（材料学专业论文）碳纳米管作为生物支架和胞内给药载体材料的研究.pdf

p h d d i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt os h a n g h a ij i a ot o n g u n i v e r s i t y s t u d yo fc a r b o nn a n o t u b e sb a s e d s c a f f o l db i o m 瞄l t e r i a l sa n d i n t r a c e l l u l a rd r u gc a r r i e r s a u t h o r ：x i a o k ez h a n g s p e c i a l t y ：m a t e r i a l ss c i e n c e a d v i s o r ：p r o f q i n g h u al u s c h o o lo f c h e m i s t r ya n dc h e m i c a le n g i n e e r i n g s h a n g h a ij i a ot o n gu n i v e r s i t y s h a n g h a i ，p r c h i n a n o v e m b e r , 2 0 0 9 上海交通大学博士学位论文答辩决议书 所在 姓名张晓科学号 0 0 5 1 1 0 9 0 1 4 材料学 学科 指导教师 王宗光 答辩 2 0 0 9 一l l 一1 3 答辩 闵行校区化学楼五层演讲厅 日期地点 论文题目 碳纳米管作为生物支架和胞内给药载体材料的研究 投票表决结果：j 一j j( 同意票数实到委员数应到委员数)答辩结论：酶过口未通过 评语和；缸讨! 本论文立足于将碳纳米管( c n t s ) 作为生物支架和靶向给药载体两大主要应用，对细 胞与c n t s 之i 、白j 的相互作用机理给予初步探索，并借用多糖这一自然界广泛存在的天然大 分子，对单壁碳纳米管( s w c n t s ) 进行非共价修饰以构建生物相容性良好的生物支架材 料和胞内靶向纳米载药体系。取得了以下的重要研究结果：1 ) 系统的研究了s w c n t s 和 多肇碳纳米管( m w c n t s ) 构建的c n t s 支架的细胞相容性，阐明了c n t s 的直径、亲疏 水性、表面电荷及c n t s 内部残留的金属催化剂等因素对细胞生长的影响规律。2 ) 利用直 链淀粉、海藻酸钠和壳聚糖等对s w c n t s 进行修饰改性，定量的研究了改性s w c n t s 基 支架与细胞相互作用的机理和舰律。3 ) 构建了种p h 响应的荧光s w c n t s ，对s w c n t s 进入细胞的机理以及进入细胞后的分布和代访 状况进行了跟踪研究。4 ) 通过海藻酸钠和 壳聚糖对s w c n t s 进行非共价修饰，制备兼具靶向和缓释载药的s w c n t s 基载药体系。 本论文条理清晰，层次分明，实验工作量饱满，理论分析深入，结论正确，具有创新 性，是一篇优秀的博士学位论文。论文作者已经掌握了扎实的基础理论和系统的专业知识， 具备了独立从事科学研究工作的能力。作者在答辩过程中能很好地回答了答辩委员们提出 的问题。经答辩委员会投票表决，同意并一致建议校学位评定委员会授予张晓科同学工学 博士学位。 职务姓名职称单位 签名 主席 武利民教授复旦大学 加烈昃一 答 宅纯， 辩 委员 辛忠教授华东理工大学 委 委员 王锦山研究员美国柯达公司 狲 贝 厶 委员王新灵 教授上海交通大学 镌牡 石 成 0 瓣 贝 委员任吉存教授上海交通大学 签 名 委员 委员 秘书 史子兴副教授上海交通大学寝舌罨 也了 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：孑诬日瓷料 日期：。一7 年，月6 日 _ j j - 一 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 ， 不保密囡。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：和诧抖 日期：叩7 年，f 月肜e l 指导教师签名： 日期：砌声，f l i j _ 一 上海交通大学博士学位论文 碳纳米管作为生物支架和胞内给药载体材料的研究 摘要 碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e s ，c n t s ) 是一种人造的、具有类似一维管状结构的碳纳米 材料。由于具有优良的物理和化学性能，c n t s 一经问世就激起了人们极大的兴趣，迅速成 为最热门的纳米材料，在生物医学等诸多领域都有巨大的潜在应用前景。