（发酵工程专业论文）盐胁迫下酿酒酵母生理生化特性的研究.pdf

：， i i i il liii i1 11 11f i l liil y 18 12 9 4 6 关于硕士学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规 定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至2 0lo 年上卜月【日为止。 学生签名：业坠益导师签名： 列年 j ，、 ， ， 摘要 摘要 酵母是一种理想的真核模式生物，为广泛用于工业生产的生物材料。细胞在其自然 栖息环境中和工业培养过程中，常常要忍受高盐、高糖渗透胁迫。为了揭示盐胁迫对酵 母的作用，本文以酿酒酵母2 1 4 4 为出发菌，氯化钠作为渗透调节剂。研究了盐胁迫对 酵母细胞生长、形态结构和代谢的影响，希望对相关工业生产提供理论依据。 1 酵母细胞经n a c l 处理后，菌落生长明显受抑制，细胞的活细胞数和生长密度均显 著降低；在0 3m o l ln a c i 作用下，细胞到达稳定期的时间与对照基本一致；而在 0 6m o l l 和1 0m o l ln a c i 作用下，细胞生长缓慢，对数期延长；随着n a c i 浓度 的依次升高，细胞收缩，菌落数依次递减；葡萄糖消耗速率减慢；发酵结束后p h 值降低。 2 分析了n a c l 胁迫下酵母胞内蛋白质的变化规律。在各种浓度的n a c l 胁迫下酵母细 胞均出现了相对分子质量为5 3k d a 的蛋白质，随着n a c i 浓度的升高该蛋白延迟表 达。在添加o 3m o l ln a c i 和0 6m o l ln a c i 胁迫下，培养到1 0h 时均出现两条 蛋白谱带其分子量依次为6 1k d a 和6 5k d a 。 3 分析了酵母细胞对n a + 的吸收特征。随着n a c i 浓度的依次升高，胞n a + 呈升高趋势 而k + 的含量呈下降趋势；n a + k + 比升高且在胁迫条件下的n a + k + 明显高于对照组。 4 研究并发现海藻糖、甘油与酵母耐n a c l 机制有关。酵母菌株在n a c i 胁迫下胞内海藻 糖含量明显高于对照组。随着n a c i 浓度的增加，胞内甘油含量有着明显的增加。在 不同盐胁迫浓度下，酵母胞外甘油的含量均随着胁迫时间的延长，呈现出先上升后 下降的变化趋势。 5 经s e p h a d e xg - 2 5 葡聚糖凝胶层析分离盐胁迫下酵母分泌蛋白可得出：当酵母细胞 培养至8h 时，无论是对照组还是胁迫组均在3 0 管附近出现峰值管；胁迫组均在 4 0 管附近又出现峰值，而对照组则未出现。当酵母细胞培养至1 6h 时，各组均在 2 8 管、4 2 管附近出现峰值管；对照组和添加0 3m o l ln a c l 的胁迫组均在l l 管出 现峰值，而在添加0 6m o l ln a c i 和1 0m o l ln a c i 的胁迫组未出现；添加0 3m o l l n a c l 的胁迫组在5 7 管出现峰值管而对照组和其它两个浓度的胁迫组均未出现。 关键词：酿酒酵母，盐胁迫，氯化钠，渗透调节，分泌蛋白 - f 嘻 吧 r - l a b l s t r a c t a b s t r a c t & e a s ti sag o o do r g a n i s ma n dav a l u a b l eb i o m a t e r i a li ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o n i n b i o c h e m i c a lp r o c e s sw i t hw h o l ec e l lu s e d ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a em a ye n c o u n t e rs e v e r a l e n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s ，s u c ha ss a l i n es t r e s s ，s u g a rs t r e s s t oe v a l u a t et h ei m p a c t so fs a l i n e s t r e s s ，s o d i u mc h l o r i d eh a db e e nc h o s e nf o ro s m o l y t ei no r d e rt or e v e a lt h ei m p a c t so fs a l i n e s t r e s so nc e l l u l a rp r o l i f e r a t i o n ，m o r p h o l o g ya n dm e t a b o l i s m i nt h i ss t u d ys