（发酵工程专业论文）鸡枞菌丝体及其皂甙的深层发酵条件的优化.pdf

摘要 摘要 鸡枞菌 t e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ( b e r k e l e y & b r o o m e ) h e i m 是与白蚁共生的 真菌，主要分布于非洲热带、亚洲热带、南太平洋岛屿和亚洲的亚热带地区。鸡 枞茵肉质细嫩，气味浓香，味道鲜美，营养丰富。现代医学研究证明，鸡枞菌有 增强人体免疫功能、预防肠癌、治疗食欲不振，痔疮等功效，因此很有必要对其 鸡枞发酵产品做详细的研究。经过植物化学分析表明，在此真菌中主要有多糖， 皂甙，脑苷，香豆素，和麦角甾醇等物质。 皂甙是鸡枞中的主要活性成分，是极具潜力的天然产物资源之一，受到人们 广泛的关注。皂甙是一类具有特殊生理功能的活性物质，具有降血脂、抗菌、抗 病毒、抗氧化、抗自由基、抑制肿瘤细胞生长，免疫调节等作用。本实验研究发 酵过程中鸡枞皂甙的变化规律，并建立了简便快速的测定方法，为鸡枞的进一步 开发和综合利用提供理论依据和科学参考。工作的主要内容包括： ( 1 ) 对实验室保存的鸡枞菌株( j n p f t a 0 1 ) ，通过1 8 sr d n a 序列分析，并 结合i t sr d n a 序列分析确定了其在分类学上的地位。该菌株与t e r m i t o m y c e ss p 的1 8 sr d n a 序列相似性最高，达到9 9 。i t sr d n a 序列分析结果表明鸡枞菌 ( j n p f t a 0 1 ) 与t e r m i t o m y c e ss p z a l 6 4 的i t sr d n a 序列相似性达到9 6 ，说明 鸡枞菌株( j n p f t a 0 1 ) 是t e r m i t o m y c e s 属的一个种。 ( 2 ) 采用分光光度法测定鸡枞发酵菌丝体中皂甙含量。以人参皂甙r g l 为 对照品，在吸收波长为5 5 0n l i l 下，标准浓度在1 0 2 4 0 “g 范围内，浓度与吸光 度呈良好的线性关系，回归方程为：】，= n 0 0 3 0 x - - & 0 4 0 5 ，r 2 = 0 9 9 8 4 。精密度 变异系数( r s d ) 为1 8 9 ，鸡枞菌丝体皂甙类含量为2 6 9m g g 菌丝体。本方 法操作简单快速，灵敏度高且比较准确，可用于测定鸡枞发酵菌丝体皂甙的含量。 ( 3 ) 在摇瓶的水平上，分别考察了发酵培养基不同组分对鸡枞生长的影响 和胞内皂甙产量的影响。通过对发酵培养基碳氮源进行选择及对各主要因素进行 单因素实验，得到优化后的培养基组成为( g l ) ：蔗糖3 0 ，酵母粉3 ，磷酸二 氢钾2 ，硫酸镁1 5 ；通过对培养条件的考察，发现优化后接种量为1 0 ，转速 为1 5 0r m i n ，装液量为1 2 0m l ，温度为2 8 ，p h 为4 时，生物量由最初的1 2 1g l 提高至a j l 5 4g l ，胞内皂甙产量由最初的2 8 4m g l 提高到5 9 5m g l 。与优化前 的培养基相比，生物量和产物产量均有较大提高，生物量是优化前的1 3 倍，胞 内皂甙产量是优化前的2 1 倍。 ( 4 ) 在5l 发酵罐的水平上，对摇瓶进行了发大实验，优化发酵罐转速条件， 在其他实验条件不变外，分别选择转速5 0r m i n 、8 0r m i n 、10 0r m i n 、15 0r m i n 进行实验，得出8 0r m i n 是5l 发酵罐的优化后转速条件。生物量和胞内皂甙产量 分别达到最大值1 5 9g l 和6 4 1m g l 。 关键词：鸡枞，皂甙，测定，发酵，优化 a b s t r a c t a b s t r a c t t e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ( b e r k e l e ya n db r o o m e ) h e i mh a sas y m b i o t i cr e l a t i o n s h i p w i t ht h et e r m i t e s ，a n di ti sf o u n do nt e r m i t ei nt r o p i c a la f r i c a ，t r o p i c a la s i a , s u b t r o p i c a l r e g i o n so fa s i aa n dt h es o u t hp a c i f i ci s l a n d s t e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u sd e l i c a t e df l e s h ， s m e l lf r a g r a n t ，d e l i c i o u st a s t ea n dr i c hn u t r i t i o n m o d e mm e d i c a ls t u d i e sh a v es h o w nt h a ti t h a sb e e nb