一方面，随着人们 对c n t s 材料的逐步开发和研究，研究者和生产者与c n t s 的接触日益增多，关于c n t s 使 用的安全性问题已经引起各方面的关注和争论；另一方面，人们也在不断的探索如何通过改 性来提高c n t s 的生物相容性并应用于生产生活中，因此c n t s 的研究已成为纳米生物技术 的一个前沿领域和研究热点。其中，c n t s 基人工生物支架和c n t s 基靶向药物载体的研制 开发很有可能是未来的重点发展方向。 本论文立足于将c n t s 作为生物支架和胞内靶向给药载体两大主要应用，对细胞与a n t s 之间的相互作用机理给予初步探索，并借用多糖这一自然界广泛存在的天然大分子，对单壁 碳纳米管进行非共价修饰以构建生物相容性良好的生物支架材料和胞内靶向纳米载药体系。 具体为： 1 ) 对商品化的单壁碳纳米管( r a ws i n g l e - w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ，l a ws w c n t s ) 和多壁 碳纳米管( r a wm u l t i - w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ，r a wm w c ! n t s ) 进行了氧化或纯化处理，通过 真空抽滤方法制备出多种s w c n t s 和m w c n t s 支架材料，并系统的研究了这些由c n t s 构 建的生物支架材料的细胞相容性，利用扫描电镜( s e m ) 和免疫荧光化学等手段探讨了c n t s 的直径、亲疏水性、表面电性和金属催化剂等因素对细胞在c n t s 支架表面的粘附状态、细 胞的粘附斑( 激酶) 分布和细胞存活率的影响规律。 2 ) 利用自然界广泛存在的直链淀粉( a m y l o s e ，a m y ) 、海藻酸钠( a l g i n a t es o d i u m ， a l g ) 和壳聚糖( c h i t o s a n ，c h i ) 等天然多糖对经过纯化处理后的s w c n t s ( p u r i f i e ds w c n t s ) 进行非共价包覆修饰，制备了多种细胞相容性的多糖s w c n t s 纳米纤维结构生物支架，这 些支架的细胞相容性好坏顺序依次为：a m y - s w c n t s c h i s w c n t s c h f a l g s w c n t s a l g s w c n t s p u r i f i e ds w c n t s 。与未经多糖修饰的s w c n t s 支架相比，多糖修饰后的 s w c n t s 支架的细胞相容性明显提高，并进一步探讨了支架表面的官能团种类、表面电性、 亲疏水性等因素对细胞的粘附状态、细胞的粘附斑( 激酶) 分布和细胞存活率的影响规律。 3 ) 研究了s w c n t s 的长度、浓度、与细胞作用时间以及残留的金属催化剂等因素对 l 上海交通大学博士学位论文 s w c n t s 和细胞相互作用的规律。发现在悬浮状态下，s w c n t s 中的金属催化剂也具有明 显的细胞毒性；长度较长的r a ws w c n t s 和p u r i f i e ds w c n t s 进入细胞能力较弱，而长度较 短( 1 e n g t h r a ws w c n t s p u r i f i e ds w c n t s 。c u ts w c n t s 毒性具有 一定的浓度和时间依赖性，在浓度较大和作用细胞时间较长的情况下，会造成胞内活性氧水 平升高，生成内部空泡，导致细胞凋亡胡；死。但在缩短c u ts w c n t s 作用细胞的时间后，c u t s w c n t s 仍然可以进入细胞内部，毒性效果却不明显，并不影响细胞的增殖分裂。由此确 定s w c n t s 基送药体系的优化实验条件是：s w c n t s 需要截短、纯化，浓度选择( 0 1 0 0 t t g m l ) ，与细胞的作用时间选择为1h 左右。 4 ) 创新性的利用一种低毒性荧光染料吖啶橙( a c r i d i n eo r a n g e ，a o ) 对c u ts w c n t s 进行非共价修饰，制备出具有p h 荧光响应特性的s w c n t s 。用a o s w c n t s 研究了s w c n t s 进入细胞的机理以及在细胞中的分布和代谢情况，发现a o s w c n t s 可以通过网格蛋白介 导的内吞方式进入具有酸性环境的细胞器溶酶体内，并在其中长期存在( 7 d ) ，但几乎不 影响细胞的生长和增殖，随着细胞数目增多，单个细胞内部的碳管数量会逐渐减少。 