（发酵工程专业论文）虫草素提取及其与dna作用机理的初步研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 虫草属真菌是一类重要的虫生菌。核营类成分虫草素( c o r d y c e p i n ) 是虫 草重要的活性成分，有着显著的药理作用。虫草素即3 一脱氧腺苷，为含氮配 糖体的核酸衍生物，属嘌岭类生物碱。早在2 0 世纪七十年代就己被发现有抑制 肿瘤、抗疟原虫和抑制m r n a 翻译的作用；九十年代研究发现，添加腺苷脱氨酶 ( a d e n o s i n ed e a m i n a s e 。a d a ) 抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用，从 而使虫草素的研究获得突破性进展：美国1 9 9 7 年己将虫草索用于一期临床实验， 治疗急性前b 和前t 淋巴细胞白血病患者；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌、 抗h i v i 型病毒和选择性抑制梭菌的活性。 九州虫草的无性型九州轮枝菌( v e r t i c i l l i u mk y u s h u e n s i s ) 菌种的培养采用 改良的p d a 培养基，采用超声波法提取，蒸馏浓缩再通过离子交换柱获得粗制品， 通过毛细管进行再分离。提纯品通过毛细管、紫外光谱、红外光谱和质谱以标准 品作对照进行检测给以确定。通过毛细管电泳测出其纯度和含置。 本文测定了虫草素与小牛胸腺d n a 作用前后的紫外光谱、荧光光谱、圆二 色谱，构建了二者相互作用的s c a t h a r d 方程图。利用光谱学方法揭示了虫草素 对d n a 作用使其构像发生变化的这一动态过程。探讨了虫草素与d n a 直接作用的 机理，确定虫草素和d n a 的作用方式为混合方式，即存在虫草素与d n a 的磷酸基 团作用( 通过静电吸引力与磷酸根发生弱的结合) ，又存在虫草素插入d n a 双螺 旋的嵌插模式。至于是否还存在其他作用方式有待进一步研究。从而为虫草素应 用奠定了坚实的基础。作为对照同时研究了小牛胸腺d n a 和鲱鱼精蛋自d n a 的荧 光光谱，结果表明对于不同的d n a 结构，虫草素与之作用的过程略有不同，但最 终都为混合作用方式。最后，以虫草素与质粒d n a 作用采用电泳的方式检测，结 果没有发现虫草素对d n a 有切刻作用。 关键词：毛细管区带电泳；虫草素；d n a ：紫外光谱；荧光光谱：圆二色谱 一当查盔兰翌圭兰簦笙兰 a b s t r a c t t h ec o n f i g u r a t i o no fa n a m o r p ho fc o r d y c e p sh a st h ea c a d e m i ca n dp r a c t i c a l i m p o r t a n c ec o r d y c e p sk y u s h u e n s 括c o l l e c t e d f r o mm o u n t m e n g o f s h a n d o n g p r o v i n c e ，w a sr e p o r t e d a san e wr e c o r di nc h i n a t h e s p e c i e s o f v e r f i c i i l i u m 妙u s h u e n s i si s o l a t e df r o mck y u s h u e n s i sw a sd e t e r m i n e dt ob ei t sa n a m o r p h t h e t y p i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ef u n g iw a sd e s c r i b e d s o m ef r u i t i n gb o d i e sf o r m e do ni t s h o s t - c l a n i sb i l i n e a t aw a l k e r t h e i r s i g n m u r e w e r es i m i l a rt ot h o s eo fn a t u r a l s t r o m a t a c o r d y c e p sk y u s h u e n s 捃h a db e e nc u l t u r eo nt h ea m e l i o r a t e dp d a m e d i u m t h e c u l t u r ec o n d i t i o no f c o r d y c e p sk y u s h u e n s & b a s e do nt h er e s u l to fm yl a bb e f o r e u s e d t h em e t h o dw h i c hb eu s e dt oe x t r a c tc o r d y c e p i nf r o mc o r d y c e p sk y u s h u e n