（动物学专业论文）十足目crustacea：decapoda经济甲壳动物谷氨酸脱氢酶基因的研究.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e eo f2 0 1 0 s c h o o lc o d e ：1 0 2 6 9 s t u d e n tn o ：5 1 0 7 1 3 0 0 0 3 7 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y s t u d yo ng l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s eg e n e o ft h ee c o n o m i c m a c r o - - d e c a p o d s ( c r u s t a c e a n ) c o l l e g e ： s p e c i e s s c h o o io fl i f es c i e n c e m a j o r ：圣q q ! q g y r e s e a r c ha r e a ： a q u a t i cz o o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f l i q i a oc h e n ! = q 皇坠g n 圣金望g r - i _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ 一 c a n d i d a t e ： z e q u a nx i o n g m a y , 2 0 1 0 华东师范大学学位论文原创性声明 ylllll11itf7ijll4lli2lli!f7ll116ii5ll 郑重声明：本人呈交的学位论文十足目( c r u s t a c e a ：d e c a p o d a ) 经_ 济甲壳动物谷氨酸 脱氢酶基因的研究，是在华东师范大学攻读够硅博士( 请勾选) 学位期间，在导师的 指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：鳢e t 期：础年6 月胃e l 华东师范大学学位论文著作权使用声明 十足目( c r u s t a c e a ：d e c a p o d a ) 经济甲壳动物谷氨酸脱氢酶基因的研究系本人在华 东师范大学攻读学位期间在导师指导下完成的砚缶博士( 请勾选) 学位论文，本论文的 研究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位 论文，并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷 版和电子版；允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校 将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题 和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部 或“涉密学位论文幸， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 、) 2 不保密，适用上述授权。 导师签名本人签名亟。盗象 砂p 年6 月留日 “涉密”学位论文应是已经华东师范人学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位论文 ( 需附获批的华东师范大学研究生中请学位论文“涉密”审批表方为有效) ，未经上述部f j 审定 的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适刚上述授权) 。 箧淫基硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 郑哲民教授陕两师范大学主席 唐伯平教授盐城师范学院委员 唐思贤高级工程师华东师范大学委员 中文摘要 中文摘要 游离氨基酸在生物体的渗透调节过程中发挥着重要的作用，谷氨酸是其中最 为重要的一种，而谷氨酸脱氢酶( g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ，g d h ) 作为谷氨酸 代谢过程中的关键酶之一，有关其基因的研究并不多见。同时，十足目动物作为 甲壳纲中一个重要的经济类群，对盐度的适应范围多种多样。因此，研究十足目 中主要的经济动物g d h 基因及其与盐度变化的关系，将对深入了解游离氨基酸 在渗透调节过程中的作用机制及十足目动物的分化演变有着重要的意义。 本研究在获得甲壳纲十足目5 种经济动物谷氨酸脱氢酶( g d h ) 序列片段 的基础上，选择其中凡纳滨对虾的g d h b 基因序列进行生物信息学分析，并通 过对凡纳滨对虾进行急性和长期的盐度胁迫，研究谷氨酸脱氢酶基因在不同盐度 胁迫条件下的表达差异及变化规律，其中主要研究结果如下： 1 十足目5 种经济动物谷氨酸脱氢酶基因的定性研究 采用常规p c r 技术，扩增获得了凡纳滨对虾( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 、罗氏 沼虾( m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i i ) 、红螯螯虾( c h e r a xq u a d r i c a r i n a t u s ) 、中华绒 螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 、拟穴青蟹( s c y l l ap a r a m a m o s a i n ) 肌肉g d h 序列片 段；通过多序列比对，发现其氨基酸序列中的若干高度保守区域，其中g g v t v s 片段在所有已获得的真核生物g d h 序列中表现出高度同源性；在脊椎动物和无 脊椎动物类群中又分别存在一个高度保守区，综合已有文献，根据结构保守区的 差异，g d h 在真核生物中可分为g d h 一1 和g d h 2 两大类，本研究所获得的5 种g d h 序列属于g d h 一2 。 