（生物医学工程专业论文）双亲性分子伞的合成表征与穿膜研究.pdf

双亲性分子伞载体的合成表征及其穿膜研究 l 9 2 9 细胞均没有毒性；2 5 m 的5 - c f - m u 在4 8h 内也没有毒性，5 0 ，1 0 0 和2 0 0l x m 在4 8h 呈现少许毒性，但仍有较高的细胞成活率。同时检测 了5 - c f - m u 对h e l a 细胞在2 4h 内的细胞毒性，结果表明浓度低于1 0 0g m 时，分子伞对h e l a 细胞也没有毒性。上述结果说明分子伞具有良好的生 物相容性。 ( 2 ) 采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测了5 - c f - m u 在h e l a 细胞和l 9 2 9 细胞内的分布情况。绿色荧光点不仅分布在细胞质中。而且分布在细胞 核周围，表明5 c f - m u 已经进入了h e l a 细胞和l 9 2 9 细胞。实验证明分子 伞是一种可以实现跨膜运输的载体。 ( 3 ) 采用流式细胞仪考察了温度、浓度、时间以及a t p 抑制剂作用下对5 c f m u 穿透细胞膜的效率的影响。结果表明分子伞的穿膜是一个时间、浓度 和温度依赖而非能量依赖的过程。 ( 三) 分子伞的穿膜机制 ( 1 ) 建立了分子伞穿透细胞膜的数学模型。根据流式细胞仪检测结果，细胞 内的平均荧光强度( m f i ) 与培养时间的平方根( t 舱) 、初始浓度的平 方根( c o 忱) 均成很好的线性关系，线性相关系数( r 值) 分别为0 9 8 5 和0 9 9 4 。 ( 2 ) 分子伞穿透细胞膜的过程符合所建立的数学模型，表明分子伞是以溶 解扩散的方式穿透细胞膜。 关键词：分子伞：药物载体；跨膜运输 a b s t r a c t a b s t r a c t c e l lm e m b r a n e ss e r v i n ga ss e l e c t i v en a t u r a lb a r r i e r sp e r m i tt h ep a s s a g eo fs o m e n e c e s s a r ym o l e c u l e sa n di o n sw h i l ei n h i b i tt h ee n t r a yo fm a n yb i o l o g i c a l l y - a c t i v e m o l e c u l e st h a th a v et h e r a p e u t i cp o t e n t i a l , e s p e c i a l l yt h o s et h a ta rer l i g m yh y d r o p h i l i co r c h a r g e d , e 吕，a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e s ，d n a ，p r o t e i n ，a n dc e r t a i np e p t i d e s t od e s i g na n e wd r u gv e c t o rf o rp r o m o t i n gt h ea g e n t sa c r o s sc e l l u l a rm e m b r a n ea n dr e l e a s i n ga tt h e t a r g e t i s s u e si sap e r s i s t e n t c h a l l e n g e an o v e lm o l e c u l a ru m b r e l l av e c t o r 、矶l a m p h i p h i l i cf a c e sm a yt r a n s p o r tm a n yb i o t h e r a p e u t i cm o l e c u l e sa c r o s st h ec e l lm e m b r a n e a n ds o l v et h el o we f f i c i e n c ya n ds e c u r i t yp r o b l e m sa c c o u n t e di nt h ea p p l i c a t i o no fs o m e d r u gc a r r i e r sp o t e n t i a l l y a m o l e c u l a ru m b r e l l ac a r t i n g5 一c a r b o x y f l u o r e s c e i nw a s s y n t h e s i z e d i nt h i s p a p e r , t h ea b i l i t y o fm o l e c u l a ru m b r e l l at o t r a n s p o r t 5 一 c a r b o x y f l u o r e s c e n c ea c r o s sc e l lm e m b r a n ea n di t sc y t