（水产品加工及贮藏工程专业论文）不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较.pdf

1 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 摘要 本文选取当前市场销售的品质、价格不一的l o 种海参，提取分离其多糖， 从化学组成、波谱分析以及酸解寡糖组分分析三个角度分析比较了1 0 种海参多 糖。建立并优化了应用柱前衍生高效液相色谱测定海产动物多糖单糖组成的方 法，同时测定糖醛酸、氨基糖和中性单糖。本方法快速、准确，应用性强，解决 了当前海产动物中多糖、单糖组成测定繁琐、易受干扰的问题。 海参多糖提取采用酶解、乙醇沉淀和季胺盐沉淀法；分子量测定采用高效凝 胶过滤色谱法；化学组成分析分别采用传统化学法和柱前衍生高效液相色谱法， 并进行结果比较；硫酸基的取代位点采用红外波谱和核磁共振波谱测定；水解寡 糖采用稀硫酸水解法进行，酸解寡糖化学分析采用薄层层析色谱和高效液相色谱 进行。 研究结果发现，1 0 种海参多糖在化学组成上差异明显。多糖得率以中国产 日本刺参为最高，达7 1 6 ，以日本刺参为最低，仅为1 3 1 。所得1 0 种海参 多糖分子量集中在三大区域：大于7 0 万，1 6 2 5 万以及o 5 一1 2 万。b l a c kt e a t 多糖、北极海参多糖、冰岛刺参多糖、挪威红参多糖以及日本刺参多耱主要组分 的分子量为1 6 2 5 万，其余5 种海参多糖主要组分的分子量大于7 0 万。1 0 种海 参多糖总糖、蛋白、硫酸基、糖醛酸和氨基糖含量的波动范围分别为 4 0 3 3 - 6 2 1 l ，0 4 4 一1 9 4 8 ，1 9 5 4 - 2 9 9 5 ，9 8 5 1 3 3 8 细4 9 2 - 1 0 1 8 。 中性单糖测定表明1 0 种海参多糖均含有岩藻糖和半乳糖，部分含有甘露糖和葡 萄糖，且岩藻糖含量很高。1 0 种海参多糖在阴离子交换树脂色谱柱上的洗脱曲 线明显不同，除仿刺参多糖和日本刺参多糖外，其余8 种海参多糖均在盐浓度为 3 2m o l 的洗脱条件下洗脱完全。 柱前衍生高效液相色谱法采用2m o l lt f a ，1 1 0o c ，8 h 的水解条件，1 一 苯基一3 一甲基一5 一吡唑啉酮( p 胛) 衍生，z o r b a xe c l i p s ex d b - c 1 8 分离柱分离， 紫外检测法对1 0 种海参多糖进行单糖组成分析。其对中性和碱性单糖组成的测 定结果和传统化学法测定结果基本一致，但对糖醛酸的测定，传统化学法测定结 果明显偏高，液相色谱法的测定结果较为准确。将液相色谱法推广至羊栖菜多糖、 鱿鱼墨多糖、鲨鱼软骨多糖、鲨鱼鱼翅多糖以及褐藻胶等多种海产动植物多糖单 糖组成的测定，结果令人满意。 红外波谱表明，l o 种海参多糖均含有羟基、羧基、乙酰胺基、硫酸基以及 岩藻糖的甲基，且不同海参多糖硫酸基的取代位点不同。菲律宾刺参多糖、中国 产日本刺参多糖、s a n df i s h 多糖、b l a c kt e a t 多糖、j 匕极海参多糖以及墨西哥 刺参多糖的硫酸基取代位点是岩藻糖的c 一4 位或氨基半乳糖的c 一4 位；冰岛刺参 多糖和美国肉参多糖的硫酸根取代位点可能在岩藻糖的c 一4 位或氨基半乳糖的 c 一2 位或c - 4 位；而挪威红参多糖和日本刺参多糖则可能在岩藻糖的p 2 位、c - 3 位、c 一4 位或者是氨基半乳糖的c _ 4 位或c - 6 位存在硫酸根取代情况。核磁共振 波谱印证了红外波谱的信息，同时给出双硫酸根取代和未经硫酸根取代岩藻糖的 1 h 化学位移信号。除s a n df i s h 多糖外，其他海参多糖均存在c 一2 、c 蚰4 位双硫 取代岩藻糖，而c - 3 、c - 4 位双硫取代岩藻糖只存在于菲律宾刺参多糖、s a n d f i s h 多糖、b l a c kt e a t 多糖、北极海参多糖、冰岛刺参多糖以及日本刺参多糖 中。除挪威红参多糖、美国肉参多糖和墨西哥刺参多糖之外，其余7 种海参多糖 均含有未经硫酸化的岩藻糖。 酸解海参多糖的最佳条件为0 0 5 m o l lh 2 s 0 4 ，8 0 1 2 ，水浴1 8 h 。所得l o 种海参寡糖经薄层层析色谱分离得到4 7 个寡糖组分，北极海参多糖、美国肉参 多糖、墨西哥刺参多糖、日本刺参多糖和挪威红参多糖得到的组分较为简单，分 子量更为集中，有利于进一步的寡糖制备和结构分析。1 0 种海参寡糖经高效液 相色谱分析发现，酸解寡糖主要组分集中在分子量为9 2 0 2 0 0 0 的部分，可能的 聚合度为5 1 1 。 