（发酵工程专业论文）阿片肽的制备纯化及其测定方法的研究.pdf

阿片肽的制备纯化及其测定方法的研究摘要阿片肽( o p i o i dp e p t i d e ) 是一种神经免疫肽，有激素和神经递质的功能，对中枢神经系统及外周器官均起作用，分为内源性阿片肽和外源性阿片肽。从已经发现的外源阿片肽数量来看，很大一部分都来自酪蛋白，这些肽均以无活性的状态存在其中，只有用适当蛋白酶水解才能从酪蛋白前体物中释放出来。因此，在体外条件下，只要调节适当的p h 值、温度和水解时间，用适当的蛋白酶或不同蛋白酶的组合进行水解，就可以获得一定量的阿片肽。本研究利用不同蛋自酶酶解酪蛋白，确立了生成最高阿片活性的酶解条件：并对酶解液进行了醇沉租提和s e p h a d e x 层析，从而分离得到了一种具有阿片活性的短肽；经氨基酸组成分析及与酪蛋白的氨基酸序列比较获知，该肽是一种新型阿片肽，并根据其序列推测了它的空间结构；通过离体豚鼠回肠和小鼠负重游泳试验分别测定了该肽抑制回肠收缩和抗疲劳的功能。试验结果表明：相比胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，胃蛋白酶酶解酪蛋白能产生更高的阿片活性，其优化条件为：底物浓度3 ( w v ) ，酶解时间2 5 h ，酶与底物的比例3 0 0 0 0 u g 。p h = 2 0 ，酶解温度4 2 c ：之后，经8 0 乙醇沉淀杂蛋白阿片活性物质基本保留在上清液中：通过s e p h a d e x g - 5 0 层析，收集活性峰即第三个峰再经s e p h a d e x g - 1 5 细分离，经检测第四个峰具有活性：t r i c i n e s d s p a g e 电泳和毛细管电泳检测，该峰是一种单一组分，对其进行氨基酸组成分析和适合度检验得知，其对应于a l p h a - s l c a s e i n 的1 4 4 1 5 8 序列y f y p el f r q f y q l d a ，分子量为2 2 5 2 4 8 。在国际权威蛋白及生物活性肽数据库查询得知，这是一种新型的阿片活性肽。利用蛋白分析序列软件a n t h e p r o t5 0 和t h es w i s s p d bv i e w e r 对其性质和结构进行了相应预测，其等电点p i = 4 0 3 5 ，二级结构中螺旋占4 0 ，盘绕占2 7 ，转角占2 0 ，折叠占1 3 ，第四位p r o 处有一个折叠，且结构中有四个电荷集中区域，最后经离体豚鼠回肠实验发现，该肽可以抑制回肠盼自主收缩，绘制量效曲线得出它的半数抑制浓度为i c = 3 1 7 7 m g m l ，小鼠负重游泳试验也证明该肽确有明显的抗疲劳作用。关键词：阿片肽；分离纯化；结构；阿片活性；离体豚鼠回肠；抗疲劳s t u d yo np r e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n do p i o i da c t i v i t yd e t e c t i o nm e t h o d so fo p i o i dp e p t i d ea b s t r a c to p i o i dp e p t i d e sa r eak i n do fn e u r o n i m m u n ep e p t i d e sw i t hh o r m o n ea n dn e u r o t r a n s m i t t e rf u n c t i o n s ，w h i c hc o n f e ro p i o i dp e p t i d e sa ni m p o r t a n tm e d i a t o rt or e g u l a t et h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e ma n dt h ep e r i p h e r a lo r g a n s t h e yc a nb h ed i v i d e di n t oe n d o g e n o u so p i o i dp e p t i d e sa n de x o g e n o u so p i o i dp e p t i d e s q u i t eaf e wo p i o i dp e p t i d e sa r ef r o mc a s e i n h i d d e no ri n a c t i v ei nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fc a s e i n 。t h e yc a l lb er e l e a s e do ra c t i v a t e dv i as p e c i f i c e n z y m e m e d i a t e dp r o t e o l y s i s s oi nv i t r o ，c e r t a i nq u a n t i t yo fo p i o i dp e p t i d e sc a nb eo b t a i n e db ya d j u s t i n ga p p r o p r i a t ep h t e m p e r a t u r ea n dt h et i m eo f h y d r o l y s i s ，u s i n gc o n g r u e n te n z y m eo rc o m b i n a t i o n i n t h i sp a p e r 。