（皮革化学与工程专业论文）酶法水解牛皮制备胶原的关键控制因素研究.pdf

四川大学硕士学位论文 y 9 9 3 7 8 2 酶法水解牛皮制备胶原的关键控制因素研究 皮革化学与工程专业 研究生：许亮导师：石碧教授 摘要 本文以牛皮为原料，对酶法水解牛皮制备胶原的关键控制因素进行了较系 统的研究。研究了制备胶原时使用酶法预处理原料皮的方法，采用胃蛋白酶和 蛋白酶g c l 0 6 水解牛皮制各胶原的动力学过程以及水解产物的表征方法。结果 表明，当采用中性蛋白酶1 3 9 8 和碱性蛋白酶2 7 0 9 对原料皮进行预处理时，酶 法预处理方法能够同时满足清洁、高效的要求，其处理效果( 主要表现为脱毛 效果) 与使用制摹厂常用工艺的处理效果相同，而且酶法处理过程中蛋白质的 溶出率较低。由于在采用酶法预处理原料皮的过程中不会使用含硫化合物，因 此比传统预处理工艺更加清洁，同时酶法预处理将有利于胶原的提取和纯化。 当采用胃蛋白酶水解牛皮时，在1 5 c 4 0 c 范围内，提高温度、增加酶用量都 将促进水解过程的进行，但当水解进行到一定程度时，延长水解时间不能明显 提商水解程度。胃蛋白酶水解牛皮的水解过程符合内切酶限制水解历程，其动 力学模型可以用【c 】= 6 - l l n 1 + a b t 】来描述，同时水解动力学符合拟二级速度方 程。当采用蛋白酶g c l 0 6 水解牛皮时，在l o 4 0 c 范围内，提高温度、增加 酶用量和延长时间都可以促进水解过程的进行。但蛋白酶g e l 0 6 水解牛皮的水 解过程不符合内切酶限制水解历程。胃蛋白酶和蛋白酶g - c 1 0 6 水解牛皮的水解 产物的粘度- 温度变化规律相同，其水解液中胶原的热变性温度都在3 6 左右 p _ e p 四川大学硕士学位论文 当水解温度低于胶原的热变性温度时，酶量对胶原的粘度温度特性无显著影 响；而当水解温度高于胶原的热变性温度时，几乎不能得到胶原。因此，在采 用胃蛋白酶和蛋白酶g c l 0 6 水解牛皮制备胶原时，水解温度不能高于胶原开始 发生变性的温度3 0 c 。在采用胃蛋白酶水解牛皮制备胶原时，其水解产物中非 胶原成份的相对含量较蛋白酶g c l 0 6 的水解产物低，这说明胃蛋自酶较蛋白酶 g c i o g 具有更好的选择性、专一性和可控制性。因此在大规模制备胶原时，采 用胃蛋白酶水解牛皮制各胶原优于蛋白酶g c l 0 6 。 关键词：胶原；牛皮；水解；蛋白酶；动力学；粘度；分予量 ， 四j i l 大学硕士学位论文 t h e k e yf a c t o r si n f l u e n c i n gc o l l a g e np r e p a r a t i o nb y e n z y m a t i ch y d r o l y s i so f c a l f s k i n l e c h e rc h e m i s t r ya n de n g i n e e r i n g p o s t g r a d u a t e ：l i a n gx us u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rb is h i a b s t r a e t t h ek e yf a c t o r si n f l u e n c i n gc o l l a g e np r e p a r a t i o nb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i so f c a l fs k i nw a ss y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d t h ee n z y m a t i cp r e t r e a t m e n to fr a ws k i n , t h eh y d r o l y s i sk i n e t i c so f t h es k i nb yp e p s i na n dp r o t e a s cc - c 1 0 6 , a n dt h em e t h o d s f o rc h a r a c t e r i z i n gh y d r o l y s a t e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tw h e nn e u t r a l p r o t e a s e1 3 9 8a n da l k a l i n ep r o t e a s e2 7 0 9w a su s e dt op r e - t r e a tt h el a ws k i n , h i g h p e r f o r m a n c ep r o c e s so fp r e - t r e a t m e n tc a nb ea c h i e v e d t h ee f f e c t i v e n e s so f e n z y m a t i cp r e - t r e a t m e n t ，p a r t i c u l