（分析化学专业论文）动物组织中阿苯达唑代谢物多残留检测方法的研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 食品安全问题一直为世界各国政府和组织所关注，食品中违禁药物的检出以及 合法药物的超量问题逐渐成为热点问题。阿苯达唑是苯并咪唑类驱虫剂中使用最为 广泛的一种，主要用于哺乳动物肠道内寄生虫的治疗。由于阿苯达唑及其标志残留 物存在的潜在危害性，许多国家及欧盟等都规定了它们在动物可食性组织中的最大 残留限量，国内缺少相应的标准可以参考，因此有必要对其进行研究。 本论文分别以高效液相色谱一二极管阵列检测器( h p l c p d a ) 和超高效液相色 谱一二极管阵列( u p l c p d a ) 为检测手段，对动物源性食品中阿苯达唑的标志残留物 阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑一2 一氨基砜进行了研究，建立了它们在不同基 质( 肌肉、肾脏、肝脏) 中多残留的分析方法。 本论文主要分三部分。 第一章：对兽药残留概况进行了综述。介绍了兽药残留的危害及其产生的原因， 总结了兽药残留检测过程中常用的前处理技术( 固相萃取、固相微萃取、微波辅助 萃取、超临界流体萃取、凝胶渗透色谱、加速溶剂萃取、基质固相分散萃取) 和分 析技术( 免疫分析法、薄层色谱法、毛细管电泳技术、气相色谱法、气相色谱质谱 联用法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法) 。 第二章：对国内外阿苯达唑及其代谢物的研究状况进行了综述，并建立了动物 可食性组织中阿苯达唑标志代谢物的h p l c p d a 法。确立了h p l c 分析的色谱条件， 以乙腈2 5 r a m 混合磷酸盐( p h = 6 8 6 ) 为流动相，采用c 1 8 柱在梯度条件下进行测定， 三种物质在1 0 5 m i n 内分离良好；对前处理条件进行了优化，选用乙腈作为提取溶 剂超声提取，正己烷脱脂、m c x 固相萃取柱净化，浓缩过程考虑洗脱液较少选用 氮吹将其吹至近干；对方法的可行性进行了确认，进行了三种代谢物在不同基质中 的添加回收率及重复性实验，回收率在7 8 1 8 8 8 ，变异系数分别在3 4 1 9 4 5 ， 定量限为0 0 1 5 m g k g 。 第三章：建立了动物可食性组织中阿苯达唑标志代谢物的u p l c p d a 法。确立 了u p l c 分析的色谱条件，以乙腈1 0 m m 混合磷酸盐( p h = 6 8 6 ) 为流动相，采用 山东大学硕士学位论文 c 1 8 柱在梯度条件下进行测定，三种物质在2 5 m i n 内分离良好；对前处理条件进行 了优化，选用乙腈超声提取，正己烷脱脂、m c x 固相萃取柱净化，浓缩过程选用 氮吹将洗脱液吹至近干；对方法的可行性进行了确认，进行了三种代谢物在不同基 质中的添加回收率及重复性实验，回收率在7 9 1 8 9 4 ，变异系数分别在 3 3 5 9 3 6 ，定量限为o 0 0 3 m g k g 。 关键词：阿苯达唑；代谢物；残留；高效液相色谱法；超高效液相色谱法 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h e p r o b l e m so ff o o ds a f e t yh a v e b e e ng r e a t l yc o n c e r n e db yb o t hg o v e m m e n t sa n d o r g n i z a t i o n s t h ed e t e c t i o no fp r o h i b i t e dd r u g sa n dt h ee x c e s so fl e d i t i m a t ed r u g si nf o o d a r eb e c o m i n gh o ti s s u e s a l b e n d a z o l ei sa l la n t h e l m i n t i cb e n z i m i d a z o l ew i d e l yu s e da s v e t e r i n a r ya n dh u m a nm e d i c i n ef o rt h et r e a t m e n to fi n f e c t i o n sc a u s e db yh e l m i n t h e s b e c a u s ea l b e n d a z o l ea n di t sm e t a b o l i t e s ，w h i c hc o n s t i t u t et h em a r k e rr e s i d u ，m a y m a n i f e s tt h e m s e l v e sp o s i n gah e a l t hh a z a r dt oc o n s u m e r s ，m a n yc o u n t r i e sa n de u r o p e a n u n