c a s e i nw a sh y d r o l y z e dv i ad i f f e r e n te n z y m e sa n dt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gm a x i m a lo p i o i da c t i v i t i e sw e r ee s t a b l i s h e d a f t e rs e d i m e n t a t i o no fe t h a n o la n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yo fc a s e i nh y d r o l y s a t e ，as o r to fo p i o i dp e p t i d ew a si s o l a t e d b ya n a l y s i so fi t sa m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n dc o m p a r e dw i t ht h es e q u e n c eo fc a s e i n 。i tw a sf o u n dt ob ear o v e lo p i o i dp e p t i d e t h e n ，t h es p a t i a ls t r u c t u r ew a ss p e c u l a t e d m e a n w h i l e ，o p i o i dp o t e n c i e sw e r em e a s u r e di ng p i ( g u i n e ap i gi l e u m )b i o a s s a ys y s t e ma n da n t i f a t i g u ee f f e c t sw e r ei d e n t i f i e db yt h ew e i g h t - l o a d e ds w i m m i n gt e s t t h er e s u l t so ft h es t u d ys h o w e dt h a to p i o i da c t i v i t i e so fp e p t i cc a s e i nh y d r o l y s a t ew e r eh i g h e rt h a nt r y p t i ca n dp a p a i nc a s e i nh y d r o l y s a t e t h eo p t i m u me n z y m eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n sw e r e ：s u b s t r a t e3 ( w v ) ，p e p s i n ：s u b s t r a t er a t i o 【e s 】3 0 0 0 0 u g ，h y d r o l y s i sf o r15 0m i n u t e sa t4 2 。p h = 2 0 t h e n ，8 0 e t h a n o lw a su s e dt od e p o s i to t h e rm i s c e l l a n e o u sp r o t e i n s w i t hs u b s t a n c e so fo p i o i dp o t e n c yp r e s e r v e di nt h es u p e r r a t a n t t h et h i r dp e a ko fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo i ls e p h a d e xg 5 0w i t ho p i o i dp o t e n c yw a ss e p a r a t e db ys e p h a d e xg - 1 5a g a i n t h ef o r t hp e a kw i t ho p i o i da c t i v i t yw a sc o l l e c t e d a n di tw a sp r o v e dt ob eap u r ep e p t i d eb yt r i c i n e s d s - p a g ea n dt h eh i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s v i aa n a l y s i so f a m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n dg o o d n e s so ff i tt e s t ，i tw a sc o r r e s p o n d i n gt o1 4 4 - 1 5 8s e q u e n c eo fa i p h a - s 1 - c a s e i n ：y f y p e l f r q f y q l d a ，w i t ham o l e c u l a rw e i g h t2 2 5 2 4 8 a f t e rq u e r yi nt h ei n t e m a t i o n a la u t h o r i t a t i v ep r o t e i na n db i o a c t i v ep e p t i d ed a t a b a s e i tc a l lb ef o u n dt h a ti ti san o v e lo p i o i dp e p t i d e t h ep r o p e r t i e sa n ds p a t i a ls t r u c t u r e so ft h ep e p t i d ew e r es p e c u l a t e db yp r o t e i ns e q u e n c ea n a l y s i ss o f t w a r ea n t h e p r o t5 0a n dt h es w i s s p d bv i e w e r t h er e s u l t si n d i c ：a t e dt l l a ti t sp lw a s4 0 3 5 n l e r ew e r e4 0 h e l i x e s ，2 7 c o i l s ，2 0 t u r n s ，3 s h e e t si 1 3 i t ss e c o n ds t r u c t u r e w i t has h e e ti nt h ef o r t ha m i n or e s i d u ep r oa n df o u rc h a r g ea r e a si nt h es p a t i a ls t r u c t u r e f i n a l l y ，f r o mg p i ，t h ec o n s t r i c t i o no fg u i n e ap i gi l e u mi nv i t r ow a si n h a b i t e db yt h ep e p t i d ea n di t si c s ov a l u ew a s3 17 7 m g m 1 m o r e o v e r , i ta l s oh a do b v i o u sa n t i f a t i g u ee f f e c t sb yp r o l o n g i n gt h es w i m m i n gt i m eo fm i c e k e yw o r d s ：o p i o i dp e p t i d e ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；s t r u c t u r e ；o p i o i da c t i v i t y ；g p i ；a n t i f a t i g u ee f f e c t s 第一章前言l 。l 生物活性肽概述生物活性肽( b i o l o g i e a la c t i v ep e p t i d e s ，b a p ) 是一类分子量较小，在结构上较松散，具有多种生物功能的小肽。通常由氨基酸通过肽键连接而成，它是机体组织细胞的基本组成成分。最简单的肽是由两个氨基酸组成的二肽，其中含有1 个肽键；含有3 个、4 个、5 个等氨基酸的肤分冕哇称为三肢、匹肽、五肽等。出2 到l o 个氨基酸通过肽键形成的直键肽称为寡肽或小肽；由肽键结合起来的多于l o 个氨基酸的聚合体则称为多肽。动物对蛋白质的利用，长期以来一直认为是蛋白质水解成游离氨基酸后才被吸收的，但后来的研究表明，动物在肠道对蛋白质的利用并不局限于游离氨基酸的形式，而大部分是以2 3 个氨基酸组成的寡肽形式吸收的，且具有吸收快的特点，这与游离氨基酸的吸收机理和吸收过程完全不同，避免了氨基酸之间的吸收竞争，同时，肽被吸收后，被水解的氨基酸的种类和数量也影响着蛋白质的代谢水平。有些肤不仅能提供动物生长、发育所需的营养物质，而且还具有防病治病：调节机体生理机能的功效叫2 1 。生物活性肽分布很广，多来源于动植物体。内源性生物活性肽主要包括体内一些重要内分泌腺分泌的肽类激素，如促生长激素释放激素( o h m - i ) ，促甲状腺素( t s h ) ，肝脏合成的类胰岛素生长因子( i g f s ) ，胸腺分泌的胸腺肽、脾脏中的脾脏活性肽( s t f ) ，胰腺分泌的胰岛素等；由血液或组织中的蛋白质经专一的蛋白水解酶作用而产生的组织激肽，如缓激肽、胰激肽：作为神经递质或神经活动调节因子的神经多肽；以及由昆虫、微生物、植物等生物体产生的抗菌肽。外源性生物活性肽直接或间接来源于动物食物蛋白质，如动物乳汁( 尤其初乳) 就可直接提供多种生物活性肽，包括表皮生长因子( e g f ) 、转化生长因子( t g f ) 、神经生长因子( n 6 f ) 、胰岛素及胰岛素样生长因子i 和i i ( i g f i 、i g f i i ) 等，动物饲料蛋白质原料，包括筋肉、牛乳酪蛋白、小麦谷蛋白、小麦醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆蛋白等在动物胃肠道消化后可间接提供多种生物活性肽：也可以进行人工合成，如k g ( 风味欣) 、i d ( 苦昧肽) 等。