o t o x i c i t yw e r ea l s os t u d i e d t h e t r a n s l o c a t i o nm e c h a n i s mo fm o l e c u l a ru m b r e l l aw a sd i s c u s s e di nd e t a i l 砸l er e s u l t sw e r e a sf o l l o w s ： 1 s y n t h s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fm o l e c u l a ru m b r e l l a ( 1 ) t h en - h y d r o x y s u c c i n i m i d ee s t e ro fc h o l i ca c i dw a ss y n t h e s i z e df r o mc h o l i c a c i da n dn - h y d r o x y s u c c i n i m i d ew i t hd i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d ei na n h y d r o l l s o r g a n i cs o l u t i o n r e a c t i o no ft h i se s t e rw i t hs p e r m i d i n ew a sc a r r i e do u ti n a n h y d r o u sd m f t oy i e l dn l , n 3 一d i c h o l e a m i d o s p e r m i d i n e ( 2 ) 5 一c a r b o x y f l u o r e s c e i nw a sp r e a c t i v e dw i t h3 - h y d r o x y - 1 , 2 ，3 - b e n z o t r i a z i n - 4 ( 3 h ) - o n e ( d h b t ) a n dd i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d ei na n h y d r o u sd m f t og a i nt h ed h b t e s t e ro f5 - c a r b o x y f l u o r e s c e i n t h ee s t e rw a sf u l l e rc o u p l e dt ot h en t ，n 3 一 d i c h o l e a m i d o s p e r m i d i n ei n t h ep r e s e n to ft f i e t h y l a r n i n et of o r mt h e5 一 c a r b o x y f l u o r e s c e i nm o l e c u l a ru m b r e l l a ( 5 一c f - m u ) ( 3 ) t h es t r u c t u r ea n dm o l e c u l a rw e i t h to fn - h y d r o x y s u c e i n i m i d ee s t e ro fc h o l i c a c i d ，n l ，n 3 d i c h o l e a m i d o s p e r m i d i n ea n d5 一c f - m uw e r ec o n f i r m e db yi r ， e s i - m s ；t h e i rm e l tp o i n t sw e r ea l s or e c o r d e db yam i c r o s c o p i cm e l t i n gp o n a p p a r a t u s ；a n dt h ep u r i t y o f5 - c f - m uw a sa n a l y i z e db yh p l c t h e c h a r a c t e r i z a t i o nr e s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h e i rm o l e c u l a rs t r u c t u r e sa n d m o l e c u l a rw e i t h ta n dt h ep u r i t yo f5 一c f - m uw a sa b o v e9 5 2 t h ec e i lp e n e t r a b i l i t yo f m o l e c u l a ru m b r e l l a i i i 双亲性分了伞载体的合成表征及j e 穿膜研究 ( 1 ) t h ec y t o t o x i c i t yo f5 一c f - m ut o w a r dl 9 2 9c e i l sa f t e r2 4a n d4 