2 凡纳滨对虾谷氨酸脱氢酶的生物信息学分析 对获得的儿纳滨对虾g d h b 全长序列进行进一步的生物信息学分析。发现 凡纳滨对虾的g d h b 二级结构中存在2 0 个0 【螺旋和1 4 个b 折叠结构，而利用 s w i s s m o d e l 对其进行三维结构模拟则发现1 4 个a 螺旋和1 0 个p 折叠结构， 两个氨基酸保守区域则分别存在于两个d 折叠集中区域；同时发现在其1 7 0 1 8 3 a a 处存在一个多种氨基酸脱氢酶的活性位点( g l u l e u p h e v a ld e h y d r o g e n a s e s a c t i v es i t e ) v p f g g a k a g l k i n p ，利用b i o e d i t 软件对谷氨酸脱氢酶的氨基酸组成 进行分析表明，该蛋白宫含甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸等与渗透调节相关的氨基酸 类。结果提示g d h b 的结构与其功能密切相关。 中文摘要 3 急性盐度胁迫下谷氨酸脱氢酶表达变化研究 利用实时荧光定量p c r 技术研究了急性盐度胁迫下凡纳滨对虾肌肉和鳃中 g d h 的表达变化情况。发现无论面对低盐胁迫还是高盐胁迫，g d h a 在肌肉和 鳃中均是胁迫后2 4l l r 其表达量最高，在高盐胁迫下，同一时刻g d h a 在鳃中 的表达量始终高于其在肌肉中的表达量，在2 41 1 r 时差异最为显著。g d h b 的变 化则稍有差异，在低盐胁迫时，其在肌肉和鳃中的表达量在4 8l l r 最高，在高盐 胁迫时，肌肉中的g d h b 表达量在4 8l l r 最高，但变化不显著，而鳃中该基因 的表达量在9 6l l r 达到最高，且显著高于其他时刻的表达量。结果提示，在应对 盐度急性胁迫时，g d h a 响应时间要早于g d h b ，其主要靶器官为鳃，可能与 急性盐度胁迫下的渗透调节关系更为密切，g d h b 响应时间稍晚，可能在更为 复杂的代谢过程中发挥作用。 4 长期盐度胁迫下谷氨酸脱氢酶表达变化研究 利用实时荧光定量p c r 技术研究了在长期盐度胁迫下凡纳滨对虾肌肉和鳃 中g d h 的表达变化情况。发现在低盐度( 5 ) 下，g d h a 在肌肉和鳃中的表 达量要显著低于中盐度( 2 0 9 0 0 ) 及高盐度组( 3 2 0 ) ，各盐度下的组织表达差异 并不显著；而对于g d h b ，高盐度组对虾肌肉中的表达量显著高于其他两组， 鳃中表达差异并不显著。由于肌肉是氨基酸的主要积累场所，推测g d h b 在谷 氨酸合成方面起主要作用，而g d h a 在面对长期盐度胁迫时，其在渗透调节方 面的作用已不明显。 关键词：甲壳动物，渗透压，谷氨酸脱氢酶，基因，盐度，凡纳滨对虾 英文摘要 a b s t r a c t f r e ea m i n oa c i d ( f a a ) p l a yav i t a lr o l ei nc e l lv o l u m ea n do s m o r e g u l a t i o np r o c e s s o fo r g a n i s m s a m o n gt h e s ef a a s ，g l u t a m a t ei sam o s ti m p o r t a n to n e b u tl i r l e i n f o r m a t i o ni sk n o w na b o u tg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ( g d h ) ，w h i c hi st h ek e y e n z y m ei nt h ep r o c e s so fg l u t a m a t em e t a b o l i s m m e a n w h i l e ，弱am a j o rg r o u po f c r u s t a c e a n , d e c a p o d ss p e c i e sh a v ev a r i o u ss a l i n i t ya d a p t a b i l i t y s ot h es t u d yo f r e l a t i o n s h i pb e t w e e ng d hg e n ea n ds a l i n i t yv a r i a t i o nh a sas i g n i f i c a n tm e a n i n gf o r f u r t h e ru n d e r s t a n d i n gi no s m o r e g u l a t i o na n d p o l a r i z a t i o ne v o l u t i o no fd e c a p o d a t h eg d hg e n eo f l i t o p e n a e u s v a n n a m e iw a sa n a l y z e d u s i n gm e t h o d s o f b i o i n f o r m a t i c sa f t e rf r a g m e n t so fg d hc d n a sf r o m5e c o n o m i ca n i m a l so fd e c a p o d s w e r es e q u e n c e di nt h i ss t u d y t h e