代谢途径以及研究未培养微生物的基因组性质。两类文库的优缺 点【2 5 2 6 1 见表1 1 。 表1 1 小插入片段与大插入片段宏基因组文库的优缺点比较 t a b l e1 1p r o sa n dc o n so fs m a l l i n s e r ta n dl a r g e - i n s e r td n al i b r a r i e s 实验用f o s m i d 文库介绍： 1 9 9 2 k i m 等将p b a c 引入p u c c o s ，构建了f o s m i d 载体系统。该载体在宿主 菌中以单拷贝形式存在，稳定性好。而近年来发展的c o p y c o n t r o l 克隆系统共享 单拷贝和高拷贝的优点，是用于代替c o s m i d 构建大片段文库的新型载体。图1 1 3 浙江工业大学硕士学位论文 是e p i c e n t r e 公司的c o p y c o n t r o l t mf o s m i dl i b r a r yp r o d u c t i o nk i t 中的载体 c o p y c o n t r o l t mp c c 2 f o s t m 的结构示意图。 昂7 l l ，- l n ( 艴：n o ta l l 馆蛐记的n 斟砭耵嘞s 也继叫耐y 狮i n d i e a t 饿l 雀帆 s e ea p p d xf ( p 口2 0 ) f o rc 唧i e 协r e s t r l c _ 岫n 缸幻m 均r l pr i m e r sa r en 瞳d r a w nt os l e 鬟n q ：r m e , e * 。7 21 然滁 一：= = k 0 二= = 譬= = 二一一 一c g g g g a t c c c a c g t a c a a c g a c a c c t a g a c c a c g 偈丁r c c t a g g c r g r c c t g g t g g g a t f p2p c c 2 t mf o w a r ds e a u e n o n gp 掰懈5 g t a c a a c g a c a c c t a g a c 了 r p = p c c 2 t mr e v e r s es u b n 瞳翮m e r5 c a g g a 啦c a g c c l _ a g g a a 了 1 7 ：t 7p r o m o t e rp i 胁5 t a a t a c g a c t c a c t a t a g g g 图1 1c o p y c o n t r o l t mp c c 2 f o s 刑结构示意图 f i g u r e1 1p c c 2 f o s t m v e c t o rm a p 该载体的组成及特点主要包括以下几个方面： 1 两个复制起始位点：大肠杆菌f 因子复制子o r i 2 和可诱导的高拷贝复制起始 位点o m n 。大肠杆菌f 因子复制子的存在使它可以在宿主菌中以单拷贝形式存 在，稳定性好，还可确保编码毒性基因序列的成功克隆。o r i v 是一个可通过t r f a 基因产物诱导的复制起始位点，需要时可诱导使f o s m i d 达到高拷贝( 5 0 个左右) ， 便于下游f i n g e r p r i n t i n g ，末端测序，f i s h ，物理图谱构建等工作的开展； 2 与细胞分裂相关的基因：p a r a ，p a r b 和p a r c 。p a r a 和p a r b 可维持质粒的低 拷贝数； 3 c i l l r 为氯霉素抗性基因，为载体的筛选标记； 4 c o s 位点和l o x p 分别来源于九、p l 噬茵体，c o s 位点用于包装反应，同时可被 九噬菌体的末端酶所切；l o x p 可由p l 噬菌体的c r e 蛋白在l o x p 寡核苷酸存在时 4 浙江工业大学硕士学位论文 切开。