a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e214 4h a db e e nc h o s e nf o rr e s e a r c h 1 e x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a t ，u p o nn a c lt r e a t m e n t ，t h ef o r m a t i o no fy e a s tc o l o n yw a s i n h i b i t e da n dt h ev i a b l ec o u n tw a ss i g n i f i c a n t l yd e c l i n e d u p o ne x p o s u r et o0 3m o l l n a c i ，t h et i m ew h i c ht h ec e l l sr e a c h e ds t a t i o n a r yp h a s ew a st h es a m ea st h ec o n t r o rg r o u p w h i l ei nt h e0 6m o l ln a c ia n d1 0m o l ln a c it r e a t m e n t ，l o gp h a s ew a se x t e n d e d w i t h t h ei n c r e a s eo ft h es o d i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o nt h ec e l l sc o n t r a c t e da n dc o l o n y q u a n t i t i e sr e d u c e d c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ，0 6m o l ln a c ia n d1 0m o l ln a c i d e f e r e dg l u c o s ec o n s u m p t i o nr a t e ，a tt h ee n do ff e r m e n t a t i o nt h eb r o t hp ho ft h es t r e s s g r o u p sw e r el o w e rt h a nt h e c o n t r 0 1 2 e f f e c to fs o d i u mc h l o r i d es t r e s so ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ee x t r a c e l l u l a rp r o t e i nw a s a l s os t u d i e d r e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，u p o ne x p o s u r et on a c l ，an e w5 3k d ap r o t e i nw a s f o u n d w i t ht h ei n c r e a s eo ft h es o d i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o n ，t h i sp r o t e i ne x p r e s s i o nw a s d e f e r r e d w h e nt h ec e l lc u l t u r e dt o10ht w on e w p r o t e i n sw h i c hm o l e c u l a rm a s sw e r e6 1 k d a ，6 5k d aw e r ef o u n di nt h e0 3m o v ln a c la n d0 6m o l ln a c it r e a t m e n t 3 t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fn d a b s o r p t i o nw a sa l s os t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tw i t ht h e s o d i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o ns t e p p e du p ，t h ei n t r a c e l l u l a rc o n t e n to fn a + i n c r e a s e dw h i l e k + d e c r e a s e dt h er a t i oo fn d k + e x h i b i t e da l li n c r