（制糖工程专业论文）罗汉果活性组分的微波提取及分离纯化的研究.pdf

摘要 摘要 罗汉果是广西特产罗汉果属植物 s i r a i t i ag r o s v e n o r i i ( s w i n g l e ) 的果实。本论 文对罗汉果中具有药效的成分罗汉果皂苷的微波辅助提取及其大孔树脂吸附分离 过程进行系统的研究，制得了比较纯的罗汉果皂苷产品，建立了其分离纯化过程 的动力学方程和吸附透过曲线方程，提出了分离和分析目标产物的简化方法。主 要研究内容与结果如下： 1 微波辐射对罗汉果有效成分浸取的作用及浸取条件的优化 在微波萃取系统中，通过单因素实验和二次回归旋转正交组合实验，确定了 微波辐射条件下不同的物理参数( 辐射功率、辐射时间、溶剂量等) 对提取率的 影响，优化的微波辅助提取最适工艺条件是：乙醇浓度4 0 ；微波辐射功率4 9 5 w ； 辐射时间6 m i n ；提取压力0 1 m p a ；原料粉碎度1 0 0 目；固液比1 ：3 0 。在此条件 下，罗汉果皂苷一次提取率可达7 6 。 2 罗汉果有效成分的吸附分离 以a b 一8 大孔吸附树脂对罗汉果皂苷溶液的吸附体系为研究对象，对罗汉果 皂苷的吸附平衡和吸附动力学进行了研究，并与对色素吸附性能较好的a d s 一7 树 脂柱串联使用，进行吸附一洗脱实验，收集到一组分a 。 3 罗汉果提取物的纯化 采用薄层层析色谱和制备高效液相色谱对组分a 进行纯化，研究确定，硅胶 薄层色谱法的最佳展开剂配比为正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：l ：2 ；而制备高效液相色 谱法的色谱条件为：o d s 柱( 巾2 0 n m a x 2 5 0 m r a ) 、流动相为3 0 甲醇、流速为8 m l m i n 、 检测波长为2 1 0 r i m ，按峰分步收集。经薄层色谱和高效液相色谱纯度鉴定，得到三 个组分a 1 、a 2 和a 3 。 4 罗汉果提取物的分析 对所使用的大孔树脂中单体残留物及提取物中的单体残留物进行了测定。结 果表明，所使用的大孔树脂及罗汉果提取物中均未有单体残留物检出。同时，采 用u v 、f t i r 和e s i m s m s 对三个组分进行分析。确定组分a 1 是罗汉果醇一3 0 一【3 一d 葡萄吡喃糖基( 1 6 ) b d 葡萄吡喃糖苷】2 4 一o d d 一葡萄吡喃糖基( 1 2 ) 一b d 葡萄吡喃糖苷】；组分a 2 是罗汉果醇一3 一o 一【b d 一葡萄吡喃糖基( 1 6 ) 一b d 一葡萄 吡喃糖苷】2 4 一o b d 一葡萄毗喃糖基( 1 2 ) 】一 b d 一葡萄吡喃糖基( 1 6 ) 】一b d 一葡 萄毗喃糖苷 ；组分a 3 是罗汉果醇3 一o 一 0 d 一葡萄吡喃糖基( 1 6 ) 一b d 。葡萄毗喃 糖基( 1 2 ) b d 葡萄吡喃糖苷】一2 4 - o 一 b d 一葡萄吡喃糖基( 1 2 ) 】_ 【b d 一葡萄吡喃 糖基( 1 - 6 ) b d 一葡萄吡喃糖苷 。 华南理工大学工学博士学位论文 5 微波对罗汉果提取物中组分变化的影响 通过凝胶过滤色谱法，对微波作用下罗汉果提取物中组分的变化进行了研究 并对提取物中各组分的甜度及其对变形链球菌致龋的影响作比较研究。 关键词：罗汉果；三萜皂苷；微波；吸附动力学；凝胶过滤色谱 a b s t r a c t c h i n e s em e d i c i n el u o h a n g u o ，t h ef r u i t so fs i r a i t i ag r o s v e n o r i i ( s w i n g l e ) i sas p e c i a l a g r i c u l t u r a lp r o d u c ti ng u a n g x ip r o v i n c e t h ee x t r a c t i o no f a c t i v ec o n s t i t u e n t ，t r i t e r p e n o i d s a p o n i nf r o ml u o h a n g u ob ym i c r o w a v e - a s s i s t e da n da d s o r p t i o ns e p a r a t i o np r o c e s sw i t h m a c r o p o r o u sr e s i n s w e r ei n v e s t i g a t e da n ds o m es a p o n i n sw e r eo b t a i n e d t h ea d s o r p t i o n k i n e t i c se q u a t i o n sa n d a d s o r p t i o nb r e a k t h r o u g hc u r v e se q u a t i o n sf o rt h ea d s o r p t i o ns e p a r a t i o n p r o c e s sw e r ed e t e r m i n e d as i m p