s i s i sa s f o l l o w i n g ：q u a n t i f y t h e c o r d y c e p sk y u s h u e n s i sa b o u t5 9 ，b e f o r e d r i e do n6 0 t h e nc r u s h e di n t of l o u ra n dd i s s o l v e di na n h y d r o u se t h a n o l ，n l es o l u t i o nw a sd e l t w i t hu l t r a s o n i c a t i o na n dd i s t i l l e dt oe l i m i n a t ee t c h a n o la n dd i s s o l v e dw i t hl5 m e t h a n 0 1 a f t e ra 1 1 c o r d y c e p i nw a se x t r a c t e db y15 a n d2 5 m e t h a n o lg r a d e d c h r o m a t o g r a p h y w i t h7 17a n i o n e x c h a n g ec o l u m n c a p i l l a r yz o n ee e c t r o p b o r e s i sw a su s e d t od e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o n so f c o r d y c e p i n i n c o r d y c e p sk y u s h u e n s i s c a p i l l a r y z o n ee l e c t r o p h o r e s i sw a su s e dt o s e p a r a t ea n dd e t e r m i n ec o r d y c e p i n t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ec z em e t h o di sa s i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v e m e t h o df o rt h em e a s u r e m e n to fc o r d y c e p i nw i t hg o o d r e p e a t a b i l i t y t h eu l t r a v i o l e t s p e c t r u m ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y ，c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r u mw e r eu s e dt os t u d yt h e i n t e r a c t i o no ft h ea n t i t u m o rc o m p o u n dc o r d y c e p i n w j t l ld n a t h er e s u l t si n d i c t a t et h a t c o r d y c e p i n r e a c t s e l e c t r o s t a t i c a l l y w i t h p h o s p h a t eb a c k b o n eo f d n a t h e r ea l s oe x i s t sa ni n t e r c a l a t i o ni n t ot h ed o u b l e h e l i x o fd n a t h ec u ti n t e r a c t i o nb e t w e e nc o r d y c e p i na n dd n a h a sn o tf o u n dt h r o u g h a g a r o s ee l e c t r o p h o r e s i s ， k e yw o r d s c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ；c o r d y c e p i n ；d n a ；u v ；f l u o r e s c e n t s p e c t r u m ；m a s ss p e c t r a ；c d v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：日期： 够f 邝 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：主亟垒半导师签名：孑雾丘缉日期：迦垒：兰：主9 1 。 