nt h ee x p r e s s i o np r o f i l e so fg d hm r n ad u r i n g a c u t ea n dc h r o n i cs a l i n i t ys t r e s si nl v a n n a m e iw e r ei n v e s t i g a t e d r e s u l t so fc u r r e n t s t u d yc a np r o v i d eb a s i cd a t af o ru n d e r s t a n d i n gm e c h a n i s mo fo s m o r e g u l a t i o na n d n e wa p p r o a c hf o rc u l t u r eo fe c o n o m i cc r u s t a c e a n s 1 c h a r a c t e r i z a t i o no ft h eg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s eg e n e si nf i v ee c o n o m i c a n i m a l so f d e c a p o d s ，c r u s t a c e a n c o n v e n t i o n a lp c rt e c h n i c a lw a su s e df o ra m p l i f i c a t i o no fg d he d n af r a g m e n t s o fl v a n n a m e i ，m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i i ，c h e r a xq u a d r i c a r i n a t u s ，e r i o c h e i r s i n e n s i s ，a n ds c y l l ap a r a m a m o s a i n t h ea l i g n m e n to ft h ef i v eg d ha m i n oa c i d s e q u e n c e sw i t ht h o s eo fo t h e rs p e c i e ss h o w e ds o m eh i g h l yc o n s e r v a t i v er e g i o n s a h i g h l yh o m o l o g yr e g i o nw a sd e t e c t e di na l le u k a r y o t i cg d hs e q u e n c e s o t h e rt w o c o n s e r v a t i v e r e g i o n s e x i s t e di n s e q u e n c e s o fv e r t e b r a t e sa n d i n v e r t e b r a t e s ， r e s p e c t i v e l y a c c r o d i n gt ot h ee x i s t i n gl i t e r a t u r e s ，g d hi ne u k a r y o t i co r g a n i s m sc a n d i v i d e di n t ot w of a m i l i e s ( g d h 1a n dg d h 一2 ) b yt h e i rd i f f e r e n c e si ns t r u c t u r e 2 b i o i n f o r m a t i e sa n a l y s i sf o rg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s eg e n ei nl v a n n a m e i f u r t h e rb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sf o rg d h - bi nl v a n n a m e iw a sc a r r i e do u ta n d2 0 仅一h e l i c e sa n d14 3 - s t r a n d sw e r ef o u n di nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fg d h b h o w e v e r , 14a - h e l i c e sa n d101 3 - s t r a n d sw e r ed i s c o v e r e di ni t st h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r et h a t m a d eb ys w i s s m o d e l t w oc o n s e r v a t i v ea m i n oa c i dr e g i o n sl o c a t e di nt w o 1 3 - s t r a n d sc o n c e n t r a t i o nr e g i o n s m e a n w h i l e ，w ef o u n dag l u l e u p h e v a l i i l 英文摘要 d e h y d r o g e n a s e sa c t i v es i t ee n c o d i n gv p f g g a k a g l k i n pa tt h17 0 18 3a ao fg d h b t h ed e d u c e da m i n oa c i d sc o m p o s i t i o