e a s et e n d e n c y t h es t r e s s g r o u p s n 心w e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p 4 r e l a t i o n s h i pa m o n gt r e h a l o s e ，g l y c e r o la n dn a c it o l e r a n c ei ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a w e r ea l s os t u d i e d s t r e s sg r o u p sh a dp r o d u c e dm o r et r e h a l o s et h a nt h ec o n t r o lg r o u p t h e c e l l sw o u l da c c u m u l a t ei n t r a c e l l u l a rg l y c e r o lt oa d a p th y p e r o s m o t i cs t r e s sw h i l et h e y d i d n tg e n e r a t e g l y c e r o l i nn o r m a lc u l t u r e a sn a c ic o n c e n t r a t i o nh e i g h t e n e dt h e i i j ， ， j ， 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - a b s t r a c t i n t r a c e l l u l a rg l y c e r o lw a sc l e a r l yi n c r e a s e d t h ee x t r a c e l l u l a rg l y c e r o lw a sa d d e db yt h e s t r e s st i m ep r o l o n g i n g t h e ym a n i f e s t e dat e n d e n c yw h i c hw a sd e s c e n d i n ga f t e rr i s i n g f i r s t 5 s e p a r a t e dt h es a l i n es t r e s ss a c c h a r o m y c e sc e r e v 西i a es e r e t o r yp r o t e i nw i t hs e p h a d e xg 2 5 f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc l o s i n gt ot h et h i r t i e t ht u b ea p e a k v a l u eh a df o u n di nb o t hc o n t r o lg r o u pa n ds t r e s sg r o u p sw h e nc e l lc u l t u r e dt oe i g h t hh o u r a p e a kv a l u et u b ef o u n di n4 0n e a r b yw h i c hw a sn o tf i n di nt h ec o n t r o lg r o u pi ne i g h t h h o u r w h e nc u l t i v a t e dt ot h es i x t e e n t hh o u r , t w op e a kv a l u et u b e sw e r ed e t e c t e di nt h e t w e n t y e i g h ta n df o r t y t w os e p e r a t e d l yi na l lt h eg r o u p s ap e a kv a l u ew a sd e t e c t e di n e l e v e n t ht u b ei nc o n t r o lg r o u pa n dw i t h0 3m o l ln a c is t r e s sg r o u p ，b u td i d n tf i n di n o t h e rg r o u p s ap e a kv a l u et u b ef o u n di nf i f t y s e v e m hi n0 3m o l ln a c is t r e s sg r o u p w h i c hd i d n tf i n d i n gi no t h e rg r o u p s k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e , s al in es tr e s s ，s o diu r r lc hlo tir l e o s m o tic r e g uia t o r y s e c r e t o r yp r o t ein i i i ， j ， 目录 目录 第一章文献综述1 1 1 渗透应激对酿酒酵母的影响1 1 1 1 渗透作用1 1 1 2 环境渗透压对酿酒酵母生存的影响2 1 2 酿酒酵母对渗透胁迫的感应机制2 1 2 1 酿酒酵母对高渗胁迫的感应机制2 1 2 2 酿酒酵母对低渗胁迫的感应机制3 1 3 酵母的盐胁迫应答的信号传导途径。