a r l yu n - h a r i n gf i m c t i o n , i sa st h es a m ea st h e c o n v e n t i o n a lb e a m h o l l s ep r o c e s so fl e a t h e rm a a u f a c t u r i n g i tw a sa l s of o u n dt h a tt h e p r o t e i nl o s eb yu s i n ge n z y m a t i cp r e t r e a t m e n ti sr e l a t i v el o w e r t h ee n z y m a t i c p r e - l r e a t m e n t s h o u l db ea l le n v i r o n m e n t a l l y f r i e n d l yw o c e s sc o m p a f e dt ot h e t r a d i t i o n a lt r e a t m e n tb e c a u s eo fa v o i d i n gf r o mt h eu s eo fs u l f i d e a tt h es a m et i m e , o u re x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ee n z y m a t i cp r e - t r e a t m e n tf a v o r sp r e p a r a t i o no f c o l l a g e n w h e np e p s i nw a su s e d , i nt h et e m p e r a t u r er a n g eo f1 5 t o4 0 c ，t h e h y d r o l y s i sp r o c e s so fc a l fs k i nw a sa c c e l e r a t e d 、 r i t ht h er a i s eo ft e m p e r a t u r ea n dt h e i n c r e a s eo fe i l z y n wo f f e r b u tt h eh y d r o l y s i sd e g r e ec o u l dn o tb er e m a r k a b l y i n c r e a s e db yf u r t h e re x l e n d i n gh y d r o l y s i st i m ew h e ns o m ee x t e n t so f h y d r o l y s i sh a d 四川大学硕士学位论文 b e e na c h i e v e d t h eh y d r o l y s i sm e c h a n i s mo fp e p s i nf o l l o w st h ec o u r s eo fl i m i t e d h y d r o l y s i so fi n n e r - e n z y m e , a n dt h ek i n e d cm o d e lo ft h eh y d r o l y s i s c a l lb e e x p r e s s e da s c 】- b1 1 n 1 + a b t 】a tt h es a l n et i m e ，t h eh y d r o l y s i sk i n e t i c sc a l lb e f i t t e db yp s e u d o - s e c o n d - o r d e rm o d e l w h e np r o t e a s eg c l 0 6w a su s e d ，i nt h e t e m p e r a t u r er a n g eo f1 0 t o4 0 t h eh y d r o l y s i sp r o c e s so fc a l f s k i nw a s a c c e l e r a t e dw i t ht h er a i s eo f t e m p e r a t u r ea n dt h ei n c r e a s eo f e n z y m eo f f e ra n dt i m e b u tt h eh y d r o l y s i sm e c h a n i s mo fp r o t e a s eg c l 0 6d o e sn o tf o l l o wt h ec o u r s eo f l i m i t e dh y d r o l y s i so fi n n e r - e n z y m e t h ev i s c o s i t y - t e m p e r a t u r er e l a t i o n s h i p so ft h e h y d r o l y s a t e so b t a i n e db yu