5 ) 利用壳聚糖( c h i ) 和海藻酸钠( a l g ) 对c u ts w c n t s 共同进行非共价修饰，并 引入靶向分子叶酸( f o l i oa c i d ，f a ) 和葸环类抗癌药物阿霉素( d o x o r u b i c i n ，d o x ) ，制备 出一种兼具靶向和缓释效果的胞内给药载体体系( d o x f a c h i a l g s w c n t s ) 。通过调节 s w c n t s 表面修饰的多糖，可以实现对载体载药率和缓释速度的调控。f a c h i a l g s w c n t s 可以通过叶酸介导的内吞方式高效的将d o x 送入到h e l a 细胞的溶酶体内，在酸 性p h 的环境下，d o x 逐渐释放并与细胞核内d n a 结合从而抑制细胞增殖。因此， d d x f a c h 姒l g s w c n t s 具有载药率高、靶向性好、并具有p h 响应的缓释性能等优点， 有望用作新型的抗肿瘤给药体系。 关键词：碳纳米管，多糖，细胞相容性，生物支架，胞内给药载体 2 上海交通大学博士学位论文 s t u d y o fc a r b o nn a n o t u b e sb a s e ds c a f f o l d b i o m a t e r i a l sa n di n t r a c e l l u l a rd r u g c a r i u e r s a b s t r a c t c a r b o nn a n o t u b e s ( c w r s ) a r eam a n - m a d ef o r mo fc a r b o nt h a td o e sn o te x i s ti no u r e n v i r o n m e n tu n t i l19 91 d u et ot h e i ru n i q u ee l e c t r o n i ca n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e sc o m b i n e dw i t h c h e m i c a ls t a b i l i t y , c n t sh a v eb e e np r o d u c e di nt o nq u a n t i t i e s ，a n dt h e i rp o t e n t i a la p p l i c a t i o n r a n g e sf r o mb i o m e d i c i n et h r o u g hn a n o e l e c t r o n i c st om e c h a n i c a le n g i n e e r i n g p e o p l ew i l lh a v e m o r ec h a n c e st of a c et h i sn o v e lt y p eo fm a t e r i a l sa l o n gw i t he x p l o r i n gt h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o no f c n t s t h e r e f o r e ，i ti su r g e n ta n dn e c e s s a r yt oi n v e s t i g a t et h ec y t o b i o c o m p a t i b i l i t yo fc n t s h o w e v e r , i ti sa l s oi m p o r t a n tt oe s t a b l i s ha n dd e v e l o pm o d i f i c a t i o nm e t h o d st oi m p r o v et h e b i o c y t o c o m p a t i b i l i t yo fc n t sf o rs a f e ra n db e t t e ra p p l i c a t i o no ft h e i ro u t s t a n d i n gp r o p e r t i e s i na w a y , t h er e s e a r c ho fc n t sb a s e ds c a f f o l db i o m a t e r i a l sa n dt a r g e t e dd r u gc a r r i e r sh a v eb e e nt h eh o t s p o t si nn a n o b i o t e c i m o l o g y ”棼 t h ep a p e rc o n c e n t r a t e so nt h ea p p l i c a t i o n so fc n t sb a s e ds c a f f o l db i o m a t e r i a l s a n d i n t r a c e l l