no fg d h - bi nl v a n n a m e ii sa n a l y s i s e du s i n g b i o e d i ta n dt h er e s u l t ss h o w e dg l y c i n e ，a l a n i n ea n dg l u t a m a t ew h i c hr e l a t e dw i t h o s m o r e g u l a t i o na r ea b u n d a n ti nt h i sp r o t e i n 3 e x p r e s s i o np r o f f i e so fg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s eg e n ed u r i n ga c u t es a l i n i t y s t r e s si n 厶v a n n a m e i a s e m i q u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c ra s s a yw a sd e v e l o p e dt oe s t i m a t et h ee x p r e s s i o n p r o f i l e so ft w og d hg e n e si nm u s c l ea n dg i l l so fl v a n n a m e i ，d u r i n ga c u t es a l i n i t y s t r e s s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg d h am r n a e x p r e s s i o nr e a c h e dt h ep e a kl e v e l2 4 h ra f t e re x p o s u r eb o t ha th y p o a n dh y p e r o s m o t i cs t r e s s t h er e l a t i v ea m o u n to f g d h am r n ai n 西l l si sh i g h e rt h a nt h a ti nm u s c l ea n dt h ed i f f e r e n c ea r em o s t o b v i o u sa t2 4h re x p o s u r e t h em a x i m u mm r n al e v e lo fg d h - ba t t a i n e da t4 8h r b o t hi n g i l la n dm u s c l e ，b u tn os i g n i f i c a n tc h a n g ec a nb e e no b s e r v e di n d i f f e t e n t e x p o s u r et i m e w h i l et h er e l a t i v ea m o u n to fg d h bm r n a i ng i l lr e a c h e dt h ep e a k p o i n ta t9 6h re x p o s u r ea n ds i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fo t h e r s a m p l i n g t i m e s t h er e s u l t s s u g g e s t g d h - ah a sac l o s e r r e l a t i o n s h i p w i t h o s m o r e g u l a t i o ni na c u t es a l i n i t ys t r e s sf o rt h es h o r tr e s p o n s et i m ei ng i l l sa n dg d h b m a yp a l yi t sr o l ei nt h ec o m p l e xp r o c e s so f m e t a b o l i s m 4 e x p r e s s i o np r o f i l e so fg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s eg e n ed u r i n gc h r o n i cs a l i n i t y s t r e s si n 厶v a n n a m e i a s e m i q u a n t i t a t i v er e a l - - t i m ep c ra s s a yw a sd e v e l o p e dt oe s t i m a t et h ee x p r e s s i o n p r o f i l e so ft w og d hg e n e si nm u s c l ea n dg i l l so fl v a n n a m e i ，d u r i n gc h r o n i cs a l i n i t y s t r e s s t h er e s u l t ss h o w e das i g n i f i c a n tl o we x p r e s s i o nl e v e lo fg d h - ai nm u s c l ea n d g i l l sa t5 0r a t h e rt h a n2 0 9 6 0a n d3 2 9 0 0 ，b u tn or e m a r k a b l et i s s u es p e c i f i cw a sd e t e c t e d f o rg d h b ，as i g