这两个位点可作为特定的切点以锚定插入d n a 的一端，便于限制性内切 酶分析； 5 t 7 为r n a 聚合酶启动子，可用于r n a 探针的制备和末端测序，以便于染色 体步移的研究和应用； 6 在多克隆位点插入了肠龙选择标记基因，可通过蓝白斑筛选重组子； 7 e c o ri 酶切位点可用于检测插入片段的大小。 分析表明该载体有如下几个优点： 1 它含有大肠杆菌f 因子，保证了它有较好的稳定性； 2 它含有可诱导的高拷贝复制起始位点，方便了后续工作的开展； 3 此载体只能携带2 5 5 0 k b 之间的片段，所以不会出现b a c 文库和其他文库容 易出现的不同位置基因片段的嵌合现象，保证了克隆的准确性。 近年来它已成为大片段基因组文库构建中比较受欢迎的载体之一，并广泛应 用于绿头鸭，海鞘，大猩猩和人等的基因组研究。 1 3 宏基因组文库的构建与筛选 宏基因组学沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品特 点、建库目的和筛选方式采用了一些特殊的步骤和对策。一般包括环境样品总 d n a 的提取纯化、与载体连接并克隆到宿主和文库筛选三大部分。 1 3 1 环境样品总d n a 的提取和纯化 构建环境未培养微生物的总基因组文库的技术难点在于如何从环境中得到 高纯度的可以进行分子操作的混合基因组d n a 。环境样品中存在的大量的抑制 物质如腐殖酸、腐殖酸样物、蹂酸类、酚类物质、重金属离子、及其不明沉淀物 等，尤其腐殖酸的抑制作用最明显，从而环境中得到的d n a 样品中也含有较多 的影响因子，影响着对d n a 的分子操作( 如：限制性酶切反应、p c i 扩增，d n a 杂交及感受态细胞的转化) ，严重影响了宏基因组文库的构建【2 7 1 。 1 3 1 1d n a 的提取 裂解细胞的方法有以下的几种：机械法、化学法、酶法和以上三种方法的组 合。一般说来，单独使用一种细胞裂解方法效果可能不理想，三者适当的组合可 产生较好的效果。 根据提取环境总d n a 前是否分离细胞，提取方法可以分为直接提取法和间 5 浙江工业大学硕士学位论文 接提取法。直接提取法可最大限度的提取环境样品中所有微生物d n a ；间接提 取法主要是用于有选择的把细菌或其他微生物的d n a 提取出来。间接提取法， 首先要把细胞从环境样品中分离出来，然后再把细胞裂解提取d n a 2 羽。直接提 取法是不用分离得到微生物细胞，而直接把环境样品中细胞裂解以提取d n a 2 9 1 。 提取得到d n a 的数量和质量不仅与裂解方法有关，而且与所使用的裂解液也有 很大的关系。缓冲液中含有e d t a 或高浓度的盐离子有助于提高d n a 的含量，但 纯度会有所降低。一般缓冲液都用磷酸缓冲液，缓冲液中一般含有e d t a 和高浓 度的盐离子，e d t a 可鳌合金属离子以能保护d n a 避免降解，高的盐浓度可以提 高d n a 质量。 1 3 1 2d n a 的纯化 对粗提的核酸进行纯化的报道很多，包括电泳法，分子筛法，c s c l 2 密度梯 度离心法、羟基磷灰石法、选择沉淀、玻璃粉吸附法、商品纯化法。电泳法有透 析袋洗脱和低熔点琼脂糖回收两种。在琼脂糖凝胶中加入2 p v p p ( 水溶性聚乙 烯吡咯烷酮) ，在4 c 下电泳时p v p p 与苯酚基化合物结合使之电泳速率慢于d n a 而使腐殖酸内d n a 分离。分子筛法：文献报道用b i o g e l ，聚丙烯凝胶柱，s e p h a d e x g 5 0 和g 2 0 0 纯化核酸。g 2 0 0 最好，d n a 的回收率高达9 0 。c s c l 2 密度洗脱离 心可获得较纯的d n a ，但操作繁琐，成本高。羟基磷灰石法的回收率较低，仅 为2 5 左右。选择沉淀法：用亚精胺一h c i 在低盐条件下沉淀d n a ，可以去除腐 殖酸等抑制剂，回收率为5 0 一1 0 0 。玻璃粉吸附法：利用玻璃粉在高盐下吸附 d n a 的特性，纯化核酸，回收率达7 5 1 0 0 。商品纯化柱法有报道称德国 s c h l e i c h e r & s c h i c e l 公司的e l u t i p e l 纯化柱纯化核酸获得了较好的效果。 