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青岛科技大学研究生学位论文 血红蛋白在离子液体碳糊电极上的直接电化学 摘要 血红蛋白( h b ) 是脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白，是血液中运输氧气的主要 物质，研究其直接电化学行为对于研究生命体内的电子转移过程，了解生命过程 的氧化还原机理及建立高灵敏的检测方法等方面具有非常实际的意义。有“绿色” 溶剂之称的室温离子液体近年来逐渐成为研究的热点，由于室温离子液体具有特 殊的理化性质，在电分析化学领域它既可以作为溶剂和支持电解质，又可以作为 粘合剂和固定膜用于制备修饰电极。本文制备了离子液体修饰电极，并采用不同 的方法将h b 固定于电极表面，开展了h b 的直接电化学行为与电催化研究。论文 主要包括以下内容： 1 制备了2 种离子液体修饰碳糊电极。分别以室温离子液体1 丁基一3 甲基 咪唑六氟磷酸盐( b m i m i p f 6 ) 和六氟磷酸正丁基吡啶( b p p f 0 代替传统石蜡为 粘合剂与石墨粉相混合制备了新型的离子液体修饰碳糊电极( c i l e ) 。采用扫描电 子显微镜对其表面形貌进行了表征，以铁氰化钾为电化学探针对它们的电化学行 为进行了研究，并与传统石蜡碳糊电极( c p e ) 进行了比较。结果表明，由于室 温离子液体具有较高的导电性，使c i l e 比c p e 具有更高的导电效率，电流响应 明显增加；同时c i l e 具有较好的机械强度和很好的稳定性。 2 开展了h b 在c i l e 上的直接电化学行为研究。分别以上述2 种c i l e 为基 底电极，以n a t i o n 、纳米c a c 0 3 、聚乙烯醇( p v a ) 、皂土( o a y ) 等为成膜材料， 采用层层涂布法制备了不同类型的h b 修饰电极如p v a c l a y h b c i l e 、 n a i i o n n a n o c a c o # h b c i l e 等。考察了h b 在不同蛋白质膜电极上的直接电化学 行为。实验结果表明，f i b 在不同的修饰膜内基本保持了其生物活性，并且在修饰 电极上其电子传递能力明显增强，表现出一对准可逆的氧化还原峰。对f l b 的直 接电化学行为进行了研究，求解了相关的电化学参数。由于i - i b 含有铁卟啉活性 中心，具有类似过氧化物酶( p o d ) 的催化活性，因此进一步研究了该修饰电极对 h 2 0 2 、三氯乙酸( t c a ) 、亚硝酸钠( n a n 0 9 等小分子的催化性质。实验结果表 明所制备的h b 修饰电极对h 2 0 2 表现出良好的电催化性能，催化还原峰电流在一 定条件下与h 2 0 2 的浓度成正比，进而构建了用于检测微量h 2 0 2 的电化学传感 分析的新方法。 3 用血红蛋白、【b m i m p f 6 以及石墨粉均匀混合得到血红蛋白离子液体碳 糊修饰电极( h b i l c p e ) 。采用扫描电子显微镜( s e n d 和电化学法对混合在离 血红蛋白在离子液体碳糊电极上的直接电化学 子液体修饰碳糊电极中的血红蛋白0 t o ) 的性质进行了研究和表征。h b 在碳糊 中保持了其生物活性并表现出良好的电化学行为，电化学实验表明了在p h7 0 的 磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 中出现一对峰形良好的准可逆氧化还原峰。对h b 的电化 学参数进行了推导，电子转移数n 为1 2 ，电子传递系数a 为0 4 6 5 ，反应速率常 数毛为0 4 3 48 。该修饰电极对h 2 0 2 表现出非常好的电催化行为，当h 2 0 2 的浓 度在8 0 x l 酽 2 8 x l 矿m o l l 范围内时，还原峰电流随着h 2 0 2 浓度的增加而线 性增加，其线性回归方程式为i s s ( 衅产o 1 2c ( u m o v l ) + 0 7 3 “= o 9 9 7 ，n = 1 8 ) ，检 测下限为1 0 x l 酽m o l l ( 3 盯) ，表观米氏常数嘶。p p ) 为1 1 0 3m l v l 。该传感器的 表面易于更新，并表现出良好的重现性。 关键词：血红蛋白。室温离子液体，直接电化学，电催化。碳糊电极，h 2 0 2 ， 传感器 青岛科技大学研究生学位论文 d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fh e m o g l o b i n o ni o n i cl i q u i dm o d i f i e de l e c t r o d e a b s t r a c t h e m o g l o b i n ( 1 i b ) i sa l li m p o r t a n tr e s p i r a t o r yp r o t e i ni nr e de e l i s , w h i c hc a l lb e u s e d 舔t h ec a r r i e ro fo x y g e n s t u d i e so nt h ed i r e c te l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fh b c a l lb eu s e df o rt h eu n d e r s t a n d i n go f t h em e c h a n i s m so f e l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n sa n d o x i d a t i o n r e d u c t i o ni nl i f op r o c e s s e s ，w h i c hc a na l s ob ep r o p o s e d 龉as e n s i t i v em e t h o d f o rh bd e t e r m i n a t i o n r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ( r t l s ) h a v ee x c e l l e n tp h y s i c a l a n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，w h i c hc a l la l s ob ea p p l i e di nt h ef i e l do f a n a l y t i c a lc h e m i s t r y r t i l sc a nb eu s e de i t h e r 硒s u p p o r t i n ge l e c t r o l y t eo rm o d i f i e rf o re l e c t r o d e s i n c e e l e c t r o a n a l y s i sh a si n h e r e n ta d v a n t a g e ss u c h a sl o w e rd e t e c t i o nl i m i ta n dw i d e