8h t r e a t m e n tw i t h 5 - e f - m uw a st e s t e db ym t t a s s a y s t h ec o n c e n t r a t i o n so f5 一c f - m uw e r e2 5 ，5 0 ， 10 0a n d2 0 0 a mr e s p e c t i v e l y 5 - c f - m ue x h i b i t e dn ot o x i c i t yt ol 9 2 9c e l l sa t c o n c e n t r a t i o n sf r o m2 5t o2 0 0p mf o l l o w i n g2 4hi n c u b a t i o n a l t h o u g ht h e c o n c e n t r a t i o no f5 - c f - m uf r o m5 0t o2 0 0 t me x h i b i t e ds o m ei n h i b i t i o nt oc e l l s a f t e r4 8h i n c u b a t i o n , h i g hc e l lv i a b i l i t yw a sa c h i e v e da n d5 - c f - m us h o w e d n o n t o x i ct ol 9 2 9c e l l sa t2 5 “ma ta l le v e na f t e r4 8h t h ec y t o t o x i c i t yo f5 - e f - m ut o w a r dh e l ac e l l sa f t e r2 4ht r e a t m e n tw i t h5 c f - m uw a sa l s ot e s t e d n o t o x i c i t yo f5 - c f - m uw a sd e t e c t e dt oh e l ac e l l sw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f5 一c f - m uw a sb e l o w10 0l a m 1 1 1 em t fa s s a yr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a r u m b r e l l aw a sa b i o c o m p a t i b l ev e c t o r ( 2 ) t h ei n t r a c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no f5 - c f - m ui nh e l ac e l l sa n dl 9 2 9c e l l sw a s a n a l y z e db yf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ya n dc o n f o c a lm i c r o s c o p y t h ep u n c t u a t e d f l u o r e s c e n c eo f5 - c f - m uw a sd e t e c t e dm o s t l yi nc y t o p l a q l na n da r o u n dt h e n u c l e u s ，s u g g e s t i n gt h a t5 - c f - m uh a de n t e r e dt h ei n t e r i o ro f h e l ac e i l sa n dl 9 2 9 c e l l s r e s u l t ss h o w e dt h a tm o l e c u l a ru m b r e l l aw a ga i la p p r o p r i a t ev e c t o rf o r i n t r a c e l l u l a rd e l i v e r y ( 3 ) t h ei n t e r n a l i z a t i o no f5 - c f - m uw a sa n a l y z e db yf a c sa td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ，t e m p e r a t u r e sa n di n c u b a t i o nt i m e s t h ec e l l u l a ra t pi n h i b i t o r s w e r ea l s oi n t r o d u c e dt oe v a l u a t et h eu p t a k em e c h a n i s mo f5 一c f - m u 劢eu p t a k e o f5 - c f - m ui sac o n c e n t r a t i o n - ，t e m p e r a t u r e - ，t i