关键词：海参多糖；化学组成；波谱分析；酸解寡糖分析：l - 苯基孓甲基喜毗 唑啉酮 e x t r a c t i o na n dg h e m i c a ic o m p o n e n ta n a l y s i so f p oly s a o c h a rid e sf r o mdi 仟e r e n ts e ac u c u m b e r s a b s t r a c t t e ns p e c i e so fs e ac u c u m b e r sw i t hd i 岱删p r i c ea n dq u a l i t yw e r es e l e c t e df r o m t h em a r k e tf o rc h e m i c a l ，s p e c t r u ma n dh y d r o l y z a t i o na n a l y s i s p o l y s a c c h a r i d e sf r o m d i 岱玎哪s e ac u c u m b e r sw e r es e p a r a t e db yp a p a i n , p r e c i p i t a t e d b ye t h a n 0 1 a n a l y z e d w i t hs i xc h e m i c a li n d e x e su s i n gt r a d i t i o n a lm e t h o da n dh p l c ，a n de l u t e do n q s e p h a r o s e 甩r e c o r d i n gt h ee l u t i o nc u r v e s u l f a t i o np o s i t i o nw a sd e t e r m i n e db yi r a n d n m r ；h y d r o l y z a t i o n 谢吐lh 2 s 0 4w a sa n a l y z e db yt l ca n dh p l c t h er e s u l ts h o w st h a tc h e m i c a lc o m p o n e n to fp o l y s a e e h a r i d e sf r o mt e ns p e c i e so f s e ac u c u m b e r sa r c o b v i o u s l yd i v e r s i f i e d , a n d t h ee l u t i o nc l i i w e so ft h e s e p o l y s a c c h a r i d e s0 1 1q s e p h a m s ef fa i ed i s t i n c t f o rt h ey i e l do f t e np o l y s a e e h a r i d e s p o l y s a c e h a r l d ef r o ma p o s t i c h o p u sj a p o n i c u sa r r e s t e di nc h i n aa c 缸e v e st h eh i 曲e s t ， 7 1 6 a n dt h el o w e s tg o e st op o l y s a c c h a r i d ef r o ma p o s t i c h o p u s j a p o n i c u sa r r e s t e d i nj a p a n ，1 3 1 t h em o l e c u l a rw e i g h to f t e np o l y s a c e h a r i d e sf a l l si n t ot h r e eg r o u p s ： 7 0 0 ，0 0 0 ，1 6 0 ，0 0 0 - 2 5 0 ，0 0 0 ，5 , 0 0 0 1 2 ，0 0 0 t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h em a i nf r a c l j o l l o fp o l y s a c c h a r i d e sf r o mh o l o t h u r i av a g a b u n d a ，h o l o t h u r i am e x i c a n a , c u c u m a r i a f r o n d o s a , s t i c h o p u st r e m u l u sa n da p o s t i c h o p u s j a p o n i c u sa r r e s t e di nj a p a na r ei nt h e s e c o n dg r o u p ，a n dt h er e s tf i v ep o l y s a c c h a r i d e sa r ei nt h ef i r s tg r o u p c o n t e n to ft o t a l s u g a r s ，p r o t e i n , s u l f a t e ，l l r o u l ca c i da n da m i n o s u g a ro fp o l y s a c c h a r i d e sf r o mt e n s p e c i e so fs e ac u c u m b e r sa r ef l u c t u a t e dw i t h i n4 0 3 3 6 2 1 l 。0 4 4 0 o - 1 9 4 8 。 1 9 5 4 - 2 9 9 5 ，9 8 5 。o - 1 3 3 8 a n d 4 9 2 。