l e m e t h o df o r s e p a r a t i o na n da n a l y s i so b j e c tc o m p o n e n t sw a s a d v a n c e d t h er e s e a r c hw o r ka n d e x p e r i m e n tr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1m i c r o w a v ei r r a d i a t i o no nt h ea c t i v ec o n s t i t u e n ti nl u o h a n g u oa n dt h eo p t i m i z a t i o no f e x t r a c t i o nc o n d i t i o n s b yt h e m i c r o w a v el a b o r a t o r y s y s t e m s ，t h r o u g hs i n g l e f a c t o re x t r a c t i o nt e s t sa n d r o t a t i o n a lo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h ei n f l u e n c e so f m a j o r f a c t o r s ( a v e r a g em i c r o w a v eo u t p u t p o w e r , i r r a d i a t i o nt i m e ，s o l v e n ta m o t m te t c ) o ni m p r o v e m e n to f e x t r a c t i o nb ym i c r o w a v e i r r a d i a t i o nw e r es t u d i e d t h es u i t a b l ee x t r a c t i o nc o n d i t i o nw a sg i v e na s4 0 a q u e o u se t h a n o l ， 4 9 5 w a v e r a g em i c r o w a v eo u t p u tp o w e ri r r a d i a t i n gf o r6m i n ，p r e s s u r eo 1 m p a ，g r i n d i n g d e g r e e1 0 0m e s ha n dw i t h t h e1 ：3 0r a t i oo fs o l i dm a t e r i a l st os o l v e n t s t h ee x t r a c t i o nr a t eo f a c t i v ec o n s t i t u e n tc o u l du pt o7 6 2 a d s o r p t i o ns e p a r a t i o no f a c t i v ec o n s t i t u e n t i nl u o h a n g u o t h ea d s o r p t i o n e q u i l i b r i u m a n dk i n e t i c sf o r t r i t e r p e n o i ds a p o n i nw e r e s t u d i e da n d m a c r o p o r o u sr e s i n a b 一8w a su s e da sa l la d s o r b e n t i n a d s o r p t i o n - d e s o r p t i o n ，t h ea b - 8 m a c r o p o r o u s r e s i na n dt h ea d s - 7r e s i nw i t h h i g ha d s o r p t i o np i g m e n t sc a p a c i t yw e r ei ns e r i e s f r a c t i o naw a so b t a i n e d 3p u r i f i c a t i o no f t h ee x t r a c t s t h ec o m p o n e n taw a sp u r i f i e dw i t ht l ca n dh p l c i tw a ss h o w nt h a tt h eb e s t d e v e l o p i n gr e g e n t o fs i l i c a g e lp l a t e w a sn b u t t o a n o l - c h 3 c o o h - w a t e r ( 4 ：l ：2 ) t h e r e s e r v e d - p h a s e h p l cw a s p e r f o r m e d a ta m b i e n t t e m p e r a t u r e o