截止到目前，科学家们已在人体中发现了1 0 0 多种生物活性多默，这些多肽具有传递生理信息，调节生理功能的作用，对于人体的神经、消化、生殖，生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要，所有疾病的发生、发展、治疗、康复都与多肽有关系。按照功能的不同，生物活性肽可以分为以下几种【3 l ：1 1 i 神经活性肽主要存在于牛乳、鲔鱼、大豆及其它豆类等许多食品蛋白质的水解丕苎童些盔堂曼主竺垡丝塞蔓= 童堕童物中。如酪激肽、乳啡肽、a 内啡肽( a - e n d o r p h i n ) 、亮氨酰脑啡肽( l e u - e n k e p h a l i n ) 、甲硫氨酰脑啡肽( m e t - e n k e p h a l i n ) 。它们能调节神经的信息传递，现已成为食品药理学的焦点之一。1 1 2 抗菌肽和抗病毒多肽包括细菌与真菌来源的环肽、糖肽、脂肽等；y i n g z h a n g从蚕豆( v i c i af a b a ) 这种豆类植物中也获得了植物抗菌肽，命名为f a b a t i n e 但它只对革兰氏阳性和阴性细菌有效，而对酵母无效；本实验室在对酶切牛乳酪蛋白制备生物活性肽的研究中发现了一种新型的具有抗菌活性的免疫活性肽，并将其命名为“富含酪氨酸具有抗菌作用的免疫活性肽( t y r o s i n e r i c hp e p t i d eo f i m m u n o s t i m u l a t i n g ，简称1 r p i 【4 】) 并且已经通过国家科技部的鉴定，h o l z 研究了真核和原核生物中核糖体合成的抗菌肽，如：杆菌素、昆虫防御素和脊椎动物中的抗菌肽。目前有天然抗菌肽在医药上的应用，运用到食品工业上有部分取代化学防腐剂的趋势，如n i s i n 的使用。1 1 3 酶调节及抑制肽这类多肽参与了许多生化代谢的途径，其中可以抑制血管收缩素转换酶( a c e ) 活性的多肽已经被用作抗高血压的药栽，其蛋白质序歹q c 端多半为脯氨酸，且可以在牛乳酪蛋白、鱼肌肉、玉米蛋白质等水解物及许多发酵食品中发现1 5 j 。1 1 4 激素及激素调节肽包括垂体后叶催产素( d x y - t o c i n ) 、促肾上腺皮质激素( a c t h ) 、垂体后叶加血压激素( v a s o p r e s s s i n ) 、生长激素抑制素( s o m a - t o s t a t i n ) 等，它们具有促进平滑肌收缩、促进类固醇合成以及促进血管收缩的功能。1 1 5 免疫活性肽具有免疫活性的内源肽包括干扰素和白细胞介质，二者都是激活和调节免疫应答的中心。j o l l e s 等( 1 9 8 2 ) 报道从酪蛋白的降解物中分离出的免疫活性肽，能激活巨噬细胞的吞噬功能【6 】。b e r t h o “1 9 8 7 ) 等、p a r k e r 等( 1 9 8 4 ) 从人乳酪蛋白的消化物中获得的六肽( v a l - g l u - p r o - i l e - p r o - t y r ) 和三肽( g l y l e u - p h e ) ，可以通过鼠巨噬细胞激活绵羊红血细胞的吞噬作用1 7 1 i m 。j u l i u s 等( 1 9 8 8 ) 发现绵羊初乳乳清中的一段富含脯氮酸( p r o )的肽段也有免疫调节作用，它能够促进b 淋巴细胞的生长和分化，有些时候也能抑制免疫的反应。1 1 6 戆官肽( s e n s o r yp e p t i d e s ) 阿斯巴甜二肽和天门冬酰丙氨酸酯是甜度较高的甜味剂。迄今为止，阿斯巴甜被7 5 个国家核准使用在数百种的食品和保健产品中，其商业化的成功，促使了更多甜味剂的研究。现已发现了甜味剂的几种新型结构，如含赖氨酸的转化阿斯巴甜二肽、氨基丙二酸二肽，它们可作为阿斯巴甜的替代物，而且在食品加工中不像阿斯巴甜那样呈现酯的性质，所以更为稳定。多肽在食品风味里发挥的作用并不仅局限于它们对基本味的贡献，像g i u - l e u 、p r o g l u 或v a l g h u 等二肽是通过它们的缓冲作2天津商业大学颤士学位论文第一章前言用而增强食品风味的：而谷氨酸寡聚肽则是以苦味掩蔽剂的形式添加到蔬菜汁或果汁中；y 一谷胺酰多肽是葱类的风味前体；在面包、可可和花生发酵时释放出的短肽，能在焙烤时形成多种杂环芳香族的化合物，这是通过多肤与糖的美拉德反应及其降解而形成的【9 j 相对而言，对于氨基酸在热降解时产生风味物质，人们已做了深入的研究，而对多肽在这些反应中的作用却研究得较少。1 1 7 抗氧化肽大量存在于动物肌肉中的肌肽，可在体外抑制被铁、血红蛋白、脂质氧化酶和单态氧催化的脂质氧化作用f l o l 。它还可作为贮存熟肉的氧化型酸败抑制剂。某些肽和蛋白水解物一般可起着重会属清道夫作用和过氧化氢分解促进剂的作用，因而可降低自氧化速率和减少脂肪过氧化氢含量。抗氧化肽作为天然防腐剂将成为动物饲料和人类食品市场中具有重大意义的开发产品。1 1 8 营养肽在营养不良或消化吸收有问题的病人的配方食品上，多肽或蛋白质水解物已经逐渐取代氨基酸作为氮源的应用。