m e - d e p e n d e n ta n de n e r g y - i n d e p e n d e n tp r o c e s s 3 u p t a k em e c h a n i s mo f m o l e c u l a ru m b r e l l a ( 1 ) am a t h e m a t i c a lm o d e lf o rt h em e m b r a n et r a n s l o c a t i o no fm o l e c u l a ru m b r e l l a w a sp r o p o s e d a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so ff l o wc y t o m e t r y , t h em e a l l f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ( m f oi n s i d ec e l l sh a sl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h es q u a r e r o o to ft h ei n c u b a t i o nt i m e ( t 1 勺a n di n i t i a lc o n c e n t r a t i o n ( c 0 1 勺，a n dt h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r e0 9 8 5a n d0 9 9 4 ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) t h ep r o c e s so f5 一c f - m ua c r o s st h ec e l lm e m b r a n ef i t t e dt ot h ep r o p o s e dm o d e l ， i n d i c a t i n gt h a t5 - c f - m ut r a n s p o r t e da c r o s st h ec e l lm e m b r a n eb yt h es o l u t i o n - d i f f u s i o nm e c h a n i s m k e y w o r d s ：m o l e c u l a ru m b r e l l a ；d r u gc a r r i e r ；t r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t i v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：炙德肛 湖年汐月7 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () i 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 茭老地 第一章绪论 第一章绪论 细胞膜是一个具有特殊结构和功能的半透膜，它将细胞内容物与细胞周围的 环境分隔开来，构成细胞的屏障。细胞膜的主要功能之一是通过跨膜转运实现物 质交换，为细胞正常生命活动提供必要的条件。但是在临床治疗疾病过程中，细 胞膜作为细胞的一道天然屏障，使得许多具有治疗作用的药物和大分子生物活性 物质，特别是高亲水性和带电物质，如反义寡聚核苷酸、d n a 、蛋白质和多肽等 难以通过细胞膜【啦】。从而导致药物用量大、疗效差和副作用大等弊端。因此如何 构建药物载体以促进这些生物活性物质顺利穿透细胞膜并发挥其功效，已成为药 物设计中亟需解决的问题之一3 1 。本章对腺病毒、脂质体和纳米粒等传统穿膜型载 体，穿膜肽载体以及分子伞载体的最新研究进展进行评述，并给出本文的主要研 究内容。 1 1 传统穿膜型载体的研究现状 1 1 1 腺病毒 自从上世纪5 0 年代腺病毒被发现以来，它已被人们广泛地研究【4 5 1 。腺病毒 ( a d e n o v i r u s ，a d ) 载体与反转录病毒载体相比，能有效地将外源基因转染到各种 靶细胞或组织中，载体易于构建和操作、宿主范围广、感染性强、可经不同途径 进入不同组织，能感染分化后的非分裂期细胞。在a d 的生活周期中，其基因不整 合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险。且外源基因能游离地表达，因 而具有广泛的组织亲和性，这使得腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者 【6 】。 1 1 1 1 腺病毒的结构特征和穿膜机制 a d 是一种线性无包膜的双链d n a 病毒，病毒颗粒直径约6 - - - 9 0n m ，呈2 0 面体立体对称。