1 3 2 宏基因组文库的构建 宏基因组学的基本方法是分析微生物在环境中的基因组集合，直接分离未培 养微生物基因组d n a ，克隆到可培养微生物中，最后筛选所需的目的克隆。 构建宏基因组文库要选择合适的载体【3 0 】。载体的选择主要是针对有利于感兴 趣的目标基因的扩增、表达及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。有人使用 传统的方法，用一些常用载体，以e c o l i 为宿主菌，构建一些小的插入片段( 1 0 k b ) 的文库【3 。然而小的插入片段文库不易鉴定大的基因簇和操纵子，为了克服这 种研究的局限性，构建大的插入片段文库是比较合适的选择，如c o s m i dl i b r a r i e s ， 6 浙江工业大学硕士学位论文 b a c l i b r a r i e s ，f o s m i dl i b r a r i e s o 宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基 因的表达、目标性状( 如抗菌) 缺陷型等。研究经验表明不同微生物种类所产生 的活性物质类型有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株，如7 0 的 抗生素来源于放线菌，如以寻找抗菌抗肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主 较理想。而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜，但是也有报道大肠杆菌存在着某些 基因不能表达或表达不好的现象，人们现在也在研发其他的宿主菌。 1 3 3 宏基因组文库的筛选 由于环境样品中微生物种类繁多，宏基因组文库容量一般较大，活性克隆子 的筛选是新活性物质筛选的瓶颈，根据研究目的，可分为“基于功能基因表达的 筛选 和“基于序列特异性的筛选 两种不同的筛选方法。 1 3 3 1 基于功能基因表达的筛选 基于功能基因表达的筛选有时又叫活性筛选，是依赖于基因在宿主中的成功 表达形成活性克隆( a c t i v ec l o n e s ) 而进行的筛选。活性克隆也叫阳性克隆( p o s i t i v e c l o n e s ) ，从而通过对活性克隆的序列鉴定以及生化分析来决定其潜在的应用价 值。比如利用指示培养基( i n d i c a t o rm e d i a ) 或者抗生素抗性筛选就属于这种筛选方 法。该方法的优点是能够较快的鉴定克隆或克隆中包含的功能基因，及其表达产 物在医药、农业、工业上的潜在应用价值；缺点是要求功能基因或完整的基因簇 在宿主中能够成功表达。用这种筛选方法获得活性克隆的频率相对比较低，筛选 工作量大。提高这种筛选方法的效率主要是通过提高筛选底物的灵敏度或者研发 新的筛选底物，此外就是通过使用机器人来帮助提高筛选效率。 1 3 3 2 基于序列特异性的筛选 又称为序列驱动筛选( s e q u e n c e d r i v e ns c r e e n i n g ) ，根据已知相关功能基因的 序列设计探针或p c r 弓i 物，通过杂交或p c i 滞增筛选阳性克隆子。如k n i e t s c h 等 根据所有已知脱水酶基因的保守序列设计了一对简并p c r 引物对宏基因组d n a 扩增，扩增产物制作探针与宏基因组文库进行杂交，筛到两个高甘油脱水酶和l ， 3 丙二醇脱水酶活性的克隆子，有望开发应用于工业生产。这一策略有可能筛选 到某一类物质中的新分子，而且基于d n a 的操作有可能利用基因芯片技术大大 提高筛选效率，但必须对相关基因序列有一定的了解，较难发现全新的活性物质。 7 浙江工业大学硕士学位论文 一般宏基因组文库筛选的工作量都很大，尤其是基于功能基因表达的筛选， 借助于机械手臂的帮助和芯片技术进行高通量筛选是解决方法之一，另外通过克 隆前含目标序列( s e q u e n c e so f i n t e r e s t ) 微生物的富集和克隆后宏基因组克隆的收 集( c o l l e c t i o no f m e t a g e n o m i cc l o n e s ) 都是提高获取目标序列的方法【3 2 1 。