（分析化学专业论文）几种细菌处理cdⅡ、crⅥ及染料直接蓝gl的研究.pdf

摘 要 摘 要 环境中重金属离子的污染不能被降解；而印染废水由于生物降解性差、成分 复杂、色度大、cod 高，这两者是目前对人类威胁最大的污染物。传统物理化 学治理方法费用高、能耗大、易造成二次污染。论文以驯化大肠杆菌、枯草杆菌 等四种常见菌、筛选菌 c-11 为对象，分别对镉离子、六价铬离子、直接蓝 gl 进行吸附脱色研究。具体内容如下： 1 驯化大肠杆菌对 cd(ii)的吸附处理研究 利用生物驯化手段得到对 cd(ii)较强抗性的驯化大肠杆菌， 为评价驯化菌的 吸附性能， 采集天然水体， 不加营养物质， 经过滤灭菌后加镉离子制备模拟水样。 吸附试验结果表明：驯化大肠杆菌比普通大肠杆菌更能适应 cd(ii)的毒性，对 cd(ii)的去除率是普通大肠杆菌 1.4 倍。光学显微镜，tem 表面分析显示了驯化 大肠杆菌的形貌变化， 红外图谱表明， 菌的表面官能团参与了镉离子的去除过程。 2 枯草芽孢杆菌等四种菌对 cr(vi)的还原去毒作用 研究了枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌对 cr(vi)的还原 行为，结果表明，cr(vi)对四种菌具有促进生长和抑制毒害双重作用。比较四种 菌， 枯草芽孢杆菌对cr(vi)的还原效果最好， 能在40h内使1.0 mmoll -1的cr(vi) 达到 96%的转化率。比较还原前后枯草芽孢杆菌体的红外谱图和 x 衍射射线能谱 图可知，菌表面结构和成分保持完整，表明铬离子不是在菌表面被还原，而是在 菌体内被酶还原成 cr(iii)的。菌体的这种生物还原行为,有望消除含 cr(vi)废水 的毒性。 3 染料脱色菌 c-11 对直接蓝 gl 脱色降解特性的研究 从某印染厂排污口的污泥中分离筛选出几株对偶氮染料直接蓝 gl 具有脱色 降解效果的菌株，经分离得到一株对直接蓝 gl 具有较高脱色能力的菌株，命名 为 c-11，初步鉴定为芽孢杆菌属。对 c-11 菌株的脱色特性研究结果表明：c-11 菌株的脱色能力受温度，ph 值，染料浓度影响较大。直接蓝 gl 的最佳脱色条件 是 35，ph 为 7.0，染料浓度为 20mg.l -1，脱色率达到 79%。通过模拟废水处理 试验， 脱色率达到78.73%。 对脱色液进行紫外扫描， 发现直接蓝gl在633和685nm 的吸收峰消失。经 hplc 分析，直接蓝 gl 脱色产物可能是联苯胺。 关键词：镉离子；六价铬离子；直接蓝 gl；驯化大肠杆菌；枯草芽孢杆菌； 关键词：镉离子；六价铬离子；直接蓝 gl；驯化大肠杆菌；枯草芽孢杆菌； c-11；吸附；脱色 ；吸附；脱色 abstract heavy-metal pollutants and dye wastewater have become the most serious problem through out the world and can not be degraded, while dyes usually have complex aromatic molecular structure, which make the wastewater of high cod brilliance and intensity colors and low biodegradability. they are difficult to disposal by conventional physical or chemical treatment process mainly because of its expensiveness, energy-costly and secondary pollution. the domesticated e.coli, bacillus subtitles etc. and bacillus sp. c-11 were discussed in this paper, the bacteria was used for the adsorption of cd (ii), cr (vi) and direct blue gl. the main works are as follows: (1) the removal efficiency of cd (ii) with domesticated bacteria the bacteria was domesticated in the medium by increasing the cd(ii) concentration gradually. the adsorption capacity of domesticated bacteria was investigated in the simulation water. adsorption experiment showed that the tolerance of bacteria to cd (ii) became improvement after domestication. and the removal rate also