s i n gp e p s i na n dp r o t e a s eg c l0 6i sn e a r l yt h es a m e t h e d e n a t u r i n gt e m p e r a t u r em ) o fc o l l a g e ni nt h eh y d r o l y s a t e si sa r o n n d3 6 c t h e r e f o r e ，w h e nt h eh y d r o l y s i st e m p e r a t u r ei sl o w e rt h a nt do f c o l l a g e n ，t h ee n z y m e o f f e rh a sn os i g n i f i c a n te f f e c to nt h ev i s c o s i t y - t e m p e r a t u r e r e l a t i o n s h i p o f h y d r o l y s a t e w h e nt h eh y d r o l y s i st e m p e r a t u r ei sh i g h e rt h a nt h et do fc o l l a g e n ，t h e c o l l a g e nw i l ln o tb eo b t a i n e d s ow h e ne m p l o y i n gp e p s i na n dp r o t e a s eg c l 0 6t o p r e p a r ec o l l a g e n , t h eh y d r o l y s i st e m p e r a t u r es h o u l db el o w e rt h a n3 0 。c t h ec o n t e n t o f n o n - c o l l a g e nc o m p o n e n t si nt h eh y d r o l y s a t eb yu s i n gp e p s i ni sl o w e rt h a nt h a tb y u s i n gp r o t e a s eg c l 0 6 i ti n d i c a t e st h a tp e p s i nh a sb e t t e rs p e c i f i c i t ya n dq u a l i t y c o n t r o l l a b i l i t yt h a np r o t e a s eg c l 0 6i nh y d r o l y s i s i n gc a l fs k i n s o ，f o rp r e p a r i n g c o l l a g e no i lal a r g es c a l e ，u s i n gp e p s i ni sa b e t t e rc h o i c e k e yw o r d s ：c o l l a g e n ；c a l fs k i n ；h y d r o l y s i s ；p r o t e a s e ；k i n e t i c s ；v i s c o s i t y ； m o l e c u l a rw e i g h t 四川大学硕士学位论文 第一章前言 国家在“十五”计划和2 0 1 0 年规划可持续发展战略的目标和政策建议中提 出，在2 1 世纪初期，在中国如何既实现促进人类发展，又保持可持续增长的可 持续发展战略中，人口，资源和生态环境等方面仍然是我们必须面对的严峻挑 战。目前，中国资源消耗的总量大，重要资源人均占有量不断下降，资源紧缺 难以支撑国民经济和社会以现有模式发展，并且生态基础薄弱，生态破坏日益 加重t 1 。因此在保护环境的基础上，如何有效而充分的利用资源，构建节约型 社会是我们迫切需要解决的重要问题。 在众多的资源种类中，生物资源属于可再生资源，具有重要的开发利用价 值和广阔的市场前景t 2 | 。动物生物质是一类重要的生物资源。它包括猪、牛、 羊、鸡、鸭等家畜、家禽和些动物的皮、毛、骨、肉、内脏、禽蛋和肥料等。 众所周知，基于动物生物质的传统产品主要有肉类食品奶类产品，禽蛋产品， 毛纺产品、皮革、肥料等。对动物皮的传统加工工业主要为制革工业和制裘工 业。我国是畜牧业大国，根据联合国粮农组织2 0 0 0 年公布的统计资料数据表明， 我国生猪、绵羊、山羊的存栏数均居世界第一。因此，我国的制革工业和制裘 工业一直以来都是一个具有较强综合优势的传统产业唧。 然而，作为在我国国民经济建设中具有重要地位的制革、制袭工业正面临 着环境污染、资源利用率低等方面的严峻挑战。它们在为国家创造显著经济效 益的同时，也对我国的环境和生态造成了一定的负面影响；同时与发达国家相 比，我国在动物生物质加工深度上还较为落后。因此，拓宽制革工业的生产领 域和研究范围，提高对动物皮资源的加工深度，开发出基于动物皮资源的具有 高附加值的产品，对动物质资源的合理利用具有重要的意义。 动物皮中8 0 8 5 以上是胶原。