i o nh a v es e tt h e i rm a x i m u mr e s i d u el i m i t si na n i m a le d i b l et i s s u e s t h e r ea r en o c o r r e s p o n d i n gr e f e r e n c es t a n d a r d s ；t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt or e s e a r c hi t t w od i f f e r e n tm e t h o d s ( h p l c p d aa n du p l c p d a ) h a v eb e e nd e v e l o p e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h em a r k e rr e s i d uo fa l b e n d a z o l e ( a l b e n d a z o l es u l p h o x i d ea l b e n d a z o l e s u l p h o n ea n da l b e n d a z o l e 一2 一a m i n o s u l p h o n e ) i nd i f f e r e n tm a t r i x ( m u s l e ，k i d n e y ，l i v e o t h ed i s s e r t a t i o nc o n s i s t st h r e ep a r t s c h a p t e rl ：t h eg e n e r a ls i t u a t i o no fv e t e r i n a r yd r u gr e s i d u e sw a sr e v i e w e d t h e h a r m f u i n e s sa n dt h ec a u s e so fv e t e r i n a r yd r u gr e s i d u ew e r ei n t r o d u c e d m e a n w h i l e ， s a m p l ep r e t r e a t m e n tt e c h n i q u e s ( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s o l i dp h a s em i c r o - e x t r a c t i o n ， m i c r o w a v e - a s s i s t e d e x t r a c t i o n ，s u p e r e r i t i c a l f l u i d e x t r a c t i o n ，g e lp e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ，a c c e l e r a t e d s o l v e n te x t r a c t i o n ，m a t r i xs o l i d - p h a s ed i s p e r s i o n ) a n d a n a l y t i c a lt e c h n i q u e s ( i m m u n o a l y s i s ，t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y ，g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ) w e r e s u m m a r i z e d c h a p t e r2 ：t h er e s e a r c hs t a t u so fa l b e n d a z o l ea n di t sm e t a b o l i t e sw a sr e v i e w e d a h p l c p d am e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h em a r k e rr e s i d uo fa l b e n d a z o l eh a sb e e n d e v e l o p e d t h em e t a b o l i t e sw e r es e p a r a t e dw e l li n10 5m i n u t e sw h e nag r a d i e n tm e t h o d w a su s e d w i t ha c e t o n i t r i l e 2 5 m mm i x e dp h o s p h a t ea sm o b i l ep h a s e ( p h = 6 8 6 ) a n dc 1 s a sa na n a l y t i c a lc o l u m n ，t h es a m p l ep r e t r