（环境科学专业论文）菲降解菌分离鉴定、降解基因克隆与表达及菲跨膜作用研究.pdf

摘要 蛋白0 c 大亚基编码基因，命名为p h a - z p l ，其在g e n b a n k 登陆号为e u 0 8 2 7 7 6 ，该 基因全长1 2 8 7 b p ，编码3 8 3 个氨基酸。利用c n 3 d 4 1 软件和s w i s sm o d e lw o r k s p a c e 网络工具( h 郇：s w i s s m o d e l e x p a s y o r g ) 推导蛋白质三维结构，结果显示其具有 r i e s k e 型 2 f e 2 s q b 心和单核铁原子结合域这两个在酶的催化功能上具有重要作 用的保守结构。并且其氨基酸序列与来自s p h i n g o m o n a sy a n o i k u y a eb 1 和 s p h i n g o m o n a ss p p 2 的铁硫蛋白0 c 亚基同源性高达9 7 。 5 、根据已知序列设计引物分别在菌株z p l 年i z p 2 中扩增得到了各自的邻苯二 酚双加氧酶基因，分别命名为砌z p j 和砷”z p 2 ，它们在g e n b a n k 中的注册登陆 号分别为：e u 0 8 2 7 7 7 和e u 0 8 2 7 7 7 。利用c n 3 d 4 1 软件和s w i s sm o d e lw o r k s p a c e 网络工具( h t t p ：s w i s s m o d e l e x p a s y o r g ) 推导了基因所编码蛋白质的三维结构。 通过与已知基因序列和编码氨基酸序列的比对，对两段基因进行了遗传亲缘分 析。z p l 菌株c 2 3 0 基f g l p h n z p ，全长7 9 7 b p ，编码2 3 3 个氨基酸，其二级结构主要 为0 c 螺旋和p 链结构，p h n - z p 2 基因全长1 0 4 7 b p ，编码3 31 个氨基酸，其二级结构 同样主要为仪螺旋和d 链结构。 6 、通过基因重组将菌株z p 2 的邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶编码基 p h n - z p 2 在 r o s e t t a 进行了成功表达，初步检测结果显示，重组菌株的酶表达活性要明显高 于出发菌株。 7 、卵磷脂脂质体作为模拟细胞膜被用来研究p a h s 的跨膜特性和膜毒性。 结果显示，此类亲脂性有机物在跨膜的过程中符合n e m s t 分配定律。从而可以计 算出菲在卵磷脂脂质体和水之间的分配系数。研究了离子强度、温度、酸度等 条件对分配作用的影响。此外，首次研究了菲在卵磷脂微囊与模拟细胞液之间 的反分配作用。文中利用大肠杆菌及菲降解菌z p l 进一步研究了菲在不同细菌上 的跨膜作用。实验表明相对于大肠杆菌，菲更容易进入降解菌的细胞膜内，而 展开进一步的降解；在膜上的累积从而导致膜通透性的降低，是芳香环类有机 物表现毒性的可能原因；亲脂性有机物菲通过分配作用富集到磷脂层，然后通 过反分配作用从磷脂双分子层进入到细胞液，从而最终影响细胞的活性和功能。 由以上实验得出跨膜屏障一结构效应( t b s e ) 理论，从而很好的解释了有机物跨 膜过程的行为和膜毒性。 关键词：菲，鞘氨醇单胞菌，假单胞菌，代谢途径，芳香环羟化双加氧酶，邻 苯二酚2 ，3 双加氧酶，膜毒性 a b s t r a c t s t u d i e so nm i c r o b i o a l t o x i c i t y o fp h e n a n t h r e n ea n d i s o l a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o no fp h e n a n t h r e n ed e g r a d e r sa s w e l la sc l o n i n ga n de x p r e s s i o no f d e g r a d a t i o ng e n e s a b s tr a c t i nt h i ss t u d y ，t w op h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n gb a c t e r i a la n da n o t h e rb a c t e r i a lw i t hc a n i m p r o v et h ep h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o ns p e e dw h e ni n o c u l a t e dw i t hp h e n a n t h r e n e d e g r a d i n g s t r a i n sw e r ei s o l a t e d u s i n g t r a d i t i o n a li n c u b a t i o nm e t h o d t h e i r i d e n t i f i c a t i o nw a st a k e nb ys t u d y i n gi t sb i o c h e m i c a la n dg e n e t i cc h a r a c t e r t h e f a c t o r si n f l u e n c i n gg r o w t ho fp h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n gb a c t e r i aa n dd e g r a d a t i o no f p h e n a n t h r e n e ，t h ep h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o np a t h w a y ，t h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o no f p h e n a n t h r e n ed e g r a d i n gg e n eo ft w os t r a i n s ，t h em e m b r a n et o x i c i t ym e c h