l lo d sc o l u m nf 由 2 0 m m 2 5 0 m m ) u s i n g i s o c r a t i cr u n s t h em o b i l e p h a s ew a s3 0 a q u e o u s m e t h a n o la taf l o w r a t eo f8 m l m i n t h ed e t e c t i v ew a v e l e n g t hw a s2 1 0 n m t h r e ec o m p o n e m sa 1 ，a 2a n da 3 w e r e p u r i f i e d 4 a n a l y s i s o ne x t r a c t s t h er e s i d u eo fb e n z e n ei nm a c r o p o r o u sr e s i n sa n de x t r a c t sw e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t s s h o w nt h a tt h e r ew a sn o t a n y t h er e s i d u ei nm a c r o p o r o u sr e s i n sa n de x t r a c t s t h es t r u c t u r e so f t h et h r e ep u r i f i e dc o m p o n e n t sw e r ea n a l y z e db yu v f t m , e s i m s - m s t h es t r u c t u r e si n m 华南理工大学工学博士学位论文 t h r e e c o m p o n e n t s w e r ed e d u c e da s m o g r o l 一3 一o 一【b - d g l u c o p y r a n o s y l ( 1 6 ) 一b d g l u c o p y r a n o s i d e 一2 4 - o - 【b d g l u c o p y r a n o s y l ( 1 - 2 ) 一1 3 一d g l u c o p y r a n o s i d e ，m o g r o l 一3 一o - 【1 3 _ d g l u c o p y r a n o s y l ( 1 6 ) 一1 3 一d g l u c o p y r a n o s i d e - 2 4 - o 一 【t 3 一d - g l u c o p y r a n o s y l ( 1 2 ) 】一【p _ d 。g l u c o p y r a n o s y l ( 1 _ 6 ) 1 一b d g l u c o p y r a n o s i d e ，m o g r o l 一3 - 0 吖s d g l u c o p y r a n o s y l ( 1 6 ) b - d 。g l u c o p y r a n o s y l ( 1 2 ) 一0 一d - g l u c o p y r a n o s i d e 一2 4 o 一 【0 一d g h r c o p y r a n o s y l ( 1 2 ) 1 【s - i ) 一g l u c o p y r a n o s y l ( 1 6 ) 1 一b d 一掣u c o p y r a n o s i d e 。 5i n f l u e n c eo f m i c r o w a v ei r r a d i a t i o no nt h e c o m p o n e n t so f e x t r a c t s n f l u e n c eo fm i c r o w a v ei r r a d i a t i o n0 1 1t h ec o m p o n e n t so f e x t r a c t sw a ss t u d i e dw i t hg e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y a n dac o m p a r i s o nw a sm a d ea m o n g 也et h r e ec o m p o n e n t sf o r s w e e t n e s sa n dt h e a n t i - c a r i o g e n i c i t y t os m u t a n t s k e yw o r d s ：l u o h a n g u o ；t r i t e r p e n o i ds a p o n i n ；m i c r o w a v e ；a d s o r p t i o nk i n e t i c s ；g e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进 行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：豢泊棣j 日期：沙3 年驴月刃日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于， 不保密口彳 ( 请在以上相应方框内打“”) 誓嘉蓁茎! 