e a t m e n tc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d a c e t o n i t r i l e w a sc h o s e na st h ee x t r a c t i n gs o l u t i o n ，n h e x a n ea n dm c xs o l i dp h a s ee x t r a c t i o n c a r t r i d g e sw e r eu s e df o rt h ep u r i f i c a t i o n f i n a l l yt h ee l u a n tw a sb l o w e db y n i t r o g e nt o p r o x i m a ld r y t h er e l i a b i l i t yo ft h em e t h o dw a sv e r i f i e d t h er e c o v e r i e so ft h e m 山东大学硕士学位论文 m e t a b o l i t e sw e r eo b t a i n e db yv a r i o u ss a m p l e s w h i c hr a n g ef r o m7 9 1t o8 9 4 t h e r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sw e r ei nt h er a n g e3 41 9 4 5 f o rs p i k e ds a m p l e s t h el i m i t s o fq u a n t i t a t i o nw e r e0 015 m g k g c h a p t e r3 ：a nu p l c - p d am e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h em a r k e rr e s i d uo f a l b e n d a z o l eh a sb e e nd e v e l o p e d t h em e t a b o l i t e sw e r es e p a r a t e dw e l li n2 5m i n u t e s w h e nag r a d i e n tm e t h o dw a su s e d w i t ha c e t o n i t r i l e 10 m m ( p h = 6 8 6 ) m i x e dp h o s p h a t e a sm o b i l ep h a s ea n dc lsa sa na n a l y t i c a lc o l u m n ，t h es a m p l ep r e t r e a t m e n tc o n d i t i o n s w e r eo p t i m i z e d a c e t o n i t r i l ew a sc h o s e na st h ee x t r a c t i n gs o l u t i o n ，n h e x a n ea n dm c x s o l i dp h a s ee x t r a c t i o nc a r t r i d g e sw e r eu s e df o rt h ep u r i f i c a t i o n f i n a l l yt h ee l u a n tw a s b l o w e db yn i t r o g e nt op r o x i m a ld r y t h er e l i a b i l i t yo ft h em e t h o dw a sv e r i f i e d t h e r e c o v e r i e so f t h em e t a b o l i t e sw e r eo b t a i n e db yv a r i o u ss a m p l e s ，w h i c hr a n g ef r o m7 8 1t o 8 8 8 t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sw e r ei nt h er a n g e3 3 5 - 9 3 6 f o rs p i k e ds a m p l e s t h el i m i t so fq u a n t i t a t i o nw e r eo 0 0 3 m g k g k e yw o r d s ：a l b e n d a z o l e ，m e t a b o l i t e s ，r e s i d u e ，h p l c ，u p l c i v 山东大学硕士学位论文 符号说明 a b z 阿苯达唑( a l b e n d a z o l e ) a b z s o阿苯达唑亚砜( a l b e n d a z o l es u l p h o x i