（发酵工程专业论文）红法夫酵母酶法破壁提取虾青素及其β环糊精包合的研究.pdf

摘要 摘要 红法夫酵母坚韧的细胞壁严重阻碍了其细胞内虾青素的提取及应用，因此建 立合适的细胞破壁方法以提高虾青素的生物利用度及提取率是一个急需解决的关 键问题。本论文研究了环状芽孢杆菌胞壁溶解酶的发酵生产及其用于红法夫酵母 破壁提取虾青素，以及红法夫酵母虾青素的稳定性及其芦一环糊精包合保护方法， 主要实验结果如下： 对环状芽孢杆菌占c f r c “肠一ja 1 3 8 3 进行紫外线诱变处理，经过初筛、摇瓶复 筛以及传代稳定性实验，获得一株稳定高产胞壁溶解酶的突变株a 1 3 8 3 2 ，其胞 壁溶解酶产量比亲株提高了1 1 6 9 。通过对其发酵产酶条件的优化实验，得出其 生产胞壁溶解酶的适宜条件：碳源采用酵母葡聚糖，浓度为l og l ：氮源为蛋白 胨与( n h 4 ) 2 s 0 4 混合，使其总浓度为4g l ；接种量6 l o ( v v ) ；摇瓶装液量 为2 5 0m l 三角瓶装液4 0m l ：发酵温度为3 0 3 5 ；培养基初始p h6 5 7 0 。 在上述条件下发酵5 4h 后可获得最高酶活7 4 6 “m l ，比优化前酶活提高了3 8 7 。 通过单因素及均匀实验设计，确定了将且曲_ c “，4 一s a l 3 8 3 2 胞壁溶解酶用于 红法夫酵母破壁提取虾青素的最佳酶作用条件，即当p h 值为5 o ，加酶量为1 6 1 4 5 l l g 干酵母，3 7 温和震荡反应1 6 5h ，虾青素的提取率可达到9 8 以上；此胞壁 溶解酶稳定的p h 值范围为4 8 9 8 ，在5 0 以下表现出很好的热稳定性；对此胞 壁溶解酶中多种酶活进行了测定，确定该复合酶含有算1 ，3 葡聚糖酶、纤维素酶、 中性蛋白酶、几丁质酶、淀粉酶以及木聚糖酶活性。 2 脱氧d - 葡萄糖的存在会影响葡萄糖的正常代谢以及酵母细胞壁的合成，但 实验表明，红法夫酵母培养中添加o 0 0 5g l o 0 2g l 的2 脱氧d 葡萄糖却可促进 虾青索积累，而且生物量基本保持不变，在增加虾青素产量的同时还能缩短酶法 破壁的时间。当2 - 脱氧d 葡萄糖添加浓度为o 0 2g l ，且在红法夫酵母培养的前 3 6h 添加时，虾青素含量可提高到对照组的1 1 3 7 ，采用胞壁溶解酶对红法夫酵 母破壁提取虾青素，作用1 2h 提取率可达9 4 7 。推测2 脱氧d 葡萄糖促进虾青 素合成的机理是由于其在细胞内抑制了电子传递链的某个酶，从而阻断呼吸链， 造成氧自由基的大量积累，促使虾青素的合成。 通过对红法夫酵母与环状芽孢杆菌两阶段混合培养条件的优化，总结出红法 夫酵母产虾青素及酶法破壁提取的适宜工艺为：培养基初始糖浓度为3 0g l 。环 状芽孢杆菌的最佳接种时间为红法夫酵母培养6 0h 7 2h ，接种量为1 0m l l ( 1 0 旧 个细胞m l ) ，接种后最适培养温度为3 0 ，p h 为6 5 ，总发酵时间为1 2 0h ，在 此条件下，红法夫酵母虾青素产量可达到8 9 6 0 2ug l ，虾青素最终提取率可达 到9 6 8 。在两阶段混合培养实验结果的基础上，设计了红法夫酵母与环状芽孢 华南理工大学博士学位论文 杆菌三阶段混合培养方案，发酵结果表明，当在培养基中添加0 0 2g l 的2 脱氧 d 葡萄糖，三阶段混合培养明显优于两阶段混合培养，不仅最终的虾青素产量提 高到9 5 6 3 4ug l ，发酵时间也缩短为1 0 8h ，提取率提高到9 7 4 ，最终可提取 出的虾青素总量为9 3 1 4 8ug l 。 虾青素对短时受热有较好的稳定性，对光却非常敏感，但无论是在加热还是 在光照条件下，酶法破壁提取的虾青素比酸法及珠磨法破壁提取的更为稳定：当 暴露在空气中时，氧成为虾青素褪色的另一个主要因素；有机溶剂中极性最小的 石油醚有利于虾青素的保存，而极性最大的丙酮则十分不利于色素的保存，色拉 油能很好的保护色素，因其较好地隔离了空气中的氧，起到了一定的屏蔽作用。 所以，应采用避光、密闭、充氮或真空、低温贮存的方法来延缓红法夫酵母虾青 素的褪色。 皂化能提高虾青素一芦一环糊精包合的包合率；通过正交试验对包合物制备条 件进行优化，可知在本实验范围内，影响包合率各因素的主次为：d ( 转速) c ( 时 间) b ( 温度) a ( 环糊精用量) ，其中转速为显著影响因素；通过对搅拌时间及温度 进行扩展试验，确定了最佳包合条件为：p 一环糊精加入量为7g 5 0m g 虾青素， 温度4 0 ，搅拌转速6 0 0r m i n ，搅拌时间5h ，在此条件下制备虾青素一芦一环糊 精包合物，其包合率高达8 7 7 7 。于5 0 ，5 0 0 0l u x 光照条件下对经皂化后的包 合物进行稳定性加速实验，结果表明其稳定性与未经包合的虾青素提取液相比提 高了约2 0 倍。采用红外光谱及x 射线衍射对虾青素、卢环糊精、两者的物理混 合物及两者包合物的结构进行分析，发现包合物的结构与相应的主客体以及主客 体混合物的结构有明显不同，说明包合物形成后已构成新的固体相。 