病毒衣壳有2 5 2 个壳粒，规则排列成2 4 0 个六邻体( h c x o n ，每面 1 2 个) 和1 2 个五邻体( p e n t o n ) 单位，其中五邻体位于顶角处，从每个顶角壳粒 的基底伸出一根纤毛突起( f i b e rp r o t r u d i n g ) ，其末端具有一个结节区( k n o b d o m a i n ) 。因此a d 的衣壳结构可以分为五邻体和六邻体两部分，其中五邻体又由 五邻体基底部( p e n t o nb a s e ) 、纤毛突起和结节区组成。其结构如图1 1 所示。 泉件”t 伞拽作的m 表缸穿研究 图1 - 1 腺病毒的结构 f i g u r e1 - 1t h e s t r u c t u r eo f a d a d 基因组由5 个早期( e l a 、e 1 b 、e 2 、e 3 和f a ) 、4 个中期和1 个晚期转 录单位组成。e 1 区基因表达产物分为e 1 a 和e i b ：e 1 a 蛋白的主要功能是调节 细胞代谢，为病毒复制创造有利环境：e i b 蛋白结合p 5 3 、b a k 和b a x 蛋白。e 2 区基因表达产物可分为e 2 a 和e 2 b ：e 2 a 为d n a 结台蛋白；e 2 b 主要产物有两 种，分别是末端蛋白前体和病毒d n a 聚合酶，3 种蛋白至少与3 种细胞因子相互 作用，启动a dd n a 复制及病毒晚期基冈的转录和黼详。e 3 区基凼表达产物功能 与病毒基因组的复制无关主要是破坏宿主的免疫防御机制。e 4 区基因表达产物 与病毒信使r n a 的代谢有关，还有促进病毒d n a 复制及关闭宿主蛋白合成的功 能。一衅e 4 产物可以与d n a 激活的蛋白激酶结合，防止病毒d n a 发生串联。 该激酶可激活p 5 3 基因，因此认为e 4 区基因产物可以抑制细胞凋亡。晚期基田在 主要晚期启动子作用下转录为长前体转录物以及编码衣壳结构蛋白口】。 野生型a d 可感染人体多种组织细胞，并在细胞内复制，产生大量子代病毒。 目前用于基因治疗的多为人类的2 型和5 型腺病毒，其感染细胞的过程是从纤毛 的结节区黏附到细胞表面的与柯萨奇b 病毒其用的一种受体一柯萨奇腺病毒受体 ( c o x s a c k i ea d e n o v i m sr c c e p t o r ，c a r ) 开始的。随后病毒 邻体基底部的精一甘 天门冬氨酸三肽( r g d ) 与细胞表面的删b 3 和鲫b 5 整合素结合，通过内吞作 用将a d 内化到细胞中。进入细胞后，外包装壳蛋白解体，使病毒粒子进入细胞 第一章绪论 质，然后转位到细胞核，通过核孔将病毒d n a 释放到细胞核内。病毒基因组进入 细胞核后，再经过系列剪切和转录过程嘲，最终包装成新的病毒颗粒。 1 1 1 2 腺病毒载体的构建 第一代a d 载体是由去除a d 基因组的e l 、e 3 两个区而获得的。e 1 基因为病 毒复制必需区，其缺失使腺病毒载体成为复制缺陷型。e 3 基因是病毒复制非必需 区，可用作外源基因插入区。由于e l 基因的缺失，造成病毒复制的缺陷，使其复 制必须在由5 型a d 转化的可表达e l 蛋白的2 9 3 细胞中完成。第一代a d v 的生产 效价很高，宿主细胞范围广，病毒基因组整合于细胞染色体外，可以避免插入诱 变的可能。 第二代的a d 在e 1 、e 3 缺失的基础上进一步去除了e 4 区。通过在e 2 区编码 d n a 结合蛋白的基因上进行温度敏感型突变，从而使在非允许温度下不表达晚期 基因产物，降低了炎症反应，使外源基因表达时间延长。通过建立e 1 、e 4 区互补 的细胞系，人们发展了e l 、e 4 缺失的a d 载体，较e 2 a 缺陷的a d 在外源基因的 表达和安全性方面都有提高。这种载体己用于鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的i 期临床实验1 9 。 第三代a d 缺失全部或大部分a d 基因，或者包装a d 微染色体系统。由于这 种载体缺失了病毒蛋白，所以在很大程度上降低了细胞的免疫源性，并且外源基 因的表达时间明显延长，但对包装细胞的要求很高，分离辅助病毒困难。 至今在临床中应用的腺病毒载体主要是第一代腺病毒载体。 1 1 1 3 动物腺病毒载体的构建 由于a d 的复制能力具有较强的种类特异性，因此为了避免应用不适合的载 体，需要构建不同类的a d 载体。动物a d 载体的构建主要基于人a d 载体的构 建。目前研究较多的动物a d 载体主要有羊、牛、猪、禽类等。 绵羊a do a v 2 8 7 是从西澳大利亚绵羊中分离得到的一个毒株，v r a t i 等在 1 9 9 6 年已证实与人a d v 相应的e 3 区并不位于p 蛋白和纤维蛋白基因之间，认 为e 3 区可能位于其他部位，因此，其与众不同的基因组结构限制了对o a v 2 8 7 缺 失区的选择【1 0 】。目前已经构建了含有碱性磷酸酶报告基因和羊寄生虫抗原基因的 重组o a v 载体，用这些重组病毒感染羊胎肺细胞c s l 5 0 3 后，用免疫沉淀法可检 测到抗原的表达【1 1 】。 