u l a rt a r g e t e dd r u gc a r r i e r s ，s t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e na n t sa n dc e l l s a n du s i n gt h ew i d e l ys p r e a dn a t u r a lp o l y s a c c h a r i d e st on o n c o v a l e n tm o d i f yt h es i n g l e - w a l lc a r b o n n a n o t u b e st oe s t a b l i s has e r i e so fn o v e ln a n o f i b r o u ss c a f f o l d sa n dab r a n dn e w t a r g e t e da n t i - c a n c e r d r u gd e l i v e r ys y s t e m t h ed e t a i l sa r ea sf o l l o w s ： 1 ) s i n g e - w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( s w c n t s ) a n dm u l t i - w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t s ) w e r ep u r i f i e do ro x i d i z e dt op r e p a r es e v e r a lt y p e so fc n ts c a f f o l d s t h ec y t o c o m p a t i b i l i t yo ft h e c n ts c a f f o l d sw a si n v e s t i g a t e db ys e v e r a lc y t o t o x i c i t yt e s t s ，a n dt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m b e t w e e nt h ec n ts c a f f o l d sa n dc e l l sw e r es t u d i e du s i n gi m m u n o c h e m i s t r ya n ds c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) i tw a sf o u n dt h a tt h ec e l la d h e s i o n ，c e l lf o c a la d h e s i o n ( k i n a s e ) d i s t r i b u t i o n a n dc e l lv i a b i l i t yc o u l db ea f f e c t e db yt h ed i a m e t e r , h y d r o p h i l i c i t y h y d r o p h o b i c i t y , s u r f a c ec h a r g e a n dt h em e t a lc a t a l y s to f t h ec n t s 2 ) n a t u r a lp o l y s a c c h a r i d e si n c l u d i n ga m y l o s e ( a m y ) ，a l g i n a t es o d i u m ( a l g ) a n d 3 上海交通大学博士学位论文 c h i t o s a n ( c h i ) w e r ee m p l o y e df o rn o n c o v a l e n t l yw r a p p i n ga r o u n dt h ep u r i f i e ds w c n t st o p r e p a r ef o u rt y p e so fp o l y s a c c h a r i d em o d i f i e ds w c n t s c a f f o l d s c e l lv i a b i l i t yt e s ts h o w st h a tt h e c y t o c o m p a t i b i l i t yo ft h e s es w c n t s c a f f o l d sd e c r e a s ei nt h ef o l l o w i n go r d e r ：a m y - s w c n t s c h i s w c