o - 1 0 1 8 ，r e s p e c t i v e l y n e u t r a l m o n o s a c c h a r i d ea n a l y s i ss h o w st h a tf u e o s ea n d g a l a c t o e x i s ti na l lt h et e n p o l y s a c c h a r i d e sw k i l el l a a n n o s ca n dg l u c o s ee x i s t e dp a r t l y ，a n dt h ec o n t e n to ff u c o s c i sv e r yh i g l le l u t i o nc i 1 r v eo ft e n p e l y s a c c h a r i d e so nq - s e p h a r o s ef fd i f f e r s o b v i o u s l y a l lt h ep o l y s a c c h a r i d e sa 埽e l u t e da tt h es a l i n i t yo f3 2m o l l e x c e p tf o r t h o s ef r o m a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u s af a s ta n ds e n s i t i v em e t h o di sd e v e l o p e df o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fn e u t r a l s u g a r s 。a m i n os u g a r sa n du r o 碰ca c i d si np o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t e df r o ms e a c u c u m b e r s ，w h i c h i s b e s t h y d r o l y z e d u n d e r t h ec o n d i t i o n o f 2 m o l l t f a a t1 1 0 cf o r 8 h u s i n gh p l cw i 出1 - p h e n y l - 3 - m e t h y t 一5 - p y r a z o l o n e ( p m p ) d e r i v a t i z a t i o na n d v a r i a b l ew a v e l e n g t hd e t e c t i o n ( v w d ) c o m p m e dw i t ht h er e s u l td e t e r m i n e di n t r a d i t i o n a lm e t h o d , t h ec h r o m a t o g r a p h yr e s u i ts o , m se x a c tf o ra m i n o s u g a r sa n d n e u t r a ls u g a r s a n dl o w e rf o rm o m ca c i d , b u tt h el a t t e rm e 也o dg i v e sm o r ep r e c i r e s u l ta n dc a l lb ea p p l i e df o rm o n o s a c c h a r i d ec o m p o n e n ta n a l y s i si np o l y s a c e h a r i d e s f r o m 如f o , - m e ，s q u i di n k , s h a r kb o n e ，s h a r kf i na n ds e a w e e d sw i t hs a t i s f y i n g r e s u l t t h e1 ra n a l y m so ft e np o l y s a c 圮h a r i d e ss h o w st h a te a c hp o l y s a e c h a r i d ec o n t a i n s g r o u p so f o h ，- c o o h ，- n h a c ，s 0 4 ，- c h 3 ，a n di ss u l f a t e da ld i f f e r e n tp o s i t i o n s s u l f a mg r o u p so fp o l y s a c c h a r i d e sf r o mp e a r s o n o t h r i ag r a e f f e i 、a p o s 打c h o p u s j a p o n i c u sa r r e s t e di nc h i n a 、h o l o t h u r i as c a b r a 、h o l o t h u r i av a g a b u r m a 、h o l o t h u r i a m e x i c a n aa n dl s o s t i c h o p u s f u s c u sa r cs u b s t i t u t e da tc - 4 p o s i t i o no f f u c o s er e s i