山东大学硕士学位论文 1 概述 第一章前言 虫草属( c o r d y c e p s ( f r ) l i n k ) 真菌是一大类重要的昆虫病原真菌，依据 1 9 9 6 年a l e x o p o u l o s 的分类，属于子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ，麦角菌目 ( c l a v i c i p i t a l e s ) ，麦角菌科( c l a v i c i p i t a c e a e ) 。所谓虫草，是指真菌的菌丝 体通过各种方式侵染昆虫后，以昆虫体内的物质为生而行寄生生活，经过不断的 发育和分化后，最终成熟并伸出于虫体而形成的一种真菌与虫体外壳共存的独特 的虫菌结合体。在此过程中，侵染菌必须经过相对独立的分生孢子阶段( 无性型) 和子囊孢子阶段( 有性型) ，并实现两个阶段的转变。这就是虫草世代交替的生活 史。其中最珍贵的，也是目前广泛药用的我国特产于青、川、滇、藏3 0 0 0 5 0 0 0 米高原地区的冬虫夏草( c o r d y c e p ss i n e n s i s ) 虫草寄主范围极其广泛，除寄生鳞 翅目外，还对同翅目、鞘翅目、半翅目、直翅目的幼虫、蛹、成虫以及少量蜘蛛 类螨类有致病作用：同时，虫草菌与寄主浸染结合的情况也千羞万别，有专性侵 染( 如戴氏虫草c t a i i ) ，又有非专性侵染( 一菌多虫或多菌一虫，如蛾蛹虫草 c p o l y a r t h r a 、垂头虫草c n u t a n s 和粉被虫草c p r u i n o s a ) 。 本文研究的蒙山九州虫草标本采自山东蒙山天麻林场，海拔3 0 0 - - 6 0 0 m 阴 坡，国槐林落叶层；人工育得子实体由分生孢予菌株回接、感染覆栽培的豆天 蛾幼虫获得。 图卜l 野生的九州虫草子实体 山东大学硕士学位论文 豳1 2 人工培养的九， i 虫草子实俅 本文中虫草菌丝为采集到的新鲜蒙山九州野生虫草子座切成小段接种于 p d a 培养基上，2 4 ( 2 温箱培养获得。 2 研究历史 图i - 3p d a 培养基上的菌落 2 1 虫草的活性成分研究 虫草尤其是冬虫夏草、大团囊虫草、蛹虫草、亚香棒虫草等种类，由于具有 重要的药用价值，因而引起人们广泛的注意。人们已从虫草及其无性型中分离到 多种生物活性物质，依据化学结构大致可分为腺苷类、多糖类、生物碱类、环状 肽类、酶类和多胺类等。各种实验表明。这些生物活性成分分别具有抗菌、抗肿 瘤、杀虫、免疫调节、免疫抑制、降低血糖和抗辐射等作用，在生物医药方面有 山东大学硕士学位论文 重要用途。 2 1 1 核苷类生物活性物质 ( 1 ) 虫草素 即3 一脱氧腺菅，又名蛹虫草菌素。最早因c u m n g h a m 等人报道蛹虫草寄 生的昆虫组织不易腐烂而于1 9 5 1 年被发现。分子式c i o h l 3 n 6 0 2 ，溶于水、热乙 醇、甲醇，不溶于苯、丁醚和氯仿。为含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤类生物 碱。早在2 0 世纪七十年代就已被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫【1 】和抑制m r n a 翻 译的作用( 2 i ：九十年代研究发现，添加腺苷脱氨酶( a d e n o s i n ed e a m i n a s e ，a d a ) 抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用，虫草素的研究从而获得突破性进 展。美国1 9 9 7 年已将虫草素用于一期临床实验，治疗急性前b 和前t 淋巴细胞 白血病患者 3 , 4 , 5 1 ：同时，虫草素还表现出极强的抗真菌【6 】、抗h i v - i 型病毒川和 选择性抑制梭菌属细菌活性1 8 。虫草素的存在与否因虫草属菌种不同而异，目前 研究多集中于蛹虫草 9 】，冬虫夏草亦有相关论文报道【1 0 1 ，但箕含量甚少。尚未见 到其它虫草的报道。 ( 2 ) n 一2 一羟乙基腺苷 是虫草真菌的次生代谢产物，第一个生物来源的钙离子拮抗剂和心肌收缩因 子。发现对辐射伤害有保护效果【1 1 1 ，可达到巯基乙烯胍的水平，可用于治疗心率 失常，心肌缺血，心绞痛、高血压、脑血栓等病症。 ( 3 ) 腺苷 腺苷可以扩张冠状及周围血管，增加冠状动脉血流量，降低血压、减慢心率。 活性测试结果表明，腺苷还具有很强的抗人血小板聚集作用【1 2 1 。 ( 4 ) 多糖类物质 虫草多糖分为胞内多糖、胞壁多糖、胞外多糖。胞外多糖是由微生物大量产 生的多糖，易于菌体分离，可以通过深层发酵实现工业化生产，所以受到人们广 泛的重视。 山末大学硕士学位论文 2 1 3 生物碱类 ( 1 ) 细胞分裂抑制素 即细胞松弛素( c y t o c h a l a s i n ) ，是非羧肽类的有毒代谢产物，为一种吲哚类物 质。具有多种生物活性。细胞松弛素主要作用于细胞的微丝系统，是肌动蛋白聚 合的抑制剂结合在f 肌动蛋白的正( 十) 端阻止f 肌动蛋白的生长，抑制f 肌动蛋白的功能，使有丝分裂受到明显影响，从而抑制哺乳动物细胞原生质体的 分裂而形成多核细胞【1 3 1 。 ( 2 ) 苦马豆素 苦马豆素是种水溶性的吲哚类生物碱，长期以来一直是研究糖蛋白n 连 接寡糖合成的工具药。