a n i s mo f p h e n a n t h r e n ew e r ea l s ot e s t e di nt h i sp a p e r t h er e s u l t sw a se x p e c t e dt os u p p l yu s e f u l r e f e r e n c ef o rb u i l d i n gu pa l e r ti n d e xs y s t e m si n s o i lp o l l u t e db yp h e n a n t h r e n e ，f o r e n v i r o n m e n t a lq u a l i t ye v a l u a t i o na n df o rb i o r e m e d i a t i o no fp a h s p o l l u t i o n h e r ea r ep r e s e n t e dt h em a i nr e s u l t so f t h i ss t u d y ： 1 t w op h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n gb a c t e r i as t r a i n sz p1a n dz p 2a n da n o t h e rs t r a i n z p 5w h i c hc a ni m p r o v ez p1 sp h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o ns p e e dw e r ei s o l a t e d f r o ms o i li no i lr e f i n e r yf i e l di ns h a n g h a i t h e yw e r ei d e n t i f i e da sb e l o n gt o g e n u ss p h i n g o m o n a s , p s e u d o m o n a sa n d7 7 s t r e l l a , r e s p e c t i v e l yb a s e do ng r a m s t a i n i n g ，m o r p h o l o g y ，o x y d a s er e a c t i o n ，b i o c h e m i c a lt e s t s ，f a m ea n a l y s i s ， g + cc o n t e n ta n d16 sr d n ag e n es e q u e n c ea n a l y s i s s t r a i nz p1w a si d e n t i f i e d a s s p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i s , w h i l e s t r a i nz p 2w a si d e n t i f i e da s p s e u d o m o n a ss t u t z e r iw h i c hi st h ef i r s t r e p r e s e n t a t i v eo fp s e u d o m o n a s s t u t z e r is p ，a b l et od e g r a d ep h e n a n t h r e n ev e r yf a s ta th i g h e x p e r i m e n t a l c o n c e n t r a t i o n 2 b o t hz p1a n dz p 2h a sw i d et e m p e r a t u r e ，p hr a n g ef o r g r o w t ha n d d e g r a d a t i o n ，a n d c o u l dt o l e r a t eh i g hc o n c e n t r a t i o no fp h e n a n t h r e n e t h e o p t i m a lg r o w t hc o n d i t i o n so fs t r a i nz p 1a n dz p 2w e r ed e t e r m i n e dt ob ea tp h i a b s t r a c t 3 4 7 0 ，3 0o ca n dp h8 0 ，3 7o c ，r e s p e c t i v e l y a d d i t i o no fy e a s te x t r a c t i o n ， p e p t o n eo rg l u c o s ec o u ldp r o m o t et h eg r o w t ha n dp h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o n a b i l i t yo fb o t hz p la n dz p 2t od i f e r e n td e g r e e t h ep h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o n s p e e dw a sn e a r l yt h es a m ew h e n ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，n h 4 c i ，n h 4 n 0 3w e r et e s t e da s d i f f e r e n t n i t r o g e nr e s o r c e s t r a i nz p 1 c a nr e m o v e m o r et h a n9 0 o f p h e n a n t h r e n ea ta n yc o n c e n t r a t i o n sr a n g e df r o m2 5 0t o10 0 0 p p mi n8d a y s w h i l ez p 2c a nn e a r l yc o n s u m et h e ma l li n6d a y s b o t hb r i j3 0a n dt r i t i o n1 