d u e so r c - 4p o s i t i o no fg a l a e t o s a m i n er e s i d u e s ；s u l f a t eg r o u p so fp o l y s a c c h a r i d e sf r o m c u c u m a r af r o n d o s aa n di s o s 打c h o p u sb a d i o n o t u sa 1 ：es u b s t i t u t e da tc 4p o s i t i o no f f u c o s er e s i d u e so rc - 2 4p o s i t i o no fg a l a e t o s a m i n er e s i d u e s ；a n dt h o s ef o rs t c h o p u s t r e m u l u sa n da p o s t i c h o p u sj a p o n i c u sa r r e s t e di nj a p a na l ea tc - 2 3 4p o s i t i o no f f u c o s er e s i d u e so rc - 4 6p o s i t i o no f g a l a e t o s a m i n er e s i d u e s t h en m r a n a l y s i ss h o w s t h a ls u l f a t eg r o u p sa r ed i s u b s t i t u e da tc - 2 4p o s i t i o n si na l lt h ep o l y s a e e h a r i d e se x c e p t f o rt h a to fh o l o t h u r i a s c a b r a ，a n d a t c - 3 ，4p o s i t i o n si np e a r s o n o t h r i a g r a e f f e i , h o l o t h u r i as c a b r a , h o l o t h u r i av a g a b u n d , h o l o t h u r i am e x i c a n a ，c u c u m a r i a f r o n d o s aa n da p o s t i c h o p u sj a p o n i c u sa r r e s t e di nj a p a n f u c o s ew i t h o u ts u l f a t i o n e x i s t e di n a l lt h ep o l y s a c c h a r i d e se x c e p tf o rt h o s ef r o ms t i c h o p u st r e m u l u 、 i s o s t i c h o p u sb a d i o n o t u sa n dl s o s t i c h o p u s 彝岱c 憾t h eb e s th y d r o l y t i cc o n d i t i o nf o r s e ac u c u m b e rp o l y s a c c h a r i d e si sw i t h0 0 5t o o l 。l h 2 s 0 4a t8 0 cf o r1 8 h f o u rt o s e v a nc o m p o n e n ta r ef o u n di nt e nh y d r o l y z a t e sa f t e rt l cs e p a r a t i o n c o m p o n e n t f r o mh o l o t h u r i am e x i c a n a 、s t i c h o p u st r e m u l u s 、l s o s f i c h o p u sb a d i o n o t u s 、i s o s f i c h o p u s f u s c = a n da p o s t i c h o p u s j a p o n i c u sa r r e s t e di nj a p a na r cs u i t a b l ef o rf u r t h e ra n a l y s i s ， h p l ca n a l y s i ss h o w st h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to f t e nh y d r o l y z a t e si sb c t w e , c n9 2 0t o 2 0 0 0 ，a n dt h ep o s s i b l ep o l y m e r i cd e g r e ei s5t o1 1 k e yw o r d s ：s e 8c u c u m b e rp o l y s a c c h a r i d e ；c h e m i c a lc o m p o n e n t ；两挎c t r 峨 a n a l y s i s ；h y d r o l y z l o li g o s a c c h a r i d e a n a l y s i s ； 1 , - p h e n y l - 3 1 e l ：h y i 卸y r a z o l o n e ( p - p ) 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注瓤致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得教育机构的学位或证书使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文串作了明确 的说明并表示谢意。 