近年来作为一种崭新的抗癌药物受到了极大的关注，其特 点在于其既具有直接杀伤肿瘤细胞，又具有免疫调节的双向作用。 ( 3 ) 野村菌素 吲哚衍生物，能致使肌肉麻痹【1 。 2 1 4 环状肽类 ( 1 ) 环孢菌素a ( c y c l o s p o r i n a ) 环孢菌素a 是一种真菌的抽提物，为含“个氨基酸的环多肽，具有强烈的 特异性免疫抑制作用。自8 0 年代后期开始，环孢菌素a 作为免疫抑制剂，在临 床上广泛应用于器官移植后抗排斥反应和治疗自身免疫性疾病。在肿瘤治疗中， 环孢菌素a 通过抑制p g 蛋白功能而对白血病多药耐药性、非小细胞肺癌多药耐 药性有逆转作用”。 ( 2 ) 其它环状肽类物质 白僵菌素( b e a u v e r i e i n ) ，环( 3 ) 缩羧肽，对多种昆虫具毒杀作用，影响离子载 运：白僵菌交酯( t ) e a u v e r o l i d e ) ，环( 4 ) 缩羧肽，作用于围心细胞；球孢交酯 ( b a s s i a n o l i d e ) ，环( 4 ) 缩羧肽，核变性；喂食某些昆虫可使肌肉呈特异的松弛状态， 以致最后死亡。以上三种毒素发现于白僵菌。多数昆虫病原真菌毒素都含有像 一些堡查竺壁主兰垡塑塞 一一一一一 n - c h 3 缬氨酸、n j c h 3 丙氨酸和n c h 3 苯基代丙氨酸那样特殊的n c h 3 氨基 酸的环状缩羧肽。此外，在绿僵菌素和白僵菌素这样的环状结构中都含有含氧酸 的脱羧基肽。虫草及其无性型产生的环缩羧肽物质，为我们研究致癌机理，寻找 新的高效低毒抗癌物质和治疗心血管系统疾病药物，提供了极有价值的启示和新 资源。 2 1 5 多胺类物质 多胺是包括腐胺、精脒和精胺在内的一类小分子脂肪族化合物，广泛存在于 生物体的各种组织细胞内，是一种重要的代谢调控物质，在细胞增殖分化中起重 要作用。在生理条件下，多胺能通过其多价正电荷和dna 、rna 、核苷酸、 蛋白质等生物分子相作用，从而影响和调节其功能嘲。 2 2 虫草的药理作用研究 2 2 1 对免疫功能的影响7 1 8 ，1 9 l ( 1 ) 对脾脏、胸腺重量及网状内皮系统的影响 虫草与虫草多糖的抗放射和增强免疫功能的生理活性已有许多的报道，如虫 革及人工虫草制剂腹腔或皮下注射能加快小鼠血中胶体碳粒廓清速度，增强腹腔 巨噬细胞吞噬能力，增加肝、脾重量。 ( 2 ) 对细胞免疫功能和体液免疫功能的影响 浓度为5 1 0 r a g m l 的虫草提取物体外对胸腺及脾细胞有轻度刺激作用， 可促进迟发过敏反应及免疫器官保护作用，并能使小鼠血清溶血素生成，血清 i g g 增加。因此，虫草对免疫功能，特别是对特异性免疫功能的影响属于双向调 节。体内外试验证明，虫草水提取物可提高正常人及自血病患者n k 细胞活性， 在所使用荆量范围内( 1 5 6 2 5 m g m 1 ) ，呈剂量效应依赖性。同时发现。虫草可 促进淋巴细胞表面c d l 6 抗原的表达，提高k 5 6 2 细胞的结合率，而对自细胞无 毒性作用，故可提高白血病人的n k 细胞活性，有治疗意义。 山东大学硕士学位论文 2 2 2 抗肿瘤作用1 1 7 , 2 0 l 虫草素为一种广谱抗菌素。同时也有抗癌作用。硒为抗癌及抗氧化生理活性 中起重要作用的微量元素。氨基酸及肽类被认为是虫草滋补强壮效用的物质基 础，也具有抗癌( k b 细胞) 和增强免疫活性作用。 2 2 3 对心血管系统的作用口1 2 2 2 3 2 5 l ( 1 ) 对心脏的作用 据报道，虫草中的某些维生素及微量元素为抗氧化的生理活性物质。给麻醉 大鼠静注虫草人工发酵菌丝体发酵提取物( c s b ) ，当剂量( 生药计算) 为1 5 9 k g 以上时能使心率减慢，5 分钟左右恢复正常；皮下注射5 9 k g 以上时，能明显 延长小鼠耐缺氧能力，使心肌对r b 的摄取增加，表现它可增加心肌营养性血流 量。腹腔注射2 5 9 k g 以上则明显降低小鼠心肌耗氧量。 ( 2 ) 对血压、血管阻力及组织血流量的影响 实验表明，大鼠静注c s bl s g k g 以上时能使麻醉大鼠血压短暂下降，小鼠 注射5 - 1 0 9 k g 可使心、脑组织对8 6 r b 摄取增加，但大剂置可引起肾组织对8 6 r b 摄取减少；麻醉犬静注c s b0 3 8 k g 出现降压作用，维持约半小时；o 6 9 k g 的剂量可使椎动脉及股动脉阻力下降；椎动脉注射3 5 一l o m g k g 时血压无变化， 但脑血管阻力明显下降。7 0 虫草醇提取液具有明显麻醉犬冠状动脉血流量和降 低冠脉、脑及外周血管阻力作用和降压作用。 ( 3 ) 降血脂及抗动脉硬化 皮下注射c s b 可降低正常小鼠及t d t o n w r l 3 3 9 引起的高血脂症。对肝组织 t c 无影响，但可使肝t g 减少。其主要原理是抑制肝组织合成胆固酵，而对胆 固酵的吸收、排泄影响不大。以高胆固酵食物饲养的家兔，3 个月后血脂升高， 并形成动脉硬化，若同时给予c s b 则可抑制血脂升高，并减轻动脉壁的粥样硬 化程度，减少主动脉中胆固醇脂的含量。而对游离腰围醇含量没影响。 