n t s c h i a l g - s w c n t s a l g - s w c n t s p u r i f i e ds w c n t s i m m u n o c h e m i s t r y a n ds e ms t u d yr e v e a l e dt h a tt h et h ec e l la d h e s i o n , c e l lf o c a la d h e s i o n ( k i n a s e ) d i s t r i b u t i o na n d c e l lv i a b i l i t yw e r ei n f l u e n c e db yt h es u r f a c ef u n c t i o n a lg r o u p s ，h y d r o p h i l i c i t y h y d r o p h o b i c i t ya n d s u r f a c ec h a r g eo fp o l y s a c c h a r i d em o d i f i e ds w c n t s 3 ) t h ec y t o t o x i c i t yo fr a ws w c n t s ，p u r i f i e ds w c n t sa n dc u t ( p u r i f i e d ) s w c n t sw e r e s t u d i e d t h ec y t o t o x i c i t yo ft h e s et h r e et y p e so fs w c n t si n c r e a s ei nt h ef o l l o w i n go r d e r ：p u r i f i e d s w c n t s r a ws w c n t s c 6 0 ( 图 l - 4 ) 。d m b r o w n 等人 5 0 1 发现直径较小，分散性较好的m w c n t s 比容易缠结的c n f s 更能引起巨噬细胞( t h p - 1 ) 内的炎性因子如n 盯一a 和r o s 的产生。z h a n g 等【6 7 】研究了 s w c n t s 、d w c n t s 和m w c n t s 对造骨细胞( o s t e o b l a s t s ) 的毒性作用，实验证明c n t s 对细胞的生长、分化和矿化作用随着作用时间和浓度的加大有明显的抑制作用，同时抑制作 用的大小为s w c n t s d w c n t s m w c n t s 。根据t e m 的观察结果( 图1 4 ) ，发现很少 量的c n t s 可以进入到细胞内部，据此他们认为碳管对细胞新陈代谢的影响作用同时来自于 细胞内和细胞外，而不同c n t s 的毒性差异可能是由于不同的表面能造成的，但并没有进一 步实验论证表面能是如何影响c n t s 与细胞之间的相互作用。 口洲 潮z 0 2基鹞 i 3 0 d o “帕，嘲勺 图l - 4 左图，不同浓度下s w c n t s 、直径为1 0 - - 2 0n l n 的m w c n t s 和富勒烯对肺泡巨噬细 胞的毒陛。右图，经c n t s 处理后的造骨细胞。( a ，b ) 细g e h ) t5 0i , t g m ls w c n t s 处理；( c ，d ) ) 细胞被5 0o g m lm w c n t s 所处理点箭头指向细胞膜，实线箭头指向胞内的c n t s f i g u r e1 - 4l e f t ，c o m p a r i s o nw i t hc y t o t o x i c i t yt oa ma m o n gs w n t s ，m w n t i o ( d i a m e t e r - 1 0 - 2 0n m ) ，a n dc 6 0a td i f f e r e n td o s a g e m g h t , t e mi m a g e so f t h ei n t e m a l i z a t i o no f c a r b o nn a n o t u b e s ( a ，b ) c e l l st r e a t e dw i t h5 0 烬m l 一1s w c n t s ；( c ，d ) c e l l st r e a t e dw i t h5 0 甥 m l m w c n t s d o t t e da r r o w si n d i c a t ee x t r o c y t o p l a s m i cs u r f a c ea n ds o l i da r r o w ss h o wt h e c n l 隐 关于c n t s 的长度对细胞毒性的影响目前研究的相对较少【6 5 ，6 6 】。