d e ) a b z s 0 2 阿苯达唑砜( a l b e n d a z o l es u l p h o n e ) a b z s 0 2 n h 2 阿苯达唑一2 一氨基砜( a l b e n d a z o l e 一2 a m i n o s u l p h o n e ) a s e加速溶剂萃取( a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ) c e 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) e l i s a f a o g c g c m s g p c h p l c h p l c m s l l e m a e m r l m s p d p a d s f e s p e s p m 哐 t l c u p l c w h o 酶联免疫分析( e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ) 联合国粮农组织( f o o da n da g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o no ft h eu n i t e d n a t i o n s ) 气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y ) 气相色谱一质谱连用技术( g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t e r ) 凝胶渗透色谱( g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 高效液相色谱( h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 高效液相色谱一质谱联用( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ) 液液萃取( l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n ) 微波辅助萃取( m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n ) 最大残留限量( m a x i m u mr e s i d u el i m i t ) 基质固相分散( m a t r i xs o l i d p h a s ed i s p e r s i o n ) 光二极管阵列检测器( p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r ) 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ) 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ) 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ) 薄层色谱法( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) 超高效液相色谱( u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 世界卫生组织( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ) v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：! 虱函聋一 日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：豆婚师签名：辱迎日期：碑剑 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 兽药残留概况 随着经济的发展和生活水平的提高，人们对动物性产品的要求也越来越高，兽 药残留问题逐渐成为社会关注的热点。兽药( 包括添加剂) 在保障动物健康生长方面 发挥着重要的作用，在降低动物发病率与死亡率的同时，还能提高饲料的利用率、 促进动物生长、并能改善动物产品的品质；但另一方面也导致了动物性产品中的兽 药残留，给人体健康带来了危害。兽药残留超标不仅可以直接对人体产生急慢性毒 性作用，引起细菌耐药性增强，还可以通过环境和食物链的间接作用对人体健康造 成潜在危害，从长远角度来看还会影响到我国养殖业的发展和走向国际市场。因此， 必须采取有效措施，减少和控制药物的残留。 根据联合国粮农组织( f o o da n da g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o no f t h eu n i t e dn a t i o n s ， f a o ) 和世界卫生组织( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ，w h o ) 食品中兽药残留联合立法 委员会的定义，兽药残留( a n i m a ld r u gr e s i d u e ) 是指动物产品的任何可食部分所含兽 药的母体化合物及( 或) 其代谢物，以及与兽药有关的杂质。 