人们已经证明二肽与三肽被人体吸收的效率较氨基酸高【i l l 。将y - g l u l y n 强化在小麦面筋中制造面包是非常好的l y n 来源，常在苯丙酮酸尿病患者膳食中添加由游离苯丙氨酸构成的多肽。而且由于多肽的低抗原性使其在牛乳蛋白过敏儿鼋的低过敏婴儿配方食品中得以广泛的应用。长期以来，对多肽的研究集中在内源生物活性肽的医学作用上，而它们在食品构成中的作用则是最近的研究热点。已经认识到多肷对食品感官风味存在一定的影响，在有些食品中( 尤其是奶酪) ，它的苦味、甜昧、酸味以及肉汤味和杏仁味的产生都认为与乳蛋白水解产生的某些肽类有关。有的研究还发现，多肽对提高冻藏肉的风味也有贡献。在最近几年内，已有大量食品来源的多肽被分离和鉴定，其开发重点是食品甜味剂、抗氧化剂，风味剂和营养强化剂。1 2 国内外阿片肽的研究动态及趋势阿片肽( o p i o i dp e p t i d e ) 又称安神麻醉肽，是一种神经活性物质，有激素和神经递质的功能，对中枢神经系统及外周器官均起作用，目前广泛认为阿片肽是全面参与神经系统、内分泌系统及免疫系统的重要因素，被称为神经免疫肷。阿片肽的研究已有3 0 多年的历史，1 9 6 2 年我国学者邹冈、张昌绍发现在第三脑室周围灰质内注入微克级剂量的吗啡，能产生相当于外周注射毫克级吗啡的镇痛作用，从而提出了脑内存在吗啡有效作用位点的创见，被国际上誉为吗啡作用原理研究的里程碑。从此科学家们采用受体药理学方法。努力分离、提取脑内吗啡类药物的专一性结合位点。1 9 7 3 年：1丕整查些鑫竺曼主芏堡丝塞蔓= 皇蔓童p e r t 、s i m o n 、t e r e n i u s 等同时证明了阿片受体的存在f 1 2 j ，从而揭开了阿片肽研究的序幕。它分为内源性阿片肽和外源性阿片肽。1 2 1 内源性阿片肽( e n d o g e n o u so p i o i dp e p t i d e ，e o p )内源性阿片肽是在体内合成，并存在于动物体脑、神经和外周组织中的吗啡样作用物质。它的发现晚于阿片受体，目前已发现的阿片受体主要有6 ( d e l t a ) 、i l ( m u ) 、x ( k a p p a ) 、o f q r ( 孤啡肽受体) 等4 种，且每种受体均有不同的亚型。其中，研究最多的是前三种阿片肽受体，均为糖蛋白，属g 蛋白偶联受体。最先发现的三种内源性阿片欣是脑啡肽( 1 9 7 5 ) 、b 一内啡肽( 1 9 7 6 ) 和强啡肽( 1 9 7 9 ) ，它们有一个共同的结构即其n 末端的4 个氨基酸残基均为t y r g l y g l y p h e ，第一位酪氨酸残基不能替换，否则将失去与阿片受体结合的能力。1 9 9 5 年，o f q r 的内源性配体孤啡肽被发现【1 3 l 。两年之后即1 9 9 7 年，z a d i n a 等发现了u 受体的强效内源性配体内吗啡肽( e n d o m o r p h i n s ，e m ) 0 4 1 。到目前为止，已发现多种内源性阿片肽( 见表卜1 ) ，它们可分为五大家族：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、孤啡肽和内吗啡肽。1 2 1 1 脑啡肽( e n k e p h a l i n ，e n 酗1 9 7 5 年，英国的h u g h e s 等在动物脑内提取到两个吗啡样活性5 肽m 1 ，证明是甲啡肽( m e n k e p h a l i n ，m e n k ) 和亮啡肽( l e n k e p h a l i n 。l e n k ) ，均属于脑啡肽，m - e n k 和l e n k 一级结构的区别仅在c 一端氨基酸残基，分别为甲硫氨酸和亮氨酸。前脑啡肽是脑啡肽的前体，原含有2 6 3 或2 6 7 个氨基酸残基，可酶切加工出甲啡肽、亮q 肽、甲七肽和甲八肽。脑啡肽被认为是6 受体的内源性配体，主要分布于纹状体、下丘脑和杏仁核等区域，用秋水仙素注入脑室后发现e n k 免疫反应阳性神经细胞分布于下丘脑前区、视上核、室旁核、腹内侧核、背内侧核、弓状核、下丘脑外侧区等处，且这些部位均含有阳性神经末梢。1 2 1 2 内啡肽( e n d o r p h i n ，e p )内啡肽的前体是前阿黑皮素( p o m c ) ，原含2 6 5 个氨基酸残基，可水解产生b 一趋脂素、促黑激素和肾上腺皮质激素等。其中b 一趋脂素( 1 3 - l i p o t r o p i n ) 是q 一内啡肽( a - e n d o r p h i n e - e p ) 、b 一内啡肽( 8 一e n d o r p h i i l 8 - e p ) 和y 一内啡肽( t e n d o r p h i n ，1 ，e p ) 的直接前体。1 3 一内啡肽( i b - e p ) 是1 9 7 6 年发现的最早的内啡肽，对u 和6 受体均有较强的亲和力，是一种有3 1 个氨基酸组成的多肽，主要分布于脑和垂体，具有较强的吗啡样活性与镇痛作用，参与免疫和内分泌功能的调节。1 2 1 3 强啡肽( d y n o r p h i n ，d y n )前强啡肽作为强啡肽的前体，原含有2 5 6 个氨基酸残基，可水解产生强啡肽a ( d y n a ) 、强啡肽b ( d y n - b ) 、c l 一新内啡肽( a - n e p ) 和p 一新内啡肽( e - n - e p ) 等，所有这些肽都己从哺乳动物脑组织中分离成功。