关键词：红法夫酵母；虾青素；胞壁溶解酶：提取：2 脱氧d 葡萄糖；芦一环糊精 摘要 a b s t r a c t t h er i g i dc e l lw a l lo fp q 加口砌d 如纠m 口s e v e r e l yh a m p e r st h ea v a i l a b i l i t yo f a s t a x a n t h i nb e c a u s ea s t a x a n t h i ni sa c c u m u l a t e di nl i p i dd r o p l e t si nt h ec y t o p l a s m a t i c m e m b r a n e s ，s oi t sc e l lw a nm u s tb em o d i f i e db ys u i t a b l em e | h o d st oe n b a n c et h e a b s o r p t i o no fp i g m e n tf o r 觚i m a l sa n dm ee x t r a c t a b i l i t yo fa s t a x a n t h i n t h ep r e s e n t s t u d yi n v e s t i g a t e d t h e p f o d u c t i o no fl y t i ce n z y m ew i t h b 口c f ，“sc f r c “肠甩s ，t h e e x t r a c t i o no fa s t a x a n t h i na n e rh y d r o l y s i so fy e a s t w a l l sw i t ht h el ”i ce n z y m e ，t h e s t a b i l i t yo fa s t a x 粕t h i na n dt l l ee n c a p s u l a t i o no fa s t a x 髓t h i nw i t h 卢- c y c l o d e x t r i nf o r p r o t e c t i n g i tf r o mo x i d a t i o n s o m en e wt e c h n o l o g i e s ，v i e w p o i n t sa n dr e s u l t sw e r e s u g g e s t e da sf o l l o w s ： 。k c f z ? “5c f r c “肠一sa 1 3 8 3p r o d u c i n gl y t i ce n z y m ew a sm u t a g e n i z e dw i t hu va i l d f u r t h e rs c r e e n e dt l l r o u g hr e p e a t e ds h a k en a s ke x p e r i m e n t s ，a n do n ep l u s m u t a n tw i t h h i g h l yg e n e t i cs t a b i l i t y w a s a c q u i r e d t h el y t i ce n z y m ep r o d u c t i o no fm e p l u s - m u t 锄t ( a1 3 8 3 2 ) i n c r e a s e db y1 16 9 c o m p a r e dw i t ht h a to ft h eo r i g i n a ls t r a i n t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tf a c t o r so nt h el y t i c e n z y m ep r o d u c t i o no f 丑 c f r c “缸n s a 1 3 8 3 - 2w e r es t u d i e di ns h a k ef l a s k 如r m e n t a t i o n y b a s tg l u c a n ( 10g l ，w a t e r i n s o l u b l e ) w a st h eb e s tcs o u r c e s 锄dt h em i x t u r eo fp e p t o n ea n d ( n h 4 ) 2 s 0 4w a st h e b e s tns o u r c e s( t o t a lc o n c e n t r a t i o ne q u i v a l e n tt o4 g ，l ) t h eb e s ti n o c u l u m c o n c e n t r 砒i o nw a s6 1o ( v v ) a n d4 0m lm e d i u mv o l u m ei n2 5 0m lt r i a n g l en a s k w a sb e n e f i tf o r 丑c f ，c “，口一sa 1 