improved more than 1.4 times. light microscope and tem were applied to investigate the changes of bacteria after domesticated. ft-ir spectra showed that more functional groups had participated in cd (ii) accumulation in the sample. (2) hexavalent chromium reduction by bacillus subtitles etc. activity, the reduction behaviors of cr (vi) with bacillus subtilis, escherichia coli, yeast, staphylococcus aureus were investigated. the experimental results showed that cr(vi) was not only had toxic reduction to four species of bacterium, but also can enhance the growth of the bacterium at cr(vi) condign concentration. among the four species of bacterium, bacillus sp. was the best effective in the cr(vi) reduction, its transformation rate can be improved up to 96% after 40h when the cr(vi) concentration is 1.0 mmoll-1. comparing with the ftir and x-ray spectrograms of bacillus sp. before and after the cr (vi) reduction, the results showed that the structure and component on the surface of bacillus sp. kept invariant. it indicated that the surface of bacillus sp. could not reduce cr (vi). in addition, the cr (vi) can be reduced to cr (iii) by a kind of protease in bacterium. the reduction of bacterium could be used for environmental clean off the cr (vi) toxic in the waste containing cr (vi). (3) decolorization of direct blue gl by bacillus sp. c-11 and catabolite analysis a new bacillus sp. c-11 that was capable to decolorize direct blue gl and was newly isolated from outfall of printing. the decolorization experiment showed that when the optimized ph values was 7.0, the optimized temperature was 35 and the optimized concentration of direct blue gl was 20mg.l-1,the decolorize rate of dye was 79%. by reaching the request of simulated wastewater the decolorized rate of dye was78.73%. when uv-v is spectrum of cr, the adsorption peak at 633 and 685nm vanished. the analysis of hplc showed that the catabolite product of decolorization might be benzidine. key words : cd(ii);cr(vi); direct blue gl; domesticated bacteria; bacillus subtitles; c-11; adsorption; decolorization 中南民族大学硕士学位论文 中南民族大学中南民族大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权中南民族大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1、保密，在_年解密后适用本授权书。 