e l i e v e dt op o s s e s sm e d i c i n a lp r o p e r t i e s ，s u c ha se n h a n c i n gi m m u n ef u n c t i o n ， p r e v e n t i n go fc a n c e ra n dc u r i n go t h e rh e a l t he f f e c t sf o rl o s so fa p p e t i t e ，h e m o r r h o i d s ，e t c t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt od os o m es t u d yo ff e r m e n t a t i o np r o d u c t s p h y t o c h e m i c a la s s a y s r e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fp o l y s a c c h a r i d e s ，s a p o n i n s ，c e r e b r o s i d e s ，c o u m a r i na n de r g o s t e r o li n t h i sf u n g u s t h em a i n c o n t e n t so ft h i sw o r ka r ea sf o l l o w s ： s a p o n i n sa r et h em a i na c t i v ei n g r e d i e n to ft e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ，w h i c ha r eg r e a t p o t e n t i a lr e s o u r c e so fn a t u r a lp r o d u c t sb yt h ew i d e s p r e a dc o n c e r n s a p o n i n si sa na c t i v a t e d s u b s t a n c e 、v i t hs p e c i a lp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s u c ha sr e d u c i n gb l o o df a t ，an t i b a c t e r i a , a n t i - v i r u s ，a n t i o x i d i z a t i o n ，r e s i s t a n c et of r e e r a d i c a la n dt u m o rd ev e l o p m e n t ，g e n e r a t i n g i m m u n i t ye t c w es t u d i e dv a r i a t i o no fs a p o n i ni nt h ef e r m e n t a t i o no ft e r m i t o m y c e s a l b u m i n o s u s ，a n de s t a b l i s h e das i m p l ea n dr a p i dm e a s u r i n gm e t h o dt op r o v i d et h e o r e t i c a l b a s i sa n ds c i e n t i f i cr e f e r e n c ef o rt h ef u r t h e rd e v e l o p m e n ta n dc o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no ft h e t e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s t h em a i nw o r k sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t a x o n o m i cs t a t u so ft e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ( j n p f t a 01 ) w h i c hi sp r e s e r v a t e di n m yl a b o r a t o r y , w a si d e n t i f i c a t e db y18 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i sa n di t sr d n as e q u e n c e a n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t r a i n ss e q u e n c eh a