3 8 3 - 2t op r o d u c et h el y t i ce n z y m ew h i c hh a dt h eh i g h e n z y m ea c t i v i t y t h ef e r m e n t 砒i o nt e m p e r a t u r ea n dt h eb e s ti n i t i a lp hv a l u eo ft h e c u l t u r em e d i u mw e r e3 0 3 5 a n d6 5 7 o ，r e s p e c t i v e l y t h e1 ”i ce n z y m ea c t i v i t y o ff e r m e n t a t i o nn u i dr e a c h e d7 4 6 “m lw h e n 曰c f ”z 口玎ja1 3 8 3 2w a sc u l t i v a t e do n t h ea b o v e - m e n t i o n e dc o n d i t i o n s ，i n c 糟a s i n g3 8 7 c o m m s t e dt ot h ei n i t i a l _ t h eo p t i m u mr e a c t i o c o n d i t i o n so ft h el ”i ce n z y m ep r o d u c e db y 口c f ，c “肠刀s a 1 3 8 3 - 2 ，w h i c hw a su s e dt oh y d r o l y z et h ey e a s t 哪a l l sf o re x t r a c t i o no fa s t a ) 【蚰t h i n f r o mp 够d 砌d 如砂惴口，w e r es t u d i e db yt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n dt h eu n i f o r m d e s i g n w h e nt h ef e a c t i o nt 锄p e r a t u r ea n dp hf b r t h ea s t a x a n t h i ne x t r a c t i o nw e r e3 7 a n d5 o ，r e s p e c t i v e i y ，a n d1 6 1 4 5u ( gd r yy e a s t ) l ”i ce n z y m ew a sa d d e d ，o v e r9 8 o f t h ea s t a x a n t h i nc o u l db ee x t r a c t e dw i t l l i n16 5h t h el y t i ce n z y m ew h i c hm a i n l y c o n t a i n e dp - 1 ，3 g l u c a n ，c e l l u l o s e ，c a s e i n ，c h i t i n ，s o l u b l es t a r c hh y d r o l y z i n ga c t i v i t y w a ss t a b l eb c l o w5 0 蛆dw i t h i nt l l ep hr 姐g e4 8 9 8 2 - d e o x y d - g l u c o s e ，ag l u c o s ea n a l o g u e ，c a nh i n d e rt h ec e l l u l a ru t i l i z a t i o no f 华南理工大学博士学位论文 g l u c o s ea n dt h es y n t h e s i so fy e a s t - w a l l s t h ec o n c e n t r a t i o no f2 - d e o x y - d - g l u c o s ei n y mm e d i u ms i g n i f i c a n t j ya f f e c t e dt h eb i o m a s sa n dt h ea s t a x a n t h i nc o n t e n to fp 疗够口 r 厅d 如纠脚疗 a n dt h ee x t r a c t i o no fa s t a x a n t h i nw i t hl y t i ce n z y m e t h eo p t i m a l c o n c e m r a t i o n w h i c hc o u l da c h i e v el3 7 e n h a n c e m e n to ft h ea s t a x a n t h i nc o n t e n ta n d ， m o r ei m p o n a n t l y ，f a c i l i t a t et h ee x t r a c t i o no fa s t a ) ( a n t h i n ，w a s0 0 2g l 一w h e nm 醒历a r 矗d d o 互y ，聍口w a sc u l t i v a t e di nt h i sm e d i u m ( o 0 2g l - 12 - d e o x y - d - g l u c o s ew a sa d d e d ) ， t h ee x t r a c t a b i l i t yo fa s t a x a n t h i nc o u l dr e a c h9 1 7 a i t e rt h er e dy e a s tw a sh y d r o l y z e d w i t hl y t i ce n z y m ef b rl6 h i na d d i t i o n ，2 - d e o x y - d g l u c o s es h o u l db ea d d e dd u r i n gt h e 6 r s t3 6ho ft 1 1 ep 劝砌d 幽互y 埘ac u l t u r et i m e t h e r ei sah y p o t h e s i st h a ts o m e e n z y m e sf o rt h er e s p i f a t o r yc h a i na r er e s 仃a i n e db y2 一d e o x y d - g l u c o s e 趾di tl e a d st o t h ea c c u m u l a t i o no fo x y g e nf r e er a d i c a l ，w h i c ht h e nt r i g g e r st h ea c c u m u l a t i o no f a s t a x a n t h i n r e s u l t so ft h et w o - s t a g eb a t c hm i x e dc u l t u r e so fp 厅够4 ，协。如互y m 口a t c c6 6 2 7 0 a 1 1 d 口c f ”，口，玎a 1 3 8 3 2i n d i c a t e dt h a tt h es u i t a b l ei n c u b a t i o nt i m ea n dg l u c o s e c o n c e n t r a t i o nf o rp h q 卵口r h d d b 互y 聊口c u l t i v a t i o ni nt h ef i r s ts t a g ew e r e6 0h 7 2ha n d 3 0 g l d u r i n gt h es e c o n ds t a g eo ft h em i x e dc u l t l l r e ，1 0m l l ( 10 1 uc e l l s m l ) i n o c u l u mo f 口c 抛“肠以sa 1 3 8 3 - 2s u p p o r t e dt h eh i g h e s te x t r a c t a b i l i t yo fa s t a ) 【a i i t h i n t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e 觚dp hf o rt l l ea s t a x a n t h i ne x t r a c t i o ni nt h cm i x e dc u l t u r e w e r e3 0 柚dp h6 5 ，r e s p e c t i v e l y ，蚰dt h et o t a lf c 哪e n t a t i o nt i m ew a s1 2 0h u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ，t h ef i n a la s t a x a n t h i np r o d u c t i o no fp q 历ar o d b z y m 口c o u i dr e a c h 8 9 6 0 2ug ，la n do v e r9 6 o ft h ea s t a x a n t h i nc o u l db ee x t r a c t e dd u r i n gt h es e c o n d s t a g eo ft h i s “v o - s t a g em i x e df e m e n t a t i o n t h ep r o c e s s0 ft h et h r e e - s t a g em i x e dc u l t u r ew a sd e s i g n e db a s e dt h et w o - s t a g e b a t c hm i x e dc u l t u r e 蛆do 0 2g l2 - d e o x y - d g l u c o s ew a sa d d e db e f o r