r d y n a m i cr a n g e ，i tc a nb eu s e dt oi n v e s t i g a t e t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so f b i o m o l e c u l e s i nt h i st h e s i st h ed i r e c te l e c t r o c h e m i c a li n v e s t i g a t i o no fh bw a s c o n n e c t e dw i t he l e c t r o a n a l y t i c a lm e t h o d t h e p a p e rc a nb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： i t w or o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ( r t i l s ) m o d i f i e dc a r b o np a s t ee l e c t r o d e ( c p e ) w e r ec o n s t r u c t e db a s e do nt h es u b s t i t u t eo fp a r a f f i nw i t hl - b u t y l 一3 - m e t h y l i m i d a z o l i u m h e x a f l u o r o p h a t e ( b m i m p f 6 ) o rn - b u t y l p y r i d i n i n m h e x a f l u o r o p h o s p h a t e ( b p p f 6 ) t om i xw i t hg r a p h i t ep o w e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp r e p a r a t i o n w e l - es e l e c t e da n dt h es l l r f a c em o r p h o l o g i e so ft h ec i l ew e r es c a n n e db yas c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h ec i l ew a si n v e s t i g a t e db y u s i n gk 3 f e ( c n ) 6 】嬲p r o b ea n dc o m p a r e d 诵t l lt h a to ft r a d i t i o n a lc p e t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ee l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s ew a sg r e a t l yi m p r o v e d 、衍t ht h e h i 罟h c o n d u c t i v i t yo fr t i l sa n dt h em o d i f i e dc i l es h o w e dg o o dm e c h a n i cp r o p e r t ya n d s t a b i l i t y 2 t h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fh bi sc a r e f u l l ys t u d i e do nt h ec i l e h i ) w a s i m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fc i l ew i t hc l a ya n dp o l y v i n y la l c o h o l ( p v a ) f i l mo r n a l i o n n a n o c a c 0 3f i l mb ys t e p - b y - s t e pm e t h o d t h ec h a r a c t e r so fh bi nt h e s e i i i 血红蛋白在离子液体碳糊电极上的直接电化学 m o d i f i e df i l m sw e i 它i n v e s t i g a t e db ye l e c t r o c h e m i c a l s p e c t r aa n ds c a j le l e c t r o n m i c r o s c o p i cm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e d t h a th bi nt h e s ef i l m sr e t a i n e dt h ee s s e n t i a l f e a t u r e so fi t sn a t i v es t r u c t u r e ap a i ro fw e l l d e f i n e da n dq u a s i - r e v e r s i b l ec y c l i c v o l t a m m e t r i cp e a k sw e r ea p p e a r e d t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o u r so fh bi nt h e m o d i f i e de l e c t r o d ew e r ec a r e f u l l yi n v e s t i g a t e d t h ef o r m a lp o t e n t i a l ( e w a sa l m o s t i n d e p e n d e n to ft h es c a nr a t ea n dt h ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r sw e l ea l s oc a l c u l a t e d h bh a sa l li r o n - p o r p h y r i nh e m ea st h ea c t i v ec e n t e r , s oi th a st h ei n h e r e n tr e a c t i v i t ya s ap e r o x i d a s e ，w h i c hc a nc a t a l y z et h er e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e t h ef a b r i c a t e d h bm o d i f i e de l e c t r o d ee x h i b i t e de x c e l l e n te l e c t r o c a t a l y t i cb e h a v i o r st