y o s h i n o b u 等【6 6 】将 m w c n t s 在浓硫酸浓硝酸的混酸溶液中超声并用滤膜收集得到了两种长度分别为大约2 2 0 l i r a 和8 2 5n m 的m w c n t s ，并研究了这两种m w c n t s 对巨噬细胞1 l 口1 的毒性作用。研 s 船 雒 祷 仲 o 一害一鼍蚤琶虿。，墨童嚣一 上海交通大学博士学位论文 究发现当m w c n t s 被植入小鼠皮下组织四周后长度为2 2 0n l n 的c n t s 被巨噬细胞吞噬后出 现于溶酶体中，而8 2 5n m 的m w c n t s 被吞噬后则出现在细胞质中，且长度为2 2 0n l l l 的 c n t s 引起的炎症程度轻于8 2 5a m 的m w c n t s 。但是体外细胞实验却未发现这两种长度的 m w c n t s 对细胞有任何的毒性作用，这个结果可能是因为实验采用的m w c n t s 剂量太小 ( 1 8m q ) ，美国p a l l 公司m i l l i - q 纯水机制得； 四甲基偶氮唑盐干粉( m t r ) ，s i g m a 公司； w s t - 1 细胞毒性检测试剂盒，购于碧云天生物技术研究所； 3 2 上海交通大学博士学位论文 细胞内活性氧检测探针2 ，5 - d i c h l o r of l u o r e s c e i n c i a c t a t e ( d c h - i d a ) ，购于s i g m a 公司： 细胞打孔液t r i t o nx - 1 0 0 ，购于s i g m a 公司； 小鼠i g g la n t i - f a k 抗体购自b ds c i e n c e s ，罗丹明标记的山羊抗小鼠i g g 二抗购自上海 康成生物工程有限公司。 2 2 2 实验 2 2 2 1c n t s 的氧化处理 将商业购买的c n t s ( r a wm w c n t s 或r a ws w c n t s ，5 0 0r a g ) 分散子5 0 0m l9 8 h 2 s 0 4 和6 5 h n 0 3 混和酸0 ：1 ，v v ) 中，0o c 冰水浴下超声6h ，用超纯水( 1 8 2m q ) 洗涤至中性 并用抽滤装置经0 4 5 肛1 偏氯乙烯微孔滤膜( p v d c ，滤膜先浸泡于乙醇中1 0s 润湿， 下同) 真空减压抽滤收集，6 0 。c 真空干燥2 4h 后，得到氧化的c n t s ( o x i d i z e ds w c n t s 和o x i d i z e dm 陬，c n r s ) 。 2 2 2 2s w c n t s 的纯化处理。矗 在装有磁力搅拌转子的2 5 0m l 单颈圆底烧瓶中，加入r a ws w c n t s ( 4 0m g ) 和稀硝酸 ， ( 2 6m o l l ，1 2 0m l ) ，超声处理3 0m i n 后，放到油浴中并装上球型冷凝管及尾气吸收管， 加热到回流状态，搅拌2 4h 。反应结束后，冷却，用超纯水洗涤至中性并收集，6 0 。c 真空 干燥2 4h 后，得到纯化的s w c n t s ( p u r i f i e ds w c n t s ) 。 2 2 2 3c n t s 支架的制备 分别将一定量的c n t s ( r a ws w c n t s ，r a wm w c n t s ，o x i d i z e ds w c n t s ，o x i d i z e d m w c n t s 和p u r i f i e ds w c n t s ) 分散于超纯水中，经真空减压抽滤固定在p v d c 微孔滤膜上， 并于真空烘箱6 0o c 干燥3h ，得到5 种c n t s 支架，经紫外灯照射过夜灭菌后待用。 2 2 2 4 细胞培养 人类子宫颈鳞状上皮癌细胞( h u m a nc e r v i c a lc a r c i n o m ah e l ac e l l s ，h e l a 细胞) 由上海 市肿瘤研究所提供。细胞培养在含有1 0 f b s 高糖d m e m 培养液中，培养箱恒温在3 7o c ， c 0 2 浓度保持为5 。 2 2 2 5 荧光染色法观察细胞生长形态及细胞凋亡状态 用d i i 染色法可以观察细胞在c n t s 支架上的生长形态。先用消化液将正常h e l a 细胞 酶解收集，并用无菌的磷酸缓冲液( p b s ，p h7 4 ，0 0 1m ，下同) 离心清洗3 次除去细胞 上黏附的血清蛋白。然后将d i i 加入( 终浓度4 “g m l ) ，3 7 。c 下孵育1 0r a i n ，细胞密度约 为l 1 0 6 个m l 。离心收集这些被d i i 标记的细胞，种入不同的c n t s 支架上，培养2 4h 后 在荧光显微镜下观察其生长形态并拍照。 