0 0 c a ni n h i b i tt h ep h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o ns p e e do fz p 2a th i l 曲c o n c e n t r a t i o n ， b u th a sn oo b v i o u se f f e c to nz p1 t w e e n8 0c a np r o m o t et h ed e g r a d a t i o no f p h e n a n t h r e n eb yb o t hz p 1a n dz p 2 b o t hz p la n dz p 2s h o w h i g hs a l i c y l a t eh y d r o x y l a s e ， c a t e c h o l 1 , 2 - - d i o x y g e n a s ea n dc a t e c h o l2 , 3 - d i o x y g e n a s ea c t i v i t ye s p e c i a l l yc a t e c h o l 2 , 3 一d i o x y g e n a s e t w ok e yp r o d u c t s1 - h y d r o x y 一2 n a p h t h o i c a c i da n d 2 - h y d r o x y - - 1 - n a p h t h o i ca c i dw e r ef o u n di n t h ep h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o n p r o c e s s ，w h i c hc o u l ds u g g e s tt h ei s o l a t e sd e g r a d ep h e n a n t h r e n ev i ap h t h a l i c a c i dp a t h w a y t h eg e n e p h a - z p le n c o d i n g0 cs u b u n i to fa r o m a t i ch y d r o c a r b o nd i o x y g e n a s e w a sc l o n e df r o ms t r a i nz p 1 ，i t sa c c e s s i o nn u m b e ri ng e n b a n kise u 0 8 2 7 7 6 t h ed e t e r m i n a t i o na n ds e q u e n c ea n a l y s i so ft h eg e n ei n d i c a t e dt h a tt h ed n a f r a g m e n tw a s12 8 7b pi nl e n g t h ，e n c o d i n g38 3a m i n oa c id s t w oc o n s e r v e d r e g i o n s ：t h e 【2 f e - 2 s r i e s k ec e n t e ra n dt h em o n o n u c l e a ri r o nb i n d i n gd o m a i n w e r ef o u n da tt h ee x p e c t e dp o s i t i o n sb yd e d u c i n gt h ep r o t e i nu s i n gc n 3 d 4 1 s o f t w a r ea n ds w i s sm o d e lw o r k s p a c ew e bi n s t r u m e n t t h ea m i n oa c i d s e q u e n c e o ft h ep r o t e i ns h o w e dt h e h i g h e s ts i m i l a r i t y w i t ht h a to f s p h i n g o m o n a sy a n o i k u y a eb 1a n ds p h i n g o m o n a ss p p 2 t h eg e n ep h n z pja n dp h n - z p 2e n c o d i n gc a t e c h o l2 , 3 d i o x y g e n s ew a sc l o n e d f r o ms t r a i nz p1a n dz p 2r e s p e c t i v e l y ，t h e i ra c c e s s i o nn u m b e ri ng e n b a n k w e r ee u 0 8 2 7 7 7a n de u 0 8 2 7 7 8 t h ed e t e r m i n a t i o na n ds e q u e n c ea n a l y s i so f t h eg e n ei n d i c a t e dt h a tp h n z plf r a g m e n tw a s7 9 7b pi nl e n g t h e n c o d i n g2 3 3 a m i n oa c i d s ，p h n - z p 2f r a g m e n tw a s1 0 4 7b pi nl e n g t h ，e n c o d i n g3 31a m i n o a c i d s t h es t r u c t u r eo ft h e s et w oe n z y m e sd e d u c e db yu s i n gc n 3 d 4 1s o f t w a r e i v a b s 廿a c t a n ds w i s sm o d e lw o r k s p a c ew e bi n s t r u m e n ts u g g e s t e dt h e yw e r em o s t l y c o m p o s e db y0 th e l i xa n d1 3s t r a n d 6 t h eg e n ep h n - z p 2o fc 2 3 0o fs t r a i nz p 