用皮胶原可获得：胶原蛋白系列产品( 饲 料、氨基酸、营养保健食品、食品包装材料、胶原蛋白海绵、组织工程材料等) 、 多种纤维混合系列产品( 高级书画纸张、特种壁纸、膜塑包装材料等) 、新型皮 革产品( “三防”皮革、医疗保健皮革、防化军用革等) f 7 】这些产品的开发 需要对原料进行预处理。通常对原料的预处理都是按照制革工艺中的准备工段 进行的，其污染大、效率低。由于一些产品受其特殊用途所限制，要求其在开 发和制备的过程中能够使生产过程具有较高清洁性、高效性和可控制性。同时 阴川大学硕士学位论文 通过在生产过程中使用这些清洁化手段也可以充分利用资源，降低污染物的排 放量，并且能够大幅度的提高经济效益，这也符合绿色化学的特点和发展的趋 势( s - t 0 1 。 随着全球性环境污染问题的日益加剧和能源、资源急剧耗竭，以及全球公 众环境意识的提高，如何提高制草、制襄工业的资源利用率，减少环境污染， 拓宽制革、制裘工业的生产领域，更加清洁、简洁、高效和可控的开发出具有 高附加值的工业产品已成为制革科学工作者们近年来研究的重点领域。 1 1 皮胶原的应用研究概况 1 1 1 皮胶原在工业上的应用 自古以来我国就是一个畜牧业大国。皮摹制造自公元前十六世纪中国商代 以来就已经形成了行业，距今已有3 6 0 0 年的历史【1 1 l 。从那时候起人们就开始使 用兽皮制造皮披肩、皮围裙、鼓皮和皮鞋筒子等日常生活用品，甚至用皮制造 盔甲和钱币等物品 1 2 1 。近代，皮革开始广泛应用于人们的日常生活用品、家居 饰品、汽车内饰品和军用革制品等方面。近年来，随着全球皮革加工制造业向 发展中国家的转移，我国的皮革工业得到了长足的发展。但是皮革工业由于其 生产、制造和市场的特殊性，它不会像it 产业、生物工业、光电通讯业和材 料工程等行业一样发生迅猛的增长。但足皮革工业由于其具有不可替代的特殊 性，它又是一个具有顽强生命力的行业。因此，在未来相当长的一段时期内， 我国的皮革工业必将保持持续而稳定的增长。但需要用现代科学技术对传统皮 革产业进行改造。 皮革在生产制造过程中只有3 0 3 5 的部分能转化成为革制品。因此皮 革的生产过程就会产生大量的固体废弃物【1 3 】。固体废弃物主要集中在两个方面： 一是在准备工段中由于去肉、片皮等工艺而产生的未经鞣制的废弃物：二是在 后处理工段中由于修边、削匀等工艺而产生的含铬固体废弃物。自上世纪以来， 制革科学工作者们就对制革固体废弃物，特别是来t l 于后处理工段中的含铬废 弃物的资源化利用进行了大量的研究。对于含铬废弃物资源化利用的研究主要 集中在通过水解得到含铬量尽可能低的水解蛋白和基于这种水解蛋白所制备的 蛋白饲料的营养评价两个方面。m a l v e sd o e sr e s i 等研究认为，用氧化钙水解 可以制得铬含量低于o 1 x 1 0 由的蛋白产品，这种产品用于喂养雏鸡对产蛋没有 2 四川大学硬士学位论文 影响i l ”。王鸿儒等研究认为，通过使用碱处理含铬废弃物，从中提取的胶原蛋 白通过改性后是一种性能良好的蛋白填充剂，可以用作皮革生产中的复鞣剂旧。 动物皮一直是提取胶原及其水解产物的主要原材料之一。s m o r i m u r a 等通 过使用酶制剂从动物皮中提取出可以用于食品生产原料的食品级蛋白多肽【阚。 据任俊莉的研究报道，胶原蛋白作为粘着剂、絮凝剂和表面活性剂在造纸工业 中具有广泛的应用旧。 总之，由于皮胶原独特的分子结构和生物活性，皮胶原将得到更加广泛的应 用。 1 1 2 皮胶原在医学上的应用 胶原由三条多肽链构成三股螺旋结构，分子量约为3 0 0 0 0 0 ，其氨基酸组成 主要为甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，其每条肽链由重复的g l r x 叫序列构成( 其 中g i y 为丙氨酸，x 常为脯氨酸残基，y 常为羟脯氨酸或羟赖氨酸残基) 。到目前 为止，已发现胶原的种类超过2 0 多种 i s , t g l 动物皮中的胶原通常主要是i 型胶 原，它具有良好的生理化学性能、生物学性能和生物降解性能。胶原的生理化 学性能，如静电学性能、成纤性能、结合性能和支架作用等性能，以及其生物 学性能，如止血性能、细胞相互作用性能和免疫性能等，使其在医学上用于作 组织支架材料、手术缝合线、缓释材料、注射性材料和人造器官等【l s 2 4 l 赵云 山等研究了以液态胶原为支架构建组织工程化心肌组织用于心肌组织的缺损修 复，取得了一定成果f 2 爿赵月萍等研究了应用b f g f 胶原缓释海绵修复髓室底穿 孔，成功率达到8 0 【2 翻。 近年来，胶原优良的性质引起了许多研究者的兴趣，但是对于胶原的认识、 研究和利用尚存在许多待认识的问题。同时对胶原的基础理论研究还不充分， 与相关学科的交叉融合不够，从而制约了胶原在医学领域的应用。随着基础理 论的深入、研究技术的提高以及先进分析检测手段的利用，胶原将在医学领域 得到越来越广泛的应用。 1 1 3 胶原的提取 胶原的制备技术历史可以追溯到1 9 2 9 年，当时就已经出现了以磷酸溶解动 物骨组织提取胶原的专利技术。p e i z 0 ( 1 9 6 0 ) 以动物真皮组织提取胶原溶液， 四j i l 大学硕士学位论文 b l o c h 等( 1 9 6 1 ) 的专利方法实现了胶原的纯化。