3 3 上海交通大学博士学位论文 采用a o e b 双染法观察细胞凋亡状态。待h e l a 细胞在c h i t s 支架上培养2 4h ，用p b s 对细胞轻轻吹洗，然后将a o e b 混合液加入( 终浓度5r t g m l ) ，室温下孵育5r a i n ，洗去 多余的染料后用荧光显微镜进行观察并拍照。 2 2 2 6 细胞存活率检测 采用w s t - i 试剂盒对细胞存活率进行检测。将c n t s 支架和圆形盖玻片置于2 4 孔板中， 然后将细胞( 5 0 ，0 0 0 个m l ) 种于其上，分别培养2 4h ，4 8h 和7 2h 。培养过程结束后， 移去上层培养液，加入同等体积无菌的p b s 和1 1 0 体积的w s t - 1 溶液，并在培养箱中继续 培养2h 。随后将2 4 孔板中的溶液全部转移入9 6 孔板中，使用酶标仪在4 5 0n l n 处进行检测。 盖玻片上培养相同时间的细胞作为对照组( 1 0 0 细胞存活率) ，没有种入细胞的孔处的吸光 值作为背景。 2 2 2 7 荧光染色法观察细胞内r o s 水平 d c f i - i - d a 用来检测细胞内活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 含量，它能通透细胞 膜，被细胞质中的脂酶水解生成d c h f ，进步被过氧化氢或低分子量的过氧化物氧化成强 荧光性的物质d c f ( 2 , 7 一d i c h l o r o f l u o r e s c e i n ) 。将h e l a 细胞分别种于r a w s w c n t s 和p u r i f i e d s w c n t s 两种支架上并培养至2 4h ，用p b s 轻轻吹洗，再用d c f h - d a ( 4 0i t g m l ) 在3 7 。c 孵育3 0m i n ，用荧光显微镜观察并拍照。 2 2 2 8 扫描电镜观察细胞在c n t s 支架上的铺展形态 细胞在c h t s 支架上培养1 2h ，用p b s 轻轻吹洗后用2 戊二醛和1 锇酸固定，然后 经过乙醇梯度脱水( 5 0 ，7 5 ，8 0 ，9 0 ，9 5 ，1 0 0 浓度) 和c 0 2 临界点干燥后，用扫描电镜( s e m ) 观察细胞形态。 2 2 2 9 免疫荧光法观察细胞中粘附斑激酶( f a k ) 分布情况 细胞在c n t s 支架培养上1 2h ，用3 7 的甲醛溶液室温下对细胞进行固定，1 0m i n 后 用p b s 轻轻吹洗3 次，然后用细胞打孔液( 0 1 t r i t o nx 1 0 0 ) 室温下孵育5m i n ，p b s 轻 轻吹洗3 次。加入细胞免疫染色封闭液( 含3 f b s 的p b s 溶液) 室温下孵育3 0m i n ，加 入一抗a n t i f a k ( 1 ：1 0 0 1 ：2 0 0 ) 4o c 过夜。用p b s 轻轻吹洗3 次，加入罗丹明标记的二抗， 室温下继续孵育3 0m i n ，用荧光显微镜观察并拍照。 2 2 3 仪器与表征 采用高分辨率透射电镜( h i g h - r e s o l u t i o nt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，h r - t e m ， j e o lt e m 2 1 0 0 ) 和分析型透射电镜( a n a l y t i c a lt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，j e o l t e m 2 0 1 0 ) 观察氧化或纯化前后c n t s 的形貌差异。 3 4 上海交通大学博士学位论文 采用扫描电镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，s e m ，j e o lj s m - 7 4 0 1 f ) 对c n t s 支架 的表面形貌和细胞在c n t s 支架上的铺展形态进行观察。c n t s 支架样品在观察前不经喷金 处理，细胞样品经喷金处理。 c n t s 支架的表面亲疏水性表征采用接触角测量仪( c o n t a c ta n g l em e a s u r i n gd e v i c e ，d a t a p h y s i c s ，o c a - 2 0 ) 测量其表面的水接触角，采用座滴法，水滴取3 皿，同一样品表面上至 少选取不同位置的三个点进行测试并取平均值。 荧光染色法观察细胞形态及细胞凋亡状态，免疫荧光法检测细胞中f a k 分布情况均采 用荧光显微镜( f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，o l y m p u s ，i x7 1 ) 观察，并用荧光显微镜成像用 相机( c h a r g ec o u p l e dd e v i c e ，c c d ，p h o t o m e t r i c s ，c a s c a d e6 5 0 ) 拍照。 