山东大学硬士学位论文 2 2 4 调节血糖水平作用的研究 鼬h o 等的研究表明虫草菌丝体中多糖成分c s f l 0 可明显降低正常小鼠、链 脲佐菌素致糖尿病小鼠及肾上腺素致高血糖小鼠的血浆葡萄糖水平，显著升高链 脲佐菌素致糖尿病小鼠的肝脏葡萄糖激酶活性，显著降低灌注大鼠肝脏葡萄糖的 排出萤，腹腔注射c s f l 0 还可明显降低大鼠肝脏g l u t 2 的蛋白质含量，说明虫 草菌丝体中多糖成分c s f l 0 具有降低血糖的作用【2 4 】。季晖【2 卸等研究表明：腹腔注 射人工虫草菌丝体水提取物对正常小鼠、四氧嘧啶糖尿病模型小鼠及链脲佐菌素 糖尿病模型小鼠均有显著的降血糖作用，且呈现一定的量效关系。 2 2 5 对于血小板功能及造血系统的影响 实验证明，c s b 能抑制a d p 及胶原诱导的离体血小板聚集，对人及免血小 板的作用要比对大鼠血小板强数倍，但天然虫草对血小板聚集不仅没有明显抑制 作用，反而能够轻度诱导血小板聚集。据报道。人工虫草的抑制血小板聚集作用 用药后6 0 分钟为最大值，作用强弱与剂量大小呈依赖关系。推测其抑制血小板 聚集作用机理可能在于增加血小板的c a m p 。另据报道，虫草能促进脾脏巨核细 胞增殖，使血小板数增加。虫草提取物能促进骨髓红系祖细胞、粒一单核系祖细 胞、成纤维祖细胞及造血干细胞的增殖。由此看来，虫草对造血功能有全面的促 进作用。 2 2 6 对神经系统的作用 大量文献报道1 2 5 , 2 9 , 3 0 , 3 ”，虫草制剂有镇静作用，注射后能很快使动物活动减 少，处于朦胧状态，但一般不引起睡眠，对外界刺激仍有反应。这些作用主要与 其所含的腺苷物质有关。 2 2 7 对于呼吸系统的影响郾i 虫草制剂能扩张离体豚鼠气管，发酵的虫草菌丝及发酵液灌胃能延长氨雾致 咳小鼠模型的咳嗽潜伏期及减少咳嗽次数，增加大鼠气管分泌液量，降低肾上腺 累引起的小鼠急性水肿死亡率，能使组织胺致痉的离体豚鼠气管松弛。药理实验 ，7 山东大学硕士学位论文 证明：虫草提取液l o g l 【g 小鼠灌胃7 天，大鼠皮下注射3 9 k 9 9 天，可使肾上腺 增重，血浆皮质醇和醛固酮含量升高，肾上腺皮质三个带明显增厚，以囊状带增 厚尤为明显。表明虫草能促进和增强肾上腺激素的合成与分泌，与其产生抗炎作 用有关。 2 2 8 抗衰老、抗应激作用2 7 1 虫草小鼠灌胃剂量相当1 5 - 1 1 5l d 5 0 时，有明显抗疲劳、增强耐高温作用， 小鼠腹腔注射虫草2 5 - 5 9 k g 有增加常压耐缺氧作用。将大鼠切除辜丸后给1 ：l 虫草煎荆l m l l o g 体重( 1 0 9 k g ) 灌胃，连续6 天，取精囊称重，结果有雄激素样 作用。 3 小分子药物与d n a 相互作用中的分子识别 3 1 研究意义 在以生物大分子( 菌、受体及核酸) 为分子靶标的药物设计研究中，小分子对 d n a 的分子识别研究发展特别迅速，从生物学和临床科学的角度来说研究小分 子与d n a 的相互作用，对于认识小分子的生物活性以及药物作用机理有重要意 义。核酸是生物体的重要组成物质，遗传信息的携带者和基因表达的物质基础， 它在生物的生长发育和繁殖活动中居于十分重要的作用。小分子不仅可作为生物 探针，还可以核酸为靶目标作为抗肿瘤药物的母体，同时某些致癌物与棱酸混合 物还是癌变的预警标示物。研究小分子与d n a 的作用方式在药物尤其是抗癌、 抗艾滋病新药的设计和研制工作中具有举足轻重的地位。可以为药物的定向合成 提供理论依据，并减少抗癌药物的毒副作用。目前，以d n a 分子识别为基础 的药物设计研究一般分为两种途径进行。第一：合成一系列模型化合物，并对模 型系统进行分子水平的剖析。对它们与d n a 的结合方式、结合强度及影响结合 的电性因素、立体因素等进行研究，以更深入地理解核酸与化合物相互反应的分 子基础，同时参照生物活性筛选结果进行药物助理性设计。应该指出、计算机分 子图形学的发展促进了这一研究，分子力场的计算在药物设计中已显示出重要的 理论指导意义。实际上在以d n a 为靶分子的模型化合物的设计、合成中已经产 山东大学硕士学位论文 生了不少有意义的分子，一些合成的d n a 嵌插剂已显示出明显的抗癌活性并有 很好的应用前景：同时，这些化合物提供了核酸与小分子形成的络合物在结构及 能量上的新的信息，使小分子与核酸的相互作用研究又前进了步。第二：对于 以d n a 为靶分子的临床应用药物，结合其与d n a 的作用机制进行深入分析， 从分子药理学方面进行系统研究，以期对现有的药物进行合理的修饰和改造；同 时对药物作用机制的认识在d n a 与小分子相互作用的研究中。也得到了深入一 步的发展阱j 。 3 2 作用方式 d n a 三维空间的复杂性及其与小分子作用的多样性给研究的工作带来了较 大难度。小分子与d n a 结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环。d n a 由 平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条有核苷酸链形成的大沟、小沟 组成了小分子的识别位点。其作用方式主要有三种：非共价结合、剪切作用和共 价结合。 一 3 2 i 共价结合 包括与亲核试剂( 如n h 2 一n h 2 ，n h o h ) 的作用及与亲电试剂的反应( 如d n a 的烷基化) ，c i s - - p t 与d n a 的交联作用等。