2、不保密。 （请在以上相应方框内打“” ） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 中南民族大学硕士学位论文 1 第 1 章 绪 论 第 1 章 绪 论 1.1 引言 引言 随着电镀、采矿、冶炼、化工、纺织、印染、医药、油漆、合金、造纸、陶 瓷等行业的发展，工农业废弃物和城市生活垃圾的剧增，以及农药和化肥的大量 使用，人类赖以生存的土壤、水体等环境遭受到了严重的重金属离子及各种染料 的污染，并呈加剧趋势，进而在各介质间循环运动，形成对环境的永久性污染， 严重危害了生态平衡。据报道，我国受镉、砷、铬、铅、镍等重金属污染的耕地 面积近2000万公顷，约占总耕地面积的1/51，长江、黄河、珠江和松花江也均有 不同程度的重金属污染，其中黄河某断面总汞含量超标高达100%2。另一重要污 染源是染料，迄今我国可生产的染料已超过1200种，经常生产的染料品种为 700800种3。他们的污染会造成生态环境恶化和农产品品质下降，并严重影响人 体的健康，治理刻不容缓。 由于环境中重金属的污染不被降解，而印染废水最大特点是色度深，传统物 理化学治理方法费用高、能耗大、易造成二次污染，特别是对大面积河流、湖泊、 地下水以及土壤污染的修复困难4。而且染料分子可生化性差、成分复杂、色度 大、cod高，已成为我国各大水域难处理的重要污染源。近年来，环境污染的微 生物修复与检测技术受到了国内外专家学者的广泛关注。微生物具有种类繁多、 分布广泛、表面积大、繁殖速度快和代谢旺盛等特点，在生长代谢过程中不断向 体外分泌小分子有机酸、无机酸和大分子物质，并伴随有死亡解体。微生物本身 及其产生的各种物质广泛参与水体、土壤、矿渣和沉积物的物理、化学和生物学 反应， 它们可改变环境中粘土矿物表面的物理化学特性， 分解矿物或形成新矿物， 降解染料分子，影响诸多污染物的迁移转化5，也可通过对污染物的吸附富集、 氧化还原、成矿沉淀、淋滤、协同植物吸收、共代谢等作用修复污染的环境。 综上所述，利用微生物与重金属或染料相互作用的生物法，在去除这些污染 物时表现出明显的生态效益和经济效益，因此，具有非常广阔的发展前景。 1.2 重金属离子和染料废水的危害 重金属离子和染料废水的危害 1.2.1 重金属离子的危害 重金属离子的危害 重金属是指密度4.0以上的约60种元素或密度在5.0以上的45种元素。环境污 染所指的重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷，也包括 具有毒性的锌、铜、钴、镍、锡、钒等无机污染物。重金属不能被生物降解， 且易与环境中有机物形成毒性强的有机金属盐，大部分被植物，动物吸收和富集 或聚积在水体底部沉积物中 6。植物和动物吸收重金属后通过食物链的作用可使 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 2 生物重金属的富集系数达1000-10000倍 7，造成严重危害。 目前，重金属污染主要由冶金、金属加工、机器制造、有机合成及其它工业 排放的废水引起。另外，大气降尘和雨水对地面的冲刷，都可以使重金属进入江 河湖泊水体， 使水体受到污染。 cd(ii)是一种重要的环境污染物， 具有致癌、 致畸、 致突变作用，对人类健康产生多方面的损伤8，不少研究者还发现cd(ii)可以在人 体许多组织内蓄积9。cd(ii)在人体的肾和肝中蓄积，造成积累性中毒，并可能引 发癌症，cd(ii)在骨髓中积累会引起“骨痛病” ，另外cd(ii)还会在睾丸中积累， 可致睾丸间质细胞癌10。 cr(vi)同样是一种毒性较大的致畸， 致突变剂， 六价铬的毒性是三价铬的100 倍， 它是美国epa公认的129种重点污染物之一。 铬在人体内可以产生明显的积蓄， 造成六价铬中毒11，六价铬的微溶盐还有致癌作用，美国国家职业安全与健康学 会和西德研究委员会先后曾宣布铬酸钙、铬酸锌及铬酸锶为致癌物。 1.2.2 染料废水的危害 染料废水的危害 目前世界染料年产量约为(800-900)103t，我国年产量已达150103t，居世 界前列。印染加工过程中约有10%20%染料随废水排出，进入各种地表水中。这 些废水品种多，成分复杂，毒性大，生物可降解性低，水质水量变化大。废水中 的有机物绝大多数是以苯、萘、蒽、醌等芳香基团作为母体，带有显色基团，颜 色很深，色度达500 500000倍，有很强的污染感12。此外，染料及其中间体往往 含有卤化物、硝化物、氨基物、苯胺、酚类等系列有机物和氯化物、硫化钠、硫 化物等无机盐，增强了水溶性，使物料流失量加大，并产生抗光解、抗氧化、抗 生物降解性，使染料和染料中间体废水的处理难度越来越大。 1.3 重金属离子和染料废水处理技术进展 重金属离子和染料废水处理技术进展 目前国内对重金属离子和染料废水的处理大多还是使用物理化学方法，虽然 具有一定的效果，但是处理低浓度的这类废水时，操作费用和成本相对高。随着 污染的日益严重，开发一种经济、简便、有效的废水处理技术势在必行。