3 1 3 1 高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶途径3 1 3 2 依赖于c a 2 + c a m 的钙调磷酸酶4 1 3 3 环腺磷蛋白激酶a 途径4 1 3 4 雷帕酶素靶分子信号途径5 1 4 盐胁迫应答分子机制。5 1 4 1 离子平衡机制5 1 4 2n a + 平衡6 1 4 3c a 2 + 平 葑6 1 5 酵母抗渗透应激的可能机理7 1 5 1 主要渗透保护性物质的合成7 1 5 1 1 甘油7 1 5 1 2 海藻糖8 1 5 2 影响抗渗透应激的因素1 0 1 5 2 1 细胞周期与兼容溶质1 0 1 5 2 2 液泡10 1 6 微生物胁迫蛋白研究进展1 1 1 6 1 胁迫条件下的微生物蛋白质组学1 l 1 6 2 全局调控网络1 l 1 6 3 盐胁迫反应的蛋白质研究1 2 i v 古 - ， 日录 1 7 本研究的目的、意义及主要内容1 2 第二章盐胁迫下酿酒酵母生理特性的变化1 4 2 1 实验材料1 4 2 1 1 菌株1 4 2 1 2 培养基14 2 2 实验仪器l5 2 3 实验药品l5 2 4 实验方法16 2 4 1 盐胁迫下酵母菌株的生长量测定1 6 2 4 2 盐胁迫下酵母细胞菌落生长情况观察1 6 2 4 3 盐胁迫下酵母细胞存活力的测定。1 6 2 4 4 盐胁迫下酵母葡萄糖含量的测定1 7 2 4 4 1 二硝基水杨酸的配制1 7 2 4 4 2 葡萄糖标准曲线的绘制1 7 2 4 4 3 葡萄糖含量的测定。1 8 2 4 5 盐胁迫下发酵p h 值的测定1 8 2 4 6 盐胁迫下酵母胞内蛋白浓度测定18 2 4 6 1b r a d f o r d 标准曲线的绘制18 2 4 6 2 蛋白样品的制备及其含量测定1 9 2 4 7 盐胁迫下酵母胞内蛋白分子量的测定2 0 2 4 7 1s d s p a g e 电泳技术2 0 2 4 7 2 蛋白质分子量计算方法2 0 2 5 结果与讨论2 1 2 5 1 盐胁迫下酵母菌株的生长量测定2 l 2 5 2 盐胁迫下酵母细胞菌落生长晴况观察2 2 2 5 3 盐胁迫下酵母细胞存活力的测定2 2 2 5 4 盐胁迫下酵母葡萄糖含量的测定2 3 2 5 5 盐胁迫下发酵p h 值的测定2 4 2 5 6 盐胁迫下酵母胞内蛋白浓度测定2 5 2 5 7 盐胁迫下酵母胞内蛋白的s d s p a g e 图谱2 6 2 6 小结2 8 v 目录 第三章盐胁迫下酿酒酵母的渗透调节机制2 9 3 1 实验材料2 9 3 1 1 菌株2 9 3 1 2 培养基2 9 3 2 实验仪器2 9 3 3 实验药品3 0 3 4 实验方法3 0 3 4 1 酿酒酵母培养3 0 3 4 2 盐胁迫下酵母胞内n a + 、k + 离子浓度测定3 0 3 4 2 1 测定条件。3 0 3 4 2 2n a + 、k + 标准曲线的绘制3 l 3 4 2 3 胞内n a + 、k ，离子提取测定3 2 3 4 3 盐胁迫下酵母胞内海藻糖含量测定3 2 3 4 3 1 海藻糖标准曲线的绘制3 2 3 4 3 2 胞内海藻糖的提取和测定3 3 3 4 4 盐胁迫下酵母胞内、胞外甘油含量的测定3 3 3 4 4 1 甘油标准曲线的绘制3 3 3 4 4 2 酵母菌中甘油的提取测定3 4 3 5 结果与讨论3 5 3 5 1 盐胁迫下酵母胞内n a + 、k + 离子浓度动态变化规律3 5 3 5 1 1 胞内n a + 的动态变化规律3 5 3 5 1 2 胞内k + 的动态变化规律3 6 3 5 1 3 胞内n a + k + l 匕的动态变化规律3 7 3 5 2 盐胁迫下酵母胞内海藻糖的动态变化规律3 8 3 5 3 盐胁迫下酵母菌中甘油的动态变化规律3 9 3 5 3 1 胞内甘油的动态变化规律3 9 3 5 3 2 胞外甘油的动态变化规律4 0 3 6 j 、结4 1 第四章盐胁迫下酿酒酵母分泌蛋白的提取分离4 2 4 1 实验材料4 2 4 1 1 菌株4 2 v i 一 ， ， c r 膏 ， 目 录 4 1 2 培养基4 2 4 2 实验仪器4 3 4 3 实验药品4 3 4 4 实验方法4 3 4 4 1 酿酒酵母培养4 3 4 4 2 酵母菌株在盐胁迫下的生长量测定4 4 4 4 3 