双亲性分了伞载体的合成表征及其穿膜研究 牛a d 载体的研究始于牛a d3 型( b a d 3 ) ，1 9 9 5 年m i t t a l 等在b a d 3 e 3 区插 入萤火虫虫荧光素基因，构建表达载体b a d 3 2 l u e 重组子，通过酶法和w e s t e r n b l o t 证实，荧光素基因在m a d i n d a r b y 牛肾细胞中表达的量依赖于病毒d n a 的复 制情况，而插入基因的转录是在b a d 3 晚期启动子的控制下完成，重组效率也较 1 9 9 9 年，r e d d y 等【1 3 】和h a m m o n d 等【1 4 】报道了用猪a d ( p a v ) 构建表达载 体。在右末端处的h p ai 位点将s v 4 0 早期启动子和s v 4 0p o l ya 控制下的c a t 基因插入猪3 型a d ( p a v 3 ) 基因组，获得了重组病毒。感染细胞后，早期表达 水平低，感染3 6 小时后达最高，能够诱导产生c s f v 特异性中和抗体，能抵抗 c s f v 强毒的攻击。 s h e p p a r d 掣1 5 】以鸡l o 型a d ( f o w la d e n o v i r u s1 0 ，f a v l 0 ) 为载体构建了表 达传染性法氏囊病毒( i b d v ) v p 2 基因的重组病毒。该重组病毒没有缺失f a v l 0 基因组的任何部分，免疫接种s p f 鸡，可诱导产生抗i b d vv p 2 的抗体反应，并 能保护鸡免受i b d vv 8 7 7 的攻击。 1 1 1 4 存在的问题 a d 载体能高效表达外源基因，并能对外源蛋白进行剪切、糖基化、磷酸化等 翻译后加工，表达的蛋白具有天然蛋白的特性，可用于制药、基因工程疫苗、基 因治疗以及肿瘤治疗等领域，已展现出良好的应用前景。但a d 载体还存在许多不 足之处：( 1 ) 对某些细胞如血管内皮细胞，平滑肌细胞，呼吸道上皮细胞等感染 效率差；( 2 ) 转基因表达水平较低，持续时间较短；( 3 ) a d 作为载体时会产生 一定的毒副作用；( 4 ) 宿主的免疫反应。目前用于生产和基因治疗的a d 主要为 5 型和2 型，因为a d 的复制具有种类特异性，需要构建不同类的a d 载体。 1 1 2 脂质体 脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层( 厚度约4n m ) 内而成的微型泡囊 ( v e s i c l e ) ，也有人称其为类脂小球或液晶微囊。脂质体是英国学者b a n g h a m 等 人于1 9 6 5 年发现的【1 6 】，在2 0 世纪7 0 年代r a h m a n 等【1 7 】首先将脂质体作为药物载 体应用。近年来应用脂质体作为药物和生物大分子载体已取得了很大的进展。 1 1 2 1 脂质体的结构 磷脂分子存水斗h 中可自发形成亲水端向外、疏水端向内的脂质双层或包裹少 量水十日的囊泡型脂质体。常用的磷脂有磷脂胆酰胆碱( p c ) ，磷脂酰乙醇歧 ( p e ) 和磷脂酰丝氨酸( p s ) i 。胆固醇也可掺入脂质双层基本结构。根据其结 构所包含类脂质双分子层的层数，脂质体可分为肾室脂质体和多窀脂质体。禽柏 单一般分子层的称为单室脂质体，其中，粒径在2 0 - - 8 0f r i l l 之间的称为小单室脂质 体( s i n g l eu n i l a m e l l a rv e s i c l e s ，s u v ) ；粒径在01 1 岫之间的称为大单室脂质 体( 1 a r g eu n i l a m c l l a rv e s i c l e s ，l u v ) 。l u v 包封的药物量比s u v 大，l u v 通过 膜过滤后可得到s u v 。含有多层烈分子层的称为多室脂质体( m u l t i l a m e l l a r v e s i c l e s ，m l v ) ，其粒径在l 5 岬之间。多室脂赝体的每双分r 堪均可包封药 物，水溶性药物包封于艰分子层的亲水基团火层中，而脂溶性药物则分散于双分 子层的疏水基团的火层中。脂质体的结构如图l 之所示。 图1 - 2 脂质体的结构 1 1 2 2 脂质体与细胞的相互作用 脂质体属胶体系统，具有粑向和缓释作用，町提高药物药效，降低不良反 应。脂质体与细胞膜的组成类似，能显著增蛐细胞摄取，延缓和克服耐药性。脂 质体! - j n 胞f n 的柑吒作用主耍包括咀下四种：( 1 ) 吸附：细胞可以非特异忖_ 吸 附或通过连接在脂质体戒而的配体，如抗体、激索、凝血索等，特异性l 吸附脂质 覃；i i 掰m 嘲竺攀 i _ ， 双亲性分子伞载体的合成表征及其穿膜研究 体。吸附并不一定导致脂质体被吞噬进入细胞。 ( 2 ) 内吞( e n d o c y t o s i s ) ：内吞 作用是脂质体的主要作用机制。脂质体被单核巨噬细胞系统( m p s ) 细胞，特别 是巨噬细胞作为外来异物吞噬，称为内吞作用。通过内吞，脂质体能特异性地将 药物浓集于作用的细胞房室内，也可使不能通过浆膜的药物到达溶酶体内。 ( 3 ) 脂交换：脂质体的脂类与细胞膜上脂类发生交换。其交换过程包括；脂质体先被 细胞吸附，然后在细胞表面蛋白的介导下，特异性交换脂类的极性基团或非特异 性地交换酰基链。交换仅发生在脂质体双分子层中外部单分子层和细胞质膜外部 的单分子层之间，而脂质体内药物并未进入细胞。