商业化提取胶原工艺于1 9 6 2 年由 u n i t e ds h o e m a e h i n a r y 公司开发成功 2 1 1 。到目前为止，提取胶原的原料主要来自 于猪、牛、羊、鱼等动物的皮、骨、肌腱和韧带等。 由于胶原在水中的溶解度较低1 2 7 1 ，提取和纯化较为困难。根据不同的用途， 胶原的提取和纯化方法也不尽相同。胶原及其水解产物的提取方法主要有酸法、 碱法、酶法以及酸、酶结合法和碱、酶结合法等方法【2 舯。t a k e s h in a g a i 等研究 了使用0 5 m 醋酸从鱼皮废弃物中提取纯化鱼皮胶原，产率达到5 0 左右，并研 究了胶原的热变性和分子量分布等性质 2 9 1 。h s i u - oh o 等研究了使用胃蛋白酶消 解猪皮提取纯化猪皮胶原用于制备药物缓释材料，并使用s e m 、分子排阻高效 液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 对提取的胶原进行了表征1 3 0 l 。 1 2 课题的研究意义及指导思想 动物皮组织是一种富含胶原纤维的物质，以干重计大约含有高达8 0 8 5 的胶原。胶原分子中的含氮量比其它蛋白质的含氮量高且富含多种人体必需的 氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和蛋氮酸等【3 “。基于动物皮生物质的胶原 具有十分广泛的用途，除了包括皮革代用品、表面活性剂、食品包装材料、微 生物培养基、化妆品等传统的工业用途之外，胶原在医学上作为手术缝合材料、 人工皮肤、组织支架、注射性材料等方面越来越受到医学科学工作者的重视 1 2 0 2 , 4 , 2 8 1 。因此近年来胶原吸引了大批各学科科学工作者对其制备、改性、应用 等方面进行研究。由于皮胶原独特的化学结构和生物特性，皮胶原未来的利用 价值将可能会远远超出制革的范畴，而且可能对许多领域的科技发展产生重要 的影响。 基于动物皮生物质的胶原的提取、纯化和表征一直是胶原研究的重要内容 之一。近年来，国内外的科学工作者采用各种动物皮组织( 牛皮、猪皮、羊皮、 鼠皮、鱼皮等) 和固体废弃物( 制革废弃物、动物加工厂废弃物等) 为基质， 利用酸法、酶法、酸酶结合法等方法，对制备胶原及其水解产物进行了大量的 研究，取得了一定的进展1 3 2 3 0 。但大规模制备胶原需要建立清洁高效的原料皮 预处理方法，同时在此基础上需要对胶原的制备方法进行深入的研究。目前， 原料皮的预处理方法主要集中在以下两种方法：一是以碱处理原料皮进行脱脂， 使用手工脱毛；二是以传统制革工艺中的准备工段预处理原料皮。但这两种方 四川大学硕士学位论文 法在大规模制备胶原时不能够同时达到高效、清洁的要求。同时在大规模制备 胶原时，如何简单、有效的控制胶原水解的关键因素，快速的监控水解过程和 检测水解结果也是需要深入研究的问题。本文以牛皮为原料，首先研究了酶法 预处理方法。此法在制备胶原时，能够同时满足清洁、高效的要求。因此，酶 法预处理方法不失为工业化预处理原料皮的一种选择。在此基础上，研究了胃 蛋白酶和g c l 0 6 蛋白酶水解牛皮的动力学，以便对胶原水解的关键控制因素深 入地了解，有利于对大规模制备胶原的生产过程进行控制。本文还通过粘度和 分子量分布测定对牛皮酶水解产物进行了表征。这两种表征方法在大规模制备 胶原时可以作为监控水解过程和检测水解结果的手段之一。 四川大学硕士学位论文 第二章牛皮的酶法预处理研究 基于动物皮的胶原及其水解产物的工业化提取，其预处理一般需要借用制 革工业中传统的准备工段。该工段的目的是去除动物皮组织中的毛、污物、油 脂、非胶原蛋白质等成份，促进皮组织中胶原纤维的分斟3 7 1 ，以适合利用酸、 碱、酶等对胶原进行提取和纯化。传统的准备工段一般包括组批浸水脱脂 脱毛碱膨胀脱碱软化浸酸等二- 系列的步骤在制革工艺中，准备工 段是主要的污染源之一由于大量的石灰硫化物铵盐有机物和中性盐等 随着废水排放，从而造成废水中c o db o dt d s 固体悬浮物含量很耐3 们，且 难以处理，从而造成对生态环境的严重影响m 1 州l 准备工段中所产生的污染物 主要来自于脱毛碱膨胀浸酸这三个步骤传统的脱毛碱膨胀工艺主要是 用硫化碱石灰来处理生皮，达到去除于制革无用的物质的目的由于该工艺 具有成本低脱毛效率高可操作性强等特点，所以一直沿用至今传统的浸 酸工艺也伴随有大量的盐( n a c i ) 的排放针对上述问题，制革工业长期以来试 图通过开发环境友好的皮革化工材料制革用酶制剂，以及调整工艺参数等方 法来解决准备工段所造成的环境污染问题 在脱毛和碱膨胀工艺中，为了降低硫化物和石灰的排放，可用浸灰助剂和酶 制剂作为硫化物的替代物彭必雨、汪建根【4 7 l 等的研究表明，通过使用酶、 浸灰助剂可以减少硫化钠和石灰的用量丁绍兰【耜博通过研究浸灰脱毛废液的 循环使用，试图从工艺方面减少预处理阶段的废水排放量。 用牛皮为原料制备胶原时，其原料的预处理与传统制革工艺的准备工段存 在着一定的差异，它不需要考虑制革中需要考虑的一些问题，如由于浸水、浸 灰过度、酶制剂用量过大、作用时间过长、机械强度过强等造成的成革松面、 成革强度不足、革制品手感等方面的问题，但需要考虑胶原的分离和纯化、分 子量分布以及生物活性等方面的问题。