ef e r m e n t a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et h r e e - s t a g em i x e dc u l t u r ec o u l dp r o v i d eau s e f u lw a yt o t r e a tt h ec e l lw a l lo ft h ey e a s t 锄di tw a sm u c hb e t t e rt h 蛐t h et w o - s t a g em i x e dc u l t u r e t h ef i n a la s t a 】【a m h i np r o d u c t i o no f 朋q 厉口，厅d 咖互y 珊口c o u l dr e a c h9 5 6 3 4ug ，la n d 9 314 8ug lc o u l db ee x t r a c t e d ，m o r ei m p o n a n t l y ，t h et o t a lf e r m e n t a t i o nt i m ec o u l d b er e d u c e d t 01 0 8h t h ei n v e s t i g a t i o no ft h ei n n 鹏n c eo fl i g h ti r r a d i 砒i o n ，o x y g e na n dh e a to n a s t a x 趾t h i nc o l o rs h o w e dt l l a t 髂t a x 髓也i nw a ss t a b l et oh e a t i n gf o rs h o r tt i m eb u tq u i t e s e n s i t i v et o l i g h ta do x y g e n m e a n w h i l e ，t h ea s t a x a n t h i nw h i c hw a se x t r a c t e da f t e r u s i n gt h el y t i ce n z y m ep r o d u c e db y 丑口c f 盯sc f ，c “ 棚s a 1 38 3 2t oh y d r o l y z et h e y e a s t w a l l sw a sm o r es t a b l et ol i g h ta n dh e a tt h a i lt h a te x t r a c t e da n e rb e a dm i l lo r c h e m i c a lt r e a t m e n t s p e t r o l e u me t h e fw a st h eb e t t e fm e n s t r u u mf b ra s t a x a n t h i nt ok e e d 摘要 i ts t a b l et h a na c e t o n e ，a n ds a l a do i lc o u l dp r o t e c ta s t a x a n t h i nw e l lf b mb e i n g d e s t r o y e db yo x y g e n t h ei n c l u s i o nc o m p l e xo fa s t a x a n t h i nw i t h 卢- c y c l o d e x t r i nw a sp r e p a r e db y e n c a p s u l a t i o n t h ei n c l u s i o nr a t eo fa s t a x a n t h i nw i t h - c y c l o d e x t r i nc o u l db ei m p r o v e d b ys a p o n i n c a t i o n t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fe n c a p s u l a t i o nw e r ee s t a b l i s h e db yt h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：w h e nt h e 锄o u mo f 卢一c y c l o d e x t r i nw a s7g 5 0m ga s t a x a n t h i n ， t e m p e r a t u r e4 0 ，s t i r r i n gs p e e d6 0 0r m i n ，t i m e5h ，t h ei n c l u s i o nr a t ec o u l dr e a c h 8 7 7 7 t h ea c c e l e r a t i v ee x p e r h n e n to f s t a b i l i t yw a sc a r r i e do u ta