das i m i l a r i t yw i t ht h el8 sr d n a s e q u e n c eo ft e r m i t o m y c e ss p ，w h i c hi su pt o9 9 i t sr d n as e q u e n c ea n a l y s i sr e s u l t s s h o w e dt h a tt h ei t sr d n as e q u e n c eo ft e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ( j n p f - t a o 1 ) h a da s i m i l a r i t y 、析mt h et e r m i t o m y c e ss p z a 16 4o ft h ei t sr d n as e q u e n c e w h i c hi su pt o9 6 i ti n d i c a t e st h a tj n p f - t a 01i sas p e c i e so f t e r m i t o m y c e s ( 2 ) t h es p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o dw a su s e df o rd e t e r m i n i n gt h ec o n t e n to fs a p o n i n s f r o mt h em y c e l i ai ns u b m e r g e dc u l t u r e g i n s e n o s i d er g la st h es t a n d a r d ，a t5 5 0n l n ，t h e l i n e a rr a n g eo ft h es a p o n i n sc o n c e n t r a t i o nw a sf r o m10 鹇t o2 4 0p g ，a n dt h er e g r e s s i v e e q u a t i o nw a s 】，= o 0 0 3 0 x - - o 0 4 0 5 , r 2 = 49 9 8 4 n er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o ft h e a c c u r a c yw a s1 8 9 t h ec o n t e n to fs a p o n i n sf r o mt h em y c e l i ai ns u b m e r g e dc u l t u r ew a s a b o u t2 6 9m e d g i ti sc o n v e n i e n tt oo p e r a t ea n dt h er e s u l ti sa c c u r a t ea n dh i g h l ys e n s i t i v e i t i su s e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to fs a p o n i n sf r o mt h em y c e l i ao ft e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u si n s u b m e r g e dc u l t u r e ( 3 ) w ea l s os t u d i e dt h ee f f e c to f t h em e d i u mc o m p o s i t i o no nc e l lg r o w t ha n di n t r a c e l l u l a r s a p o n i n sp r o d u c t i o ni nf l a s kb ys i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t ，t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o n s w e r ed e t e r m i n e da s ：s u c r o s e3 0g l ，y e a s t3g l ，k h 2 p 0 42g l ，m g s 0 4 。7 h 2 01 5g l t h e e f f e c to fc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw a ss t u d i e d t h r o u g ht h ee x a m i n a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n s ， r e s p e c t i v e l ya tt h eo p t i m a li n o c u l a t i o ns i z e1o ，r o t a t es p e e dl5 0r m i n , v o l u m ei nf l a s k12 0 m l 5 0 0m l ，t e m p e r a t u r e2 8 。