一一竺幽竺竺! 互! ! ! 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复铡手段保存、汇编学位论文。 靴论文储鹳懈3 跨 签字日期：h 0 年月p 日 导师签字： 季0 签字日期纠年g 月t 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位仁眺鹚) ，家岑东召莎。司 电话： 通讯地址： 邮编： 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 0 前言 0 1 海参资源概述 海参( a c u c u m b e r s ，h o l o t h u r i a n s ) 属于棘皮动物门海参纲，广义的海参包括 海参纲所有的种类。水产上的海参系指那些可供食用的干海参。全世界有海参约 1 0 0 0 多种，我国有约1 4 0 多种。全世界约有4 0 种海参可供食用，我国约2 0 种，其中 有1 0 种具有较高的商品价值l l l 。 0 1 1 世界海参资源概述 全球有记录的海参种数约1 0 0 0 多种，分布于全球各大洋，主要在热带区和温 带区，绝大多数进行底栖生活【2 】。热带区海参资源呈多种性，多分布在太平洋热 带区和印度洋，主要有印度尼西亚、菲律宾、马来西亚和南太平洋的新喀里多尼 亚、斐济、巴布亚新几内亚等国家。热带区海参资源不仅种类多，而且资源量大， 据统计，目前世界海参产量的8 6 来自热带区。热带区海参资源主要有黑沙参( 丘 n o b f f 妇) 、白沙参( 豇f u s e o g i l v a ) 、糙海参( hs c a b r a ) 、多色糙海参值s c a b r a v e r s i c o l o r ) 、棘辐肛参( 4 e c h i n i t e s ) 、乌皱辐肛参组m i l i a r i s ) 、梅花参缸 a n a n a s ) 、绿刺参 c h o l o r o n o t u s ) 、花刺参 v a r i e g a t u s ) 等。 海温带区海参资源呈单种性，多分布于太平洋东西两岸的温带区，其中东岸 以美国棘参僻c a l i f o r n 洒) 为主，西岸以棘参 j a p a n i c u s ) 为主。温带区主要有 中国、日本、韩国、加拿大、美国等。其中，日本主要产区在北海道，美国主要 产区在华盛顿州，加拿大全部产区在不列颠哥伦比亚省。温带区海参资源主要有 刺参 j a p o n i c u ss e l e n k a ) 、花刺参 v a r i e g a t e ss e m p e r ) 、绿刺参岱c h l o r o n o t u s b r a n d t ) 、梅花参( t a n a n a sj a e g e r ) 、黑乳参m i c r o t h e l e ) 等。 0 1 2 我国海参资源概述 我国有海参约1 4 0 多种，其中2 0 多种海参可供食用，常见的食用海参归类于 表o l 。 表o - 1 我国食用海参的类群分布1 3 4 l t a b l eo - ld i s t r i b u t i o no fe d i b l e 蝴e n c u m b e r si nc h i n a 科目 海参学名中文名 产地食用质量 刺a p o s “c h o p u s 体壁厚而软，是北部沿海的食用 参仿刺参山东、河北和辽宁沿海 科 j a p o n i e u s海参中质量最好的一种 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 p e n t a e t a 裸五角山东青岛、浙江嵊泗列体壁较硬，食用质量较差 2 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 瓜参岛、福建厦门、东山 参p a r a c a u d i n a 科 体壁很薄，品质较差，食用价值 c h i n e n s i sv a l ：海棒槌南北沿海浅海均常见 很低 r a o , s o n n e t i i 0 1 3 本研究所用1 0 种海参资源概述 本实验选取了当前市场销售的品质价格不一的1 0 种海参，基本信息如表d 屹 所示。 表o - 21 0 种海参资源基本信息 t a b l eo 一2b a s i ci n f o r m a t i o no f1 0s e ac u c u m b e r s 3 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 0 2 海参加工现状 目前，国内海参产品主要有海参鲜品、传统海参干品、深加工的海参食品。 