一般宏基 因组文库的筛选是集中在单个克隆基础上的，但如果某一功能是由一些克隆一起 作用才能实现，就可以通过宏基因组克隆的收集来富集目标克隆，即在含有选择 性底物的液体培养基中接种宏基因组克隆，通过培养能够对选择性底物作用的一 组克隆就会被富集【3 2 1 。 2 瘤胃微生物 2 1 瘤胃微生物的多样性 瘤胃微生物( r u m e n m i c r o b e s ) 是指栖息在瘤胃中的微生物。种类繁多、数量巨 大，包括古菌( a r c h a e a ) 、细菌( b a c t e r i a ) 、原核生物( e u c a r y a ) 和真菌四大类，包括 各种好氧、兼性厌氧和厌氧微生物。瘤胃微生物的种类和数量受动物的机体状态 和饲粮结构等因素的影响。这些微生物与反刍动物宿主间、各种微生物之间( 细 菌与原虫，一种细菌与另一种细菌之间) 形成了一个复杂而完善的生态系统。 瘤胃是个开放系统，随着采食、饮水以及舔扶等日常行为，经常从外界环境 输入大量的不同种类的微生物。但是，瘤胃又是一个特殊的生态系统，上述这些 外来的微生物只是在瘤胃内作暂时性过客性居留。s a - v a g e 总结为瘤胃微生物具 有以下特性：在厌氧环境中生长，代谢产物和中间体能在栖居点找到，在 正常成年的动物消化道内经常存在，定居胃肠道的特定部位。从动物的幼龄开 始就连续定居于它们的栖居点。在正常成年动物消化道微生物群落中保持稳定 的组成。同消化道粘膜上皮保持亲和的联系。 瘤胃中微生物的内环境因素包括：恒温、恒定p h 值及低氧气浓度。瘤胃内 温度范围为3 8 4 2 。c 。p h 影响瘤胃内几种主要细菌及原虫的生长效率，从而影响 瘤胃生态系统。瘤胃p h 值一般为6 2 7 0 ，采食精料型日粮的p h 值在5 5 6 5 之问， 某些情况下低于5 5 。氧化还原电位( e h ) 为2 5 0 至4 5 0 m v 。这表明瘤胃内氧含量 较低。 1 瘤胃细菌 瘤胃内细菌种类很多，但多为厌氧菌。早期研究表明：瘤胃细菌非常复杂， 8 浙江工业大学硕士学位论文 在瘤胃中担负着降解和发酵纤维性饲料的重要功能。产生挥发性脂肪酸( v f a ) 为 瘤胃所吸收，成为反刍动物的主要的能量来源，同时细菌自身生长和繁殖，合成 了大量的菌体蛋白、必需脂肪酸和维生素等营养物质，进入消化道后段被吸收， 用于维持和生产。可以说瘤胃细菌在反刍动物营养中有着不可替代的作用。常见 的一些菌种见下表【2 7 】： 表1 2 瘤胃中的主要细菌 t a b l e1 2b a c t e d ai nt u r e e n 9 浙江工业大学硕士学位论文 分子生物学的研究揭示，瘤胃细菌种类比原来传统方法认识的更为复杂多 样。近期研究表明，原来认为是同一个细菌的菌株，在遗传进化特性上相差甚远， 而由瘤胃混合微生物1 6 s 文库的d n a ( r d n a ) 序列分析显示，还有大量的尚未认 识的种类存在。由于缺乏特定的选择性培养基，或用以判别细菌种类的特异代谢 终产物，使对瘤胃生态系统的研究非常困难，许多种瘤胃细菌的代谢终产物在瘤 胃液中检测不到，这些代谢产物( 如琥珀酸和乳酸) 会作为其它细菌的代谢原料 ( 如反刍月形单胞菌和巨型瘤胃球菌) ，说明了对瘤胃细菌分类研究的复杂性。 2 瘤胃真菌【2 7 1 1 9 7 5 年o r p i n 等首先证明瘤胃内有真菌存在，后又在牛羊的瘤胃内容物中检 测到厌氧真菌，截止2 0 0 0 年，瘤胃中已有1 5 种厌氧真菌被分离出来了。真菌的 数量接近微生物量的8 ，所有瘤胃真菌均生长在一狭窄的温度范围3 3 4 1 ， 最适p h 为6 5 6 8 ，严格厌氧。 真菌能分泌降解纤维素的纤维素酶，少数瘤胃真菌还具有降解蛋白质和淀粉 能力。根据游离孢子的形态和真菌菌丝的形成方式，将它们划分为两个类型即多 中心类型真菌和单中心类型真菌；其中，多中心类型真菌主要包括o r p i n o m y c e s 和a n a e r o m y c e s 两个属，单中心类型真菌主要包括n e o c a l l i m a s t i x , p r o m y c e s , c a e o m y c e s 三个属。 