晶体衍射及其它一些方法也都证实 了顺铂中的p t 原子能够与d n a 小沟中同一条链上相邻鸟嘌呤【d ( g pg ) 】的n 7 共价结合形成链内加成物，并使d n a 双链解旋及产生弯曲，以便于含有离淌度基 因结构的蛋白质的结合。 3 2 2 剪切作用 小分子特异选择结合位点，最终导致核酸断链。由于d n a 的断裂在d n a 修复、转录及突变中是很重要的一个生物学过程，所以d n a 断裂剂的研究在小 分子与d n a 作用的研究中是不可缺少的一部分。b l m 是一种典型的d n a 切割 化合物，分子结构的特殊性使其能够识别并结合在d n a 中5 - g c 一3 序列的鸟嘌呤 上，然后经一系列化学反应最终导致d n a 断链，这种双功能性对于设计人工核酸 山东大学硕士学位论文 酶及发展有效的抗肿瘤药物都具有非常重要的指导意义d 3 1 。 3 2 3 非共价结合 以三种不同的方式进行，包括外部静电作用、嵌括结合、沟区( 大沟区、小 沟区) 结合。非共价键一般称作次级键，其中最主要的是氢键、离子键、范德华 力和疏水键。这些均属于弱作用键，而在分子水平的生命现象中，上述弱作用链 是一种决定性的因素，形成了各种大分子生物功能所要求的空阀结构，因而决定 了基因转录、调控的主要分子机制。 ( 1 ) 外部静电作用 即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的d n a 双螺旋外部。核酸 是一个高度带电的聚合电解质，它的阴离子磷酸根部分强烈地影响d n a 的构象 及其反应。小分子作为抗性离子所起的协同作用对d n a 这神带电荷的高聚物的 构象稳定是不可或缺的。通常认为这种作用模式在作为药物的应用上价值不大， 但也并非完全如此。例如，t m p y p 金属卧啉带正电的侧链与d n a 磷酸酯骨架 间的静电作用对它能嵌入结合在c , c 碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 ( 2 ) 沟区结合 即d n a 靶向分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作用。 由于d n a 的大、小沟区在电势能、氢键特征、位阻效应、水合作用上均有较大 不同，所以与d n a 大沟区特异性结合的多为蛋白质；而药物小分子一般是在小 沟区作用。小沟区结合的分子多为简单的芳香杂环，如呋喃、毗咯或苯环。通常 非稠合的芳环体系能通过一定的旋转后结合在小沟中a t 富集区【蚓，由此产生合 适的扭转力来配合小沟区的螺旋曲线，取代沟区中的水分子，靶向分子的供体基 团与小沟中a 的n 3 或t 的0 2 这些受体阃常常有氢键形成，亦有范德华力参与 发生接触。通过这种选择性的作用非嵌入性地“捆缚”住d n a ，从而阻止了d n a 的模板作用，达到抗肿瘤、抗病毒的耳的。近年来发展起来的反义寡聚核苷酸， 因其能按照严格的碱基对互补原则，通过h o o g s t e * n 氢键结合在双螺旋d n a 的 大沟中而形成局部的三螺旋结构，因而可精确识别核酸所携带信息的特异性序 列。因此一方面可通过将一些具有特定功能的活性基团缀接于寡聚核苷酸末端， 山东大学碗士学位论文 而得到高度选择性的人工核酸酶或药物分子原型；另一方面如已知靶分子的核苷 酸序列，有可能根据反义寡聚核苷酸的碱基序列直接写下抑制物的化学结构，这 点十分有利于药物分子的合成。 ( 3 ) 嵌插结合 即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系统。嵌插结合的作用力来 自芳环的离域体系与碱基的n 体系间的n n 相互作用及疏水相互作用。这是 药物分子与d n a 发生作用的最重要的形式之一。通常稠合芳环体系都倾向于结 合在g c 富集区【3 5 】，而对于一些含有庞大取代基的分子，如吡啶环取代的卟啉 分子在与d n a 作用时，吡啶环取代基会尽量旋转，以保持与母环的共平面，从 而形成良好的堆积形状与d n a 碱基嵌合。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基对 之间后，有的可以直接抑制d n a 复制与转录的功能；有的则在经过进一步活化 后，使d n a 断裂受损而影响其功能。 3 3 研究方法 研究化合物d n a 作用体系的方法很多。x 射线衍射能够提供直接结构信息， 所获得的晶体学数据最为准确可靠，但它因存在培养化合物一d n a 复合物晶体的 巨大困难而受到极大的限制。光谱法具有快速简便、耗费低等优点，从中找寻合 适的药物筛选方法可能性最大。 3 3 1 电化学方法 d n a 的电化学研究起始于上世纪5 0 年代，由于极谱学的开创和迅速发展， 早期的研究主要集中在极谱法和伏安法方面，随着后来的发展，其它的电分析化 学方法电位法、阻抗法和电化学发光法( e c l ) 等也用于d n a 的研究。d n a 的电 分析化学研究在d n a 的结构、形态、碱基序列，以及d n a 的损伤，基因诊断 等方面都具有重要意义，并且还可以为d n a 与其它各类金属离子、金属螯合物、 小分子物质等的相互作开 机理研究提供依据。 