n i f i c a n th i g he x p r e s s i o nl e v e li nm u s c l eb u tg i l l sc a nb eo b s e r v e d a sm u s c l ei sam a i ns i t ef o ra c c u m u l a t i o no fa m i n oa c i d ，i tc a l lb es p e c u l a t e dt h a t g d h bi s i m p o r t a n t f o r s y n t h e t i c o fg l u t a m a t e ，w h i l eg d h - a sr o l ei n o s m o r e g u l a t i o ni sn o ta p p a r e n tf o rl o n g - t e r ms a l i n i t ys t r e s s k e yw o r d s ：c r u s t a c e a n ；o s m o r e g u l a t i o n ；g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e ；g e n e ； s a l i n i t y ；l i t o p e n a e u s v a n n a m e i i v 目录 目录 中文摘要i a j b s t r a c t i l l 第一章文献综述i 第一节甲壳动物渗透调节基因研究进展i 第二节本研究的目的和意义i l 第二章甲壳纲十足目g d h 基因的定性研究。1 3 1 前言13 2 材料与方法1 4 3 结果1 9 4 讨论2 8 第三章盐度胁迫对凡纳滨对虾g d h 基因表达影响：。3 l 前言3l 第一节急性盐度胁迫对凡纳滨对虾g d h 基因表达影响3 3 1 材料与方法3 3 2 结果3 5 3 讨论。3 9 第二节长期盐度胁迫对凡纳滨对虾g d h 基因表达影响4 l 1 材料与方法4 l 2 结果。4 2 3 讨论4 4 参考文献( r e f e r e n c e s ) 4 6 附录5 8 致谢5 9 第。章文献综述 第一章文献综述 第一节甲壳动物渗透调节基因研究进展 渗透调节是一个多基因调控的过程，有关甲壳动物渗透调节基因的研究，在国 外已经取得了一定的进展，并在相关的生产实践和科学研究领域发挥了重要的指导 作用。目前，我国对海产甲壳动物的淡化养殖和淡水甲壳动物在咸水区的养殖日渐 增多，但是关于甲壳动物渗透调节基因的研究仍处于起步阶段，相关文献报道并不 多见。我们知道，甲壳动物对盐度的适应能力主要体现在其对渗透压和离子浓度的 调节能力上，而这种调节功能，又是通过多种基因共同作用的结果。因此，了解渗 透调节相关基因的结构和及其表达特性，不仅能为我们进一步研究甲壳动物渗透压 调节机制提供可靠的参考资料，而且通过进一步探索相关基因的表达特点与营养学 的关系，对经济甲壳动物的增养殖也有着十分重要的现实指导意义。 1 n a + - k + a t p a s e 基因 关于渗透调节相关酶类，n a + k _ a t p a s e 是被研究最为透彻的一种。它作为生 物膜上重要的膜结合蛋白酶，在物质运输、能量转化和信息传递方面发挥着重要的 作用。众多关于n a + k a t p a s e 活性的研究( a n d r 6e ta 1 ，1 9 9 5 ；p a ne ta 1 ，2 0 0 7 ； h u r t a d oe ta 1 ，2 0 0 7 ；l i ue ta 1 ，2 0 0 8 ；张林娟等，2 0 0 7 ；刘存岐等，2 0 0 8 ) 已经证 明其与多数生物的渗透压调节有着密切的关系。因此，关于该类基因及其表达特征 的研究也是目前渗透调节相关基因领域的热点之一。一般认为，n a + k + a t p a s e 的 基本结构由u 和p 两个亚基构成( p e t e r s o ne ta 1 ，1 9 7 8 ) ，已有的文献证明，甲壳动 物a 亚基的氨基酸序列与脊椎动物的该序列存在7 1 7 4 的同一性( l u c ue ta 1 ， 2 0 0 3 ) ，该亚基与n a + k + a t p a s e 的催化作用密切相关，并且是鸟苷结合位点( s k o u a n de s m a n n ，1 9 9 2 ) ，而b 亚基则与a 亚基的折叠与膜定位相关( h a s l e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 也有报道称，在某些物种上存在t 亚基，与n a + - k ，a t p a s e 的活性调节有关 ( a r y s t a r k h o v ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。但是，对于p 和丫亚基是否在甲壳动物n a + c a t p a s e 活性调节方面发挥了某种作用，尚待进一步研究。 对于n a + k + a t p a s e 不同亚基分子大小的研究显示，在不同的物种上存在显著 第一章文献综述 差异。对c a l l i n e c t e ss a p i d u s 鳃的膜蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现存在一个磷 氧基化的0 【亚基，其分子大小约为1 0 4 k d a ( t o w l ee ta l 。，1 9 7 6 ) ；利用单克隆鸡抗体进 行w e s t e r nb l o t 分析，发现c a r c i n u sm a e n a s ，c a l l i n e c t e sd a n a e 以及cs a p i d u s 鳃上膜 蛋白的c 【亚基条带大小也基本一致( l u c ue ta 1 ，19 9 9 ；t o w l ee ta 1 ，2 0 01 ；m a s u ie ta 1 ， 2 0 0 2 ) ，但陆生等脚类动物p o r c e l l i o j c 口6 p 暇甲上皮的0 【亚基大小却达到l1 0 k d a ( z i e g l e r , 1 9 9 7 ) 。 