脂质体可与血浆中各种组织细 胞相互作用进行脂交换。( 4 ) 融合( f u s i o n ) ：融合指脂质体的膜材与细胞膜的 构成物相似而融合进入细胞内，然后经溶酶体消化释放药物。体外证明脂质体可 以将生物活性大分子如酶、d n a 、环磷酸腺苷( c a m p ) 、m r n a 或毒素以细胞 融合方式传递到培养细胞内。因此对产生耐药的菌株或癌细胞群，用脂质体载药 可显著提高抗菌或抗癌效果；大分子药物被包封于脂质体往往可以提高口服药 效；溶酶体膜的通透性有限，可阻止大分子药物释放至细胞内其他部位，而脂质 体装载的大分子药物由于融合作用则往往不受限制。 1 1 2 3 脂质体作为药物的运载工具 脂质体类似于细胞结构，有生物膜的特性和功能，具有器官或组织的网状内 皮系统的趋向性。它可以包裹水溶性和脂溶性两种类型的药物，是一种具有多功 能的定向药物载体。脂质体能使药物具有靶向性，降低药物不良反应，提高生物 利用度，提高和延长疗效，避免耐药性和改变给药途径等优点。 将药物包裹于脂质体中能改善药物的理化性质，如将二萜类抗癌药紫杉醇制 成三棕榈脂酰胆碱( d d p c ) 脂质体，能改善紫杉醇不溶于水和类过敏反应给临床 带来的不便【1 9 】。再如对人癌细胞具有广泛抑制作用的拓扑替康，其生理活性与a 羟基半内酯环结构密切相关，然而在氯化钠溶液中以上结构迅速变为无活性的形 式。为了提高拓扑替康在人血液( p h 7 6 ) 中的半衰期，在p h 为5 的水中将其包 裹于二硬脂酸磷脂胆碱( d s p c ) 中，形成低p h 的脂质体，增加了药物的稳定性 【2 0 】 o 将药物制成脂质体，能实现定向给药并增加了药物的生物利用度，从而降低 了药物本身的不良反应。如为了增强白介素2 2 ( i n t e r l e u k i n 2 2 ，i l 2 2 ) 的疗效，将 第一章绪论 i l 2 2 包埋于小的、单层、长循环、外渗的脂质体( 空间稳定的脂质体，s s l s ) 中。s s l s 的包埋率和药代动力学都优于常规的脂质体，生物利用度高达8 5 以 上，在血液中的半衰期和a u c 是其他形式制剂的1 0 - 3 0 倍。同时，与受体结合 的有关的细胞分裂分子暴露于s s l s i l 2 2 的外膜，便于与t 细胞受体靶向结合。 以上结果表明，s s l s i l 2 2 制剂的免疫调节和抗癌活性都优于其他制剂形式【2 l l 。 脂质体作为药物载体最为重要的作用之一是将药物选择性地输送到特定的靶 器官，以提高药效，减少药物用量，降低药物的不良反应。最近的研究表明，以 共价结合胶原修饰脂质体的表面，能使其具有生物粘附性和控释的作用。这种生 物粘附的脂质体可以使药物在特定部位的药效增加，并且单层和多层脂质体都能 延缓药物的释放。通过选择脂质体的类型和增加胶质表面的密度，可以改变释药 常数，若后者足够高，就可以使脂质体成为药物贮库。生物粘附性脂质体对模拟 体内靶器官a 4 3 1 细胞排列的单层膜的亲和性很高，在3 7o c 停滞2 5h 即达平 衡。上述结果说明，生物粘附脂质体是一种良好的载体【2 2 1 。 1 1 2 4 脂质体作为生物大分子的运载工具 脂质体可以携带各种基因片段，并保护基因不被核酸酶降解，而且包裹基因 片段的脂质体同时还可以与组织细胞发生融合，将目的基因快速导人细胞内。用 于基因递送的脂质体载体主要包括阳离子脂质体、阴离子脂质体、p h 敏感脂质 体、热敏脂质体、膜融合脂质体和免疫脂质体。目前一般用带正电的阳离子脂质 体和核酸形成的脂质体核酸复合物用作基因药物载体，由于细胞膜带负电荷，通 过异种电荷相互作用可以增加细胞摄人量，进而将更多基因药物带入细胞。对于 以往非病毒载体转染率不高的问题，通过修饰阳离子脂质体可以获得较高的转染 率，而且可大大降低细胞毒性。最近，钟志容等【2 3 】通过用转铁蛋白修饰载基因阳 离子脂质体载体，发现细胞毒性明显小于阳离子脂质体。2 0 0 6 年，e w e r t 等【2 4 】制 备出一种新型脂质分子，该脂质分子具有树状纳米头部，树状头部携带1 6 个正电 荷，具有很强的d n a 传递特性，而且已证实这种脂质复合物的蜂窝结构具有很高 的转染效率。 脂质体还可作为把酶导入细胞浆或细胞核的运输载体。z a j a c - k a y e 等【2 5 】用 u 把d n a 酶i 释放到正常叙利亚仓鼠胚胎细胞内，出现剂量依赖性细胞毒性 反应。d n a 酶i 还进入细胞核引起了染色体变异，导致培养细胞向癌细胞转化。 双亲性分了伞载体的合成表征及其穿膜研究 g r e g o r i a d i s 等f 2 6 1 的研究表明，蔗糖酶包裹于脂质体内可成功地递送进细胞内，使 细胞内堆积的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。 1 1 2 5 存在的问题 脂质体能使药物具有靶向性、提高疗效、缓和毒性等优势，但由于其制备过 程复杂，对有些药物尤其是水溶性药物包封率较低，且药物极易从脂质体中渗透 出来，也有少数药物很难包在脂质体中。此外，装载药物后的脂质体在贮存的过 程中溶解破裂，其稳定性还有待提高。