兽药残留成为人们关注的问题，是因为近4 0 年来畜牧业生产中普遍采用的抗微 生物药物亚治疗量用法【1 。2 1 。2 0 世纪4 0 年代以来出现的各种抗生素、激素类药物，因 其快速高效的治疗效果，诱使人们随即将其用于动物疾病的治疗，而且很快添加到 动物饲料或饮水中用于非治疗性的防病和促生长，使用剂量通常为治疗剂量的三分 之一或更低。药物添加剂无论是在试验还是在生产条件下均呈现出显著的应用效果， 使动物生产性能大大提高。这种直接和巨大的商业利益改变了人们对药物作用的观 念，提高动物的生产性能逐渐成为动物药品的重要功能。自5 0 年代开始，亚治疗剂 量的抗生素等药物添加剂逐渐成为动物饲料或饮水的常规成分。7 0 年代，8 0 以上 的家禽或家畜长期或终生使用药物添加剂，约5 0 的兽用抗生素被用于非治疗目的。 目前大多数食品动物长期使用至少一种药物，在家禽生产中9 0 的抗生素被作为药 物添加剂。 近年来我国进入食品安全事件频发期，“苏丹红辣酱、毛发酱油、石蜡火锅 山东大学硕士学位论文 底料、瘦肉精、毒大米、红心鸭蛋、多宝鱼、三聚氰胺事件等等，不仅危害人民身 体健康，而且已经成为我国食品进出口贸易的重要障碍。我国出口到日本和欧盟一 些国家的食品因有害残留问题被进出口国拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同的事 件时有发生，这不仅使商家蒙受了巨大的经济损失，也降低了我国食品在国际市场 上的竞争力。 造成如此大量问题食品的原因，除却一部分种养户只顾眼前利益、滥用高毒药 物以及黑心商贩唯利是图、掺毒造假所致，还有食品安全检测技术不够先进的因素， 才使这些食品有机会流入市场。这已经成为当前制约食品安全体系建设的“瓶颈 问题。因此，如何采取有效的方法对食品中残留的药物进行检测已成为当务之急。 1 2 兽药残留的危害 1 2 1 急性毒性作用 外源性物质毒性效应与剂量和接触时间密切相关。若一次摄入残留物的量过大， 会出现急性中毒反应。例如，2 0 0 6 年9 月，上海连续发生瘦肉精食物中毒事故，3 0 0 多人因食用猪肉及猪内脏而头晕、手发麻、浑身冒冷汗，甚至还有人出现肌肉颤抖。 2 0 0 9 年2 月1 9 日，广州市天河、增城两区共有1 l 起因吃猪内脏引起腹痛、腹泻的报告， 涉及4 6 人，检验报告显示剩余食物中瘦肉精呈阳性。 1 2 2 慢性毒性作用 动物组织中药物残留通常较低，急性中毒事件发生的几率相对来说是较少的， 兽药残留的危害大多数是通过长期接触或逐渐蓄积而造成的。如“三致( 致癌、致 畸、致突变) 、免疫毒性、发育毒性、过敏反应等，对健康和环境的危害往往具有隐 蔽性，易造成实质性和难以逆转的危害。例如，氯霉素能导致严重的再生障碍性贫 血和粒细胞缺乏症【3 1 ，人体对氯霉素比动物更为敏感，婴幼儿的代谢和排泄机能尚 不完善，对氯霉素最敏感，可出现致命的“灰婴综合征，当氯霉素在组织中的残 留浓度达至e l m g k g 以上时，即可对食用者产生很大的威胁4 。5 】；氨基糖苷类药物主要 损害前庭和耳蜗神经，导致晕眩和听力减退，如链霉素的主要毒副作用是耳毒性， 因其能选择性地损害第8 对脑神经，导致前庭功能损害和耳蜗神经损害，严重时可造 成永久性的耳聋【6 1 ，同时链霉素还具有潜在的致畸作用；磺胺二甲基嘧啶等一些磺 2 山东大学硕士学位论文 胺类药物可诱发动物甲状腺增生，并具有致肿瘤倾向，人长期食用含有该类药物残 留的动物组织后，均有引起肿瘤发生的可能【_ 刀；四环素类药物能够与骨骼中的钙等 结合，抑制骨骼和牙齿的发育，治疗量的四环素类药物可能具有致畸作用【8 】。硝基 呋喃类等药物急性毒性较高，已被证明具有致癌作用，许多国家已禁止该类药物用 于可食性动物【9 1 0 1 。 1 2 3 诱导耐药菌株 由于抗茵药的广泛使用，细菌的耐药性不断增强，而且许多细菌由单种耐药发 展到多种耐药。在饲料中添加抗菌药物实际上等于持续低剂量给药，畜禽长期与药 物接触造成耐药菌不断增多，耐药性也不断增强。这些耐药菌能够通过食物链向人 体传播，有可能把畜禽所带的耐药菌株直接传播给人类，畜禽病原菌的耐药基因也 会因此传递给人类病原菌【】。组织残留可能干扰人肠道内的正常菌丛和诱导耐药的 病原菌株。抗菌兽药残留于动物组织中，当人食用含有该类药物残留的动物组织， 也使人长期与低剂量的药物接触，使得正常人体菌丛紊乱以及人体内耐药菌的增加。 1 2 4 变态反应 许多抗菌药如青霉素类、四环素类、磺胺类及某些氨基糖苷类药物，均可引起 人的过敏反应【1 2 】。这些兽药无论是全身还是局部用药，均可从乳汁排出。青霉素加 热不能被完全破坏，食用之后，轻者可出现皮肤痰痒、荨麻疹、发热、关节肿痛及 蜂窝组织炎，严重时出现过敏性休克甚至危及生命。英国一妇女饮用含青霉素仅i l u 的牛奶后引起中度亚急性湿疹；前联邦德国有人吃了含青霉素的猪肉后发生了变态 反应，而肉中青霉素含量仅有0 3 o 4 5 i u l l 3 】。