因此在制备胶原时，一方面要尽可能去 除非胶原成份，并且尽可能不引入其它杂质；另一方面要尽可能保持胶原的三 股螺旋结构及其生物活性。为此，宜利用作用条件温和、选择性较强的酶法对 原料皮进行预处理。 6 四大学硕士学位论文 2 1 实验部分 2 1 1 实验材料与仪器 牛皮盐湿皮制革厂提供 浸水酶s g顺德市德美化工实业有限公司 a s 1 3 9 8酶活5 0 0 0 0u g 碱性蛋白酶2 7 0 9酶活l x1 0 5u g 牛血清蛋白s i g m a 公司 其它试剂均为分析纯 紫外可见分光光度计n - 2 5 0 1 p c ，日本岛津 实验转鼓锡山市东北唐山皮革机械厂 差示扫描量热仪( d s c ) d s c 2 0 0 p c ，德国n e t z s c h f o l i n 试剂实验室自制，配制方法如下 在1 5 l 容积的磨口圆底烧瓶中加入1 0 9 钨酸钠( n a ：w 0 , 2 h 劫，2 5 9 钼酸钠 ( n a z i 0 0 , 2 h 2 0 ) 及7 0 0 m l 蒸馏水，溶解后，再加5 0 m l8 5 磷酸，1 0 0 m l 浓盐酸 充分混和，接上磨口冷凝管，以小火回流1 0 h 。回流结束后，冷却，取下冷凝 管，再加入1 5 0 9 硫酸锂( l i a s o , h z 0 ) ，5 0 m l 蒸馏水及数滴溴水，开口继续煮沸 1 5 m i n ，驱除过量的溴( 在通风橱内进行) ，冷却后溶液呈黄色或金黄色( 如仍呈 绿色，须再滴加溴水数滴) ，稀释至l l ，过滤，滤液置于棕色瓶中保存。 2 1 2 原料皮的浸水方法 称取原料皮适量置于转鼓中( 材料用量以皮重计) ，加入水2 0 0 ( 2 5 ) ， 碳酸钠0 5 ，平平加o 5 ，浸水酶s g0 5 ，转动2 h ，静止1 2 h 。将浸水后的 皮置于冰箱内( 4 ) 保存备用。 2 1 3 蛋白酶2 7 0 9 的用量对脱毛效果的影响 按对称取样法从浸水后的原料皮取样，样品大小1 0 1 0 c m 2 ，分别置于转 鼓中，材料用量以皮重计，加入水1 0 0 ( 2 5 c ) ，氢氧化钠2 ，再分别加入 不同用量的蛋白酶2 7 0 9 ( o 2 、0 4 ，o 6 、o 8 、1 ) ，转动8 h ，静止1 2 h ， 次日检查脱毛效果。 7 四川大学硕士学位论文 2 1 4 不同工艺对蛋白酶2 7 0 9 脱毛效果的影响 按2 1 3 的方法取样，分别置于转鼓中。工艺( 1 ) ：加入水1 0 0 ( 2 5 c ) ， 2 7 0 9 蛋白酶o 4 ，平平加0 2 ，氢氧化钠l ，转动6 h ；再加入水3 0 0 ，氢 氧化钠3 ，转动2 h ，静止浸泡1 2 h ，次日检查脱毛效果。工艺( 2 ) ：将氢氧化 钠换成氢氧化钙，用量及脱毛条件同工艺( 1 ) 。 2 1 5 蛋白酶1 3 9 8 的用量对脱毛效果的影响 按2 1 3 的方法取样，分别置于转鼓中，加入水1 0 0 ( 2 5 c ) ，氢氧化钠 2 ，再分别加入不同用量的1 3 9 8 蛋白酶( 0 2 、0 4 、0 6 、o 8 、1 ) ， 转动8 h ，静止浸泡1 2 h ，次日检查脱毛效果。 2 1 8 不同工艺对蛋白酶1 3 9 8 脱毛效果的影响 按2 1 3 的方法取样，分别置于转鼓中。工艺( 1 ) ：加入水1 0 0 ( 2 5 c ) ， 1 3 9 8 蛋白酶o 8 ，平平加0 2 ，硫酸铵o 4 ，转动l h ；再加入氢氧化钠l ， 转动5 h ；再加入水3 0 0 ，氢氧化钠3 ，转动2 h ，静止1 2 h ，次日检查脱毛效 果。工艺( 2 ) ：将氢氧化钠换成氢氧化钙，用量及脱毛条件同工艺( 1 ) 。 2 1 7 无硫或少硫脱毛工艺实验方法 称取一定量浸水后的牛皮，分别置于转鼓中，按照下列工艺号进行操作( 材 料用量以皮重计) ： l # 加入水1 0 0 ( 2 5 ) ，1 3 9 8 蛋白酶0 8 ，硫酸铵0 4 ，平平加0 2 ， 转动l h ；再加入2 7 0 9 蛋白酶0 4 ，氢氧化钙1 ，转动2 h ；再加入氢氧化钙3 ， 转动2 h ；再加入水2 0 0 ，转动1 h ，静止浸泡1 2 h 。该工艺为无硫工艺。 2 # 加入水1 0 0 ( 2 5 ) ，2 7 0 9 蛋白酶0 4 ，氢氧化钙1 ，平平加0 2 ， 转动l h ；再加入1 3 9 8 蛋白酶0 8 ，硫酸铵0 4 ，转动2 h ；再加入氢氧化钙3 ， 转动2 h ；再加入水2 0 0 ，转动l h ，静止浸泡1 2 h 。该工艺为无硫工艺。 3 # 加入水1 0 0 ( 2 5 ) 氢氧化钙1 ，转动3 h ；再加入氢氧化钙3 ，转 动l h ；再加入水2 0 0 ，转动l h ，静止浸泡1 2 h 。该工艺为无硫工艺。 4 肆加入水1 0 0 ( 2 5 ) ，2 7 0 9 蛋白酶0 4 ，硫化钠0 5 ，平平加o 2 ， 氢氧化钙1 ，转动3 h ；再加入氢氧化钙3 ，转动2 h ：再加入水2 0 0 ，转动l h ， 8 四川大学硕士学位论文 静止浸泡1 2 h 。