而生物 法又以价廉、高效、无二次污染成为废水处理的研究热点13，如好氧处理14、厌 氧处理15,16和好氧厌氧处理17,18等生物法，是目前国内外处理废水主要发展方向 之一。 1.3.1 生物法与传统方法的比较 生物法与传统方法的比较 生物法吸附重金属主要有两个阶段，一是细胞表面的吸附，即胞外多聚物、 细胞壁上的官能团与金属离子结合的被动吸附， 这是一个吸附-解吸附的过程， 被 吸附的离子可被其它的离子、鳌合剂解吸下来。二是细胞表面吸附的金属离子与 金属运输酶相结合而转移到细胞内，包括传输和沉积。非活性的生物主要依靠表 中南民族大学硕士学位论文 3 面吸附，而活性生物两种吸附方式都有。 1.3.1.1 生物法吸附重金属离子的优势生物法吸附重金属离子的优势 生物法应用于治理重金属污染方面具有选择性强， 运行费用低， 适应范围广， 利于重金属回收等诸多优势。方法比较见表 1.119-24 表 1.1 生物法与其它技术用于重金属废水净化的特征比较 table1.1 comparison between biosorption and other treatments of heavy metal wastewater 工艺特点 适应 范围 选 择 性 净化 效率 再生 性能 耐 冲 击 负荷 运行 费用 抗干扰能 力 生物法 广 好 好 较好 弱 低 强 沉淀 窄 差 差 差 强 高 强 离子交换 一般 好 好 较好 弱 一般 弱 活性炭 一般 差 差 一般 弱 一般 强 膜分离 一般 差 差 差 弱 高 弱 蒸发 广 差 差 差 弱 高 强 1.3.1.2 生物法处理染料废水的优势生物法处理染料废水的优势 染料本身具有抗光解、抗氧化、抗生物降解性，一般的物理化学法，处理费 用高，易产生二次污染，而且不适于大规模实际废水处理，也达不到有效脱色的 目的。使用生物法与传统方法比较见表 1.2 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 4 表 1.2 各种染料废水处理方法的比较 table1.2 characteristic comparison with different treatments of dye wastewater 方法 适用范围 优点 局限性 参考 文献 吸附气浮法 阳离子、媒染、 酸性、 水溶性染料 吸附速率快， 脱色效果好 吸附容量小， 二次污染 25-33 混凝沉淀法 水溶性差，不溶 性染料废水 工艺成熟， 效果稳定 二次污染， 费用高 34,35 物理法 膜分离法 结构复杂、分子 量大的染料废水 选择性好， 脱色率高 膜通量低，易 污染，费用高 36-38 电化学法 阴阳离子染料 废水 可生化性好， 脱色率高 二次污染， 费用高 39-42 化学法 氧化法 高浓度染料废水 速度快， 效率高 费用高， 条件苛刻 40 好氧法 广泛 bod 去除 效果好 色度、 cod 去 除率低，需预 处 理 或 后 续 处理 14 厌氧法 偶氮基、蒽醌基、 三苯甲烷基染料 能耗低，甲烷 回收利用 难 以 实 现 染 料的无机化 15,16 生物法 厌氧好氧法 难降解染料 可生化性好 工艺复杂 17,18 1.3.2 生物法所采用吸附生物的种类 生物法所采用吸附生物的种类 国内外关于生物法去除污染物的研究越来越多，而一般去除效率与吸附剂结 构密切相关，微生物是该法常用的吸附剂。目前主要有以下几类，见表 1.3 中南民族大学硕士学位论文 5 表 1.3 污染物转化降解中常用微生物 table 1.3 microorganisms used in biosorption 污染物 种类 微生物 属名或菌名 参考文献 酵母菌 啤酒酵母、假丝酵母、产朊酵母等、 取自啤酒厂或是发酵工业的废菌丝 43,44 霉菌 黄曲霉、米曲霉、产黄曲霉、黄绿青霉、 黑曲霉、芽枝霉、微黑根霉、毛霉属 45,46 藻类 褐藻、鱼腥藻、墨角藻、小球藻、岩衣藻、 马尾藻、节囊叶藻、海带 47,48 细菌 枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌、氰基菌、 生枝动胶菌、脱硫肠杆菌属、黄孢展齿革菌 49,50 金属 功能性 微生物 实验室筛选或诱变，原生质融合或基因工程等 技术组建的高效工程微生物，主要包括细菌、 真菌、藻类等 51-53 细菌 枯草杆菌属、芽孢杆菌属、动胶菌属、光合细 菌、克雷伯氏菌属、浮游球衣菌属、红螺菌属、 转化单胞菌属、醋杆菌属、腐生细菌、欧文氏 菌属、气单胞菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、 黄单胞菌属、产碱杆菌属、埃希氏菌属、沙雷 氏菌属、邻单胞菌属、肠杆菌属 54,55 藻类 普通小球藻、蛋白核小球藻、斜生栅藻、 弱细颤藻 56,57 染料 真菌 黄孢原毛平革菌、绒革盖菌、朱红密孔菌 58-60 1.3.3 生物法的机理 生物法的机理 1.3.3.1 重金属离子吸附转化的机理重金属离子吸附转化的机理 微生物对重金属离子的吸附机理相对复杂，微生物细胞的主要组成成份的差 异导致了它们吸附机理的不同，溶液中的重金属离子的存在状态在一定程度上也 影响着吸附机理。