t5 0 5 0 0 0l u xa n d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es t a b i l i t yo fa s t a x a n t h i nw a si m p r o v e da l m o s t2 0t i m e sb y s a p o n i f i c a t i o n 蚰de n c a p s u l a t i o n t h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h ei n c l u s i o nc o m p l e xw a s c o n f i r m e db yi rs p e c t r o s c o p ya n dx - r a yd i f h a c t i o nt e c h n i q u e s t h es t u d yc a m ei n t o t h ec o n c l u s i o nt h a tt h e r ew a st h ee v i d e n td i f f b r e n c eb e t w e e nt h es t r u c t l l r eo ft h e i n c l u s i o nc o m p l e xa n dt h es i n g l ea s t a x a n t h i n ，声- c y c l o d e x t r i n ，a n dt h em i x t u r eo ft h e t w on l a n er t h i sd r o v e dt h a tt h en e ws o l i dm a t t e rw a sc o n s t i t u t e da f t e ri n c l u s i o n k e yw o r d ：尸蛔历口砌d 咖互y m 口；a s t a ) 【a n t h i n ；l y t i ce i l z y m e ；e x t r a c t ；2 一d e o x y d g l u c o s e 卢c y c l o d e x t r i n v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本入承摆。 作者签名：衷哞面 日期：础多月心日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密酬 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：夔鸳而 导师签名：轴 日期：帕j 年i 月r 日 日期：砂年多月盯日 第一章绪论 1 1 关于虾青素 第一章绪论 1 1 1 引言 类胡萝b 素( c a r o t e n o i d s ) 属于类萜化合物。分子中不含有氧原子的碳氢族类胡 萝h 素被称为胡萝h 素族( c a r o t e n e s ) ：分子中有含氧功能团( 如羟基、环氧基、甲氧 基、酮基、羧酸等) 的衍生物及其酯类则被称为叶黄素族( x a n t h o p h y l l s ) 。 类胡萝h 素是自然界分布最为广泛也是最重要的一类色素。它们存在于整个 植物界、所有进行光合作用的细胞组织中，不过它们常被叶绿素所遮蔽：同时也存 在于一些细菌、真菌、藻类及动物( 尤其鸟类和鱼类) 和无脊椎动物( 如虾、蟹) 之 中。但动物和无脊椎动物不能自身合成类胡萝卜素，只能通过从食物中摄取并沉 积于体内。己发现的类胡萝卜素( c 盯o t e n o i d s ) 种类超过6 0 0 种，它们主要是岩藻黄 素( f u c o x a n t h i n ) ，黄体素( l u t e i n ) ，紫黄素( v i o l a ) 【a n t h i n ) 和新黄质( n e o x a n t h i n ) 。几 种常见的类胡萝b 素结构见图1 1 。 类胡萝h 素赋予各种生物绚丽的色彩，作为光合作用的辅助色素，还参与光 能传递和物质转化，具有抗光敏化作用、碎灭自由基等重要生理功能，保护生物 体免受不利环境因素的伤害。另一方面，类胡萝h 素作为熏要的营养素来源，能 增强机体免疫功能，防病保健，在医药、食品、饲料和养殖业方面用途广泛 1 1 。 二十世纪八十年代化学合成类胡萝 素一度畅销和独占世界市场，年产近万 吨，主要用于饲料添加剂和食品工业。但天然类胡萝h 素在食品加工业有着更广 泛的应用，9 0 年代以前，西方国家大都将类胡萝h 素作为食用色素用于食品与饮 料中。9 0 年代后，天然类胡萝h 素逐渐成为一种强化营养食品的重要添加剂。面 制食品中加类胡萝 素不仅可使色泽渗入，还能增加其营养价值，可谓是一举两 得。此外，天然类胡萝卜素还与其它保健植物油，如月见草油或深海鱼油等一起 加工成软胶囊等新颖保健品【2 】。 由于类胡萝b 素具有极强的抗氧化能力，可抵御有害物质在体内造成的氧化 损伤。