该工艺为少硫工艺。 5 # 加入水3 0 ( 2 5 ) ，硫氢化钠1 ，转动l h ，排液，水洗；再加入 水5 0 ( 2 5 ) ，次氯酸钙0 1 ，氢氧化钙2 ，转动1 h ：再加入水5 0 ( 2 5 1 2 ) ，硫化钠2 ，转动2 h ；再加入水2 0 0 ( 2 5 c ) ，氢氧化钙3 ，转动2 h ，静 止浸泡1 2 h 。该工艺为制革厂常用保毛脱毛工艺。 使用f o l i n - 酚法【4 9 1 测定上述工艺的脱毛液中的蛋白质含量，计算皮的蛋白 质损失率。 2 1 8 预处理后牛皮的物化性质分析 2 1 8 1 牛皮的预处理及样品的制备 牛皮的预处理方法按2 1 7 中工艺1 # 进行，该预处理工艺为酶法无硫脱毛 工艺。样品在4 下低温保存。 2 1 8 2 物化性质分析 ( 1 ) 含水量的测定 称取一定量试样置于恒重过的称量瓶中称营，于1 0 5 c 下烘于至恒重( 8 h 左右) ，在干燥器中冷却、称量，由干燥前后质量差计算其水分含量。 ( 2 ) p h 的测定 称取5 9 试样，置于锥形瓶中，加入1 0 0 m l 蒸馏水，在2 0 o 5 d 的恒温空 气摇床中振荡6 h ，取上层清液，使用p h 计测定其p h 值。 ( 3 ) 热变性温度的测定 称取适量试样，使用差示扫描量热仪( d s c ) 测定热变性温度( t d ) 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 蛋白酶2 7 0 9 在不同条f l ：- f 的脱毛效果 蛋白酶2 7 0 9 在不同用量下的脱毛效果不同。当2 7 0 9 用量为0 2 时，皮面 较为平整，但皮面上残留的小毛较多。当用量为0 4 时，皮面平整，同时皮面 上残留的小毛已较少。当用量增大到0 6 、o ，8 和l 时，皮面上几乎没有残 留有小毛，但皮面已出现明显的褶皱和损坏，而且皮张非常柔软，这说明皮中 的胶原纤维被破坏得较为严重。基于该实验结果，蛋白酶2 7 0 9 的用量应为0 4 。 蛋白酶2 7 0 9 在不同工艺下的脱毛效果不同。当工艺中使用氢氧化钠时，皮 9 四j i l 大学硕上学位论文 的脱毛效果较好，皮面上残留的小毛较少，但整个皮张呈半透明状态，且皮张 非常坚挺，出现制革中称为碱膨胀过度的现象 4 6 , 4 r l 。这说明皮中的胶原被破坏 得较严重。当工艺中使用氢氧化钙时，皮的脱毛效果也较好，皮面上残留的小 毛更少，且皮张较为柔软，粒面清晰、平整，没有出现碱膨胀过度的现象。因 此在脱毛时，氢氧化钙不但有助于脱毛，同时可以抑制皮发生过度膨胀，从而 保护皮中的胶原纤维不被破坏和损失。基于该实验结果，当使用蛋白酶2 7 0 9 脱 毛时，应使用氢氧化钙进行处理。 2 2 2 蛋白酶1 8 9 8 在不同条件下的脱毛效果 ， 蛋白酶1 3 9 8 在不同用量下的脱毛效果不同，其脱毛规律与2 2 1 中蛋白酶 2 7 0 9 在不同用量时的脱毛规律类似。当蛋白酶1 3 9 8 用量在o 8 时，具有较好 的综合脱毛效果。因此，蛋白酶1 3 9 8 的最佳用最应为0 8 左右。 蛋白酶1 3 9 8 在不同工艺下的脱毛效果不同，其脱毛规律与2 2 1 中蛋白酶 2 7 0 9 在不同工艺时的脱毛规律类似。当使用氢氧化钙进行处理时，具有较好的 综合脱毛效果。因此，当使用蛋白酶1 3 9 8 脱毛时，应使用氢氧化钙。 综上所述，当使用蛋白酶1 3 9 8 时，酶的用量为o 8 ；当使用蛋白酶2 7 0 9 时，酶的用量为o 4 。在酶脱毛工艺中应使用氢氧化钙，而不足氢氧化钠。 2 2 3 无硫或少硫脱毛工艺的脱毛效果 在使用无硫或少硫脱毛工艺进行脱毛实验时，实验结果如下： 采用1 # 3 2 艺处理后，皮面清洁、平整，基本上没有小毛残留，表皮基本被 去除，皮张也没有发生过度膨胀的现象。 采用2 拌工艺处理后，皮面较清洁、平整，皮张也没有发生过度膨胀的现象， 但皮面上还是残留有少数小毛和表皮。 采用3 # i 艺处理后，皮面上的毛和表皮基本上未脱除，但在机械作用下可 被去除。 采用4 # i 艺处理后，其脱毛效果与2 # t 艺的脱毛效果基本一致。 采用5 # 3 2 艺处理的皮，其脱毛效果与i # t 艺的脱毛效果基本一致。该工艺 为制革厂常用保毛脱毛工艺。虽然该工艺具有与酶脱毛法相同的效果，但由于 使用了硫化钠，污染较大。 1 0 四j 大学硕士学位论文 进一步分析脱毛液中蛋白质的含量发现，当采用1 撑、2 捍、4 # 蛋白酶脱毛工 艺时，皮张的蛋白质损失率都没有超过传统的脱毛工艺( 工艺5 # ) ，如表2 1 所 示。基于上述实验结果，应采用i # t 艺对原料皮进行预处理。 表z1 原料皮预处理过程中蛋白质损失率 t a b i e2 1e x t e n to fp r o t o i nl o s sd u r i n gp r r t r e a t m e n to fr a wc a l fs k i n 2 2 4 牛皮的物化性质分析结果 采用2 2 3 中t # t 艺预处理原料皮后，其含水量、p h 值和热变性温度( t d ) 见图2 1 和表2 2 。 