c ，c u l t i v a t i o nn a t u r a lp h4 ，b i o m a s sf r o mt h ei n i t i a l12 1g lt o l5 4g l ，t h ei n t r a c e l l u l a rs a p o n i np r o d u c t i o nf r o mt h ei n i t i a l2 8 4m e t et o5 9 5m g l i nt h i s a b s t r a c t c o n d i t i o nt h eb i o m a s si s1 3t i m e so ft h ei n i t i a l i z a t i o na n dt h ei n t r a c e l l u l a rs a p o n i n s p r o d u c t i o ni s2 1t i m e so f t h ei n i t i a l i z a t i o n ( 4 ) w h e nt h eo t h e re x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sr e m a i nt h es a m e ，w es e l e c t e ds p e e do f5 0 r m i n , 8 0r m i n , 1 0 0r m i n ，1 5 0r m i ne x p e r i m e n tt oo p t i m i z eo fs p e e dc o n d i t i o ni n5l f e r m e n t e r , w ec o n c l u d e d8 0r m i nw a sa5lf e r m e n t e rc o n d i t i o n sf o ro p t i m i z e ds p e e d b i o m a s sa n dp r o d u c t i o no fi n t r a c e l l u l a rs a p o n i n , r e s p e c t i v e l y , i su pt ot h em a x i m u m15 9e g l a n d6 4 1m e g l k e yw o r d s ：t e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ，s a p o n i n ，f e r m e n t a t i o n ，o p t i m i z a t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 丝堑： 日 期：竺咝：垒：兰 | 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：丕幽! 导师签名： e l 期： 第一章绪论 第一章绪论 药食用真菌( p h a r m a c e u t i c a lf u n g i ) 是具有保健和治疗疾病作用的的一类真 菌，其药用部位有子实体、菌核菌丝体和发酵液等。属于真菌门中的担子菌纲， 子囊菌纲以及少量半知菌纲，是中草药的重要组成部分，在自然界中真菌大约有 2 0 2 5 万种，我国的真菌资源非常丰富，至少有l o 万余种，其中已报道的有8 0 0 0 余种，具有传统药食用价值的有4 0 0 种左右，但仅有几十种用于临床医疗。据统 计，能产生抗细菌抗病毒产物的真菌有2 0 0 余种，抗肿瘤的真菌有2 0 0 余种。真 菌是寻找新的抗生素和抗肿瘤等药物的宝贵资源库引。 1 1 药食用真菌概述 药用真菌按照其特性分为两大类：一类是药食兼用型，如鸡枞( t e r m i t o m y c e s a l b u m i n o s u s ) 、香菇( l e n t i n u ae d o d e s ) 、木耳( a u r i c u l a r i aa u r i c u l a ) 等；另一类 是医药专用型，如灵芝( g a n o d e r m al u c i d u m ) 、云芝( p o l y s t i c t u sv e s i c o l o r ) 等1 4 j 。 人类开始食用和栽培药用真菌的历史可以追溯到数千年前。据调查考证，在古埃 及、古罗马和古希腊时代，人们就食用野生的蘑菇并且把它当作珍肴美味。从墨 西哥的出土文物以及现在保留在民间的传统习惯可以看出，3 0 0 0 年前的印第安 人就已经有了食用毒蘑菇的习俗，他们借助毒蘑菇毒素产生的致幻作用，进行一 些节日祭奠活动【5 1 ，中国的祖先早在6 0 0 0 7 0 0 0 年前便开始采食蘑菇了。根据出 土文物和文字考证，药用真菌用来象征良药治病、祈福余荫的含义可以追溯到 4 0 0 0 年前【1 】。真菌药物也是我国中药的重要组成部分。