研究表明：天然类胡萝卜素可以预防游离基所造成的组织损伤与细胞衰老： 天然类胡萝h 素中所含微量的玉米黄质、隐黄质等有益于心脏健康以及预防血管 硬化、视网膜黄斑退化和其它因机体衰老所引起的症状：类胡萝h 素能协同体内的 “清洁系统”将同食物一起摄入体内的各种“环境激素”( 如多氯联苯等) 以及二 恶英之类有害物质清除体外【3 ，4 】。 华南理工大学博士学位论文 9 0 年代后沉寂己久的天然来源的类胡萝h 素重新开始走俏世界市场。与此同 时，开辟天然类胡萝h 素新来源及其提取工艺成为各公司( 尤其专门从事天然植物 产品开发的制药公司) 科研新课题。可以预见，今后天然类胡萝h 素产销将急剧增 长。 o o 旺 图卜1 几种常用的类胡萝b 素 f i g 1 - 1s t r u c t u r e so f s e v e r a lo r d i n a r yc a r o t e n o i d s 蝴 虾青素( 3 ，3 - 二羟基4 ，4 - 二酮基- 芦，口- 胡萝h 素) 是一种生理功能极强 的天然类胡萝卜素，它广泛存在于鲑鱼、虾、蟹、观赏鱼和鱼卵中，以及植物叶、 花和水果中，绝大多数海产甲壳类动物和鱼类都含有虾青素，但都是通过食物链 从海洋微藻、浮游植物和浮游动物中获得的。虾青素具有极强的抗氧化性能，其 抗氧化性能较维生素e 强百倍以上，有“超级维生素e ”之称。动物试验表明虾 青素有抗肿瘤和增强免疫功能的作用，因而在食品添加剂、化妆品、保健品和医 2 第一章绪论 药工业方面有广阔的应用前景1 5 j 。人工合成虾青素成本高，售价有时高达每公斤 2 0 0 0 美元【6 l ，且大多数为顺式结构。美国f d a 仅批准人工合成的反式结构的虾青 素用作水产养殖的添加剂【”。过去虾青素主要来源是甲壳类动物，但甲壳类动物虾 青索含量低，提取费用高，不适合作为虾青素的大规模来源，因此必须寻找一种 廉价的天然虾青素来源。目前发现短杆菌，分枝杆菌，土壤杆菌，雨生红球藻和 红酵母等少数几种微生物能够合成虾青素l8 1 。但具有研究价值的主要是雨生红球藻 ( 日a p 小口f d c d c c “s p ，”v f 口，括) 和红法夫酵母( p 劝铀，j i l d 如互y 晰口) 。其中雨生红球藻的 虾青素含量高，高达o 2 2 ，但其自养培养周期长，需光照和破壁释放虾青素， 因此进行大规模生产也有一定难度。红法夫酵母具有作为色素生物来源的一些必 要的特征：合成虾青素作为一种主要的类胡萝卜素；不需要光照；能利用多种糖 作为碳源进行快速异养代谢；培养时间短；能够在发酵罐中实现高密度培养等。 近2 0 年来，红法夫酵母以其生长速度快，发酵周期短，以及色素提取后菌体单细 胞蛋白可作为饵料、饲料添加剂等优点而成为国内外的研究重点。但是虾青素是 红法夫酵母的细胞内色素，由于酵母细胞壁很厚l 鲥，且动物肠道不分泌降解细胞壁 的酶类，所以动物摄入后难以消化吸收，同时对于虾青素的提取，不破壁则无法 进行。因此，在虾青素工业化开发过程中建立简便易行而且效率高的细胞破壁及 虾青素提取方法是一个急需解决的关键问题。 1 1 2 虾青素的理化性质 虾青素的分子式为c 。h 。o 。，相对分子量5 9 6 8 6 ，是一种萜烯类不饱和化合物， 是甲壳类动物如蟹、虾和三文鱼的主要色素。虾青素易于氧化，氧化后变为虾红 素( a s t a c e n e ) 。在k 盯f e r 对虾红素认识的基础上，k u l l n 和s o r e n s e n 首先对虾青素 进行了化学鉴定，d a v i d 和w e e d o n 后来通过角黄素( c 孤t h a x a n t h i n ) 合成虾红素 证实了虾青素的化学结构嗍。瑞士f 。h o f 啪l a r o c h e 的研究者已经完成了纯虾青 素的合成。 晶体状虾青素是一种精细深紫褐色粉末，熔点约2 2 4 ，在水溶液和大多数有 机溶剂中不易溶解，但在室温下能溶于二氯甲烷( 3 0g l ) ，三氯甲烷( 1 0g l ) ， 二甲基亚砜( o 5g l ) ，丙酮( 0 2g l ) 和其他的非极性溶剂。它的吸收光谱代 表一个共轭多烯结构，在三氯甲烷中的 。- 4 7 8n m ，在丙酮中的 。= 4 8 0 砌。 虾青素的化学结构是由四个异戊二烯单位以共轭双键形式联结，两端又有两 个异戊二烯单位组成六元环结构。虾青素中因为含有一个长的共轭双键系统，比 其他异戊二烯化合物更不稳定。光、热、酸和氧特别易于破坏虾青素的结构。当 从生物样品中提取虾青素时，酶的作用也可能破坏虾青素的结构。高效液相色谱 可用于检测虾青素的顺式异构体，检测时虾青素的顺式异构体一般最后从柱中流 出。全反式天然虾青素易于异构化而形成顺反异构体混合物，特别是9 顺和1 3 顺异构体i l 。因此必须采取措施防止这种转化。虾青素的顺式结构通常被认为是 华南理工大学博十学位论文 非天然的合成品。然而，虾青素顺式异构体可能有必需的代谢功能并且在某些生 物中能自然形成。p 柏。妞y m 口中已经检测到顺式结构的虾青素。在进行自然来源 虾青素及其酯的分析时，应当避免碱性条件，因为在碱性和有氧条件下皂化时， 虾青素不可逆转的转化为虾红素。 