酵母分泌蛋白的制备4 4 4 4 4 样品的凝胶层析分离4 4 4 4 4 1 凝胶溶胀4 4 4 4 4 2 装柱和平衡4 4 4 4 4 3 色谱床校正4 4 4 4 4 4 加样4 5 4 4 4 5 洗脱与收集4 5 4 5 结果与讨论4 5 4 5 1 不同浓度n a c l 胁迫下酿酒酵母的生长曲线4 5 4 5 2 凝胶过滤层析技术分离酵母分泌蛋白4 6 4 5 2 1s e p h a d e xg 2 5 分离y n b 对照组的分泌蛋白图谱4 6 4 5 2 2s e p h a d e xg 2 5 分离y n b 添加o 3m o l ln a c i 组的分泌蛋白图谱4 7 4 5 2 3s e p h a d e xg 2 5 分离y n b 添加0 6m o l ln a c i 组的分泌蛋白图谱4 8 4 5 2 4s e p h a d e xg 2 5 分离y n b 添加1 0m o l ln a c l 组的分泌蛋白图谱5 0 4 6 j 、 省! ；l 第五章结论与展望5 3 5 1 结论5 3 5 2 展望5 4 参考文献一5 5 致谢5 9 附录a 6 0 附录b 61 v i i 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬综怂 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是传统的工业生产菌株，具有生长旺盛，生 物量大，简单廉价，公认安全性菌株等优良特点，广泛用于食品、医药及化工等发酵工 业中【l 】。在其自然繁殖或是工业培养过程中，酵母细胞常常会受到高盐、高糖等应激的 作用【。 高盐胁迫对酵母细胞的毒害作用包括两方面，一方面是产生离子毒害，在细胞内积 累n a + ；另一方面是产生渗透胁迫，使质膜的跨膜渗透压降低而导致细胞膨压的丧失。 酵母细胞主要通过n a + 的外流、n a + 在囊泡中的区隔化、增加质膜k + 的吸收限制n a + 的 吸收、调节相容性渗调剂和渗透保护的合成和积累，以及胁迫蛋白的表达对盐胁迫产生 应答【3 4 】。 目前高浓度发酵由于其可节省能源，提高产量，降低能耗及生产成本已成为发酵工 业研究的一大热点课题。研究在高渗透压( 简称高渗) 条件下，酵母生理行为、代谢调 控，旨在为大规模应用提供理论依据。高渗胁迫主要发生在发酵初期，发酵醪的渗透压 较高，引起细胞内水分活度、细胞胞质组成发生显著变化，酵母的细胞膜和菌体内的酶 受到破环，从而抑制酵母的生长和发酵，因此要求其必须具有较高的高渗透耐受性。研 究高盐胁迫下细胞的抗逆应答机理有助于揭示生命活动的代谢调控，并对发酵工业的深 入研究具有重要的意义【5 】。 1 1 渗透应激对酿酒酵母的影响 1 1 1 渗透作用 渗透作用的本质是水的运动问题，根据热力学定律，水会自发地从高渗透势向低渗 透势运动。酿酒酵母细胞膜是典型的磷脂双分子层结构，选择性通过底物分子，因此可 视为“半透膜”。其细胞壁的“甘露糖蛋白一葡聚糖一几丁质 复合物构成的骨架赋予细 胞刚性和稳定性。这样，酿酒酵母细胞的内环境与外界被一个“复合膜”隔开。在稳态 时，细胞内的水的渗透势与细胞外的水的渗透势相等，当外界渗透压发生改变时，细胞 吸水或者脱水，微生物细胞内的水活度及细胞质内各种中间代谢物的浓度发生相应的变 疗 f 第一章文献综述 化，引起胞内各种生理代谢活动改变，细胞生长、繁殖被抑制，甚至导致微生物死亡。 在正常生理状态下，细胞内的渗透压较环境的渗透压略高，细胞内外的渗透压差由作用 在细胞膜上的膨压所平衡。 1 1 2 环境渗透压对酿酒酵母生存的影响 环境渗透压的变化对酵母菌的生存有着极其重要的影响，渗透压兀可定义为：将溶 液和溶剂用半透膜隔开，为阻止渗透现象发生而必须施加于溶液液面上的最小压力。其 计算公式为1 - i = c r t ( i i 为渗透压，c 为溶液的浓度，t 为温度，r 为摩尔气体常数) 。由 此可见，在一定温度条件下，渗透压只与溶液的浓度有关。因此，当细胞内部渗透压小 于环境渗透压的时候，细胞内的水分将流向环境，细胞内溶质的浓度急剧上升。这将使 许多胞内酶失活，并导致许多下常的生理代谢过程无法正常的进行，同时细胞膜上的离 子梯度将受到破坏，细胞的生存能力将下降。更加严重的是如果细胞脱水严重，细胞将 面临死亡。当细胞内部渗透压大于环境渗透压的时候，环境中的水分会流向胞内，细胞 迅速膨胀，最终导致细胞涨裂，同样会导致细胞死亡【6 】。 1 2 酿酒酵母对渗透胁迫的感应机制 环境中渗透性突然剧烈改变能引起渗透胁迫，包括高渗胁迫( h y p e r - o s m o t i cs t r e s s ， 渗透压上升) 与低渗胁迫( h y p o o s m o t i cs t r e s s ，渗透压下降) 【7 1 。比较而言，高渗胁迫 的影响相应的要危险的多。高渗透压下能引起细胞脱水并破坏胞内正常生理代谢。而低 渗透压下，会造成酵母细胞的膨胀。 