早在1 0 0 0 多年前的东汉 末年，世界上第一部神农本草神农本草经所记载的3 6 5 种药物中记载了雷丸， 猪苓、茯苓、银耳等1 0 多种真菌药物。我国著名药学家李时珍在他的名著本 草纲目中收集、整理的真菌药物有鸡枞、灵芝、木耳等2 0 多种，对各种药物 的性能、作用和无毒性分别作了记载【6 j 。 1 1 1 药用真菌药理作用 在我国药用真菌作为药膳或膳食补充物己有2 0 0 0 多年的历史，药用真菌中 的活性组分能增强生理机能，促进机体健康，使精力更为充沛，这些观念已逐渐 为人们广泛接受。药用真菌的化学成分种类多，药理活性主要表现在以下几个方 面【7 】：( 1 ) 抗癌作用：真菌多糖、茯苓三萜。( 2 ) 免疫调节作用：香菇多糖、灵 芝多糖。( 3 ) 心血管系统作用：冬虫夏草中蛋白质大分子部分的提取物、人工培 养的冬菇菌丝体的一种蛋白质、茯苓三萜、人工蛹虫草水提液。( 4 ) 肝脏保护作 用：灵芝乙醚部分。( 5 ) 清除自由基作用：灵芝、灰树花、银耳等的多糖。( 6 ) 抗h i v - 1 活性：灵芝三萜、金针菇子实体中分离出一新的低分子量的蛋白质等。 ( 7 ) 对神经系统的作用：冬虫夏草的乙醇提取物抑s j l , , j , 鼠活动、小刺猴头对抗 江南大学硕士论文 中枢抑制剂、安络小皮伞的镇痛作用。另外，有些药用真菌还有抗病毒、抗菌、 消炎祛痛、补益安神等功效。 1 1 2 药用真菌生产工艺 目前药用真菌的生产主要有以下四种途径【s j ：( 1 ) 人工栽培生产或野外采集 子实体( 或菌核) ，这是传统的生产方式，目前仍占主要地位，所得的子实体( 或 菌核) 多为直接药用如银耳、虫草等，也可用于提取成分的制剂如树舌、云芝等， 更多的是用于复方中药配伍如获荃等；人工培育是重要药源，并且子实体复栽成 功是进行菌体鉴定和复壮所需要的，在这方面我国有较多经验，如虫草、灵芝、 猴头等，但也还存在问题，一些新开发品种的人工栽培不易成功，生产周期长、 生物转化率低，如槐耳等。此外，人工培养子实体在管理上还比较混乱，应用的 菌株、种类有混杂，不好鉴别，有必要进行统一规范、清理和整顿，如灵芝等。 ( 2 ) 固体发酵生产药用菌质：2 0 世纪7 0 年代兴起的固体发酵是在人工严密控 制下应用生物技术，用真菌作为发酵菌种，以富含多种营养成分的农副产品如玉 米芯、甘蔗渣、麦麸等作为发酵基质，双方构成发酵组合，在一定条件下发酵。 此类基质的作用为单向为真菌提供所需碳、氮等营养，发酵所得的产品为菌质， 它包括生长的菌丝体、菌丝体的各种次生代谢产物以及未经发酵的基质残余物。 但在固体发酵生产中难以解决成本、效率和发酵瓶间的个体差异等问题，比较适 用于新开发的品种和不便应用的子实体。( 3 ) 新型双向性发酵生产药用菌质：2 0 世纪9 0 年代兴起的将发酵基质从原来仅利用营养物质到应用中药材成为药性基 质，这就使发酵过程具有双向性，从而产生药性菌质。经过槐茗菌质等几个药性 菌质新品种的验证，只要应用工艺可行、质控标准正确、发酵组合科学，就可能 获得优质、有效的所需的药性菌质。效果比发酵菌种本身、其药用菌质或药性基 质和菌种简单的混合物等有明显的提高。( 4 ) 液体发酵生产菌丝体( 或发酵液) ： 这是借鉴抗生素的生产工艺而进行的近代药用菌生产方法，其产品包括菌丝体和 发酵液，初用于麦角、蜜环菌，后用于云芝、猴头菌、灵芝等的生产，产品的利 用形式多种多样，有的只利用菌丝体，有的将发酵液浓缩干燥后与菌丝体共同应 用，还有的提取多糖等有效成分后再供药用。在具体的生产实际情况中，还需对 发酵工艺条件，发酵液搅拌方式，产品的后处理工艺继续改进提高。但是其生产 的自动化、机械化程度高，利于大规模的生产。 1 1 3 药周真茵的发酵培养 由于目前我国中药面临无序开发、资源枯竭、生物多样性锐减等问题，多 数药用真菌的天然资源稀少，人工栽培由于生长周期长，受外界环境因素影响较 大，很难满足社会需求。而液体发酵技术简单可行，优点是可以进行工业化连续 生产、发酵周期短、规模大、产量高、生产效率高，并且在发酵过程中产生菌丝 2 第一章绪论 或大量增殖的孢子外，还会产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、 核酸、氨基酸、维生素、植物激素、皂甙等多种具有生理活性的物质，具有抗癌、 抗茵、抗炎、抗衰老、抗溃疡等多种功效，对心血管、肾脏、肝脏、神经系统、 性器官等多种人体器官具有防病治病的作用，现在许多研究表明很多真菌液体发 酵的菌丝体多糖含量远高于人工栽培的药用真菌，灵芝发酵的研究也有类似的报 道【9 1 ，因此药用真菌的液体发酵技术已经成为了中药研发的个重要的方向。 液体发酵技术是随着抗生素工业发展起来并逐渐运用到药用真菌发酵中的。 近几年研究人员在菌种分离、培养方式、过程等方面进行了研究，还在菌种筛选 诱变，药用真菌的原生质体的制备、固体发酵、多糖的提取纯化等方面进行了探 讨，为药用真菌的培养开拓了思路。对担子菌中的灵芝、樟芝、灰树花、茯苓、 蜜环菌等，子囊菌中的冬虫夏草、蛹虫草等以及内生真菌【1 0 1 3 】的发酵研究较多， 近年来，药用真菌发酵技术应用越来越广泛，改进发酵条件，提高产物品质，降 低发酵成本，抵抗污染杂菌，发酵的放大和推广方面都是液体发酵研究的重点【l4 。 