乳导师签名：莓翟岛 新秒匕 日期：硼3 年二月明日 日期：年g 月吵日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 罗汉果及其医疗保健作用 罗汉果属葫芦科( c u c u r b i t a c e a e ) 植物，其学名为s i r a i t i ag r o s v e n o r i i ( s w i n g l e ) c j e f f r e y 或m o m o r d i c ag r o s v e l z o r is w i a g l e 。藤本、多年生宿根，有地下块茎i 叶互生、卵圆形，先端尖细：其果实圆形、卵圆形，表面有绒毛：多分布于我国 华南地区，生长在气候凉爽且昼夜温差明显、雾气多、富含松软腐质的山坡斜面 上；罗汉果同属的植物共有七种，我国共有四种，其中两种入药：罗汉果、翅子 罗汉果。罗汉果雌雄异株，开花期是每年的6 8 月，结果期8 一l o 月，果实成熟 期9 1 1 月2 1 。 罗汉果是我国广西特产的药用植物，已有二百多年的栽培历史。在岭南采 药录中就有记载：“果实昧甘，理痰火咳嗽，和精肉汤服之。”罗汉果作为民间 药用植物，药用部位为其果实。以形圆、个大、坚实、摇之不响，色黄褐者为佳。 迄今为止，对罗汉果的药用机理的研究报告尚为少见，但我国民间使用罗汉果作 中草药治疗百日咳、慢性气管炎、咽喉炎、胃肠疾病有明显效果。我国民间总结 出罗汉果具有润肺止咳、凉血、润肠通便等药效旧】。罗汉果除了作药用之外，还 可以加工制成各种饮料。把罗汉果干果实捣碎放入茶壶，加水，煮沸2 0 3 0 r a i n ， 果实中许多有效成分溶解到水中，趁热饮用独特的香甜味，可以消除疲劳。目前， 罗汉果已被国家卫生部确定为“既是药品又是食品”的极具开发潜力的天然产物 资源之一，受到人们广泛关注m j 。 国外对罗汉果的研究始于1 9 7 5 年。美国人l e ec h i h o n g 碡1 将罗汉果的5 0 乙 醇提取物经s e p h a d e x g - 2 5 柱处理，然后用制备薄层色谱法分离，得到一种甜味为 蔗糖的1 5 0 倍非糖物质，推测其结构为三萜皂苷。1 9 7 7 年日本人竹本常松开始对 罗汉果进行了一系列的研究 6 4 j ，测定其游离糖份不是葡萄糖，而是果糖，含量约 1 4 ，并分离出了纯的罗汉果皂苷，含量约1 ，其甜味比蔗糖甜3 0 0 倍，是罗汉 果中的主要甜昧成分。 罗汉果作为中国民间的中草药及保健物质已有很长的历史了。近年有实验表 明，用罗汉果热水萃取物给试验小白鼠投喂，5 0 致死率的使用量，每k g 体重摄 入干果量为1 0 9 k g 。由于罗汉果中产生甜味的主要成分是罗汉果皂苷类化合物， 因此，可以推断，食用含有罗汉果皂苷类物质的罗汉果饮料具有较高的安全性。 现代医学证明，罗汉果中还含有多种s c a v e n g e r ( 净化剂) 物质，能有效地消 除人体内的活性氧，又称自由基【9 】。这种具有不配对电子的自由基非常活跃，它 会从其他物质上夺来1 个电子配成电子对，为了争夺电子，它会攻击构成生物膜 华南理工大学工学博士学位论文 及组织的脂质、蛋白质等，造成损伤和变性，引起种种疾病，如癌症、高血压、 生理性疼痛、白内障、胃炎、溃疡、便秘、湿疹等。罗汉果能够清除人体内的活 性氧，故能防治和辅助治疗这些疾病。 7 0 年代以来，随着国外学者对罗汉果皂苷的探索与研究，国内一些科研单位 也相继开展了这方面的工作。陈迪华等h 0 、李俊等1 以及李雁群等1 2 1 对罗汉果 皂苷的提取分离进行了一系列的研究。近年来，人们对罗汉果中的强甜味物质三 萜皂苷开始重视，不仅作为甜味剂来研究，而且对它的药理也开始重视。罗汉果 三萜皂苷的发现，成为糖尿病患者理想的甜味物质。但是，国内目前还没有成熟 的能大批量生产优良品质的罗汉果皂苷的报道。 1 2 罗汉果中的主要营养成分及营养价值 罗汉果的果实和叶均含有罗汉果三萜皂苷，还有大量的果糖、十多种人体必 需氨基酸、脂肪酸、黄酮类化合物、维生素c 、微量元素等【l3 1 。罗汉果皂苷作为 罗汉果甜味剂的主要成分，是一种具有甜味的三萜烯葡萄糖苷，其配糖苷元是三 萜烯醇。 1 葫芦素烷三萜类 这类化合物是罗汉果中主要有效成分，它们有共同的苷元结构。罗汉果中这 类物质除少数外，均为甜味物质或微甜物质。其中罗汉果苷v ( m o g r o s i d e v ) 是 主要的甜昧成分，它无毒、低热量、高甜度、热稳定性好，是作为天然甜昧剂开 发的物质之一。 2 蛋白质、氨基酸 罗汉果干果中含蛋白质7 1 7 8 【”】。在其水解物中，除色氨酸未被测定 外，十八种氨基酸齐全。在测定的氨基酸中，含量较高的有谷氨酸 ( 1 0 8 2 1 1 3 3 m g k g ) 、天冬氨酸( 9 3 9 1 1 2 5 m g k g ) 、缬氨酸( 5 2 ，5 5 5 5 m g k g ) 、丙氨 酸( 4 9 9 6 6 8 m g k g ) 、亮氨酸( 4 8 5 5 6 7 m g k g ) 1 3 1 。