1 2 1 酿酒酵母对高渗胁迫的感应机制 生物的信号传递是指细胞感应胞外刺激后，通过细胞内信号分子的逐级传递作用， 最终诱导一些胞质、细胞核内生理生化反应的过程【引。据推测，酿酒酵母渗透感应有2 种可能方式：胞内某种溶质的浓度突然上升；胞外，结合在细胞膜上的感应蛋白 被激活或抑制7 1 。真核生物系统不是直接将信号传递到转换体系，而是传递给蛋白激酶 级联体系的调节蛋白。高渗胁迫下，细胞内会产生某些可溶性物质来加大内渗透压。 2 第一章文献综述 1 2 2 酿酒酵母对低渗胁迫的感应机制 酿酒酵母处于低渗环境中，为了对付低渗应激，会自动发生一些生理、形态以及代 谢方面的变化。细胞内主要的相容性溶质甘油的聚集程度自动降低，并被释放到胞外培 养基中。低渗对细胞壁和细胞膜通透性都有一定影响，细胞壁的强度变小，而且由于膨 压增大，细胞膜有所膨胀，细胞体积增大。如果在低渗环境中暴露时间继续延长，细胞 将会破裂。为了适应这种逆环境，细胞主动调节胞内物质的浓度，将一些相容性溶质如 甘油【9 1 、海藻糖、甜菜碱和脯氨酸、苏氨酸等【1 0 1 和某些离子转运至胞外，用以降低胞内 渗透压。 1 3 酵母的盐胁迫应答的信号传导途径 高渗透性甘油促分裂原激酶( h i g h o s m o l a r i t yg l c e r o l m i t o g e n - a c t i v i t e dp r o t e i nk i n a s e ， h o g m a p k ) 途径和依赖于c a + c a m 的钙调磷酸酶( c a n ) 途径在酵母适应高渗透胁迫 和盐胁迫的信号传导途径中起主要作用。此外，环腺一磷蛋白激酶a ( c a m p d e p e n d e n t p r o t e i nk i n a s ea ，r a s c a m p p k a ) 途径、雷帕酶素靶分子( t a r g e to f r a p a m y c i n ，t o r ) 信 号途径也在盐胁迫中起重要作用。酵母的盐胁迫应答是通过几种不同的信号传导途径传 递的f 1 1 1 。 1 3 1 高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶途径 目前，已经详细鉴定的m a p k s 途径有酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中的高渗甘油途 径( h o gp a t h w a y ) 1 2 - 1 4 】，见图卜1 。酵母中对盐胁迫强烈应答的大多数基因都高度或 完全依赖于m a p 激酶h 0 9 1 。酿酒酵母m a p k h o g l 是h o g m a p k 途径具有调节功能的激 酶，于1 9 9 3 年首先被b r e w s t e r 等发现并分离出。m a p k s 途径是真核细胞对外界环境刺 激做出应答反应的一种保守的信号传导机制，s c e r e v i s i a e 中已发现6 种m a p k 途径，分 别参与不同的胁迫应答。m a p k h o g l 介导的h o g m a p k 途径是高渗胁迫条件下激发的 1 条最重要的信号转导途径。该级联途径上游有2 个独立的早期分支感应渗透信号，分别 是s l n l 和黝d 基因编码，存在质膜中。这可能使得细胞可以对更宽范围的渗透压变化产 生应答。因此，h o g m a p k 在盐胁迫下基因组范围内的调节中起关键作用。 3 第一章文献综述 g e n ee x p r e s s i o n 图1 - 1 酿酒酵母h o g - k a p k 信号传导途径 f i g 1 lt h es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eh o g m a pk i n a s ep a t h w a y 1 3 2 依赖于c a 2 + c a m 的钙调磷酸酶 c a n 信号途径主要对离子环境的胁迫产生应答l l4 1 。在盐胁迫下c a n 以两种方式参与 酵母的n a + 外排。一方面通过特异转录因子t c n l p c r z l p h a l 8 p 激活e n a l p m r 2 a ( 编码 p 一型n a * - a t p a s e ) 表达，使n a + 外排。e n a l 的启动子区具有两个5 - g a g g c t g 一3 花边序 列，对c r z l p 分别具有较低和较高的亲和性，其表达还部分依赖于h o g 途径。另一方面， 盐胁迫下c a n 还可启动k + 高亲和吸收系统t r k l ，2 ，由于t r k 蛋白对k + 的亲和性高于n a + ， 细胞内优先积累k + ，增加k + 的浓度，减少n a + 积累，从而减少n a + 对细胞的毒害。c a n 可 能在蛋白水平上调节t r k l ，2 的表达，还有待进一步证实。 1 3 3 环腺磷蛋白激酶a 途径 c a m p 依赖性蛋白激酶a 的活性是渗透胁迫下一个主要的决定因子。