随着生物吸附研究的深入，越来越多的实验结果表明生物吸附 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 6 是多种吸附机理共同作用的结果61。如表面络合、离子交换、静电吸附、氧化还 原、酶促机理、微沉积等62,63。 1)配位作用 微生物细胞壁表面基团，细胞分泌的多糖、蛋白质、核酸、氨基酸等生物大 分子都能与重金属离子形成配位化合物或鳌合物64，吸附溶液中金属离子。 2)离子交换机理 在吸附的过程中重金属离子与吸附剂表面的 k+， ca2+ ，mg2+等发生离子交 换65。目前的研究表明，交换下来的离子总量与金属离子吸附的总量相比只是很 小的一部分，说明离子交换并非主要吸附机理。 3)静电吸附作用 kuyucak 等人研究中发现，较低的 ph 条件下，漂浮马尾藻能选择性地吸附 金，它通过静电吸附作用使金沉积在细胞表面。静电吸附作用已被证明是微生物 吸附各种金属离子的主要原因66。 4)胞内积累 研究发现金属离子的积累与细胞的代谢活性有直接的关系，金属首先通过物 理、化学作用吸附在细胞表面65，再由依赖能量的转移系统运送到胞内。代谢抑 制剂如二硝基苯、五氟苯酚、叠氮化钠等会使细胞失去吸附能力。说明吸附过程 包括一个金属离子与细胞的被动结合过程和一个依赖能量的转移过程。 5)氧化还原作用 变价金属离子，如 cr（）能在具有还原能力的生物体上吸附，有可能发生 氧化还原反应，以丙酮酸、甲酸或 h2等作为电子供体，而无其它辅助因子存在的 条件下的吸附金属离子61。 7)无机微沉淀 重金属离子能在细胞壁上或细胞内形成无机微沉淀，以磷酸盐、硫酸盐、碳 酸盐或氢氧化物等形式通过晶核作用在细胞壁上或细胞内沉淀下来67。 8)酶促机理： 非活性和活性的生物都能吸附重金属，活性细胞对其的吸附可能与细胞上的 某种酶的活性有关。 1.3.3.2 染料降解脱色机理染料降解脱色机理 一般认为生物法脱色主要有两种机理起作用：吸附和降解，以降解为主63， 在吸附过程中，染料分子和微生物间同时存在多种作用力，如范德华力、形成氢 键、静电吸引、疏水基团间相互作用以及配位基交换和形成化学键等。在吸附过 程中，这些作用力的作用方式取决于具体的菌种和染料，以及作用过程的条件和 环境。 辛宝平64认为吸附菌对染料的吸附属于物理吸附，而不是选择性的化学吸 中南民族大学硕士学位论文 7 附，并推论出它们间的作用属于疏水基团相互作用。张志杰和glenda b.mzchaels 等的实验证明，染料降解的分为两个阶段：一是染料分子的迁移转化，即染料吸 附到菌体上，部分透过细胞膜进入细胞体内；二是在染料的诱导下，合成催化氧 化还原染料的酶，如偶氮还原酶68、phanerochaete chrysosporium胞外过氧化物酶 系、过氧化物酶等，通过氧化、还原、合成等过程破坏不饱和共轭体系，将其降 解成简单的无机物，达到脱色的目的，中间产物进一步氧化还原分解并最终分解 为co2和水或转化为细菌所需的营养物质，组成新的原生质。 1. 4 课题意义及研究内容 课题意义及研究内容 对重金属离子的吸附，目前生物法主要分为活细胞吸附与死细胞吸附二种。 活细胞吸附分二个阶段，第一阶段与代谢无关,为生物吸附过程，进行较快,在此 过程中,金属离子吸附至细胞表面；第二阶段为生物蓄积过程，进行较慢,在此过 程中,金属被运送至细胞内。 而死细胞吸附主要是依靠死细胞表面官能基团对重金 属离子的物理或者化学吸附进行吸附作用。目前，国内外大多采用生物吸附法处 理重金属，为提高吸附性能，该法通常需要对微生物进行预处理，如酸化、碱化、 交联、化学修饰等，既增加成本，又可能产生二次污染，更为后续处理带来困难。 活性微生物因其分布广，繁殖快等特点越来越多的被用于处理重金属离子。 有些研究69结果也证明活体和死体微生物对 cu(ii),pb(ii),zn(ii)与 cd(ii)具 有相似的吸附能力。对 cd(ii)的吸附实验中，选用埃希氏大肠杆菌为驯化对象， 希望通过逐步增加培养基中 cd(ii)的浓度， 使微生物适应 cd(ii)环境， 提高其对 cd(ii)的耐受力。以期为污水处理提供较为迅速、可控制的处理方法。对 cr(vi) 还原处理中，采用四种环境中普通的微生物作为生物吸附剂，研究不同菌类在生 态环境中生物还原 cr(vi)的应用有重要意义。 对染料废水处理，微生物在染料脱色方面的研究已经积累相当丰富的资料 70-73，而且还筛选培养了许多用于染料脱色的微生物74。然而单菌株对染料的降 解效果不够理想，而且其作用对象的种类也非常有限。本实验选择偶氮染料直接 蓝 gl 作为脱色对象，利用生物手段筛选出对直接蓝 gl 具有特殊脱色能力的菌 株，并对其脱色能力进行研究。 本文利用几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及直接蓝 gl，具体工作如下： 将普通大肠杆菌在含镉离子的培养基中进行驯化， 使大肠杆菌发生应急反应， 对 cd(ii)的耐性增加， 吸附 cd(ii)的能力也提高。 南湖排污口所取得污水加入定 量的镉离子配置成模拟废水，利用驯化大肠杆菌去除模拟水样中的 cd(ii)。并初 步探讨吸附机理。 