关于n a + k + a t p a s e0 【亚基的序列克隆研究较多。对于甲壳动物，研究者已经 获得了a r t e m i a f r a n c i s c a n a ( b a x t e r - l o w e e ta 1 ，1 9 8 9 ；m a c i a se ta 1 ，1 9 9 1 ) ，c a l l i n e c t e s s a p i d u s ( t o w l ee ta 1 ，2 0 0 1 ) ，h o m a r u sa m e r i c a n u s ( p a r r i ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 等多个物种的 a 亚基的c d n a 序列。在对a r t e m i a 幼体的a 亚基的研究中，发现其体内存在由两 种不同e d n a 编码的a 亚基，其中口l 亚基广泛存在于盐腺，中肠和触角腺等渗透 调节器官当中( m a c i a se ta 1 ，1 9 9 1 ；e s c a l a n t ee ta 1 ，1 9 9 5 ) ，暗示其与渗透调节功能 存在密切的关系，而0 c 2 亚基只在盐腺中进行表达( b a x t e r - l o w ee ta 1 ，1 9 8 9 ；e s c a l a n t e e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，编码a 1 亚基的基因在自然种群中表现出了高度的多态性( s a e ze ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。其中，蓝虾的a lc d n a 编码了一个由1 0 0 4 个氨基酸构成的蛋白，其分子 大小约为11 0 7 k d a ( m a c i a se ta 1 ，1 9 9 1 ) ；蓝蟹和龙虾的0 【亚基c d n a s 则编码了 一个由1 0 3 9 个氨基酸组成的蛋白，其分子大小约为l1 5 6 k d a ，比在凝胶电泳上得 到的相应条带分子量大。通过进一步的分析发现，在三种0 c 亚基序列的跨膜区域， 都存在一个信号肽裂解位点，如果邻近该裂解位点的n 端氨基酸被扣除，那么计算 得到的a r t e m i a 和c a l l i n e c t e s 的0 【亚基的分子量就分别为1 0 0 6 和1 0 1 2 k d a ，与凝 胶电泳所观察到的条带大小基本一致。 b a x t e r - l o w e 等( 1 9 8 9 ) 曾对a r t e m i a 的0 【2 亚基结构模型进行序列分析，发现 了8 个疏水性跨膜区域，被一个细胞质内环状区域分为两类( 分别为h 1 h 4 和 h 5 h 8 ) ，而该环状区域存在有a t p 结合位点和磷酸化位点。其中7 个跨膜螺旋在0 亚基序列上与其他物种显示了高度的同源性，只有a r t e m i a 的砣亚基的h 3 区域存 在较大的差异。而c a l l i n e c t e s 的a 亚基的h 3 区域，与其他物种有较高的一致性 ( t o w l ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 总的看来，n a + k + a t p a s e 的伐亚基在不同的物种之间表现出了高度的保守性， 蓝蟹c a l l i n e c t e s 的a 亚基的氨基酸序列与鸟类该亚基的相似性达到了7 1 7 4 ，而 第一章文献综述 与螯龙虾h o m a r u s 的相似性更是达到了9 4 ( t o w l ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在这些已有的 序列当中，几乎都存在一个蛋白激酶a 位点，同时，至少存在着一个完全保守的 a t p 结合位点( l u c ue ta 1 ，2 0 0 3 ) ，这些保守位点对于其功能至关重要。但是，关 于甲壳动物n a + k + a t p a u s e 的其他两种亚基的序列却缺少足够的研究。仅有关于卤 虫a r t e m i a 的b 亚基在信号转移膜区域和c 端与脊椎动物的该区域存在高度保守性 的报道( b h a t t a c h a r y y ae ta 1 ，1 9 9 0 ) ，关于丫亚基序列的研究则未见报道。另外，在 对蓝虾幼体发育过程的研究中发现，在发育初期的2 4 h 和3 6 h 内，蓝虾盐腺的9 亚 基m r n a 将会出现一个表达高峰期，随之4 8 h 后在肠黏膜中其含量随之升高( s u n e ta 1 ，1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) ，但尚缺乏足够的证据证明其在幼体发育过程中的作用。 随着实时定量技术的日趋成熟，急性或长期盐度胁迫对于n a + k + a t p a s e 基因 表达水平的影响成为近几年的研究热点。