2w a sr e c o m b i n e da n de x p r e s s e di n r o s e t t as u c c e s s f u l l y t h ea c t i v i t yo fr e c o m b i n e de n z y m ep r o t e i ne x p r e s s e db y r e c o m b i n a n to b t a i n e dw a sm u c hm o r et h a nt h a tb yt h eo r i g i n a lz p 2s t r a i ni n p r i m a r yd e t e c t i o n 7 l e c i t h i nl i p o s o m ea st h es i m u l a t i o nm e m b r a n ew a su s e dt oi n v e s t i g a t et h e i n t e r a c t i o n sw i t hp a h ss u c ha sp h e n a n t h r e n e r e s u l t sr e v e a lt h a ta p o l a r c o m p o u n d so b e y e dt h en e r s tp a r t i t i o nl a w t h ep a r t i t i o n c o e f f i c i e n to f p h e n a n t h r e n ew a sc a l c u l a t e d a n di t s b i n d i n gb o n d si n l i p o s o m e sw e r e c l a r i f i e d e f f e c t so fe l e c t r o l y t e ，t e m p e r a t u r e ，a c i d i t yo fs o l u t i o nw e r ea n a l y z e d a sw e l la se f f e c to ft h em o l e c u l a rs t r u c t u r ew a sd is c u s s e di nd e t a i l b e s i d e s ， t h ei n v e r s ep a r t i t i o no fa p o l a rc o m p o u n d sf r o ml i p o s o m et oa na n a l o g u e c y t o s o l w a sf i r s t p r o p o s e d t r a n s m e m b r a n e d i s t r i b u t i o nd i f f e r e n c eo f p h e n a n t h r e n eb e t w e e ne s c h e r i c h ac o ba n dp h e n a n t h r e n e d e g r a d i n gs t r a i n s p h i n g o m o n a ss p z p1w a si n v e s t i g a t e d t h ea p o l a rc o m p o u n d sp e n e t r a t e di n m e m b r a n ep h o s p h o l i p i db i l a y e rb yd i s t r i b u t i o n e f f e c ta n di n t oc y t o s o lb y a n t i d i s t r i b u t i o nw a y r e s u l t ss h o wt h a tc o m p a r et oec o l i p h e n a n t h r e n ew a s e a s i e rt oe n t e ri n t oc y t o p l a s mo fp h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n gb a c t e r i a t h e a c c u m u l a t i o no fp h e n a n t h r e n ei ne e l lm e m b r a n ec a u s et h eb a r r i e re f f e c t ，s oi t m a y b et h er e a s o n o ft o x i c i t yo fp a h sp o l l u t a n t s t h et r a n s m e m b r a n e b a r r i e r - s t r u c t u r ee f f e c t ( t b s e ) w a sa d v a n c e da n di tw i l lp r o v i d eav e r y h e l p f u le x p e r i m e n t a ls t r a t e g y f o rt o x i c i t ya s s e s s m e n to fal i p o p h i l i c c o m p o u n d k e yw o r d s ：p h e n a n t h r e n e ，s p h i n g o m o n a s ，p s e u d o m o n a s ，d e g r a d a t i o np a t h w a y , c a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s e ，m e m b r a n et o x i c i t y v 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 笋哝t | 只l 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在三一年解密后适用 本授权书。 