在n a c l 胁迫 下，表达增加的蛋白根据与p k a 活性的关系可分为三类：p k a 非依赖性的、完全依赖于 p k a 、部分依赖于p k a 的【15 1 。在p e a 依赖性诱导表达的基因启动子中含有s t r e 位点， 通过m s n 2 p 和m s n 4 p 激活【16 1 。盐胁迫下p l 活性下降从而促进h o g 介导的信号调节。 4 k k ： 嘲 恢 p p p s 一 删 忡 一 挑 m k 犁 第一章文献综述 1 3 4 雷帕酶素靶分子信号途径 t o p , 信号途径在酵母盐胁迫应答的控制中能够起重要作用【1 7 1 ，t o p , 参与e n a l 表 达的调节。在e n a l 启动子区有6 个g a t a a 花边序列，t o r 通控制g a t a 结合的转 录因g l n 3 和g a t l 调节e n a l 的表达【1 8 】。删j 基因编码的质膜i - i + a t p a s e ，是维持质 膜电化学梯度的重要h + - a t p a s e ，其表达也g l n 3 依赖性的。因此t o r 信号途径可能 在离子平衡的调节中起广泛作用。 1 4 盐胁迫应答分子机制 n a + 胁迫对细胞的毒害作用通常被认为由于n a + 会争夺m 孑+ 的蛋白质结合位点，导致 相应的蛋白质失活。酵母具有完善的排n a + 系统，主要由e n a l p 和n h a l p 承担。n a + 胁迫时， 由各种信号传导途径将胁迫信号级联放大，并最终启动n a + 胁迫的各种应答功能蛋白的 表达，众多蛋白协同作用，以维护酵母细胞的生存。 1 4 1 离子平衡机制 图1 2 酵母离子运输系统 f 培1 2i o nt r a n s p o r ts y s t e mo fy e a s t 对盐胁迫最适应的基因型是能够协调离子跨膜吸收与液泡分隔作用的类型。因此质 5 第一章文献综述 膜或细胞器膜上调节离子进出或分隔的转运过程对盐适应很重要。细胞要适应外界环境 的变化，必须要调节n a + 外排、n a + k + 的平衡【1 9 1 、c a p 平衡、h + 平衡和k + 平衡。其中， n a + 外排及其调节是最主要的离子平衡模式。只有平衡几种离子之间的相互关系，才能 维持细胞的正常代谢。 1 4 2n a + 平衡 所有的活细胞都向外排除n a + ，从而使有毒害作用的n r 在胞内保持较低的水平，并 使细胞膜处于极化状态。酿酒酵母通过降低n a + 内流并倾向于外排以及使其在液泡中区 隔化来阻止积累过多的n a + 。控制n a + 外流主要决定于e n a l 基因。e n a l 基因的表达在低 浓度n a c l ( o 1 - 0 3m o l l ) 下由h o g 途径调控，在高浓度n a c l ( 0 6 - - 一1 0m o l l ) 下由 c a n 途径调控【l 。b z l p 转录抑制因子s k o l 可以结合到e 删，启动子区的c a m p 应答元件类 似序列调节e n a l 转录。删三j 是e n a l 的效应子，通过增加k + 的吸收降低细胞内的n a + 肘， 与e n a l 和其他基因协同作用使细胞内n a + 保持低浓度，其表达是非h o g 依赖性的，由p k a 反式调节。删三3 是酵母中另一个重要的耐盐基因，h a l 3 p j 甬_ _ 过抑制丝氨酸苏氨酸蛋白磷 酸酶调节e n a i 的表达。酵母没有特异的n a 十吸收系统，而是利用豫k 基因编码的k + 吸收 系统使n a + 跨膜进入【2 0 l 。盐胁迫下通过c a n 信号途径，激活t r k k + 高亲和系统，最终使 n a + k + 降低。n a + 的区隔化能够增加渗透压同时减少离子毒害。在酿酒酵母中n h x l 编 码n 埘反向转运蛋白通过与h + 交换使n a + 进入液泡。 1 4 3c a 2 + 平衡 c a 2 + c a m 能, 激活c a n 的活性，因此在高盐胁迫下增加胞质c a 2 + 水平对于耐盐性很有 帮助【2 1 1 。在酵母 c a 2 + 平衡是由3 种不同的c a ：+ 泵调节。p m e l p 是液泡上膜的p 一蚕d c a 2 + a t p a s e 。v c x l p 是液泡膜上的i t c a 2 + 交换蛋白，其功能完全依赖于跨膜p h 梯度。p m r l p 主要定位于高尔基体或相关的分泌区，也定位于内质网，可能是盐胁迫下主要的调节 c e + 平衡的c a 2 + a t p a s e 。在盐胁迫条件下激活的c a n 也参与胞质c a 2 + 平衡，正向调节 p m r l p 和p m c l p ，反l f i v c x l p 2 引。 6 第一章文献综述 1 5 酵母抗渗透应激的可能机理 酵母细胞具有适应环境不同渗透压的能力，当环境的渗透压上升时，细胞内部会积 累一些特殊溶质使细胞内外的渗透压保持平衡。这些能高浓度存在