四环素的降解产物甚至具有更强的溶 血或肝毒作用，因此烹调是不能够避免变态和过敏反应的。人长期食用微量抗生素， 会影响免疫系统功能，免疫能力下降。 1 2 5 激素样作用 性激素及其类似物主要包括甾类同化激素和非甾类同化激素，上世纪7 0 年代前， 许多国家将其作为畜禽促生长剂，使其在肝、肾和注射或埋植部位常有大量同化激 素存在。人食用后可产生一系列激素样作用，引发潜在的致癌性、发育毒性( 儿童早 熟) 、女性男性化和男性女性化。近年来我国常有儿童性早熟的报道，这与养殖业中 非法使用性激素作为促生长剂，致使其残留于动物食品中有关。 山东大学硕士学位论文 1 2 6 环境污染 兽药及其代谢产物会通过粪便、尿液等途径进入环境，由于它们仍具有生物活 性，对周围环境有潜在的毒性，会对土壤微生物、水生生物及昆虫等造成影响【1 4 】。 如阿维菌素类药物对低等水生动物、土壤中的线虫和环境中的昆虫均有较高的毒性 作用。同化激素随排泄物进入环境成为环境激素污染物，污水中l n g l 的雌二醇即能 、； 诱导雄鱼发生雌性化；抗球虫药物常山酮对水生动物( 如鱼、虾) 有很强的毒性，进 入环境中的兽药通过食物链在动植物体内富集，危害人类和动物的健康。 1 3 兽药残留的原因 1 3 1 人为方面的原因 随着现代畜牧业的发展，一方面工厂化、高密度饲养方式使现代畜牧业面临发 病率和死亡率的巨大压力，另一方面畜牧业生产者极力寻找一种能促进动物生长的 药物，于是出于对疾病的控制和经济利益的驱使，长期和非法滥用一些促进动物生 长及违禁违规药物成为药物残留的根源。据农业部通报的2 0 0 8 年上半年全国饲料产 品质量安全监督检测结果显示，此次抽检检出违禁添加物3 5 批次，其中，在2 8 8 批次 的蛋白饲料中检出三聚氰胺1 7 批次；在8 2 1 批次的禽饲料和水产饲料中检出超范围使 用喹乙醇1 8 批次【1 5 】。同时由于饲管人员的知识水平不高，缺乏合理的用药常识，不 合理用药、滥用药物也是药物残留的原因。一些饲养场和屠宰场出于市场供求关系 和受商业利益的诱惑，不遵守休药期，也会导致畜产品种兽药残留超标。 1 3 2 药物方面的原因 近年来，伪劣兽药的存在既影响了动物疾病的治疗，又因用药量加大，使药物 残留的机会增多，而且市场上有一半的兽药使用商品名，其标签上并未注明药品的 化学名称和含量，还有生产单位、经营单位不负责任，产品的宣传和标识存在着违 规现象，致使用户在使用过程中发生误用的可能性增大。农业部发布的2 0 0 9 年第一 期兽药抽检情况的通报结果显示，2 0 0 8 年四季度抽检兽药合格率为8 0 4 ，其中重 点监督性抽检合格率为7 9 4 ，抽检涉嫌假冒产品1 0 6 批，非法企业产品6 1 批。目前兽 药市场主要存在以下问题：一是非法生产：此次抽检共发现4 7 个非法兽药生产企业 生产的6 l 批假兽药，突出表现在含量不足、套用或编造文号；二是涉嫌假冒：所抽 4 山东大学硕士学位论文 检假冒产品1 0 6 批，占被通报产品比例持续偏高；三是改变组方：部分产品中违规添 加其他药物成分，成为动物性产品安全隐患【1 6 】。 1 4 常见的兽药残留前处理技术 样品前处理( s a m p l ep r e t r e a t m e n t ) 是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难 点和热点问题之一。它是指样品的制备以及对样品中待测组分进行提取、净化、浓 缩的过程。生物样品十分复杂，含有成千上万种化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、 氨基酸、核酸、维生素、激素、无机盐、水分等。这些物质的分子结构、分子大小、 理化性质各异，其中许多化合物的性质目前尚不明确，其中任何一种物质的含量可 能是兽药残留组分的数百倍甚至数万倍以上。这些样品基质的存在，不仅干扰对待 测物的检测，还会污染仪器和降低设备的使用寿命。样品前处理的目的是消除基质 干扰，保护仪器，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。样品前处理约占 整个样品分析时间的6 0 以上。在食品安全检测中，样品前处理是分析检测过程的 关键环节，只要检测仪器稳定可靠，检测结果的重复性和准确性主要取决于前处理， 方法的灵敏度也与样品前处理过程有着重要关系，开发一个新的食品检测方法的主 要工作往往是在样品前处理上。 c 传统的样品前处理技术有索氏提取，液一液分配，柱层析技术等。这些传统的方 法自动化程度低、提取净化的效率低、成本高、劳动强度大、试剂消耗大、环境污 染严重等。2 0 世纪末，现代科学技术和分析仪器技术的发展推动了前处理技术的发 展，使样品前处理技术朝着分析速度快、批量大、自动化程度高、成本低、劳动强 度低、试剂消耗少、环境友好、成本低廉的方向发展。近年来发展较快的前处理技 术有固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 、微波辅助萃取( m a e ) 、超临界 流体萃取( s f e ) 、凝胶渗透色谱( g p c ) 、加速溶剂萃取( a s e ) 、基质固相分 散萃取( m p s d ) 等。 