谷氨酸是人体中需要量最大的非 必需氨基酸，是合成谷胱甘肽的重要原料，可见，罗汉果具有较高的营养价值。 3 无机元素 罗汉果果实中含有2 4 种无机元素，其中人体必需的微量元素和广泛元素有1 6 种， 含量较高的元素有钾( 1 2 2 9 0 m g k g ) 、g c j ( 6 6 7 m g k g ) 、镁( 5 5 0 m g k g ) 。罗汉果中含有的硒达 到0 1 8 6 m g k g ，是粮食的2 4 倍”】，而元素硒在冠心病防治、抗衰老、抗癌方 面有较好的疗效。 4 其它成分 从罗汉果中分离出非糖的甜味物质d 甘露醇，d 一甘露醇的甜味强度相当于蔗 糖的o 5 5 t o 6 5 倍 “】，经药理证明，d 一甘露醇有止咳作用，医疗上d 一甘露醇用 以代替蔗糖作糖尿病患者的甜味食品或调味剂，还用于脑水肿，能提高血液渗透 压，降低颅内压，脱水作用强于尿素，且持续时间长，d - 甘露醇亦可用于大面积 2 第一章绪论 烧伤和烫伤的水肿，防治急性肾功能衰竭病和降低眼球的内压，治疗急性青光眼 等。 罗汉果中含维生素c 约3 1 3 5 l o m g l o o g ”，比苹果、葡萄、柿子等水果高 出5 1 2 0 倍左右，其含量比号称“维生素之王”的猕猴桃还高。营养学家认为， 人体生理机制每日需摄入7 0 m g 的维生素c ，才能满足机体对维生素c 的需求， 罗汉果中含有高量的维生素c ，人们只要食用5 0 9 的罗汉果，足可以满足体内对 维生素c 的需求，其最大功益是可以阻止强致癌物质亚硝酸化合物在体内的合 成，促进亚硝酸盐的分解，消除致病因素，保护机体免受细胞的癌变，经常食用 罗汉果饮料，摄入维生素c 对预防胃癌等癌症起到积极而有益的效果。罗汉果的 种仁中含油脂2 7 3 3 ，人体必需脂肪酸有亚油酸、油酸、棕榈酸，总计占脂 肪酸的7 7 i l ”。 据报道【9 】，罗汉果不但能清除活性氧，分解过氧化脂质，同时还含有多量的 与s o d 同样起清除剂作用的成分，它可以通过内服或外搽使其内外兼施地应用于 人体，完成肌肤健美的目标。 1 3 三萜皂苷化合物的研究进展 三萜( t r i t e r p e n o i d ) 是由3 0 个碳原子组成的萜类化合物【1 ”。三萜类化合物 在自然界中有广泛的资源分布，多数以游离状态存在，这类化合物极性小，在水 中不溶解，而易溶于极性较低的溶剂，如氯仿、乙醚、草酸等。有的三萜则与糖 结合成苷，三萜与糖结合后，因极性较大而使其在水中的溶解度较大。三萜类化 合物的苷元结构较大，极性低，具有亲脂性，而糖部分极性大，具有亲水性，这 种结构有类似于表面活性剂的结构特点，其水溶液振摇后能产生持久类似肥皂溶 液的泡沫，在此又称三萜皂苷。根据其化学结构，三萜主要分为四环三萜和五环 三萜两大类，而以五环三萜为常见【15 1 。萜皂苷在豆科、五加科、伞形花科、报春 花科、葫芦科等植物中比较普遍。 三萜皂苷由三萜皂苷元和糖、糖醛酸所组成。组成皂苷的糖常见的有：葡萄 糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖以及其它糖类。三萜皂苷广泛分布于植物 中，具有各种生理活性。近年来，由于分离和结构研究方法的进展，促进了对皂 苷类极性较大化合物的研究【1 6 02 1 。上世纪九十年代。a m e r i c a n c a n c e rs o c i e t y ( a c s ) 第一次召开了以皂苷为主题的学术讨论会，与会专家认为，皂苷是有机化学家不 应忽视的一个研究领域。一些新结构的皂苷具有抗癌、防治心脑血管疾病、降压、 抗菌、消炎解热、镇静等方面的药理作用，因而，皂苷的研究日益引起国内外的 广泛重视。在国内，由于应用一些新的分离方法和结构鉴定技术，使我国对药用 植物中皂苷成分的研究得到不断的发展。 华南理工大学工学博士学位论文 1 3 1 三萜皂苷的生物活性研究 三萜皂苷在自然界分布很广，据统计约有一半的植物中含有皂苷，如人参皂 苷、黄芪皂苷、强心苷等。近年来，从海洋生物，如海星中也分离得到了越来越 多的皂苷，而且具有很强的生物活性。一般认为，除强心苷外，大多数皂苷的水 溶液能破坏红细胞产生溶血作用，因此，皂苷的应用受到了很大的限制。然而， 越来越多的研究结果表明 3 3 - 4 4 ) 皂苷具有广+ 泛的药理作用和生物活性，如免疫作 用、抗肿瘤、抗菌、防治心血管疾病等，而且还可以作为食品天然甜味剂、保护 剂、发泡剂、增味剂、抗氧化剂等。 有些皂苷类物质具有捕获自由基的功能，如清除氧自由基，因此，能应用于 与磷脂、核酸、蛋白质相关的质变。喻正坤等4 5 人从黄芪中分离出的皂苷具有淬 灭氧自由基的作用，据此解释了黄芪为什么对老年性心血管疾病具有良好的疗效。 目前，皂苷已经广泛应用于药物和食品方面。另外，一些三萜皂苷可作为表 面活性剂用于高级洗涤用品、灭火剂、乳化剂等，所以，三萜皂苷具有多种多样 的应用前景，尤其在抗癌药物和高甜度、低热量天然甜昧剂方面，将引起国内外 人们的极大兴趣和j “泛重视。 1 3 2 三萜皂苷的提取与分离 提取三萜皂苷的方法主要有两种，一种是水提法，即用热水多次浸泡物料， 然后过滤、浓缩、干燥、得到深褐色的粗皂苷。