3 瘤胃原虫【2 7 】 原虫虽然数量比细菌少，但由于其体积大，占瘤胃中微生物生物量的 3 0 8 0 ，从生理上将原虫分成两个主要亚类，即鞭毛虫( f l a g e l l a t ep r o t o z o a ，简 称f l a g e l l a t e s ) 和个体大、数量多、很重要的纤毛虫( c l i i a t ep r o t o z o a ，简称c l i i a t e s ) 。 驱虫研究表明瘤胃原虫不是反刍动物所必需的，它能吞噬大量细菌，导致了原虫 和细菌多样性的逆反关系，而且许多原虫能吸收和贮藏小淀粉颗粒，因此可调整 发酵效率，使动物免于酸中毒；然而，原虫捕食细菌及自身裂解过程剥夺了动物 的微生物蛋白，增加了进入瘤胃的氨；另外，一些原虫似乎消化纤维素，其消化 的纤维素能达到总纤维素的l 3 。 2 2 瘤胃微生物间相互关系的复杂性 瘤胃微生物作为一个整体的生态系统，各种微生物之间存在着一种既相互共 生又相互竞争的动态平衡关系。在正常情况下，总的效应是处于和谐共处状态。 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 互惠共生指两种或两种以上细菌、真菌或原虫共同生活，各方都受益的关系， 这是瘤胃生态系统中最重要的一种协作形式。已揭示的协作关系中，最典型的、 最复杂的是细胞壁降解过程中微生物的互作。细胞壁含有果胶、半纤维素、纤维 素、木质素和蛋白质，他们按一定的物理层次排列，降解过程中需要具有分泌一 定相应的酶的细菌共同进行。因此，栖居于瘤胃内植物多聚体底物上的菌落大多 是配套的，并在空间布置上有利于最有效的进行降解活动。如：白色瘤胃球菌和 瘤胃杆菌相互作用，瘤胃杆菌生产充足的蛋氨酸支持黄色瘤胃球菌生长。生长在 纤维素上的琥珀酸拟杆菌产生充足的糖，支持瘤胃新月单胞菌生长。纤毛虫依赖 细菌提供氨基酸，而细菌也广泛利用纤毛虫解体生成的蛋白质和支链淀粉。当纤 维素分解菌与纤毛虫同时存在时，不论体内还是体外纤维素消化率最大。一些被 吞噬的细菌与纤毛虫之间存在共生现象，其他独立的细菌与纤毛虫之间也有代谢 上的交互作用。例如，当细菌的氢供应不足时，产甲烷菌就会将自己吸附在内毛 虫上。真菌分解的终产物同样也被甲烷菌利用。细菌、纤毛虫和瘤胃真菌三者之 间关系密切，纤毛虫所需蛋白质主要靠吞噬细菌，细菌繁殖有赖于纤毛虫。当纤 毛虫和细菌单独存在时，纤毛虫对纤维素的分解率为6 9 ，细菌为3 8 1 ，当 两者共存时，纤维素的分解率提高至6 5 2 ，瘤胃真菌与细菌在纤维素的降解过 程中起协同作用【2 7 1 。 竞争关系指两种或两种以上细菌、真菌或原虫共同生活时，一方的获利使对 方受损。从整体生态系统看，这个竞争关系是协作关系的补充，是保持瘤胃环境 稳定不可缺少的。例如，牛链球菌利用可溶性淀粉产生乳酸，导致p h 下降，当 p h 6 2 时，将严重抑制纤维素分解菌的生长。也有瘤胃细菌抑制真菌降解纤维 的报道，如真菌与瘤胃球菌共同培养，n r o n t a l i s 溶解秸秆的能力显著下降。o r p i n 报道，瘤胃纤毛虫的运动可增强真菌种群的活性，同时，纤毛虫也可吞噬真菌游 离孢子，在饲料的降解中调节瘤胃真菌各种群的数量。a k i n 发现，瘤胃真菌及 瘤胃细菌混合培养液中使用抗菌素后，群集在饲草上的真菌数增加。纤毛虫吞噬 细菌的现象更为多见，据报道内毛虫( e s i m p l e x ) 每小时能捕食溶丁酸弧菌2 8 0 0 小【2 7 】 lo 3 木聚糖以及木聚糖酶 木聚糖酶是一类能够催化水解木聚糖的1 ，4 一p d - 木糖苷键( 1 ，4 p d - x y l o s i d i c 浙江工业大学硕士学位论文 l i n k a g e s ) 的0 糖苷水解酶( o g l y c o s i d eh y d r o l a s e s ，e c3 2 1 x ) ，其作用底物木聚糖 是植物细胞壁的一种主要的结构多糖，木聚糖通过共价键和非共价键与纤维素、 木质素相互作用，提高纤维间的粘合