采用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、面包酵母菌、金黄葡萄球菌这四种常见菌对 六价铬离子进行吸附试验，并利用细菌的活性将高毒性的六价铬离子还原成低毒 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 8 的三价铬离子。对比四种菌吸附还原六价铬离子的能力，分析六价铬离子对细菌 生长的影响，并探讨细菌还原六价铬离子的机理。 从印染厂排污口污泥中取得菌种，通过生物筛选得到一株对直接蓝 gl 具有 脱色效果的菌株，命名为 c-11。经过活化培养，利用此菌对直接蓝 gl 进行脱色 反应研究，并对脱色产物进行了初步鉴定。 中南民族大学硕士学位论文 9 第 2 章 驯化大肠杆菌对 cd(ii)的吸附处理研究 第 2 章 驯化大肠杆菌对 cd(ii)的吸附处理研究 2.1 引言 引言 镉离子是公认的对生态环境有很大危害的重金属污染物，主要来自电镀厂， 冶金厂，化工厂、合金制造、电镀、陶瓷等行业的工业“三废”75。如果含镉的 废水不经过处理就排到自然环境中，将严重威胁人类赖以生存的地下水和地表水 76。水体中重金属离子的去除，主要依靠水体的自净功能，除稀释、沉降、扩散 等物理作用及氧化、还原、分解、凝聚等化学作用，最重要的是生物作用，因为 水中大部分有机物需经生物氧化分解而得到降解与去除。而在水体自净过程的各 类生物中，细菌最为活跃，它对无机离子或有机物的去除及降解速度比其他生物 快若干倍，因此，细菌的活动是改变水质的主要原因。 本章通过驯化普通大肠杆菌，使其对镉离子的耐受力增强，并研究驯化菌的 生长及吸附行为，在含 cd(ii)的模拟水样中，对驯化菌的去除性能进行评价，讨 论了水样中 cd(ii)浓度及作用时间对去除率的影响， 分析了驯化菌在 cd(ii)的去除 过程中的官能团的变化。 2.2 实验部分 实验部分 2.2.1 仪器与材料 仪器与材料 2.2.1.1 仪器仪器 nexus 470智能型傅立叶红外光谱仪（美国，nicolet公司） ；aa-6300型原 子吸收光谱仪（日本岛津） ；721分光光度计（上海第三分析仪器厂） ；tgl-16g 离心机（上海安亭科学仪器厂） ；hya 恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂)； pipette 微量取液器(上海金花)； 医用高压灭菌锅 （江苏昆山仪表厂） ； sw-cj-ib （v）单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司） 。 2.2.1.2 菌种菌种 普通大肠杆菌（escherichia coli.） （cctcc ab 91097） ；驯化大肠杆菌 （本实验室培养） 2.2.1.3 水样水样 南湖排污口取水样，过滤，灭菌，冷藏待用 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 10 2.2.1.4 培养基培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，nacl 5.0 g， 蒸馏水 1000 ml，调 ph 至 7.6 ，121高压灭菌 20min。 驯化培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入适量浓度的 cd(ii)。 2.2.2 实验方法 实验方法 2.2.2.1 大肠杆菌的驯化试验大肠杆菌的驯化试验 取2ml大肠杆菌菌液加入到驯化培养基中，35，180rpm振荡培养，培养直 至生长周期完成，即为驯化第一代的大肠杆菌。第二代驯化即取第一代大肠杆菌 对数生长期的菌液2ml，接入含cd(ii)浓度更高的培养基中培养，依次驯化得到第 三代。培养的代数与每代的cd(ii)的浓度见表2.1： 表 2.1 培养的代数与每代的 cd(ii)的浓度 table 2.1 generation and concentration of cd(ii) for e.coli during domestication 驯化的代数 第一代 第二代 第三代 培养基中cd(ii) 的浓度 0.5 2.0 5.0 mmoll-1 2.2.2.2 镉离子去除试验镉离子去除试验 镉离子去除试验采用模拟水样测试，模拟水样为南湖排污口所取水样加入适 量 cd(ii)配置而成，大肠杆菌及驯化大肠杆菌直接加入模拟水样，不额外加入营 养物。 2.3.2.3 生长度的测量生长度的测量 大肠杆菌及驯化大肠杆菌生长量采用浊度法测定，浊度法是光线通过微生物 菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定范围内，微 生物细胞浓度与透过度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由分光 光度计测出77。以水样为参比，在 600nm 处测菌悬液的浊度（od）值 2.3.2.4 cd(ii)浓度测定浓度测定 cd(ii)浓度采用火焰原子吸收法测定。 