尽管前强啡肽也含有亮啡肽的序列结构，但它并不水解生成亮啡肽。强啡肽( d y n ) 对k 受体的选择性较强，主要分布于下丘脑、垂体和脑室组织周围。1 2 1 4 孤啡肽( o r p h a n i nf q o f q )孤啡肽( o f o ) 是1 9 9 5 年底由r e i n s c h e i d 及m e u n l e r 分别从鼠和猪脑中分离纯化出的一种新型的内源性阿片肽，它与此前人们发现的孤儿受体( o r l i ) 亲和力很强，被认为是其内源性配体，从此孤儿受体( o r l l ) 也改名为孤啡肽受体( o f q r ) 。孤啡欣( o f q ) 又称痛敏烈1 6 1 ，主要分布于脑内杏仁核、下丘脑和皮层等区域，是一种1 7 肽，分子量为1 8 1 0 d a ，其第一个氨基酸是苯丙氨酸f ，最末氨基酸是谷氨酰胺q ，一级结构与强啡肽a 很相似，氨基端第2 4位氨基酸序列与所有内源性阿片肤的骨架的第2 4 位序列完全相同。1 2 1 5 内吗啡肽( e n d o m o r p h i n s ，e m )1 9 9 7 年4 月，美国新奥尔良市都蓝大学的z a d i n a 等在“自然”( n a t u r e ) 杂志上发表文章宣布从牛脑中发现了对“阿片受体具有高选择性的、强效的内源性配体，其性能类似吗啡，因此被命名为内吗啡肽( e n d o m o r p h i n s ，e m ) ，分为内吗啡肽- 1 ( e n d o m o r p h i n s 1 ，e m - i ) 和内吗啡肽一2 ( e n d o - m o r p h i n s - 2 ，e m 2 ) 【1 4 j ，其中e m - l 是当今所知对u 受体亲和力和选择性最高的生物活性肽。如果把e m l 和e m 一2 与其他3 种阿片肽的前4 位氨基酸残基相比。其第l 位t y r和第4 位p h e 不变，改变的是：( 1 ) 第2 位由g l y 改为p r o ；( 2 ) 第3 位的g i y 改为t r p g 戈p h e ；( 3 )第3 位的p h e 成为酰胺( p h e - n h 2 ) 。这种序列细微变化引起的功能显著改变，足以说明阿片肽氨基酸序列中蕴藏着的信息十分丰富。内吗啡肽广泛分布于小鼠、大鼠、猴、脉鼠等实验动物及人的中枢神经系统内，在人额顶层中含量丰富，它通过与g 蛋白偶联的“阿片受体结合而发挥许多生物学效应，可降低毛喉素( f o r s k l i n ) 引起的细胞内环腺苷酸( c a m p ) 水平的增加，并开放k + 通道，引起k + 外流，且呈剂量依赖性，这些效应可被纳洛酮阻滞。m a r t i n 等认为e m - 2 在神经元的初级感觉神经元中合成并被转运到脊髓背角浅层，在表达p 受体的神经元附近分泌。有学者认为这种分布表明e m 参与伤害性刺激传导的调节和奖赏行为。由于e m 在体内含量极微，目前尚难观察到生理剂量下跏的作用，因此内吗啡肽的真正生理功能尚不清楚，但它的发现被认为是阿片肽研究的一次突破。并将带来阿片肽研究的爆发式进展【 1 。表1 1 内源性阿片肽及其序列内源性阿片肽氮基酸序列甲啡肽( m e n k )y g g f m亮啡肽( l e n k )y g g f l舡内啡肽( a - e p )y g g f m t s e k s q t p l v t6 内啡肽( b - e p )y g g f m t s e k s q t p l v t l f k n a ii k n a y k k g e丫内啡肽( t e p )y g g f m t s e k s q t p l v t l强啡肽a ( d y n - a )y g g f l r r i r p k l k w d n q强啡肽b ( d y n b )y g g f l r r q f k v v ta 新内啡肽( 肛n e p )y g g f l r k y p k9 薪内啡肽( 岱- n e p )y g g f l r k y p孤啡肽( o f q )f g g f t g a r k s a r k l a n q内吗啡肽( e m 1 )y p w f n h 2内吗啡肽( e m 2 )y p f f n h ：1 2 2 外源性阿片肽( e x o g e n o u so p i o i dp e p t i d e )内源性阿片肽的发现说明动物体内有自己的“吗啡”，这已经轰动了整个科学界，随后科学家们又开始考虑动物的食物中是否含有能产生吗啡的物质呢? 众所周知，晚上休息前喝杯牛奶人会更容易入睡，婴儿在喂奶后也会变得异常安静，后来的研究表明这些现象都是由于奶在消化后产生了一种作用于神经系统的生物活性肽阿片肽所致，这种存在于外源性食物中的阿片肽就称为外源性阿片肽( e x o g e n o u so p i o i dp e p t i d e ) ，简称为外啡肽( e x o r p h i n s ) 。乳是外源性阿片肽的通常来源，一般把来自于酪蛋白的阿片肽，叫酪啡肽( c a s o m o r p h i n ,c m ) ，来自于乳清蛋白的阿片肽，叫乳啡肽( l a c t o r p h i n s ) 。