海参加工是新兴行业，发展迅速，但是海参产品正面临着质量标准空白的窘境。 传统海参于晶加工方法不仅粗糙两且复杂。通常按以下环节处理： 鲜参去内脏一清洗一煮参一腌渍一下缸一烤参拌灰一晒干一成品干参 传统的海参干品加工方法缺点很多：一是干参食用之前需多次水洗、煮沸， 水溶性及热敏性等营养活性物质损失太大：二是食用十分不便，水发时间长；三 是容易以次充好、掺假使杂，判断干参好坏优劣无标准可循。同时，制品的体积 缩小严重，复水较难，还容易出现表面结壳龟裂、脂肪氧化，导致产品表面变色 等质量缺陷，影响了制品质量的均一性和耐藏性。为解决食用不便这一闯题出现 的水发海参，在干参胀发过程中再次造成风味物质大量流失，产品已无鲜参风味。 更为严重的是某些加工企业为了快发、多发，采用火碱等化学药剂发参，为了防 腐甚至添加有害人体的物质，造成严重的食品安全问题。 深加工的海参食品分为以下几种：以新鲜海参为原料，热干后研磨成粉状 4 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 制成胶囊剂型。以海参浆液为主体，配以蜂蜜、蜂皇浆等调味制成口服液型。 海参的即食食品( 海参的熟制品) ，通常采用南方产量很高的梅花参、白参等为 原料，熟制后烘干切成丝状或条状。将发制后的海参，真空包装或者罐装。 海参酶水解制品，通过组织自溶、外源酶处理等化学方法，经喷雾干燥成粉剂或 者经调味剂、防腐剂调配制成口服液型。这种工艺，可将海参中的蛋白质转变成 可溶性的多肽或氨基酸，易于被人体吸收利用。以鲜海参为主要原料，经有益 活菌发酵、喷雾干燥得到的发酵型海参营养素干粉。提取海参体内的活性物质， 制成含蛋白质、多糖等有效成份的胶囊。 近年来，真空冷冻干燥技术被越来越多地应用于海参产品的研制工艺中。干 燥后的海参含水量极低，不需任何添加剂和防腐剂，即可在密闭的真空环境下持 续较长的保质期，且产品形体大而饱满，复水容易。冻干海参虽然生产成本高， 但其附加值高，被公认为是目前最好的海参加工方法。 总之，海参加工产品层出不穷，市场前景越来越广阔，但是也存在着一系列 问题，如加工方法科技含量不高，海参行业标准亟待建立等。特别是海参产品质 量标准空白这一窘境已引起社会广泛关注，这也为本课题提供了研究背景。 0 3 海参多糖研究概况 海参多糖，主要存在于海参体壁及废弃内脏中。目前发现存在于海参体壁的 多糖主要分两类：一类为海参糖胺聚糖或粘多塘( h o l o t h u r i a ng l y c o s a m i n o g l y c a n ， h g a 6 ) ，是由d - n 乙酰氨基半乳糖、d 葡萄糖醛酸和b 岩藻糖组成的分支杂多 糖，相对分子质量为4 万一5 万；另一类为海参岩藻多糖( h o l o t h u r i a nf u c a n ，磁) ， 是由l 岩藻糖所构成的直链多糖，相对分子质量为8 万一l o 万。两者的组成糖基虽 不同，但糖链上都有部分羟基发生硫酸酯化，并且硫酸酯基类多糖含量均在3 2 左右，两种海参多糖的特殊结构，均为海参所特有。由于h g a g 的结构组成比h f 复杂，下文的研究方法概述主要就h g a g 展开。 0 3 1 海参多糖的提取分离 h g a g 是蛋白多糖的糖链部分。众多g a g 以共价键( 糖肽键) 与蛋白链相连， 自然状态下，h g a g 与蛋白链间通过非共价键( 氢键等次级键) 形成具有螺旋、 折叠、盘绕、卷曲空间构象的大分子聚集体。h g a g 的提取分离首要问题是在多 糖不被显著降解的条件下去除结合的蛋白质【5 l 。提取分离h g a g 不仅要破坏蛋白 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 多糖聚集体间的次级键( 这只能分离蛋白多糖) ，还要降解核心蛋白链，更主要 的是要破坏多糖链与蛋白质的共价结合( 糖肽链) 。从而释放出多糖链，以便提 取分离。 目前常采用酌提取方法主要有碱提取法与蛋白质水解法。前者是基于蛋白多 糖中的糖肽键对碱的不稳定性，该法简便易行。但由于碱处理后易发生w a l d e n 转化或形成3 ，6 - 内醚衍生物而发生脱硫现象，所以使这种方法的应用受到限制。 蛋白质水解法是提取h g a g i 比较理想的方法，它在不改变多糖链结构的前提下， 先以碱处理，再以蛋白酶水解，对于h g a g 的释放十分有效。同时为了使蛋白质 充分水解，历用蛋白水解酶多采用两种以上酶制剂来加强水解效果。韩慧敏等6 1 就曾采用匀浆技术，胃、胰蛋白酶降解蛋白质的方法，对h g a g 的提取取得了良 好的效果。巴西研究学者r i e a r d op v i e i r a 等t 7 1 采用木瓜蛋白酶辅以半胱氨酸和 e d t a 酶解法提取lg r i s e a g a g ，效果良好。 h g a g 的分离方法主要有沉淀法，近年来又出现了离子交换色谱法及其它方 法嘲。常用的沉淀剂有乙醇、季胺盐和醋酸钾，其中乙醇应用最为广泛。在h g a g 的钙盐、钠盐或钾盐溶液中加入不同含量的乙醇，多糖颗粒水化膜被破坏，溶液 电离常数降低，h g a g 便以盐的形式分级沉淀，从而得以分离。