山东大学碗士学位论文 3 3 2 光谱学方法 ( 1 ) 荧光光谱 多引入外源性荧光作为指针，莱些小分子与核酸( 饼q a ) 结合后，会使原 本荧光很弱的分子荧光强度大为增加；丽有些小分子与核酸结合后会发生荧光淬 灭作用，具体又分为动态淬灭和静态淬灭两种方式。利用这些现象，可以通过荧 光光谱法进行分析，获得热力学和动力学数据。根据s c a t c h a r d 方程计算k 、n 值进行结合方式的判定。 ( 2 ) 紫外光谱法 d n a 在小分子作用下结构和构象的变化可以由相互作用前后紫外可见吸收 光谱的变化过程反应出来。d n a 吸收光谱的减色效应和增色效应是它特有与其 双螺旋结构相关的光谱性质。同时，亦有检测作用前后小分子吸收光谱的变化特 征的报道：在紫外、可见光的测定中发现嵌插结合通常引起减色效应。使最大吸 收波长向长波长方向移动而出现等吸光点口6 1 。 ( 3 ) 圆二色光谱 以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，一方面根据d n a 在2 6 0n m 处的吸收能提供有关其结构的信息；另一方面对一些本身虽然没有c d 信号，但 在与d n a 结合后能产生诱导c d 的光学活性小分子，可获得与核酸作用后旋光 性发生变化的的立体选择性，得到其绝对构型、构象和反应机理的有用信息，是 研究有机化合物、生物大分子的构型构象和三维空间结构的有力工具，是相互作 用分析中的重要方法。 ( 4 ) 拉曼光谱 激光拉曼光谱技术应用于脱氧核糖核酸大分子构象的研究始于上世纪七十 年代初期。它可以分析晶体、固体、胶体及溶液状态下的d n a 样品，较之x 射 线衍射、圆二色谱等技术有着独特的优点。拉曼光谱也是相互作用分析的一种方 法，它受水溶液的影响较小且对分子振动具有指纹式的分辨率，能够提供有关分 子骨架构象及碱基对的大量信息；特别是对模拟生理环境下d n a 溶液构象的解 山东大学硕士学位论文 析卓有成效。作为结构探针其灵敏度高、测量速度快、操作方便和所需样品浓度 的低( 1 0 一一1 0 m o l l ) 。 3 3 3 生物学方法一序列凝胶电泳及足印迹分析技术 序列凝胶电泳及足印迹分析技术是生物学中用来研究d n a 与其它分子相互 作用最基本的两种手段 3 7 1 。凝胶电泳可以考察d n a 剪切或其它分子与d n a 螺 旋共价结合留下的永久性“痕迹”，研究其它分子与d n a 作用的序列特异性； 而对于多数与d n a 发生非共价结合的分子来说，足印迹法及转录足印迹法是确 定其结合位点的比较好的实验方法，其中转录阻断的方法更易判断序列特异性较 高的药物结合位点。 3 3 4 其它方法 ( 1 ) 粘度铡定 在没有晶体结构资料的情况下，粘度测定是检测配合物与d n a 是否以插入 方式结合的非常有效的方法1 3 8 捌，s a t y a n a r y 锄等认为其结果比光谱数据更具说 服力。小分子配合物以其插入配体通过经典插入方式与d n a 作用时，d n a 相 邻碱基对的距离会交大以容纳插入配体，因而导致d n a 双螺旋伸长，d n a 溶 液的粘度增加：当以静电、沟面结合等非插入方式与d n a 作用时，d n a 溶液的 粘度无明显变化；以部分插入方式与d n a 作用时，则可能使d n a 双螺旋发生 扭结使其粘度减少。 ( 2 ) 扫描隧道显徽镜( s t m ) 与原子力显徽镜( a i 嘲) 扫描隧道显徽镜( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p y ，s t m ) 与原子力显徽镜 ( a f m ) 是具有原子级分辨率的新一代显微镜。s t m 发明于1 9 8 1 年，在生命科 学研究中，美国劳伦斯利弗莫尔一劳伦斯研究小组于1 9 8 9 年初发表了世界上第 一张在大气环境下得到的清晰的d n a 分子的s t m 图象【柏l ，证实了1 9 5 3 年美国 遗传学家j a m e sw a t s o n 和英国物理学家f r a n c i sc r i c k 共同建立的著名的沃森一克 里克d n a 双螺旋结构模型。此后，s t m 在分子生物学领域显示出强大的生命力。 新的成桑不断涌现( 4 i 捌。目前采用的主要方法有：1 将样品溶液直接滴到衬底上， 山东大学硬士学位论文 待水分自然蒸发后，样品吸附于村底表面；2 将一定浓度的样品溶液滴于衬底上， 然后放在离心机上旋转，村底表面将残留部分样品；3 l b 膜技术等。前两种方 法不易在衬底表面形成单分子( 或亚单分子) 层，容易产生堆积现象l b 膜技术 虽能在衬底表面覆制单分子层，但设备昂贵。 原子力显微镜( a f m ) 是在s t m 基础上研制出来的更加先进的扫描探针显微 镜。自1 9 8 6 年发明以来得到了广泛的应用和发展，成为众多研究领域中的强有 力工具，并为其它的研究技术提供了良好的互补手段。a f m 样品制备简单，可 直接对d n a ，r n a 和它们的蛋白或其他配合体复合物结构进行研究。同时，样 品制备上避免了电镜成像过程中所需要的喷镀、染色和标记等用来增加图像反差 的复杂处理步骤。