1 9 7 9 年b r a n t l 等人最早报道从喂食了牛乳酪蛋白酶解物的豚鼠的回肠纵行肌毛细血管中发现了具有类吗啡活性的短肽 1 8 1 ，他们首先从酶解的1 3 一酪蛋白水解产物中分离到一个七肽物质( t y r p r o - p h e p r o g 1 y - p ro i l e ) 为b 酪蛋白第6 0 - 6 6 氨基酸残基片断，命名为s 一酪啡肽- 7 ( b c m 一7 ) ，与受体具有良好的亲和力，并呈现出阿片肽类所具有的特征，如依赖性、呼吸抑制性等。随后人工合成了8 一c 1 - 7 和它的同系物口- c m - 6 、b c m 一5 、b c m - 4 ，并证明1 3 - c m 一5 在豚鼠回肠试验中具有最强的阿片活性。l i i e i s e l 等则从饲喂牛酪蛋白的微型猪空肠食麋中分离到一个阿片肽，对应b 一酪蛋白第6 0 7 0 氨基酸残基片断t y r p r o p h e - p r o g l y p r o - l i e - p r o a s n- s e r - l e u ，称为b c m l l ，是b c m 一7 的前体。一般来讲，从含3 个氨基酸到含7 个氨基酸的小肽均称为e 一酪啡肽，7 个以上则称一酪啡肽前体。研究结果表明：对于所有不同数量氨基酸残基的酪啡肽，要保持其生物活性，n 一末端t y r p r o p h e 一氨基酸结构不能改变。这b蒌星查些盔竺夔主竺垒堡塞蔓= 童堕壹种结构是其与阿片受体结合不可缺少的，所有类型的b 一酪啡肽都是8 弋龋一1 l 的c 一末端丢掉一或多个氨基酸残基形成的。p 一酪啡肽由于脯氨酸的含量高，可避免被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶降解。但当它被肠吸收后。会被肠粘膜上的二肽基一二肽酶i v ( d p i v )降解成x - p r o ( n - 末端) 二肽类物质。后来又发现来源于入b 一酪蛋白的阿片活性肽有f 5 1 -5 7 、f 5 1 5 4 、f 5 1 - 5 5 、f 4 1 - 4 4 等4 个氨基酸片断，其中f 5 1 5 7 排列顺序与牛的8 - c m - 7 相似，只是在第4 、5 位上不同( t y r p r o p h e v a l - g l n - p r o - l l e ) ，其阿片活性比牛b - c m - 7 低4 - 5倍。l o u k a s 等1 9 8 3 年报道牛乳or 酪蛋白的三个水解片断f 9 0 9 5 、f 9 0 - 9 6 、f 9 1 9 6 同样具有弼片活性【1 9 l ，而且均为8 受体的选择性配体。同年e r m i s c h 等通过给鼠注射标记的b c m 一5后发现这种阿片肽可以很轻松地通过血脑屏障，从而与脑内的阿片受体结合。据c h a b a n c e报道，成年入在大量饮用牛奶后，在其胃肠道内能检测到多种酪蛋白水解产生的酪啡肽片断【2 0 1 ，我们认为这些阿片肽可以直接作用于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的运动或者作为胃肠道激素的外源性调节剂，也可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽，穿过肠粘膜进入外周血液，再透过血脑屏障与中枢阿片受体结合，从而发挥其镇痛、呼吸抑制、促进睡眠、调节行为、刺激摄食等作用。2 0 0 3 年p e r p e m o 等用胰蛋白酶水解y 一酪蛋白又发现了一种含有8 个氨基酸残基的新阿片活性肽t y r p r o v a i g l u p r o p i l e t h r - o l u ，对应y 一酪蛋白的第1 1 4 - 1 2 1 氨基酸序列【2 l 】。2 0 0 5年韩飞等利用基因重组毕赤酵母生产出一种短肽，含1 0 个氨基酸残基，序列为t y r - p r o p h e p r o o l y p r o - l i e - a r g - t y r - g l y ，在b - c m - 7 的基础上又增加t 3 个氨基酸，经检测具有明显的阿片活性陋l 。同年，l i a n gj 等报道从硬虱中分离得到一种阿片肽，序列为l e u v a l v a l t y r -p r o t r p - t h r l y s m e t ，但因这种物质与此前从哺乳动物血色素中提取的阿片肽h e m o r p h i n有很大的序列相似性，而硬虱又是一种以吸食血液为生的动物，所以该肽是硬虱本身产生还是在吸食血液时从宿主获得有待进一步研究1 2 3 1 。另外，a 乳清蛋白含有一个阿片活性序列( t y r g l y l e u - p h e ) ，为第5 0 - 5 3 氨基酸片断，称为a - 乳啡肽( 洳l a c t o r p h i n ) 。与此相似，1 3一乳球蛋白的第1 0 2 1 0 5 氨基酸片断( t y r - l e u - l e u p h e ) 同样具有阿片活性，称为1 3 一乳啡肽( 3 - l a c t o r p h i n ) 。