1 4 1 固相萃取 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 又称固液萃取，是液固萃取和液相色谱 柱技术相结合的发展，是常用的净化方法。与传统的液液萃取法( l i q u i d l i q u i d e x t r a c t i o n ，l l e ) 相比，s p e 具有操作简单、溶剂消耗少、省时、省力和适用面广等 山东大学硕士学位论文 优点【1 7 。18 1 。s p e 采用经典的柱色谱程序进行操作，其分离机理、固定相和淋洗溶剂 的选择和h p l c 相似。目前用于h p l c 的填料几乎均可用于s p e ，但s p e 的填料一般 专为样品处理设计，粒径大于h p l c 填料，其柱效远低于h p l c 色谱柱。因此s p e 只 适合于分离保留性质差别比较大的化合物，对于性质相近的化合物，往往得不到有 效的分离。 s p e 柱的种类有正相、反相、离子交换柱和吸附树脂柱【l9 1 。s p e 操作步骤包括 固定相活化、样品上柱、洗涤和洗脱四个部分，其中加到萃取柱上的样品量取决于 萃取柱的尺寸、类型、待测组分的保留性质以及待测组分与基质组分的浓度等因素。 何乔桑【2 0 】等利用阳离子交换固相萃取柱净化，建立了奶粉和液态奶中三聚氰胺的 h p l c 检测方法，回收率为8 1 4 0 o - 8 3 7 。曹彦忠【2 1 】等通过o a s i sh l b 固相萃取柱净 化与高效液相色谱一串联质谱建立了同时测定蜂蜜中1 4 种喹诺酮类药物残留分析方 法，比较了c 1 8 固相萃取柱、o a s i sh l b 固相萃取柱和苯磺酸型阳离子交换柱对1 4 种 喹诺酮类药物的萃取效率，不同添加浓度的回收率在6 6 0 o - , 11 1 。s h a o 2 2 】等建立了 猪肝脏、肾脏、肌肉组织中1 6 种禁用p 激动剂残留的u p l c e s i m s m s 方法，样品 经酶解，高氯酸提取后依次用o a s i sh l b 固相萃取柱和m c x 固相萃取柱净化，方法 具有较好的准确度和精密度。z h a n 9 1 2 3 1 等建立了同时测定鸡肉中氯霉素、甲砜氯霉 素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的l c e s i m s m s 方法，样品经碱性乙酸乙酯提取，正 己烷脱脂之后，o a s i sm c x 柱净化，4 种目标分析物的回收率在9 5 1 10 7 3 。 m i r a n d a a t 2 4 】等利用毛细管区带电泳紫外法同时检测鸡肉的四环素、土霉素、强力霉 素，两种净化手段c 1 8 固相萃取柱和x a d 7 离子交换树脂均取得较好的效果，回收率 均在8 5 0 o - - 9 5 ，离子交换树脂因其再生性而更具优势。s a n g j a r u s v i c h a i 2 5 】等建立了 对虾中7 种磺胺类药物的h p l c e c 法，比较了c 1 8 固相萃取柱和o a s i sh l b 固相萃取柱 对回收率的影响，o a s i sh l b 柱因其结构拥有既亲水又亲脂的混合模式，能适应更宽 的极性范围而使每种目标物都能获得更高的回收率。 s p e 技术在样品前处理中具有突出的优点，但是也存在某些不足，例如处理复 杂基体样品时可能会引起回收率的显著降低；污染严重的复杂样品尤其是含有胶体 或固体小颗粒的样品会不同程度地堵塞吸附剂的微孔结构，引起柱容量和穿透体积 的降低、萃取效率和回收率的严重降低；吸附剂的选择性有时还不够强，对提取液 6 山东大学硕士学位论文 净化不完全等。 1 4 2 固相微萃取 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 是在s p e 的基础上发展起来 的一种新型、高效的样品预处理技术，它集采集、浓缩于一体，简单、方便、无溶 剂，不会造成二次污染，是一种很有应用前景的预处理方法【2 6 】。与l l e 和s p e 相比， 具有操作时间短、样品量小、无需萃取溶剂、适用于分析挥发性与非挥发性物质、 重现性好等优点。 其原理是利用石英纤维表面涂层对分析组分的吸附作用，将组分从试样基质中 萃取出来，并逐渐富集，完成试样前处理过程。在进样过程中，利用气相色谱汽化 室的高温，高效液相色谱、毛细管电泳的流动相将吸附的组分从固定相中解吸下来， 由色谱或电泳进行分离分析。在s p m e 方法中，被测物质的萃取量取决于样品基质 和固定涂层中的分配平衡，分配系数越大，萃取率越高【2 7 1 ，检出浓度也越佳。应剑 波【2 8 1 等应用s p m e ，与g c m s 联用技术分析尿液中的氯胺酮，方法预处理简单、分 析速度快、灵敏度高，最低检出限2 5 i t e g l 。l u l 2 9 1 等通过s p m e 净化，建立了猪肉和 鸡肉中8 种磺胺类药物的l c - a p c i - m s 法，检出限在16 p 眺g 3 9 p 眺g ，方法简单、快 速，适于肉及肉制品中痕量磺胺类药物的分析。 