如陈菊娣等 9 1 对 花刺参d p g a g 的提取即是以4 2 9 6 乙醇分离，而沈鸣等【删采用6 5 的l 醇分离糙海 参多糖，李海棠等【1 1 1 则结合使用季胺盐、乙醇和醋酸钾沉淀分离玉足海参多糖。 离子交换色谱法的分离原理是根据离子特性的差异，如h g a g 中己糖醛酸的 羧基与s o g 一的取向、类型及数量差异，用不同离子强度的n a c l 溶液洗脱而分离 0 2 1 。其相对于其他许多分离方法的优点在于上柱前不必浓缩，色谱柱本身从溶液 中吸附多糖，从而起到浓缩作用。层前，许多商业化离子交换树脂，尤其是多糖 基离子交换树脂已在h g a g 的分离中应用。如d e - 5 2 - 纤维素【l ”， d e a e s e p h a d e x 1 4 l ，q - f f s e p h a r o s e 1 5 1 等等。 另外，6 0 9 代发展起来的凝胶过滤色谱、7 0 年代发展起来的亲和色谱以及近 年来兴起的制备性高效液相色谱技术都已用于h g a g 的提取分离，并已取得了很 好的效果。但是由于h g a g 分子量的不均匀性、硫酸化程度的不致性、显微结 构的不均匀性以及残基数量的多变性，目前尚难将提得绝对意义上“纯”的 h g a o 。 6 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 o 3 2 海参多糖化学组成分析 0 3 2 1h g a g 的分析与检测 h g a g 的测定( 定性、定量) 主要采用一些化学方法，如：组织化学和物理 化学方法。组织化学方法常用的是染色法，如：阿利新蓝( a l i c a nb l u e ) 染色法、 天青i 染色( a z u r ea ) 、甲苯胺蓝等。由于g a g 的染色没有特异性，所以难以得到 准确的结果。比色法和分光光度法常用于g a g 的共同定性定量分析中。另外还有 同位素标记法【、凝胶色谱法、电泳法等。 0 3 2 2 单糖组分的测定 g a g 的二糖重复单位是由氨基己糖、己糖醛酸通过糖苷键连接而成，在氨基己 糖与己糖醛酸上还带有一些取代基团，如：硫酸基( 一s 0 4 2 - ) 、乙酰基( 一n r ) 等。 在进行单耱组分的测定之前，必须先用酸、碱或酶进行水解，将g a g 大分子分解成 单耱片断、取代基团和氨基酸片段三部分。其中的单糖片断可分为碱性单糖 ( h e x n h ) 、中性单糖和酸性单糖( h e x u a ) 。 碱性单糖包括游离的氨基己糖和n 一乙酰氨基己糖，最常用的检测方法有e l s o n - m o r g a n 法、m o r g a n - e l s o n 法、w a n g e r 法及其改进方法。 中性单糖的测定常用的方法有比色法，如：苯酚一硫酸法、蒽酮比色法、卜 半胱氨酸一硫酸法等。现在已有多种自动分析仪器出现，给中性单糖的测定带来 了方便，如：气相色谱。 酸性单糖( 已糖醛酸) 的测定方法有d i s c h e 法及其改进方法b i t t e r 法和n e l l y 法。常用的还有咔唑一硫酸法f r n 。 0 3 ，2 3 取代基的测定 对于g a g 中的硫酸基，通常采用明胶一氯化钡法进行鉴定，另外还有：比重法、 滴定法、电导率法和比浊法等，但都不如用4 一氯一4 一联苯胺进行分光光度法灵敏 度高。电泳法也可用于完整g a g 分子中o - 和n _ 硫酸酯基的测定( 低于l | lg ) 主 要是根据电泳迁移率与硫酸基组成比例来进行分析的。 对于乙酰基的测定，可采取气相色谱法( 6 c ) 、核磁共振波谱法( 1 hn m r ) 等。 0 3 2 ，4 国内外研究进展 国内外有关研究表明海参中酸性粘多糖基本上由氨基半乳糖、葡萄糖醛酸， 岩藻糖和硫酸基组成，现将几种海参多塘的化学组成 9 , l g 铡归列于表0 - 3 。 7 不同海参多塘提取分离及化学组成分析比较 表o _ 3 不同海参多塘的化学组成( g l o o g ) t a b l e 0 - 3 c h e m i c a l c o m p o n e n t o f p o l y s a c c h a r i d e s f r o m d i f f e r e n t s e a c u c u m b e r s 。：( m o v m 0 1 ) 0 3 3 海参多糖结构分析 对多糖结构的分析测定是研究其生物活性的基础。而糖的高级结构是以级 结构为基础的，但与蛋白质或其它大分子不同的是，糖链的一级结构包括更广泛 的内容，要分析多糖的一级结构必须包括以下几个内容：相对分子质量、糖基组成 及各种组成单糖的分子数比例、单糖构型、单糖的连接次序、异头构型、取代基 情况、以及糖链与非糖链的连接等。g a g 结构分析的方法也有很多。测定糖链一 级结构的方法见表o - 4 。 表o - 4 测定糖链一级结构的常用方法 t a b l e0 - 4t h ea n a l y s i sm e t h o d so f s a c c h a r i d e ss t r u c t u r e 解决的问题常用的方法 相对分子质量的铡定 单糖组成和分子比例 毗喃环或呋喃环形式 连接次序 凝胶过滤法，m s ，蒸气压法等 部分酸水解，完全酸水解，纸色谱，g c i r 部分酸水解，糖苷酶顺序水解，啪t 8 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 解决的问题常用的方法 2 。