来自于牛血清白蛋白( b s a ) 的3 9 9 4 0 4 片断( t y r g l y p h e g l n - a s n - a l a ) 也是一种阿片肽，称为s e r o r p h i n 。人们在水解酪蛋自得到阿片活性肽的同时，也发现了一些具有阿片拮抗作用的短肽。c h i b a 和y o s h i k a w a 都报道从牛乳和人乳k _ 酪蛋白酶解液中发现其含有类似纳洛酮阿片拮抗作用的短肽，称为酪新素( c a s o x i n s ) 1 2 4 i p 5 1 。目前从k 酪蛋白发现的阿片拮抗肽有c a s o x i n s蒌苎塑些盔兰曼主兰垡堡塞蔓= 童煎童a ( f 3 5 4 1 ，t y r - p r o - s e r - t y r - g l y l e u - a s n ) 、c a s o x i mb 8 - 6 1 。t y r - p r o t y r - t y r ) 和c a s o x i mc ( t 2 5 - 3 4 ，t y r - i l e p r o - i l e - g l n - t y r - v a l - l e u s e r - a r g ) ，其q b c a s o x i n sc 的拮抗活性最高。而c a s o x i n sd 则是从入乳i - 酪蛋白中分离得到的又一个阿片拮抗肽，其序列对应于a s l 酪蛋白的1 5 8 1 6 4 氨基酸片断t y r - v a l p r o p h e p r o p r o p h e 。经研究发现，这些酪新素的c 一末端在甲氧基化能显示出更高的活性。另外，人乳铁蛋白经酶解同样可以产生阿片拮抗肽，现己发现的有三种：l a c t o r f e r r o x i na ( f 318 3 2 3 t y r - l e u - o l y s e r - g | y - t y r - o c h 3 ) 、l a c t o f f e r r o -x i nb ( f 5 3 6 - 5 4 0 , a r g - t y r - 研一g l y - t y r - o c h 2 ) 、l a c t o f f e = o x i nc ( f 6 7 3 6 7 9 ，l y s - t y r - l e u - g l y p r o g i n t y r - o c h 3 ) 。其中l a c t o r f e r r o x i na 选择性结合| l 受体，l a c t o r f e r r o x i nb 、c 则对k受体有比较高的亲和力【2 6 i 。同内源性阿片肽类似，外源性阿片肽也具有自己特定的n 一末端序列：y x f 或y - x - x f 腭。它们的氨基末端均具有t y r 残基( a 酪啡肽除外) ，而且在第三或四位上还有其他的芳香族氨基酸如p h e 、t y r 的出现，这种结构特点对于阿片肽和体内受体位点的特异性结合非常重要。在l o u k a s 报道的三个舡酪啡肤中，f 9 0 - 9 5 和f 9 0 - 9 6 片段的第一个氨基酸残基是a r g ，同其他酪啡肽不同，但研究发现这也是其本身活性所必需的结构特点。由此可见，研究阿片肽的氨基酸序列，对于进一步探讨其结构、功效有着十分重要的价值。下表列出了目前发现的一些主要外源性阿片肽及其序列。表1 2 外源性阿片肽及其序列外源性阿片肽氨基酸序列来源作用y p f p g p i p n s l ( f 6 0 - 7 0 )b 酪蛋白( 牛)y p f p g p i ( f 6 0 6 6 )b 酪蛋白( 牛)y p f p g ( f 6 0 6 4 )b 酪蛋白( 牛)阿片l b - c a s o m o r p h i n sy p f v q p i ( f s l 一5 7 )b 酪蛋白( 人)受体y p f v ( f 5 1 - 5 4 )b 酪蛋白( 人)激动y p f v q ( f 5 1 - 5 5 )b 酪蛋白( 人)剂y p s f ( f 4 1 - 4 4 )b 酪蛋白( 人)r y l g y l e ( f 9 0 9 6 )啦1 酪蛋白( 牛)a - c a s o m o r p h i n sr y l g y l ( f 9 0 - 9 5 )l 一酪蛋白( 牛)y l g y l e ( f 9 1 - 9 6 )i - 酪蛋白( 牛)7 - c a s o m o r p h i n sy p v e p f t e ( f l1 4 一1 2 1 ) r 一酪蛋白阿片a - l a c t o r p h i ny g l f ( f 5 0 一5 3 )叶乳清蛋白天雄商业大学磺士学位论文第一章曹育b - l a c t o r p h i ny l l f ( f 1 0 2 1 0 5 )p 乳球蛋白受体激动s e r o r p h i ny g f q n a ( f 3 9 9 4 0 4 )牛血清白蛋白( b s a )剂c a s o x i n say p s y g l n ( f 3 5 4 1 )k 一酪蛋白c a s o x i n sby p y y ( f 5 8 6 1 )k 酪蛋白c a s o x i n scy i p i q y v l s r ( f 2 5 3 4 )1 c 酪蛋白c a s o x i n sdy v p