a f m 能在多种环境( 包括空气、液体和真空) 中运作，生物分子 可在其生理条件下直接成像，还能对活细胞进行实时动态观察：a f m 能提供生 物分子和生物表面的分子亚分子分辨率的三维图像；a f m 能以纳米尺度的分辨 率观察局部的电荷密度和物理特性，测量分子间( 如受体和配体) 的相互作用力； a f m 能对单个生物分子进行操纵：由a f m 获得的信息还能与其它的分析技术和 显微镜技术互补。 ( 3 ) x 射线衍射与核磁共振 研究化合物d n a 作用体系的方法很多，x 射线衍射能够提供直接结构信息， 所获得的晶体学数据最为准确可靠，但是培养化合物- d n a 复合物晶体是十分困 难的，况且d n a 的晶态结构与其在生物体细胞内( 近似溶液状态下) 的结构有很 大差别。 核磁共振在测定生物大分子的溶液结构方面受到广泛的关注。但是测定核酸 溶液结构的难度要比测定蛋白质大得多，主要是它们的谱峰重叠太严重，获得单 晶和标记也困难得多。 一虫草素提取 1 材料与方法 l - 1 材料 第二章：虫草素提取及检测 蒙山九州虫草菌种本实验室提供，7 1 7 型强碱性阴离子树脂，无水乙醇、 甲醇等试剂皆为国产分析纯。 1 2 仪器 旋转蒸发仪，上海亚荣 p a c e t m 如q 毛细管电泳仪，b e c k m a n 公司 熔融石英毛细管，3 0 0 m m x 4 5 1 tm ，河北永年光纤厂 j r 5 0 0 3 光电分析天平，上海天平仪器厂 b s z - 2 型自动双重纯水蒸馏器，上海博通公司 1 3 树脂的预处理 去离子水浸泡一以树脂2 倍体积的4 h c l 溶液泡2 - 4 h - - 去离子水洗至中性 一2 倍体积4 n a o h 溶液浸泡2 - 4 h - - 去离子水洗至中性一去离子水浸泡存放备 用。 1 4 方法 1 4 1 蒙山九州虫草菌丝体培养 1 4 1 1 培养基成分 马铃薯2 0 ，麦麸5 ，蔗糖2 ，磷酸二氢钾0 3 ，硫酸镁0 1 5 ，p h 6 5 ， 一一。 些至查堂堡主堂堡塑奎 8 磅2 0 r a i n 灭菌。 1 4 1 2 培养条件 3 0 0 m l 三角瓶中装入1 0 0 m , 液体培养基，灭菌后接入1 0 m l 液体种子，2 4 3 2 ， 1 4 0 r p m 振荡培养三天。 1 4 2 虫草素提取 蒙山九州虫草菌丝体充分洗涤后抽滤，6 0 3 2 烘干至恒重，粉碎过筛的细粉 用大约2 倍体积的无水乙醇浸泡，超声波破碎处理( 功率4 0 0 w ，破碎5 s ，间歇 5 s ) ，6 0 减压蒸馏得到的固型物以1 5 甲醇溶解，离心去除杂质，上阴离子交 换树脂柱( c 1 0 柱，4 0 0 m m x1 0 r a m ) ，2 5 甲醇洗脱，收集洗脱峰。 1 4 3 毛细管电泳 1 , 4 4 1 电泳条件1 4 3 1 分离电压：2 0 k v ；检测波长2 5 8 n m ；进样量0 5 p s i 迸样5 s e c 柱温2 0 。c ； 电泳缓冲液：o 0 2 5m o l l 硼砂溶液( p h 9 4 ) ，o 4 5 1 m 的微孔滤膜过滤：运行时 间：5 m i n ；每次进样前依次用o 2m o l l n a o h 溶液、重蒸水、缓冲液各冲洗2 r a i n 、 1 m i n 、2 m i n 。 1 4 4 2 标准曲线绘制 标准样品购自s i g m a 公司，先配制成4 0 咖d 的母液，稀释成2 0 p 咖l 、 1 0u g m l 、5ug m l 和2 5u 咖l ，按照l _ 3 3 1 所述的电泳条件分别进行毛细管电 泳。 1 4 4 3 样品检测 采用标准加入法。1 4 2 中获得的的洗脱蜂和l o pg 皿l 的标准品按照l ：1 的 比例混合，采用1 4 4 1 的电泳条件进行毛细管电泳。 2 结果 2 1 毛细管电泳如图 o o ， 6 c 0 2 4 0 0 2 d 0 0 m i n u r e 图2 - l2 0p 咖l l 的虫草素标准品毛细管区带电泳图 埔n u t e 图2 2 样品毛缅管区带电泳图 45 瑚 咖 舌 蛳 斯 言 一生查查兰堡主竺垡堡苎 弋o 爱 图2 - 3 采用标准加入法后虫草素样品的毛纲管区带电泳图 2 。2 标准曲线绘制 表2 一l 虫草素标准品毛细管区带电泳的浓度与峰面积 虫草素浓度( | ig m l )虫草素峰面积 2 0 1 0 5 2 5 1 8 3 0 2 5 1 0 4 2 2 8 3 4 7 5 7 3 3 2 5 耋” 差，2 0 0 图2 4 虫草素毛细管区带电泳标准曲线 y = 5 1 5 0 9 + 6 3 4 7 x x r 2 = 0 9 7 8 样品的峰面积为1 2 4 4 4 ，代入公式求得浓度，减去加入的标准虫草素的浓 度可得容液的浓度为1 4 9ug m k ，过柱子共收集了2 0 , 1 的溶液，所以收率为5 9 6 u g g 。 二结构检测 2 1 紫外光谱 虫草素标准品及本室自制虫草素样品分别溶于2 0 m m o l lk n 0 3 溶液中，使 用u v - 2 4 0 型紫外分光光度计于2 0 0 - 3 4 0 n m 的波长问进行扫描。结果如图 些墨查量堡主兰丝堡苎 m n m ) 图2 - 5 虫草素标准品紫外扫描图谱 ( n m ) 图2 - 6 自制虫草紊样品