cd(ii)去除率 q q = ( co ce) / c0 100%； 式中，c0水样中初始 cd(ii)浓度（mmol l-1) ；ce细菌吸附后水样中的 cd(ii)浓 度(mmol l-1) 中南民族大学硕士学位论文 11 2.3 结果与讨论 结果与讨论 2.3.1 大肠杆菌与驯化大肠杆菌的电子显微镜图与 tem 图 大肠杆菌与驯化大肠杆菌的电子显微镜图与 tem 图 图 2.1 大肠杆菌和驯化大肠杆菌的电子显微镜图片(100) fig 2.1 microscope picture of e.coli and domesticated e.coli a: e.coli b: domesticated e.coli 图 2.2 大肠杆菌和驯化大肠杆菌的 tem 图片(1700) fig 2.2 tem graph of e.coli and domesticated e.coli a: e.coli b: domesticated e.coli 图 2.1 是大肠杆菌与驯化大肠杆菌的电子光学图片，图中显示驯化前后，大 肠杆菌的个体形状变化不大，呈杆状或圆柱状，但是驯化后的菌体表面有光晕状 物质产生，为进一步观察其形貌，采用高放大倍数的 tem 对其进行表征，结果 见图 2.2。未驯化细胞表面光滑饱满，细胞生长状态良好，大多数菌体分散存在， 而驯化大肠杆菌表面由于细胞分泌的壳聚糖等生物分子使细胞粘结程度增加78， 有局部的胞膜瓦解并存在较多块状裂片。细胞基本形状没有变化，但个体边界模 糊。可能是镉离子与大肠杆菌细胞壁表面的多聚糖，蛋白质及酰胺等生物大分子 结合，形成针状芒刺效果；同时大量高毒性的镉离子进入细胞内部，对胞内的大 分子产生了破坏作用，进而破坏细胞结构，引起细胞破碎79。 a b a a b 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 12 2.3.2 大肠杆菌与驯化大肠杆菌在不同浓度 cd(ii)中的生长 大肠杆菌与驯化大肠杆菌在不同浓度 cd(ii)中的生长 cd(ii) 是有毒金属离子，但是实际水体中其含量很低，故模拟水样中加入 cd(ii)，使 cd(ii)浓度分别为 0.1、0.2、0.5、1.0 mmoll-1。驯化大肠杆菌与大肠 杆菌在不同 cd(ii)浓度的模拟水样中的生长情况见图 2.3。 020406080100120 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 大肠杆菌 4 3 2 1 生长 量/od 时 间/h 020406080100120 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 驯 化大肠杆菌 4 3 2 1 生长 度/od 时 间/h 图 2.3 驯化大肠杆菌与大肠杆菌在不同浓度的cd(ii)水样中培养的生长度曲线 fig.2.3 the growth curve of e.coli and domesticated e.coli incubated at different concentration of cd(ii) the concentration of cd(ii)，1-4 ： 0.1，0.2，0.5，1.0 mmoll-1 细菌随水样中cd(ii)浓度增加，生长速率降低，细菌生长量也逐渐减少，这是由 于cd(ii)对大肠杆菌的毒性导致的；而除了cd(ii)浓度为1.0 mmoll-1时，驯化大 中南民族大学硕士学位论文 13 肠杆菌在相同cd(ii)浓度的水样中，菌体的生长量是普通大肠杆菌的两倍左右， 表明驯化大肠杆菌生长增值更快，这充分说明了，驯化大肠杆菌比普通大肠杆菌 更能适应cd(ii)的毒性，具有更强的耐毒性，能获得更多的细菌量，从而增大了 吸附面积，可能因此获得更好的吸附效果。 2.3.3 驯化大肠杆菌对水样中 cd(ii)的去除 驯化大肠杆菌对水样中 cd(ii)的去除 图 2.4 驯化大肠杆菌与大肠杆菌在不同浓度的 cd(ii)水样中的去除率曲线 fig.2.4 the adsorption rate curve of e.coli and domesticated e.coli incubated at different concentration of cd(ii) the concentration of cd(ii)，1-3 ： 0.1，0.2，0.5 mmoll-1 020406080100120 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 大肠杆菌 3 2 1 去除率/% 时 间/h 020406080100120 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 驯 化大肠杆菌 3 1 2 去除率/% 时 间/h 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 14 驯化大肠杆菌与未驯化大肠杆菌对不同 cd(ii)浓度的水样的去除率曲线见图 2.4， 将图中所得数据列于表 2.2。根据表中数据，可以看出对 cd(ii)最大去除率均在 细菌的稳定生长期，随着细菌的继续生长，进入衰亡期去除率有所下降，这可能 是随着细菌的死亡，有一部分吸附的 cd(ii)被重新释放到了水样中。 