图2 io s c 测定原料皮预处理后的热变性性质 f i g2 1d e n a t u r et e m p e r a t u r eo fc a l fe k l l la f t e rp r o - t r e a t m e a t d e t e r m i n e db yd s c 四川大学硕士学位论文 2 2 原料皮预处理后的物理化学性质 t a b l e2 2t h ep h y s i c a ia n dc h e m i c a lp r o p e r t j e 8o fc a l fs k i na f t e rp r e - t r e a t m e n t 原料皮经预处理后的热变性温度为4 9 6 。据文献报道，按制革厂常用工 艺预处理后的皮，其热变性温度在5 0 附近【5 0 1 。因此，使用酶法预处理工艺不 会引起皮胶原的破坏。 2 3 结论 ( 1 ) 中性蛋白酶1 3 9 8 和碱性蛋白酶2 7 0 9 可用于原料皮的预处理。其处 理效果( 主要表现为脱毛效果) 与制革厂常用工艺的处理效果相同，而且酶法 处理过程中蛋白质的溶出率较低。 ( 2 )由于酶法处理不使用硫化物，因此比传统预处理工艺更加清洁。同 时酶法预处理将有利于胶原的提取和纯化。 四川大学硕士学位论文 第三章牛皮酶水解动力学的研究 皮胶原中有一部分可用中性盐或稀醋酸溶液提取而溶解出来，这部分称为 可溶性胶原或又称为酸溶性胶原；而大部分以网状胶原纤维形式存在的胶原则 为难溶性胶原，对于难溶性胶原可以通过使用蛋白酶消解端肽和非螺旋区域促 溶的方法进行提取。 酸提取法主要使用醋酸缓冲液提取胶原及其水解产物。但是酸提取法制备 时间较长，且所提取的胶原主要是组织中的可溶性胶原，溶解量很小【5 m ”。碱 提取法制备胶原及其水解产物时，会破坏胶原纤维中含有巯基和羟基的氨基酸， 以及胶原分子内和分子间的交联，同时产物会发生消旋作用。工业制备明胶通 常使用该提取方法【6 l l 。为了提高胶原及其水解产物的溶解量，缩短制备时间， 提高产物的品质，现在一般采用酶提取法或者酸酶结合法。当产物用于生物材 料时，为了保证其具有更好的生物活性和功能性，大都使用酶提取法和酸酶结 合法。酶水解具有专一性好，反应速度快，作用条件温和，环境污染小，提取 的胶原及其水解产物纯度高，水溶性好，理化性质稳定等特点。胶原及其水解 产物的酶法提取可以使用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、5 3 7 酸性蛋白 酶、1 3 9 8 中性蛋白酶、胰酶等【5 ”。 牛皮酶法制备胶原实际上是牛皮在酶作用下的水解过程。在制备胶原的过 程中，酶解过程的控制一直是研究的重点和难点之一，目前还缺乏完整和系统 的研究，这在一定程度上妨碍了其在工业上的应用。目前，关于蛋白质酶解过 程动力学的研究，主要集中在大豆蛋白质为主的植物性蛋白质以及以乳蛋白和 血红蛋白为主的动物蛋白【5 s l 。m a r q u e z 等 s g l 建立了以血红蛋白为底物的碱性蛋 白酶水解动力学模型，t e l l o 等唧l 以乳清蛋白为底物，建立了m p kp r o t c i n a s o 6 6 0 l 、a l c a l a s eo 6 l 及p e m2 5 0 0s 等酶水解动力学模型。而关于酶提取胶原动 力学研究则未见报道。2 0 0 0 年，唐世华等【6 1 1 对明胶酸水解反应动力学和机理进 行了研究。2 0 0 5 年，郑巧东等【6 2 t 建立了胶原蛋白酸解为蛋白多肽的动力学模型。 本章对胃蛋白酶和蛋白酶g c l 0 6 水解牛皮制备胶原的动力学进行了研究，主要 考察了水解温度、酶量和牛皮用量对水解过程的影响，建立了以游离氨基理论 浓度为基础的动力学，初步讨论了两种蛋白酶的水解历程，为工业化酶法制备 牛皮胶原提供参考依据。 1 3 四川大学硕士学位论文 3 1 实验部分 3 1 1 实验材料与仪器 预处理牛皮实验室自制( 制备方法见2 1 7 方案l # ) 胃蛋白酶 9 8 0 0u g ，北京奥博星生物技术有限公司 酸性蛋白酶6 c 1 0 6 2 8 0 0u g ，美国杰能科公司 茚三酮上海三爱思试剂有限公司 甘氨酸上海泊奥生物科技有限公司 其它试剂均为分析纯。 紫外可见分光光度计u v - 2 5 0 1 p c ，日本岛津 3 1 2 水解程度的表征 一般认为在牛皮酶水解制备胶原的过程中，胶原端肽或者非螺旋区域被破 坏，从而使胶原游离出来，同时胶原也可进一步被水解为多肽或氨基酸。通过 测定水解液中游离氨基浓度可以表征水解程度。测定方法如下： 标准曲线的绘制：取0 1 0 0 0 9 干燥过的甘氨酸溶于蒸馏水后定容至l o o m l ， 取出2 o m l 定容至l o o m l ，得到2 0 m g l 的溶液，再取此液稀释成含量为2 2 0 u g m l 的溶液用于标准曲线绘制。分别取2 o m l 稀释液置于试管中，再在试管 中加入1 o o m l 显色剂，混匀后沸水浴中加热1 5 m i n ，然后冷水冷却，加入5 o o m l 4 0 乙醇溶液混匀，放置1 5 m i n ，同时做空白实验，用i c m 比色皿以空白管调零 于5 7 0 m n 处测定吸光