其中，c h u n g ( 2 0 0 6 ) 在获得了拟穴青蟹 s c y t t a p a r a m a m o s a m 的n a + - k + a t p a s e 基因全长的基础上，研究了在高渗和低渗胁 迫之后，n a + 一k + a t p a s e 基因的a 亚基m r n a 的在前鳃，后鳃，触角腺和中肠中的 表达变化情况，发现在所研究的四种器官中，n a + k + - a t p a s e 的仅亚基不存在有其 他的亚型，其c d n a 全长为3 8 6 6 b p ，编码了一个1 0 3 9 个氨基酸的开放阅读框；同 时发现，当拟穴青蟹由环境盐度2 5p p t 分别转移到5p p t 和4 5p p t 的水体7 天之后， n a + k - 一a t p a s e0 【亚基的m r n a 水平发生了显著的变化，5p p t 处理组的后鳃m r n a 水平显著升高，4 5p p t 处理组的前鳃、后鳃和触角腺的m r n a 水平也显著高于2 5 p p t 处理组，作者认为，这种m r n a 水平的显著升高，是造成5p p t 处理组在第1 4 天后 鳃n a + 一l p a t p a s e 活性显著升高的一个重要原因，后鳃是甲壳动物渗透调节的一个 重要器官。但是，4 5p p t 处理组前鳃，后鳃及触角腺中的n a c a t p a s e 活性并没 有随m r n a 表达量的升高而上升。这种m r n a 与酶活表达的不一致，在 c h a s m a g n a t h u sg r a n u l a t u s 上也曾有过报道。g e n o v e s e 等( 2 0 0 0 ) 将c g r a n u l a t u s 转移到4 5p p t 的水体后，发现n a + k + a t p a s e 的m r n a 表达上升，但是，其酶活却 没有相应的上升。 2 神经肽家族基因 甲壳动物眼柄的x 器官窦腺复合体合成与分泌不同种类的神经肽，这些神经肽 包括甲壳动物高血糖激素( c r u s t a c e a nh y p e r g l y c e m i ch o r m o n e ，c h h ) 、蜕皮抑制激 第一章文献综述 素( m o l t - i n h i b i t i n gh o r m o n e ，m i h ) 、大颚器官抑制激素( m a n d i b u l a ro r g a n i n h i b i t i n g h o r m o n e ，m o i h ) 和卵黄发生抑制激素( v i t e l l o g e n e s i s i n h i b i t i n gh o r m o n e ，v i h ) 或性腺抑制激素( g o n a d i n h i b i t i n gh o r m o n e ，g i h ) ( k e l l e r , 1 9 9 2 ；w a i n w r i g h t 1 9 9 6 ； l i u ，1 9 9 7 ) ，由于这一类神经肽的一级结构与c h h 有许多相同之处，它们就被称作 c h h 家族神经激素( 王再照，2 0 0 1 ) 。这些神经肽家族仅在甲壳动物体内发现，与 甲壳动物的生殖，发育和生长密切相关( b e l t z ，1 9 8 8 ；k e l l e r , 1 9 9 2 ；f i n g e r m a n ，1 9 9 7 ) 。 在上述神经肽中，c h h 的作用至关重要，它起着调节甲壳动物血淋巴中葡萄糖 含量的功能，同时与糖类和脂类代谢有关，另外，在甲壳动物的蜕皮( d ek l e i j n 1 9 9 5 ) 、生殖( d ek l e i j n ，1 9 9 8 ) 、以及渗透调节( c h a r m a n t i e r - d a u r e se ta 1 ，1 9 9 4 ；s e r r a n o e ta 1 ，2 0 0 3 ) 等方面都发挥着重要的作用。关于c h h 基因的研究，目前已经获得了 龙虾( t e n s e ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 、小龙虾( k e g e le ta 1 ，1 9 9 1 ；h u b e r m a ne ta 1 ，1 9 9 3 ；y a s u d ae t a 1 ，19 9 4 ) 、对虾( s i t h i g o m g u le ta 1 ，19 9 9 ；u d o m k i te ta 1 ，2 0 0 4 ) 、蟹类( c h u n ge ta 1 ， 1 9 9 8 ；k e g e le ta 1 ，1 9 8 9 ) 以及等脚类( m a r t i ne ta 1 ，1 9 8 4 ) 等物种的氨基酸的序列。 通过比对发现，甲壳动物的c h h 氨基酸序列有着较高的保守性，不同物种的c h h 间的同源性比例均高于5 5 。总的看来，c h h 的有如下主要特征：( 1 ) 氨基酸残基 数目相同，一般为7 2 或7 3 个；( 2 ) 肽链上c y s 残基位置的保守性；( 3 ) 肽链核心 部位存在保守氨基酸序列。对凡纳滨对虾眼柄中c h h 基因的研究结果( l a g o l e s t 6 n ， 2 0 0 6 ) 显示，其染色体d n a 和c d n a 的核苷酸序列出现了一些重要的差异，c h h 基因片段长7 8 9 b p ，但是其c d n a 产物却只有6 5 4 b p ，c h h 基因存在两个外显了和 一个小片段的内含子( 1 3 5 b p ) 。有报道称( c h e ne ta 1 ，2 0 0 4 ) ，在所有的c h h 基因 中，内含子都插入在一个信号肽区域当中，这暗示在5 区域存在一个额外的外显子， 这样就存在3 个外显子和2 个内含子，其中外显子i 包括了小部分的信号肽，而大 部分的信号肽区域及c p r p 则包含在外显子i i 当中，外显予i i 的前端部分存在加工 位点，然后是一个4 0 个氨基酸的成熟肽。在c h h 肽的3 端，存在一个c 端蛋白酶 加工位点，它同样包含了6 个保守的半胱氨酸残基，这一位点在c h h m i h g i h 家 族的其他成员中的位置也是相当的一致。 另外，c h e n 等( 2 0 0 4 ) 研究了c h h 基因在罗氏沼虾中的组织特异性表达情况， 发现眼柄、心脏、鳃、触角腺和胸腺都是c h h 基因的靶器官，而在肌肉和肝