1 1 4 药用真菌生产中存在的问题 传统的生产方法如野外采集或人工栽培生产子实体( 或菌核) 受到野生资源 稀少、子实体栽培生产周期较长( 4 5 个月) 、生产受气候等条件影响及生物活性 物质含量低等诸多因素制约；固体发酵在药用菌生产方面的优点是原料来源丰 富，发酵周期相对较短( 2 5 4 0d ) ，成本低，操作简单，且不易染菌，但缺乏科 学的发酵终点与质量控制指标；液体发酵在药用菌生产方面有很大潜力，优点是 可以进行工业化连续生产、发酵周期短( 8 1 5d ) 、规模大、产量高、生产效率高， 但发酵条件要求严格，且易染菌，有待于进一步研究和完善【15 1 7 j 。 1 2 鸡枞菌的研究动态 鸡枞菌 t e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ( b e r k e l e y & b r o o m e ) h e i m 是与白蚁共生的 真菌【1 8 以9 1 ，主要分布于非洲热带、亚洲热带、南太平洋岛屿和亚洲的亚热带地区 【2 0 】。鸡枞菌肉质细嫩，气味浓香，味道鲜美，营养丰富。现代医学研究证明，鸡 枞菌有增强人体免疫功能、预防肠癌、养血润燥健脾胃等功效，适用于食欲不振、 虚劳怔忡、痔疮下血者等【2 ，为古今中外颇受赞美的名贵食用菌，因此很有必要 对其鸡枞发酵产品做详细的研究【2 2 j 。 鸡枞隶属于担子菌类、伞菌目( a g a r i c a l e s ) 、白蘑科( t r i c h o l o m a t a c e a e ) 、 白蚁菌属( t e r m i t o m y c e s ) ，本属至目前己发现有2 0 个种以上。鸡枞菌肉质细嫩， 气味浓香，味道鲜美，营养丰富。据本草纲目记载：“南人谓之鸡枞，言其 味似鸡也 ，并具有“益胃、清神、治痔”等功效。据报道，鸡枞菌菌丝干品中 蛋白质含量高达4 9 2 ，超过许多其它种类食用菌菌丝体或子实体干品的蛋白质 含量，且人体8 种必需氨基酸含量占总量的1 5 1 5 ，特别是主粮中缺少的赖氨 江南人学硕士论文 酸和亮氨酸含量高。我国劳动人民采食鸡枞菌的历史悠久。古籍、民间还有其它 称呼它，如鸡宗，伞把菇，鸡丝菇，白蚁菇等等2 ”。 1 2 1 鸡纵菌的形态特征 图i - 1 鸡枞茁的外形 f i gi - it h es h a r po f t e 丌，d t o m y c e sa l b 删i n o s m 子实体光柄菇状或金钱菌状多呈斗笠状，大或小，生于白蚁巢上或白蚁巢逐 出物上：苗盖表面光滑或呈不规则龟裂，蓑帽状、平凸形或圆形，具脐突或无， 表面微白色、灰色、灰褐色到暗褐色，干或湿时粘，菌盖表层菌丝葡匐着生，菌 丝透明；菌褶离生近贴生，密，常常具小菌褶，象牙白色到粉红色；菌柄中央生， 粗细不等，变异很大实心或空心，多内实，肉质、革质到纤维质，绝大多数种地 f 为或长或短的假根，下连白蚁巢，表面污白色、淡黄绿色到黑褐色，基部形态 各异；菌环存在或缺失菌肉肉质，菌丝一体型，无锁状连合；孢子印淡红色，孢 子卵圆形、椭圆形成近圆形，透明，平滑，非淀粉质；担子棍棒状，透明，卵圆 到椭圆形，壁光滑，具有芽孔，4 小梗或2 _ 4 小梗；裙缘有囊状体，异型或不育， 初期双叉列，成熟后多呈规则状平行列：于实层囊状体存在，透明，棍棒状、梨 形域圆柱形到纺锤形，表面光滑或粗糙壁有时增厚或聚折：子实层体菌髓两侧 型或近规则型；皿子实层发育好：菌盖表面为匍匐、辐射菌丝的外皮层1 2 4 。 生于白蚁巢菌台表面的白球状突起( s p h e r u l e s ) ，或称小白球( s p o m d o c h i a ) ， 其直径0 5 25m m ，初期为珍珠白色，后期变为乳黄，早期被认为是小白球菌 ( t e r m i t o s p h a e r i a 幽t h i e i 0 3 e r k l c i f e r r i ) ，现已证实它是鸡枞菌的一个发育阶段。 该白球状突起是由分叉的菌丝交织而成菌丝透明，不具色素，菌丝外向的末端 膨大形成球状胞( s p h a e r o c y s t ) ，近圆形，长圆形，成串、簇生，其末端着生成 串的狭椭圆形分生孢子。 1 2 2 鸡枞茵的分类与分布 鸡檄菌属( t e r m i t o m y c e sh e l m ) 是h e i m ( 1 9 1 4 ) 针对与白蚁( t e r m i t e ) 共 生的伞菌提出的。1 9 7 7 年h e l m 在白蚁与真菌的专著中，把鸡枞菌属分为两 第一章绪论 个亚属：真鸡枞菌亚属和早熟鸡枞菌亚属。真鸡枞菌亚属分为6 组1 类：条痕组、 乳头组、钝项组、粗柄组、盾形组、绵毛组和靛青色鸡枞菌类。鸡枞菌属大约有 2 8 种，我国发现可食用的种约有十多种。 鸡枞菌属主要分布于非洲热带、亚洲热带、南太平洋岛屿和亚洲的亚热带地 区。由于该菌与某些白蚁有互惠的共生关系，故其分布范围与大白蚁群 ( m a c r o t e r m i t i n a e ) 的分布界限极为相近。在我国主要分布在西南三省( 云南、 四川、贵州) ，长江以南的广大地区和台湾、香港、海南及西藏。其中云南达1 2 种，四川有9 种，贵州有8 种，广东有4 种，其它省区仅报道1 2 种。