虾青素在3 和3 位置有两个不对称碳原子，能以四种构象存在，包括均一对 映体( 3 s ，3 s ：3 r ，3 r ) 和内消旋形式( 3 r ，3 s ；3 r ，3 s ) 。化学合成的虾青 素是几种构象异构体的混合物。顺反异构体和构象异构体可以通过h p l c 和t l c 分离。a n d r e w s 和s t a r r l 9 7 5 年发现p 柏。加y m 口中含有3 r ，3 r 虾青素( 9 2 ) 作为主要的构象异构体。红球藻中生物合成的虾青素为3 s ，3 s 异构体。野生鲑 鱼中检测到所有的虾青素内消旋和对映异构体i l ”，为法夫酵母及红球藻虾青素的 应用打消了人们的担忧。 1 1 3 虾青素的生理功能 1 1 3 1 抗氧化性能 生物氧化反应是需要氧的基本生理生化过程，在维持正常新成代谢上非常重 要。生物氧化过程必然产生氧自由基、过氧化氢等活性氧，但是过量产生就会导 致氧化损伤。氧是生物氧化过程中的电子受体，由于得到电子的个数不同，可以 形成多种产物。虾青素是一类断链抗氧化剂，具有极强的抗氧化性能。d i 等利用 内生过氧化物的温敏消散产生分子氧研究了多种类胡萝h 素淬灭分子氧的能力， 发现淬灭分子氧的能力依次为：虾青素 卢胡萝h 素 r 胡萝 素 玉米黄质 黄体 素 胆红素 胆绿素。l e e 等人研究了叶黄素、玉米黄质、番茄红素、异玉米黄素和 虾青素( 双键数分别是1 0 ，1 1 ，1 1 ，1 1 和1 3 ) 等五种类胡萝卜素在豆油光氧化作 用中淬灭活性氧能力。它们淬灭单线态氧速率常数分别为5 7 2 1 0 9 ，6 7 9 1 0 9 ， 6 9 3 1 0 9 ，7 3 9 1 0 9 和9 7 9 x 1 0 9 。表明它们淬灭活性氧能力随着双键数的增加而增 加，以虾青素的淬灭能力为最强【1 2 】。m i k i ，a r u lc a n t r e u 等也研究了叶黄素、玉米 黄素、金枪鱼黄素、角黄素、p 胡萝h 素、维生素e 和虾青素等类胡萝h 素淬灭 单线态氧和清除自由基能力【l3 1 。各类胡萝卜素和维生素e 清除自由基的半数效应 剂量如表1 1 所示。研究结果表明，类胡萝卜素具有清除自由基和淬灭活性氧的活 性，这种活性与维生素e 相似，而且认为类胡萝h 素中羟基和酮基的存在和数目 对清除自由基十分重要，其中以虾青素活性最强，比维生素e 强百倍以上，作者 将其称为“超级维生索e ”。以大鼠红细胞膜和肝线粒体进行的实验也得到类似的 结果。同时还发现虾青素具有抑制脂过氧化的作用【l 。w o o d a u 等人发现虾青素具 有降低脂质过氧化作用，能保护磷脂酰胆碱脂质免受氧化【”l 。n a k a g a w a 等人也发 现虾青素具有显著降低脂质过氧化物积累的作用【1 6 】。s o v o u r e 等研究紫外线对 s k h i 无毛鼠皮肤的影响时，发现虾青素的添加可强烈抑制腐胺产生，并降低精胺 和亚精胺等游离多胺浓度，具有极强的单线态氧淬灭能力。t c r a o 等利用测定甲基 4 第一章绪论 亚麻酸氢过氧化物的生成来测验类胡萝h 素的抗氧化功能，发现虾青素由于在 紫罗酮环4 和4 位上含有氧基团，可有效地延缓氢化过氧化物的形成，而且虾青 素的自催化氧化速率比芦胡萝h 素和玉米黄素慢得多。虾青素可解除光诱导的氧 化胁迫，抑制光敏作用能力强。c o n n o r 等分析了虾青素、黄体素、卢胡萝h 素等 几种类胡萝 素保护小鼠肾纤维细胞免受u v 诱导产生的氧化压力的能力，发现 虾青素( 1 0n m o l ，l ) 、黄体素( 1m m o l l ) 、卢胡萝卜索( 1m m o l l ) 均可保护机 体免受u v 诱导产生的氧化胁迫，而虾青素的效果最佳。0 s h i m a 等将组成蛋黄卵 磷脂的大型单片脂质体添加水溶性光敏物质或脂溶性光敏物质后进行光照辐射， 用以检测虾青素和卢胡萝卜素抑制磷脂双分子层的光敏氧化作用的效果。结果表 明虾青素比口- 胡萝h 素抑制光敏氧化作用的能力强。 表1 - 1 类胡萝h 素和口生育酚作为自由基清除剂的e d 5 0 值【1 4 t h b l e l 一le d 5 0o f c a r o t e n o i d sa n d 口t y p h e r o l 清除剂e d s o ( n m ) 虾青素 玉米黄素 角黄素 叶黄索 金枪鱼黄素 ，胡萝h 素 。生育酚 2 0 0 4 0 0 4 5 0 7 0 0 7 8 0 9 6 0 2 9 4 0 1 1 3 2 增强免疫功能 许多研究表明虾青素能增强抗体反应和增加体液免疫的功能。有人对用 h p y l o r i 处理过的老鼠进行研究，发现虾青素能显著地降低细菌侵蚀和胃炎症状， 而且也能调节细胞浆液的释放【1 7 】。j y o n o c h i 等人研究了虾青素和口胡萝h 素两种 类胡萝n 素对小鼠淋巴体外组织培养系统的免疫调节效应，结果表明类胡萝h 素 的免疫作用与有无v a 活性无关，虾青素表现出更强的作用【1 8 】。通过整体实验观察， 他们还发现虾青素等类胡萝h 素均显著促进胸腺依赖抗原( t d a 。) 刺激时抗体产 生，分泌i g m 和i g g 的细