该方法虽然提取易得，价廉且安 全，但产品色泽、质量性能较差。另一种是有机溶剂法，用此方法，产品纯度虽 有提高，但提取溶剂消耗多，成本较高，工艺也较复杂。 对这些方法提取得到的三萜皂菅粗品，必须进一步分离及精制，常用的方法 主要有： ( 1 ) 正丁醇萃取法 将粗皂苷用少量水溶解，水溶液用正丁醇萃取，即可得到正丁醇层，浓缩至 干，得到褐色粘稠固体。此法得到的皂苷颜色太深，且杂质较多。 ( 2 ) 重结晶法 将粗皂苷加入热乙醇中，溶解后过滤，重复操作2 3 次，合并滤液后加入盐 酸，放置冷却使其结晶析出，如果颜色不合要求，再用乙醇重结品，即可得到高 纯度的皂苷。但此法皂苷得率较低，且不适用于工业化生产。 ( 3 ) 吸附法 在粗皂苷的水溶液中，加入新煅制的氧化镁粉，然后向蒸发至干的粉末中加 入乙醇，使吸附在氧化镁申的皂苷溶解出来，放冷后，皂苷析出，得到纯品，得 率大约为粗皂苷的5 0 ，且纯度不高。 ( 4 ) 聚酰胺柱层析法 4 第一章绪论 将粗皂苷进行聚酰胺柱层析，分别用水、不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱， 在某一合适浓度即可得到皂苷组分。此法得到的皂苷纯度不高，且聚酰胺柱回收 不易，不适合工业化生产。 ( 5 ) 硅胶柱层析 硅胶柱采用干法上柱，干法上样，用水饱和的正丁醇洗脱，收集皂苷部分， 直至洗脱液在薄层上无皂苷点出现，减压浓缩至干，得到纯化的皂苷产品。干法 装柱既可以省时，也可以节约溶剂，而且干柱在分离条件上更接近薄层层析，这 样就更容易找到合适的分离条件，此方法得到的皂苷较好，但不适用于工业化生 产。 ( 6 ) 大孔吸附树脂分离法 大孔吸附树脂是类新型的非离子型高分子化合物，理化性质稳定，不溶于 酸、碱及有机溶媒中，对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物的 影响。由于大孔吸附树脂有很好的吸附和分离性能，也适合于工业化的生产，因 此，大孔吸附树脂分离法是一种较好的分离方法。 1 4 药用植物有效成分研究的概况及发展前景 天然药物活性成分的研究与开发是人类寻找新药的重要手段。我国分布着极 为丰富的药用植物资源，有“天然药物王国”之称。目前，所发现的天然产物中 8 0 来源于植物，大多数具有某种特殊的生物活性，被用于医药治疗疾病，用于 环保生产无公害农药、除草剂等f 4 ”。天然产物在医疗、保健、环保、食品等领域 具有越来越广泛的应用前景。 随着现代医药、食品等工业的不断发展以及对药用植物的药理、药化、临床 应用、食品等产品开发研究的不断深入，药用植物的使用价值己经越来越引起人 们的广泛关注，因此，开展对药用植物资源的研究及开发利用，生产药用植物系 列药品、绿色保健食品等，有着十分广阔的前景。综合开发利用药用植物资源， 不仅可寻求防治疾病、保障人民健康的新药，还可以利用资源进行深度加工，取 得最佳的经济效益，促进我国的经济发展。 研究植物药效成分，目的在于研究其药效成分的化学结构、理化性质与生物 活性之间的关系，逐步阐明其防病治病的原理，寻找新药物、新药源或开发利用 对国民经济有价值的资源，同时，探索植物药的加工工艺，改进药物剂型，控制 中药及其制剂的质量，提高临床疗效。 由于药用植物往往含有结构、性质不同的多种成分，且有效成分的含量一般 较低，因此，研究和开发植物药必须从复杂的药用植物组成成分中提取、分离和 鉴定出有活性的纯成分h 7 。”j 。 华南理工大学工学博士学位论文 1 4 3 药用植物有效成分的提取技术 药用植物中具有药效的有效成分的提取在我国有悠久的历史，为提高有效成 分的收率，降低生产成本，药用植物的开发利用必须真正完成药剂的提取和纯化， 包括浸出、澄清、浓缩、层析、结晶与冻于等许多的单元操作。而其中提取单元 运作的优劣直接关系到药用植物中具有药效的有效成分的得率和后续加工的难易 程度，因此，提取过程可以视为开发利用药用植物的重要环节，研究并优化药用 植物有效成分浸出工艺十分必要【” 。 1 4 1 1 基本原理及影响因素 具有生物或生理活性的有效成分绝大部分存在于细胞内，在生物体类固体基 质中，如果细胞壁没有受到破裂，浸取作用将难以进行，这是由于溶质分子不能 通过细胞壁，只有溶剂通过细胞半透膜渗透入细胞内：当把细胞胀破时，溶质就 被带到浸取液中，因此，细胞壁对浸取过程产生阻力，致使浸取的速率缓慢，因 此，为了提高提取效率，通常需要对生物体内的细胞进行预处理。以药用植物为 例，为了从药用植物的叶、茎、花和根中浸取药用组分，在浸取之前先将对物料 干燥，这样有助于溶剂容易进入细胞内部直接溶解溶质。 药用植物有效成分提取过程的实质是溶质从植物体内部细胞向溶剂中转移的 传质过程。溶剂从植物体中浸取可溶性物质，其过程包括以下步骤【5 7 1 ：溶剂从溶 剂主体传递到植物体的表面；溶剂扩散渗入植物体内部和内部微孔隙内；溶质溶 解进入溶剂；通过植物体的微孔隙通道中的溶液扩散至植物体表面并进一步进入 溶剂主体，其提取过程及阻力环节分析如下图所示； r 溶剂 溶液 k 出物 对于存在于植物细胞中不同位置和细胞器中的目标产物，若将其从细胞内浸 取到液相中，目标分子将经历液泡和细胞器的膜透过、细胞浆中的扩散、细胞膜 和细胞壁的透过等复杂的传质过程。