在我国所 产的鸡枞菌属中，其产量最大、分布最广的种是鸡枞菌t e r m i t o m y c e sa l b u m i n o s u s ( b e r k ) h e i m 。东从台湾延至日本的石垣岛，南从海南以南直至苏门腊岛、爪哇岛， 西从大巴山越横断山脉至贡山西部，直至印度和巴基斯坦，北从江苏省句容县境 内的宝华山、长江下游以南的广大地区都有分布。我国传统入食的鸡枞菌主要是 此种洲。 1 2 3 鸡枞茵的生活条件 鸡枞菌是与白蚁共生的真菌。鸡枞菌与大白蚁亚科的昆虫构建的一个完美的 共生生态系统。白蚁构建了蚁巢，培养鸡枞菌菌丝体作食物，二类生物群体互助 互利，共栖于同一生活环境，使群体都得到持续生存和发展。鸡枞菌是白蚁巢中 的主要菌物，白蚁巢中还存在着许多微生物种群，主要是真菌和细菌，放线菌罕 见。真菌中除鸡枞菌外，还有青霉、木霉、黄曲等十余种。在蚁巢弃掉或破坏后 会发生另一类菌物生长，但在蚁巢正常发育时，它们处于被抑制状态。在蚁巢中 除了白蚁外，还有大量共生的无脊椎动物，主要是各种节肢动物，其种类在1 0 0 种以上。白蚁把植物残体、土壤和水搬入蚁巢。新建的蚁巢出蚁后带来的鸡枞菌 菌丝作新培养物质菌种，成长的蚁巢由原来的菌丝作菌种。在一定的条件下，菌 丝体不断地侵入植物残体，分解吸收各种物质，合成菌体生长、繁殖所需的各种 物质，如蛋白质、多糖等。菌丝大量繁殖，在蚁巢内迷宫式的巢道壁上形成小白 球菌。白蚁啃食这些小白球菌获得生长繁殖不可缺少的各种营养物质和抗病物 质。而且，白蚁吞食的活菌丝体，在体内分泌出多种酶，有利于白蚁对所吞食的 植物残体的消化、吸收。同时，白蚁排出的大量的粪便中含有氨基酸和其它可溶 性含氮化合物，鸡枞菌可利用它们作为氮源；粪便中还含有一些蛋白酶，把一些 植物蛋白分解成氨基酸，从而进一步促进鸡枞菌的生长。 鸡枞菌要在颇为恒定的环境中生长。所需的温度较高，一般温度要维持在 2 5 2 6 c 之间。鸡枞所需的空气湿度也较高，一般在9 0 以上。p h 值要在4 0 左 右j 能耐高c 0 2 ，生物素、维生素b 2 、吡哆醇和硫胺素等生长因子能促进其生 长【2 5 】。 5 江南大学硕士论文 1 2 4 鸡枞菌的生活史 由于鸡枞菌是类所谓“蚁”栽的食用真菌，生活史比一般食用菌复杂 今尚束完全探明。据陈楚塑【2 6 i 等人对鸡枞菌( r 口i b u m i n o s u s ) 的孢子萌发 丝细胞核数目等方面进行了研究，初步探明了鸡枞菌的生活史( 图l 一2 ) 。 至 菌 1 图l 也鸡枞生活史 f i gl - 2 t h e l i f ec y c l e o f t e r m i t o m y c e sa l b w n i n o s u s a 担孢子和担子梗b a s i d i o s p o l _ ea n db a s i d i u ms k m b 担孢于萌发b a s i d i o s p o t l 巳 g e r m i n a t i o n ，c 分生孢子c o n l d i a ，d 钊生茁丝p r i m a r yh y p h a e 次生菌丝s c c o n g a r yh y 曲a ， e 锁状联合c l a m pc o n n e c t i o n ，o 小自球s p h e r u l e s ，h 原基p r i m o r d i a l ，i 白蚁巢l h en e s t o f o d o n t o t c r m e s 如r m o t l l u $ ，j 白蚁巢体上的鸡枞苗t e r m i t o m y c e s 口凸啪m 甜驸0 1 1 t h e t e r m i t e t ) e s t ，k 质配p i a s m o g a m y ，l 减数分裂m e i o s i 鸡枞菌除了有性过程外，还有3 个无性循环：( 1 ) 分生孢子萌发成初生菌丝， 经双双融合，形成次生菌丝，又产生分生孢子；( 2 ) 双核的次生菌丝产生分生孢 子，分生孢了= 萌发后又形成次生菌丝；( 3 ) 两初生菌丝间接舍形成双核的次生菌 丝，继而又不断交织成小白球。 鸡枞菌具有担子菌的典型特征，其子实层担子细胞观察，在一般情况下，绝 大多数担子都经过双核至单核( 核配形成2 倍子核) ，经减数分裂形成4 个担孢 子。大多数担孢子是单枝的，偶见到多核，这可能是减数分裂后的有丝分裂。同 时观察到的菌丝细胞核数目。多数是双核，其次是单核，偶见多核。 1 2 5 鸡机茵丝体液体培养 随着食用苗液体深层培养研究的不断深入，鸡枞苗的液体深层发酵培养也取 得了成功，并对培养基、发酵条件、发酵周捌、生理生化等方面作了研究。陈楚 望 2 7 1 等利用鸡枞菌连续发酵生产营养酱油，其最适接种量为2 0 ，发酵时间7d ， 果胶酶和纤维素酶混合处理发酵液，可显著提高氨基态氯和总氮含量氨基酸生 第一章绪论 成率达6 2 8 。发酵温度2 5 2 8 ，p h 4 5 ，搅拌速度1 5 0r m i n ，酶解温度4 5 5 0 ， 该工艺实用、简便，产品成本6 0 0 9 0 0 元t ，其产品主要质量指标超过国际标准， 在经济上是可行的，为鸡枞菌的深度开发、利用提供了一条新途径。