指导教师竺多夕z 匀队位论文作者签名： 箨活f 丁 卅年i f 月_ e i 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名： 卅年 ， 第1 章前言 第1 章前言 1 1 持久性有机污染物研究概述 1 1 1 p o p s 研究概述 随着近代工业的发展，大量有毒有机化合物排放到环境中，使得环境质量 日趋恶化，这一问题已引起全球关注。 和 的出版使人们更为关注这些有机污染物的环境行为及其对人类健康的危害【1 3 l 。 持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，p o p s ) 是一类能够通过各 种环境介质长距离迁徙并长期存在于环境，进而对人类健康和生态环境造成严 重危害的天然或人工合成的有机污染物。分别于1 9 9 8 年6 月和2 0 0 1 年5 月生 效的 和 将包括p a h s 、多氯联苯、艾氏剂在内的等1 6 种物质规定为需优 先采取行动的p o p s 污染物【3 剖。 p o p s 具有以下四个显著特征：持久性，p o p s 排入环境后很难被分解， 可在水体、土壤和沉积物等环境介质中存留数年甚至数十年之久；生物蓄积 性，p o p s 具有低水溶性、高脂溶性特征，从而诱导p o p s 从周围环境介质中富 集到生物体内，并通过食物链的生物放大作用达到中毒浓度；半挥发性，p o p s 能以蒸汽形式进入大气环境或吸附在大气颗粒物上，经远距离迁徙沉降到地面， 正是由于p o p s 的持久性和半挥发性，使得全球范围内，包括大陆、沙漠、海 洋和南北极地区都检测出p o p s 的存在；高毒性，p o p s 大多是对人类和动物 有较高毒性的物质，近年来试验室和流行病学调查都表明，p o p s 可能导致生物 体内分泌紊乱、生殖及免疫机能失调、神经行为和发育紊乱及癌症等严重疾病。 虽然自上世纪8 0 年代以来，各国相继停用p o p s ，但滞留在环境中的p o p s 仍 在迁移和转化，p o p s 已成为全球生态公害，是目前全世界关注的重大环境问题 之一。 第l 章前言 1 1 2 典型p o p s p a h s 的概述 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，简记为p a h s ) 是指2 个或2 个以 上的苯环稠和在一起的一类化合物。是由两个或两个以上的苯环以线形排列、 弯接或簇聚的方式而构成，典型的p a h s 结果如图1 1 。两个以上的苯环连在一 起有两种方式：一种是非稠环型，即苯环与苯环之间各由一个碳原相连，如联 苯、联三苯等；另一种是稠环型，即两个邻位碳原子为两个苯环所共有，如萘、 蒽等。它们在环境中普遍存在，己发现3 0 0 0 0 多种( 包括s ，n ，o 及其烷基同系物) 7 1 ，是最早为人们所认识到的具有致癌变的有机化合物【3 1 。p a h s 具有疏水性、 蒸气压小及辛醇一水分配系数高的特点1 8 】，因此，p a h s 进入海洋环境中后容易 分配到生物体和沉积物中，通过食物链进入人体，对人类健康和生态环境造成 潜在危害。美国国家环保局( e p a ) e 将芴、萘、蒽、苯并( a ) 芘( b a p ) 等1 6 种p a h s 列为优先控制污染物，欧洲则把荧蒽、b a p 等6 种p a h s 作为目标p a h s ，我国水 体6 8 种优先控制污染物中，p a h s 有7 种。全世界每年有近4 3 0 0 0 吨p a h s 进入大 气圈，2 3 0 0 0 0 吨p a h s 进入水环境。其中最具代表性的三致化合物b a p 每年进入 大气的量为5 0 0 0 吨左右，进入水环境的有7 0 0 吨之岁6 1 ，因此必须对p a h s 类物 质进行有效控制和治理。 大多数p a h s 不溶于水，它们的水溶性随分子量的增加而减小，但是当溶液 中存在其它有机化合物时，它们可与这些有机物形成胶体，使水溶性发生很大 的变化。p a h s 沸点高达1 5 0 5 2 5 ，熔点也很高，可达1 0 1 4 3 8 ，分子量在 1 2 8 3 0 0 。由于其自身的琉水性及低水溶性，能很快进入到沉积环境中，可长期 存在；随着苯环数量增加，脂溶性越强，水溶性越低，在环境中存在时间越长， 遗传毒性越高，致病性增刮射1 1 。在自然界中p a h s 一个分子中可能含有几个甚 至十几个芳环，它们的结构特征明显不同，分子量也有很大的变化。分子中的兀 电子系统对化合物的物理、光学特性以及化学稳定性具有重要的影响。它们的 成键轨道能量高，而反键兀奉轨道能量低，使得它们能够吸收可见和紫外范围内 的短波长光能量，形成特征吸收和特征荧光光谱。具有线性排列结构的p a h s 如萘、葸等，能够产生与苯相似的电子波谱，只是波长发生红移。具有规则角 状排列结构的p a h s 女i 菲、屈、芘等，它们的波谱与它们的同分异构体相比要复 杂的多 1 2 - 1 3 1 。 第1 章前言 驴圆 蒽a n t h r a c e n e 菲p h e n a n t h r e n e - ep y r e n e 苯并葸( b e n z ( a ) a n t h 阳c e n e )屈c h r y s e n e 苯并芘( b e n z o ( a ) p y r e n e ) 双苯葸( d i b e n z ( a ，h ) a n t h r a c e n e ) 荧葸( f l u o r a t h r e n e ) 图1 1 典型p a h s 结构和名称 p a h s 在自然界中发生的化学反应可分为取代反应和加成反应，即分子中的 不饱和化学键被破坏，生成较稳定的化合物【1 4 1 。此外，p a h s 在自然环境中的反 应大多是光氧化反应，在自然光或人造紫外线的照射下，p a h s 会与氧气、臭氧 或其它氧化剂反应生成内环过氧化物。另一方面，蒽的光化学氧化会生成二聚 体，如双蒽。菲是蒽的角状同分异构体，它不能发生二聚合反应，但是会氧化 生成9 ，1 0 醌。臭氧也可与这类化合物发生剧烈反应，生成含有醌基化合物和奎 宁类化合物i l3 。p a l l s 还可以与氧化氮或稀硝酸反应。如苯并( a ) 芘在室温下与硝 酸的稀乙酸苯溶液迅速发生硝化反应，生成单硝基衍生物【1 5 】。 1 1 2 1p a h s 的来源与分布及归趋 p a h s 的来源主要有三种途径：生物代谢合成、地球化学作用合成以及人类 活动的输入。前两者属于天然的p a l l s 来源，包括微生物和高等植物合成，以及 火山活动、海底漏斗、森林大火和沉积物矿化等过程