若细胞壁没有破裂，浸取作用是靠细胞壁的 渗透来进行的，浸取速率很慢。细胞壁被破坏后，传质阻力减小，目标产物比较 容易进入到萃取剂，并依靠相似相容原理而溶解，达到萃取之目的。 研究表明，影响这类提取的主要因素是欲提取物质在所使用溶剂中的溶解度 大小以及该物质向溶剂扩散的难易程度【5 ”。 一般而言，在植物的成分中，萜类、甾体等脂环类及芳香类化合物因为极性 小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；而糖苷、氨基酸等成分则极性较大，易 6 第一章绪论 溶于水及含水醇中；至于酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态( 分子或离子 形式) 随溶液而异，故，溶鳃度将随p h 而改变。 对包含浸取溶质的固体物质来说，溶质在固体物质中的存在形式是选择固体 预处理方式的依据。当溶质存在于固体物质的表面时，固体物质可以不需要任何 预处理就可以用溶剂轻易地把溶质提取出来；当溶质存在于固体物质内，为惰性 物质所包围时，往往必须通过粉碎、研磨或切片的方法来对固体预处理，从而增 加溶质分子与溶剂的接触表面积，使溶质浸取速度明显提高：当溶质存在于动植 物的细胞中时，则必须尽量使细胞壁破裂，以便其中的溶质成分能够很快地通过 破碎的细胞壁扩散到浸取溶液中。 固相颗粒度的减少可加速溶质从固体中向浸取溶液的扩散，从而有利于浸取 过程。但是，如果固相颗粒度过小，则溶剂可能不能顺利地渡过固体床，流体的 压降可能过大，并引起固体床被压实，也会使浸出液较牢固地吸附在固体颗粒的 周围，而使得固体分离困难。此外，过细的颗粒，会增加液体的流动阻力，从而 对浸出速率产生不利的影响。当然，过分地减少固相的颗粒大小显然也是不经济 的。 1 4 1 2 提取药用植物有效成分的研究现状 从药用植物中提取其有效成分的传统方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法及升 华法等【l ”。后两种方法的应用范围有限，大多数情况下是采用溶剂提取法。常用 的溶剂提取方法有回流法、索氏法、冷浸法、渗漉法等，而原料的粉碎度、提取 时间、提取温度等因素也都能影响提取效率。在回流提取法中，溶剂用量大，提 取所需的时间较长，由于药液长时间受热，很容易使其中的有效成分发生改变； 在索氏提取法中，虽然溶剂用量不大，但需要进行长时间的加热提取；而冷提法 ( 冷浸、渗漉) 则避免了加热，从而使其中的有效成分有了一定的安全性，但冷 浸法和渗漉法所用的溶剂量较大，提取时间也相当长，操作较麻烦。 针对药用植物有效成分的传统提取技术能耗与物耗大、杂质多、效率低的状 况，近年来，许多学者从不同角度对药用植物有效成分的提取工艺进行了摸索与 优化，以实现天然药物生产的科学化、规范化和标准化，建立切实可行的提取方 法，充分借鉴和利用现代提取分离工程技术。 吴盛贵等【5 9 】以提取时p h 值、提取时间、酸化时p h 值为变量，对穿心莲碱 水提取过程进行了优化，发现，提取时的p h 值对提取效果的影响最大，提取时 间和酸化时p h 值的影响则不明显。李俊等1 以提取温度、乙醇浓度、浸提时间 和乙醇用量作为考察的主要因素，对罗汉果中罗汉果糖苷的乙醇提取过程进行了 正交试验，发现，乙醇浓度、乙醇用量及浸提温度对罗汉果糖苷含量有显著影响， 并认为，采用稀乙醇提取方法时的溶剂用量大，成本较高，但由于蛋白质等杂质 华南理工大学工学博士学位论文 被去除，故，得到的罗汉果提取物中糖苷的含量高、产品颜色浅，质量较好，易 于二次开发，是较佳的罗汉果糖苷提取方法。魏风玲等1 6 0 1 考察了提取时间、提取 次数、乙醇浓度、乙醇用量、物料粒度等对三七总皂苷提取率的影响，优选出了 合理的提取工艺，应用结果表明，该提取工艺设计合理，可作为提取三七皂苷成 分生产工艺的参考。 卢起来等1 6 ”对水提一醇沉一酯萃法、丙酮盐水提取法、醇提酯萃法、乙醇提 取一树脂吸附法制备银杏提取物进行了比较研究，发现，用醇提酯萃法和醇提树 脂吸附法从银杏叶中提取黄酮苷和萜内酯是可行的，黄酮苷质量分数分别为 2 6 2 0 和3 1 6 2 ，萜内酯均为6 ，达到德国同类产品的标准。 在传统的提取技术中，使用不同的提取溶剂会导致其有效成分的提取效果不 同。李雁群等【l 引研究了5 0 乙醇水溶液、2 5 乙醇水溶液和水三种溶剂提取罗汉 果中罗汉果皂苷，发现，用水作溶剂时皂苷的萃取得率比其它两种溶剂都高，用 5 0 乙醇溶液作溶剂所得的浸出液比较纯净。乙醇不利于蛋白质、糖的溶解，所 以，乙醇浓度提高，固形物溶出减少。而且，乙醇浓度的变化还会从传质状况和 溶剂效应两个方面影响皂苷的溶出，这是因为乙醇对蛋白质的凝聚作用使蛋白质 滞留在颗粒的内部孔道中，增大了皂苷扩散的阻力，同时水的减少也削弱了对颗 粒细胞的溶胀。另一方面，由5 0 乙醇和5 0 水组成的双组分溶剂对皂苷有较强 的溶出作用。 1 4 1 3 高新技术在药用植物有效成分提取中的应用 近年来，一些新型分离技术已开始引入药用植物有效成分提取的过程中，如 超临界流体萃取( s f e ) 、超声场强化、微波辅助提取技术等。许多研究结果表明， 与传统技术相比，这些新技术的引入具有产率高、纯度高、速度快、物耗能耗少 等特点，有着广阔的应用前景。 