表 2.2 驯化大肠杆菌与大肠杆菌对不同水样中 cd(ii)的去除率及所需时间 table 2.2 the adsorption rate and time of e.coli and domesticated e.coli incubated at different concentration of cd(ii) 0.1 mmoll -1 0.2 mmoll -1 0.5 mmoll -1 最大 去除 率（%） 时间 （h） 最终 去除 率（%） 最大 去除 率（%） 时间 （h） 最终去 除率 （%） 最大 去除 率（%） 时间 （h） 最终 去除 率（%） 驯 化 大 肠杆菌 81.4 50 48.2 78.6 72 66.4 66.0 30 42.2 大 肠 杆 菌 56.4 48 34.0 42.2 60 30.0 比较驯化大肠杆菌与普通大肠杆菌的去除率数据， 发现驯化大肠杆菌对cd(ii) 的去除率要高于普通大肠杆菌，在三种梯度cd(ii)浓度水样中驯化菌均有较高的 最大去除率，并能在细菌生长的大部分时间都有较高的去除率80。而普通大肠杆 菌虽然在低浓度cd(ii)水样中有一定得去除率，但是在cd(ii)浓度大于0.5 mmoll-1的水样中，几乎没有吸附效果。这说明大肠杆菌经过前期驯化81，在含 cd(ii)水样中的生长过程中能释放出更多的多聚糖，蛋白质及酰胺等生物大分子， 使得对cd(ii)离子的吸附和储存能力大为增强， 从而加大了驯化大肠杆菌对cd(ii) 离子的去除率。 2.4.4 驯化大肠杆菌的红外表征 驯化大肠杆菌的红外表征 为深入了解驯化大肠杆菌对cd(ii)的吸附机理， 对吸附cd(ii)前后的驯化菌表 面进行红外光谱分析。 中南民族大学硕士学位论文 15 4000350030002500200015001000500 0 20 40 60 80 100 1541 1539 1390 1397 1079 1067 2927 2930 3407 3323 2 1 t/% wavenumber/cm -1 图 2.5 驯化大肠杆菌吸附 cd(ii)前后的红外图谱 fig.2.5 ftir spectra of domesticated e.coli before and after the absorb of cd(ii) 1：before the absorption of cd(ii)；2：after the absorption of cd(ii) 由图2.5中两条红外光谱曲线对比可知，驯化大肠杆菌吸附cd(ii)后3323、 1390、1067 cm-1处的吸收峰分别位移到3407、1397、1079 cm-1处，此三处吸收峰 对应归属为o-h,n-h吸收峰、羧基的对称伸缩振动峰82、磷酸二酯基团的对称和 反对称伸缩振动峰83。由此可知，驯化大肠杆菌主要是-oh，-cooh，-nh2等官 能团参与了水样中镉离子的去除反应，而磷酸二酯基团的对称和反对称伸缩振动 峰的位移则说明菌体中的核酸也参与了吸附反应84。 2.5 小结 小结 南湖排污口所取污水加入定量的cd(ii)配置成含cd(ii)浓度为0.1，0.2，0.5， 1.0 mmoll-1的水样。 利用驯化大肠杆菌对cd(ii)的强耐毒性和去除率对水样进行 处理，结果发现，在水样中驯化大肠杆菌的生长量是未驯化大肠杆菌的两倍，对 cd(ii)的去除率也远高于未驯化菌， 并能保持较长时间的去除效果。 对驯化菌吸附 cd(ii)前后的菌体的红外光谱分析表明，在去除cd(ii)时，主要是菌表面的-oh， -cooh，-nh2参与吸附反应，另外菌体中的核酸也有一定的吸附作用。 几种细菌处理 cd(ii)、cr(vi)及染料直接蓝 gl 的研究 24 第4 章 染料脱色菌第4 章 染料脱色菌 c-11 对直接蓝对直接蓝gl脱色降解特性 的研究 脱色降解特性 的研究 4.1 引言 引言 随着染料与印染工业的发展， 生产过程中产生废水,因其具有盐度高、 色度深、 组分复杂、 化学稳定性高、 生物可降解性低等特点,成为当前最主要的水体污染源 之一。而染料按化学结构可分为: 偶氮染料、蒽醌染料、靛旋染料、硫化染料、 菁染料、 三芳基甲烷染料和杂环染料99 。偶氮染料由于其化学稳定性高, 毒性强, 一直是废水处理中的难点，并成为染料化工污染治理的重中之重, 研发并应用高 效、经济的处理技术已经成为当务之急。染料废水通常用物理或化学方法处理, 如絮凝沉淀、吸附、离子交换、超滤、渗析、化学氧化、光氧化、电解、萃取法 等100。物化法存在耗药量大，运行费用大, 污泥量大等不足。而生物法具有操作 方便和处理费用低等优势, 在一定程度上克服了物化法的缺点,被认为是一种经 济有效的处理方法，并成为去除这类污染物的研究热点。 生物法处理染料废水多采用活性污泥法，而传统的活性污泥系统已证明并不 能有效地去除难降解的染料及其化合物101 目前，国内外许多学者应用细菌或真 菌等微生物开展了难降解有机污染物的生物降解实验研究102-104。但是降解结果 并不如人意。因此, 有必要分离筛选出一些对某种偶氮染料具有专属脱色能力的 菌株并对其性能进行研究。基于此目的，我们