细胞存活率检测采用酶标仪( m i c r o p l a t er e a d e r ，b i o - r a d ，m o d e l6 8 0 ) 测定。 2 3 结果与讨论 2 3 1 氧化处理前后碳纳米管的结构变化 机 细胞生长通常要求生物材料具有较为亲水的表面，如广泛用作体外细胞和组织培养的聚 苯乙烯由于其表面具有疏水性，不利于贴壁细胞生长，因此在使用前通常要经过富氧等离子 体处理来增加其亲水性。而购买到的c n t s 也具有疏水的表面，因此实验首先对c n t s 进行 氧化处理以提高c n t s 的亲水性。氧化前后c n t s 的t e m 图片如图2 1 所示。从图2 1 a 和 c 中可以看到r a ws w c n t s 和r a wm w c n t s 的末端部位( 见白色三角所指部位) ，封端完好。 图2 - 1 ( a ) r a ws w c n t s ，c o ) o x i d i z e ds w c n t s ，( c ) r a wm w c n t s 和( d ) o x i d i z e dm w c n t s 的 t e m 图片三角指向c n t s 的封闭端( 见a 和c 图) ，箭头指向c n t s 的开口端( 见b 和d 图) f i g u r e2 一lt e mi m a g e so f ( a ) r a ws w c n t s ，( b ) o x i d i z e ds w c n t s ，( c ) l a wm w c n t sa n d ( d ) o x i d i z e ds w c n t s t h et r i a n g l e sp o 硫t ot h ec l o s e de n d s “a ) a n d ( c ) ) ，a n dt h ea r r o w sp o i n tt 0t h e o p e ne n d s ( c o ) a n dc d ) ) 3 5 上海交通大学博士学位论文 而在混合酸氧化和超声的共同作用下，氧化后的c n t s 的封端被打开( 见图2 1 b 和d 中白色 箭头所指部位) 【1 2 】。 2 3 2 碳纳米管支架的表面形貌 通过真空抽滤可以将c n t s 收集和固定在微孔滤膜上制备c n t s 支架【5 】。实验用s e m 来表征c n t s 支架的表面形貌( 如图2 - 2 所示) ，c n t s 经过真空抽滤后均能很好地覆盖在滤膜 上，形成纳米纤维状的支架。其中，s w c n t s 管径小、柔性好、管间作用力强，所以r a w s w c n t s 易互相缠绕聚集成块，支架上团聚严重( 见图2 - 2 a ) ，经氧化处理后由于在管壁上 引入了含氧基团而提高了s w c n t s 在水中的分散性，在制备支架的过程中可以明显减少 s w c n t s 的团聚( 见图2 - 2 b ) 。m w c n t s 的管径大于s w c n t s ，刚性比较强，不容易发生 团聚，所以氧化前后制成的支架的表面形貌没有明显差别( 见图2 2 c 和d ) 。 图2 - 2c n t s 支架的s e m 照片。( a ) r a ws w c n t s ， ) o x i d i z e ds w c n t s ，( c ) r a wm w c n t s ， ( d ) o x i d i z e dm w c n t s 内部插图为水滴在各c n t s 支架表面保持平衡时的照片 f i g u r e2 - 2s e mi m a g e so f ( a ) r a ws w c n t s ，( b ) o x i d i z e ds w c n t s ，( c ) r a wm w c n t sa n d ( d ) o x i d i z e dm w c n t s i n s e t , i m a g e so fw a t e rd r o p so nt h es u r f a c e so fc n ts c a f f o l d s 一般来讲，亲水性表面对细胞粘附有促进作用，而疏水性表面对蛋白质的吸附能力较强。 但细胞与生物支架材料之间的粘附通常是需要以蛋白质为介导的，因此生物支架材料表面的 亲水性并非越强越好，适宜细胞粘附、生长的表面有一最佳的亲水j 琉水平衡值，此平衡值 与细胞种类有关。润湿性的测试表明接触角在四种c n t s 支架上均保持恒定( 同一样品至少 3 6 上海交通大学博士学位论文 测量3 次) ，r a wc n t s 支架的表面处于疏水的状态( 水接触角 1 3 0o ，见表2 1 )