s p m e 的纤维萃取头寿命较短，一些大分子的蛋白质在纤维上发生不可逆吸附， 难以清除，从而改变涂层的性质，影响结果的准确性。另外s p m e 的应用有局限性， 对基质复杂的样品，共萃物多，干扰较大。 1 4 3 微波辅助萃取 微波辅助萃取( m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n ，m a e ) 始于8 0 年代，利用微波能 量，快速而有选择地萃取，克服了传统萃取方法的不足。m a e 在密闭的容器中进行， 加热萃取溶剂可使其迅速达到2 倍或3 倍常压时的沸点温度，从而缩短萃取时间，使 溶剂消耗大为减少。搅拌可以促进分析物与溶剂的作用，有助于从基质中释放目标 物。极性分子如水、甲醇、乙醇、丙酮等可迅速吸收微波能量来加热，因而样品中 水的存在在某种程度上能促进微波萃取的过程【3 0 1 。 选择适当的有机溶剂对m a e 萃取的成功至关重要，首先要考虑目标化合物在溶 剂中的溶解度，溶剂与基体的相互作用，以及溶剂的微波吸收特性。由于化合物吸 7 山东大学硕士学位论文 收微波能量的多少与其介电常数成比例，介电常数值越高，能量吸收率越高。而有 机物的萃取一般使用介电常数很小的非极性溶剂，因此常常必须使用极性共溶剂以 助溶液加热。用极性共溶剂的缺点是除了萃取目标化合物以外，还可以萃取其它杂 质干扰化合物，增加分析的困难。因而，m a e 技术常常和其它的前处理技术联用以 进一步净化样品萃取物【3 l 】。 然而m a e 必须克服一些内在的缺点才可拓宽其应用范围：萃取非极性有机化合 物时，常常需要对提取液进一步净化，增加了分析步骤和分析时间；不易于实现自 动化和与其它仪器的在线联用技术。 1 4 4 超临界流体萃取 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 是采用处于临界压力和临 界温度以上的超临界流体的溶解能力达到萃取分离的目的。超临界流体具有比较低 的黏度和较高的扩散系数，可以比液体溶剂更容易穿过多孔性基体，提高了萃取效 率。另外，通过改变萃取压力和萃取温度可以很容易的改变超临界流体的密度，调 整其溶解能力，从而实现对特定分析物的选择性萃取。超临界流体提取的分析物可 以通过压力的调整来进行分离，省去了传统萃取过程中的样品浓缩过程，节省了时 间，避免了挥发性分析物的损失。c 0 2 是常用的超临界流体，它具有无毒、无臭、 化学惰性、不污染样品、易于提纯、超临界条件温和等特点，是萃取热不稳定和非 极性分析物的良好溶剂3 2 1 。s f e 还可以与多种色谱技术直接联用，有利于挥发性有 机化合物的定性定量分析。 由于s f e 的诸多优点，目前在食品中组分提取和各种有害残留分析中的应用日 益广泛。申京掣”1 等建立了鸡肉中4 种氟喹诺酮类药物残留的s f e h p l c 法，萃取样 品用荧光法外标定量，前处理方法简便、经济、效果好，相对标准偏差在1 4 - 1 4 1 。 d a n a h e r t 3 4 】等采用离线的s f c h p l c p d a 方法测定动物肝脏中1 0 种苯并咪唑类药物 的残留，比较了o a s i sm c x 柱、c 1 8 柱、s c x 柱、l l p 四种不同的净化手段，结果表 明s c x 故乡萃取柱的净化效果最好，方法的平均回收率在5 1 - 一11 5 ，定量限为 5 0 “g l ( g 。s t o l k e r 3 5 】等建立了肉中康力龙的h p l c m s 快速测定方法，样品经s f e 萃取， 在线氨丙基富集，内标法定量，方法的平均回收率在11 1 8 ，定量限为o 5 p g l ( g 。 s f e 只适用于非极性或弱极性化合物的萃取，若要萃取极性化合物或离子化合 3 山东大学硕士学位论文 物，需加入少量的有机改性剂以增加溶剂的极性，如甲耐3 6 1 、乙醇【3 7 1 、乙腈【3 8 1 、水 【3 9 】、异丙醇【矧、丙酮【4 l 】、正己烷【4 2 】等。 s f e 由于以下缺点限制了其应用：仪器昂贵，试验成本较高；萃取过程中需要优 化的参数太多，建立一个新的方法较费时间；极性化合物的萃取需要向超临界c 0 2 加入改性剂，这会导致萃取的选择性降低；样品基体对萃取结果有较大的影响，从 而导致每一种样品的分析都要重新优化萃取方法。 1 4 5 凝胶渗透色谱 凝胶渗透色谱( g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，g p c ) 是食品样品分析中最常用 的净化技术，特别适用于有机污染物的痕量分析。利用被分离物质分子量大小的不 同进行分离，其作用类似一组分子筛，将样品溶液加到柱子上后，用溶剂淋洗，分 子量大于目标分析物的脂肪、色素、蜡质、聚合物、蛋白质、类固醇等先被淋洗出 来，然后目标分析物按分子量大小相继被淋洗出来。 g p c 适用于各种食品样品萃取液的净化，特别是对脂类和色素含量高的样品净 化特别有效。g p c 作为一种有效的分离净化技术，可以与h p l c 或g c 系统在线联用， 将样品的萃取净化和检测自动