8 2 异头异构体糖苷酶水解，n m r ，i r 羟基被取代情况甲基化反应一气相色谱，高碘酸氧化，n m r 。i r 糖链2 肽链连结方式单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应 0 3 3 1 化学方法 水解法：在进行多糖链分析时，水解法是最基本的方法。水解法包括完全酸水 解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。完全酸水解是将多糖与强酸( 硫酸、盐酸) 在一定温度( 8 0 - 1 0 0 x 2 ) 进行水解( 4 1 0h ) 。水解后可采有纸色谱( p c ) 、薄层色谱 ( t l c ) 、气相色谱( g c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 和离子色谱法( i c ) 进行分析。部 分酸水解是利用多糖链中部分糖苷键如呋喃型糖苷键、位于链末端的糖苷键和支 链中的糖苷键易水解脱落，而构成糖链的主链重复结构的部分和糖醛酸等对酸水 解相对稳定的特点，将多糖进行部分酸水解后，经醇沉、离心，将上清液与沉淀物 分别进行分析，根据所得到的一些小片段可推测多糖链的一些结构特点。乙酰解 主要是将多糖乙酰化，可进行单糖组成分析。目前应用较好的是甲醇水解，多糖在 h c l - c h 3 0 h 溶液中甲基化，形成甲基糖苷，经g c 或t t p l c 分析，可得到单糖的组成。 甲醇水解虽然得到不同形式的单糖，但得率高，所得图谱清晰，分辨率高。 高碘酸氧化法：高碘酸可以选择性地断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处， 生成相应的多糖醛，甲醛或甲酸，根据反应的定量进行，通过测定高碘酸的消耗量 及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分支 数目等。但反应必须在控制条件下进行，以防止发生超氧化反应。 s m i t h 降解：将高碘酸氧化产物用硼氢化钾或硼氢化钠还原成稳定的多羟基 化合物，经酸水解后，用纸层析或g c 鉴定水解产物，由降解产物可推断糖苷键的位 置。 甲基化反应( 改良h a k o m o r i 法) ：多糖在无水二甲亚砜( d m s o ) 作用下，各种单 糖残基中的游离羟基全部甲基化，从而将糖苷键水解，水解后得到的化合物其羟 基所在的位置即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例可以 推测出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。水解产物经g c 或g c m s 分析。由 于g a g 中含有酸性单糖( 不溶于d m s o ) ，进行甲基化之前必须先将其乙酰化，乙酰基 在反应过程中会自动脱落而不影响结果。一般是将多种方法结合起来进行推定糖 9 不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较 苷键的位置和糖链上取代基的位置。 0 3 3 2 生物学方法 多糖裂解酶法在酸性粘多糖的结构研究与组成分析中已得到了广泛的应用。 这主要是由于糖苷酶的底物高度专一性。其中外切酶主要是针对耱链的非还原端 单糖及其糖苷键的构型，应用最多；内切酶主要是用于从糖复合物中释放糖链。 外切酶消化产物用气一液色谱、纸色谱等可分析测定所释放的寡糖。另外还可用 同位素标记寡糖叫，观察消化前后产物的变化( 纸色谱、凝胶电泳、凝胶过滤色谱 阅等) ，可推测糖基数。常用的糖苷酶有：软骨素裂解酶( a c 、a b c 、a c i i ) 【硼、 8 一半乳糖苷酶i 均等，如软骨素酶a c 或a s c 只裂解n 一乙酰氨基己糖s1 4 糖醛酸， 肝素裂解酶只裂解n 一硫酸氨基己糖q1 4 糖醛酸。酶法一般要借助于其它的分 析方法共同分析，如在研究海鞘s p l i c a t a 和h , 毋, r i f o n n j sq a g a g = 糖重复单位时， 就将酶法与h p l c 法结合 2 9 1 。g a z u y u k is u g a h a r a ( 1 9 9 6 ) 在研究巨蟹软骨q = c s - k 时， 用软骨素酶a c - i i 降解后，结合快速离子轰击法、h p l c 和1 h _ n m r ( 5 0 0 m h z ) 法分析其 四糖重复单位( 3 0 l 。 免疫学方法：抗原与抗体会相互结合，一定结构的多糖会抑制抗体一抗原的相 互结合，不同的糖( 半抗原) 有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链对抗原和 抗体的结合产生了抑制，通过测定其抑制常数，再与已知结构的糖链相比较，有相 近抑制常数的多糖，其结构也相似【3 1 翊。 0 3 3 3 物理学方法 红外光谱法( r ) ：是有机化学元素和高分子化学研究中不可缺少的工具。 5 0 年代开始应用于糖类的研究中，如不同糖的鉴定、定量测定( 可达微克级) 、取 代基的识别口3 】等。随着人们在研究中发现，还可识别糖的构型( d - 、l 一型) 。如b 一糖菅键8 9 0 c m - 1 有吸收峰，两a 一糖营键在8 4 0c m