1 超临界流体提取技术( s i z e ) 随着国际上超f 临界流体提取技术的迅速发展，用该技术提取植物中的有效成 分也越来越得到不断的普及。与有机溶剂法相比，超临界流体提取技术具有提取 效率高、无溶剂残留、有效成分和热不稳定成分不易被分解等优点，通过控制温 度和压力以及调节改性剂的种类和用量，还可以实现选择性萃取和分离纯化。近 年来，国内学者6 2 6 3 1 也开始探索和研究用超i 临界流体提取技术提取银杏叶黄酮类 化合物，得黄绿色粗提物，收率4 1 ，其中黄酮苷含量在3 5 以上。邓启焕等忡刊 以银杏叶的有效成分为分离对象，建立了一套超临界流体小试、中试装置和实验 方法，所得的提取物中银杏黄酮含量为2 8 、银杏内酯含量为7 2 ，均高于国际 现行公认的质量标准。夏开元等“1 以乙醇和用大孔树脂吸附提取的银杏叶精提 物，在采用c 0 2 一s f e 精制前，毒性成分白果酸含量为2 o ，而用c o ：一s f e 精制 第一章绪论 后，白果酸含量降低到0 0 2 。c h e n 等 6 5 1 对s f e 萃取银杏内酯和白果内酯进行 研究，认为，在萃取过程中必须有改性剂的参与。 超临界流体萃取不适于极性物质的提取分离，对生产设备的工艺要求较高， 因此，其运行成本比较高，但是，该项技术高选择性、高收率、低毒害是其他方 法所不能比拟的。 2 超声波辅助提取技术 超声波是一种高频机械波。它在溶液体系中产生的声空化的过程一液体中空 腔的形成、振荡、生长、收缩至崩溃，是集中声场能量并瞬间释放的过程。空化 泡崩溃时，在极短的时间和在空化泡周围的极小空间内，可产生5 0 0 0 k 以上的高 温和大约5 0 m p a 的高压，温度变化率可高达1 0 9 k s ，并伴有强烈的冲击波。在这 种特殊的物理环境下，使处于空化中心附近的细胞受到严重的损伤以至破坏，从 而使细胞中的有效成分得以释放，直接与溶剂接触并溶解在其中，从而提高了有 效成分的提出率。 宋小妹等【6 叫对从绞股蓝中提取绞股蓝总苷的3 种不同方法，即回流法、低频 超声法、高频超声法进行了比较，认为，高频超声法提取最好。他们进一步研究 了高频下不同提取时间对绞股蓝总皂苷提取率的影响，发现，提取时间越长，皂 苷提取率越高。但如果考虑工业生产成本，则以提取8 0 m i n 为宜。于淑娟等【6 7 】 在超声波对多聚糖结构极性影响的研究中认为，由于灵芝多糖是一种实体木质化 的真菌多糖，细胞壁中有蛋白质、几丁质、纤维素及木质素等，其结构紧密，一 般的处理方法难于将细胞壁破坏，然而， 从2 3 4 降低到o ，比表面积增加8 5 5 ， 分容易提取。 通过1 2 0 w 超声波作用使其相对结晶度 水解速度将显著增加，从而使其有效成 秦炜等 6 8 1 从化学工程的角度分析，提出了超声场的湍动效应、微扰效应、界 面效应和聚能效应等4 个附加效应。他们以姜黄素一乙醇水溶液的浸取过程为研究 对象，研究了超声场介入对固液体系的浸取速率和提取率的影响，并与其升温、 机械搅料进行了比较，发现，超声波辅助提取不仅加快了动力学过程，还提高了 收率，即打破了原有的平衡体系。 3 微波辅助提取技术 微波是频率介于3 0 0 m h z 和3 0 0 g h z 之间的电磁波。利用微波强化固液浸取 过程是颇具发展潜力的一种新型辅助提取技术【6 ”“】。其原理是微波射线辐射于溶 剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于极性的溶剂及细胞液吸收微波能，细胞内部 及附近的温度升高，气化压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破 裂，位于细胞内部的有效成分从细胞中释放出来，传递转移到溶剂中。 微波辐射辅助提取法具有选择性高、提取时间短、易挥发性成分的提取得率 高以及不需要特殊的分离步骤等优点。该技术适用于许多天然物的提取，不受限 9 华南理工大学工学博士学位论文 j i i _ e e j _ _ = 目_ e = = e j _ _ e i - | j e = - _ e _ - _ 目_ _ _ _ _ j _ - _ _ _ _ - _ - 目_ - _ _ _ _ _ 日_ - 制都可达到高效、快速、高度选择性、安全无害环境的要求。近十几年来，国内 外不少学者8 5 9 3 1 将微波应用于天然产物的浸取过程中，有效地提高了收率。 微波提取的选择性主要取决于目标物质和溶剂性质的相似性，必须根据被提 取物的性质选择极性或非极性溶剂。极性溶剂可用水、乙醇等，非极性溶剂可用 正己烷等。但由于非极性溶剂不能吸收微波，为加速提取，通常的做法是在非极 性溶剂中加入极性溶剂。如果样品和溶剂两者均不吸收微波，则微波提取无法进 行。 介质吸收微波的能力主要是取决于其介电常数、介质损失因子、比热和形状 等。极性较大的溶剂或目标成分，其吸收微波的能力强，在微波辐射下能迅速升 温，沸点低的溶剂甚至有过热现象，极性较低者吸收微波的能力差，而非极性的 溶剂如氯仿等则几乎不吸收微波。因此，利用不同的物质在介电性质上的差异也 可以达到选择性提取的目的。 水是吸收微波的最好介质，任何含水的非金属物质或各种生物体都能吸收微 波。因此，样