一般的脂质体的靶向性主要集中在肝、 肾、脾等网状内皮细胞丰富的器官，如果对其他组织器官进行治疗，其靶向性不 明显。脂质体在进入细胞后容易被溶酶体降解，限制了脂质体在肿瘤化疗和基因 治疗中的应用【2 7 2 8 1 。 1 1 3 纳米粒 纳米微粒是指颗粒尺寸为纳米量级的超细微粒，一般在1 - 1 0 0h i l l 之间，而一 般细胞均较之大，如人的红细胞大小为6 9l a m ，这就使纳米微粒作为载体进入细 胞成为可能。另外，由于纳米微粒的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及宏 观量子隧道效应等导致其具有特有的热、磁、光敏感特性和表面稳定性，可以通 过外场( 电、磁、光) 实现对其性能的控制，有利于实现靶向输送、控制释放、 保护和稳定被输送物质。此外，纳米微粒经表面修饰后可提高微粒的表面活性， 改善纳米微粒与其它物质之间的相容性，使微粒表面产生新的理化、机械性能和 新的功能。 1 1 3 1 纳米粒的载体材料 最初用于纳米粒的载体材料多为非生物降解材料，目前常使用天然或合成的 生物降解材料。( 1 ) 非生物降解材料：这类材料多为合成高分子材料。如聚苯乙 烯、二乙氨乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯类、n ，n 亚甲基双丙酰胺等。 应用此类载体材料制备纳米粒的工艺较为简单，但载体材料本身毒性较大，在体 内又不能降解，滞留时间太长，对人体正常生理功能有一定的影响，现已不多采 用。( 2 ) 可生物降解材料：该类载体材料可分为天然和合成高分子材料两类。天 然大分子物质如蛋白质、明胶、桃胶、壳聚糖等，由于大多数药物易与蛋白质亲 和，所以载药容易。主要缺点是制备工艺复杂，有时用于人体具有抗原反应。合 第一章绪论 成高分子材料主要有聚氰基丙烯酸酯、聚乳酸等。使用这类载体材料时，制备工 艺简单，由于所得纳米粒为多孔性，故载药量高，同时，毒性明显低于非生物降 解材料。 1 1 3 2 纳米粒作为基因治疗的载体 基因治疗是将质粒d n a 插入目的细胞后，修复遗传错误或产生治疗因子( 如 多肽、蛋白质、抗原等) ，其核心目标是实现能控释外源基因在靶细胞中表达的 位点特异的基因转运系统。转运基因的载体一般分为两类：病毒载体和非病毒载 体。病毒载体可高效转运基因，但存在转运d n a 量有限、毒性较大、有潜在的病 毒复制可能以及花费高等缺点。基于此，人们一直在探寻没有这些缺点的新载 体。目前利用纳米粒子作为转染基因的载体己成为研究的热点。 c o r s i 掣2 9 1 采用壳聚糖d n a 纳米颗粒转染人间质干细胞( m s c s ) 、肾肉瘤细 胞( m g 6 3 ) 和人胎肾细胞( h e k 2 9 3 ) ，同时用l i p o f e c ta m i n e2 0 0 0 ( l f ) 作为 对照。结果显示，l f 转染效率高于壳聚糖d n a 纳米颗粒，壳聚糖d n a 纳米颗粒 转染h e k 2 9 3 的效率高于m s c s 和m g 6 3 ；壳聚糖d n a 纳米颗粒的细胞毒性约为 l f 的一半。这些结果表明，壳聚糖d n a 纳米颗粒在基因转运中具有毒性小、细 胞依赖性的特点。 肖苏尧等【3 0 】利用反相微乳液法制备了直径约为5 0a m 的带负电荷的淀粉纳米 微粒，然后用多聚赖氨酸进行修饰，得到了多聚赖氨酸淀粉纳米微粒( p l l - s t n p ) 。研究表明p l l - s t n p 具有基因装载量多、转染率高、细胞毒性低以及可 生物降解等优点，可能作为基因载体。 纳米系统输送反义寡核甘酸能保护被输送的核甘酸，有助于转染细胞，增强 反义寡核甘酸对表达突变点h r a $ 基因细胞的抑制作用【3 ，而且能通过与其共轭连 接的配基实现靶向运输。 1 1 3 3 纳米粒子介导基因入胞的机制 纳米介导的入胞机制与其他非病毒载体( 如脂质体、脂精胺及聚氮丙啶) 相 似。纳5 - d n a 复合物通过其表面阳离子与细胞膜上带有负电荷的糖蛋白及磷脂相 互作用而进入细胞质，且阳离子数与其基因转移率呈正相关。将复合物中d n a 或 载体进行放射性标记证实，该复合物进入细胞主要机制为胞吞作用。细胞与胞吞 抑制剂( 如松胞菌素b 及去氧葡糖) 或细胞代谢抑制剂( 叠氮化钠) 共孵育后， 双亲性分了伞载体的合成表征及其穿膜研究 细胞对复合物摄取率及相应转移基因的表达率均降低【3 2 1 。此外，使用溶酶体酸化 抑制剂氯喹可提高纳米粒介导的基因转移率，这是因为复合物被溶酶体包裹形成 溶酶小体后，氯喹防止其被溶酶小体酸化或酶解。然而壳聚糖纳米粒在加入5 2 抗酶剂氯喹后，基因转移率无明显变化。但壳聚糖纳米粒结合转铁蛋白及k n o b 蛋白后，在h e l a 细胞中基因转移率分别提高了4 倍及1 3 0 倍。通过胞吞作用进入 细胞的复合物通过质子海绵体效应( p r o t o ns p o n g ee f f e c t ) 等机制避免细胞质中溶 酶体的降解【3 3 1 ，质粒从载体中释放到细胞质后通过核孔或者在细胞分裂时进入细 胞核。 1 1 4 阳离子聚合物 阳离子聚合物载体是通过电荷相互作用与带负电的d n a 分子形成聚