胡尚勤幽】 等为了进一步开发利用鸡枞菌，对鸡枞菌进行深加工，采用鸡枞菌子实体为原料， 洗干净后磨成酱醪与辅料混合，装瓶杀菌成为鸡枞酱。并对鸡枞酱用化学方法和 仪器法分别进行营养成分分析。结果表明，鸡枞酱颜色鲜艳，为浅红褐色，味道 鲜美，营养丰富，含有1 7 种氨基酸和人体8 种必需氨基酸，蛋白质含量8 5 1 ， 脂肪1 2 2 ，以及丰富矿物质和维生素，鸡枞酱是一种营养丰富老少皆宜的调味 品。为鸡枞菌的深入研究和开发利用提供了科学依据。 对于鸡枞菌菌丝体的液体培养研究最多的仍然是其培养条件。菌丝体的生长 除需要合适的碳源、氮源、微量元素和维生素外，还需合适的温度、光照、p h 等。胡尚勤【2 9 】等人的研究结果表明：鸡枞菌菌丝体在碳源为葡萄糖，氮源为氨基 酸时，最适c n 为1 2 1 4 ：1 。在2 0 种氨基酸实验中，在分别以谷氨酸、天门冬 氨酸和精氨酸为氮源时，鸡枞菌菌丝体的生长最好，其生物量最高，鸡枞菌菌丝 体对c a 2 + 的需要量最大，其次是k + 和m n 2 + 。对v b l 、v b 2 、v b 3 、v b 5 、v c 、 v m 的需要量在3 5m g l 时鸡枞菌菌丝体生物量最高，对v b 6 、v b l 2 的需要量 在2 0 2 5m g l 时，其菌丝体生物量最高为0 5 8 6 0 5 9 2g l 。胡忠剩3 0 】等人的研 究结果为：研究了不同碳源、氮源和起始p h 对鸡枞菌液体深层发酵的影响，采 用均匀设计方法对发酵培养基进行优化，当培养基的组成为大米水解糖4 2 9 ， k h 2 p 0 4 为0 3 1 ，酵母粉0 5 3 ，p h4 5 时在2 8 、1 5 0r m i n 的条件下培养5 d ，生物量可高达1 9 8g l 。赵呈裕1 3 l j 等人的研究结果为：在其它条件相同的情 况下，饴糖、土豆为碳源时，优于蔗糖和玉米淀粉；黄豆饼粉+ 蛋白胨组合为氮 源时，优于无机氮( 尿素) 、蛋白胨、黄豆粉三种单独氮源；扩大到5 0 0 l 发酵罐 生产，在p h 6 5 7 ，温度2 8 3 0 。c ，经3 0h 左右发酵培养菌丝体得率较高，获得 菌丝体最大收率为2 4 5g l 。南昌大学朱必凤 3 2 】等人报道，鸡枞菌的最适碳源为 玉米淀粉，最适氮源为花生蛋白，最适生长因子为麸皮浸汁，最适p h 为4 7 ， 最适温度2 5 。李筱剩3 3 j 等人报道鸡枞菌生长的最适p h 为6 4 ，最适温度为 2 6 ，最佳c n 比为3 0 4 0 ：1 ，摇床转速为1 4 0 1 4 5r m i n ，强光会抑制菌丝生长， 且人工培养鸡枞菌不需提供外源维生素，液体培养的鸡枞茵丝体氨基酸总量为 2 7 3m g g ( 干重) 。各研究者的报道差异较大这可能是他们所采用的菌种不同所 致。所以除了形态学鉴定外，对菌种有一个标准的合理的鉴定方法，对以后鸡枞 菌的发酵有很大的指导意义。 1 2 6 鸡枞子实体与液体发酵茵丝体营养成分对比 蛋白质和氨基酸是人体需要的重要营养素，而鸡枞菌子实体中含有较为丰富 的蛋白质，氨基酸种类也较为全面，野生鸡枞菌子实体中蛋白质含量为3 6 9 4 ， 7 江南大学硕士论文 含有人体所需的8 种必需氨基酸。研究表明：液体发酵鸡枞菌菌丝体所含的蛋白 质总量为4 9 1 8 ，较子实体中蛋白质含量明显提高，二者必需氨基酸含量占总 氨基酸的比例分别为3 6 0 和3 7 4 ，菌丝体中含量较子实体略高( 见表1 1 ) 。 由此可以看出，鸡枞菌蛋白的营养价值较高，可以利用鸡枞菌菌丝体大规模发酵 生产蛋白质用于食品工业，也可通过酶解等生物技术开发功能性多肽食品1 3 。 鸡枞菌作为名贵野生菌，脂肪含量较低，但多由必需脂肪酸组成，容易吸收。 此外，鸡枞菌中含有丰富的矿物元素和维生素，能为机体提供k 、c a 、f e 、m g 、 z n 、m n 、c u 等人体必需的矿物质和维生素b l 、b 2 、b 3 等，为机体正常功能提 供保障。 表1 1 鸡枞菌子实体和菌丝体氨基酸含量 t a b l e1 - 1a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no ff r u i t i n gb o d i e sa n dm y c e l i u mo f t e r m i t o m y c e sd l b t l m i n o s t l sf r o ms u b m e r g e dc u l t u r e 1 2 7 鸡枞活性物质 赵呈裕1 3 1 1 等人采集中国西昌的野生鸡枞菌子实体，发酵培养获得鸡枞菌丝 体。对其菌丝体化学成分与野生子实体进行对比测试，结果显示：液体发酵菌丝 体含有香豆素0 2 5 ，皂甙0 1 ，麦角甾醇1 3 x 1 0 6 等生物活性小分子物质。 1 2 7 1 鸡枞多糖 m o n d a l 等【3 4 】人对从( t e r m i t o m y c e se u r h i z u s ) 灰鸡枞菌中提取的两种水溶性 多糖的结构进行了鉴定。实验结果表明，鸡枞菌子实体中包含有两种同种物质 p s i 和p s i i 。作为单糖组分，p s i 中只