ot h er e d u c t i o no f h 2 0 2 ，t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) a n dn a n 0 2 3 an e wh e m o g l o b i n ( 1 i b ) m o d i f i e de l e c t r o d ew a sc o n s t r u c t e db yu s i n gr o o m t e m p e r a t u r e i o n i c l i q u i d1 - b u t y l - 3 - m e t h y l i m i d a z o l i u mh e x a f l u o r o p h o s p h a t e ( b m i m p f 6 ) a sb i n d e r b ym i x i n gl a bw i t h b m i m p f 6a n dg r a p h i t ep o w d e rt o g e t h e r , ac a r b o np a s t ee l e c t r o d ec o n t a i n i n gh ba n di l ( h b m - o e ) w a sp r e p a r e da n df u r t h e r c h a r a c t e r i z e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d t h ef i bi nt h ec a r b o np a s t ek e p ti tb i o a c t i v i t ya n ds h o w e dg o o dd i r e c te l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r s a p a i ro f w e l l - d e f i n e d , q u a s i - r e v e r s i b l er e d o xp e a k sw a sa p p e a r e da tp h 7 0 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n0 瞪s ) t h ee l e c t r o e h e m i c a lp a r a m e t e r ss u c ha st h ee l e c t r o n t r a n s f e rn u m b e r ( n ) ，t h ee l e c t r o nt r a n s f e rc o e f f i c i e n t ( 回a n dt h eh e t e r o g e n e o u se l e c t r o n t r a n s f e rk i n e t i cc o n s t a n t ( k s ) o f t h ee l e c t r o d er e a c t i o nw e r ec a l c u l a t e da s1 2 ，0 4 6 5a n d o 4 3 4s 1 r e s p e c t i v e l y t h ef a b r i c a t e dh b - i l - c p ee x h i b i t e de x c e l l e n te l e c t r o e a t a l y t i c b e h a v i o r st ot h er e d u c t i o no f h 2 0 2 t h ec a l i b r a t i o nr a n g ew a sb e t w e e n8 0 x 1 0 6 m o l l t o2 8 x 1 0 4m o l lw i t ht h el i n e a rr e g r e s s i o na si s s0 t a ) = 0 1 2c0 * m o l l ) + 0 7 3 9 9 7 ，n = 1 8 ) a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ta s1 0 x 1 0 6m o l l ( 3 0 ) t h ea p p a r e n tm i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n t 张m 印p ) o ft h i ss e r l s o rw a sc a l c u l a t e dt ob e1 1 0 3m m o l l t h e s u r f a c eo fb i o s e n s o rc a l lh er e n e w e db ys i m p l ep o l i s h i n gs t e pa n ds h o w e dg o o d r e p r o d u c i b i l i t y k e yw o r d s ：h e m o g l o b i n , r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ，d i r e c te l e l c t r o e h e m i s t r y , e l e c t r o c a t a l y s i s ，h 2 0 2 ，c h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e ，s e 蚺o r i v 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：高鲜芳签字日期：如0 1 年月塔日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用学位 论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密团。 本人签名：蔼端芳 导师签字：矛分影辟 i 签字日期：胁7 年g 月日 签字日期：矿7 年z 月心日 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 1 1 血红蛋白的结构、性质及研究意义 红细胞内含有大量的血红蛋白 ( h b ) ，红细胞的机能主要由h b 完成。 h b 除作为血液缓冲物质而发生作用外， 其主要功能在于携带0 2 、c 0 2 、分解 h 2 0 2 、传递电子等与氧和能量代谢有关 的重要活动，在生命活动中起着关键作 用。h b 是一种四亚基的蛋白质，它的相 对分子质量约为“5 0 0 ，其分子具有四级 结构( 如图1 1 所示) ，是由两条a 和两 条口多肽链构成的四聚体，每个肽链上 各结合有一个血红素分子，且相互接近， 形成近似球形的h b 分子，直径约为5 5 衄。血红素位于肽链折叠形成的介电常 数较低的疏水环境中，铁离子以共价键 形式与卟啉的四个吡咯环中的n 原子以 及肽链中的组氨酸相连接，其结构非常 类似于辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s h p r o f i l e 圈卜l 血红蛋白分子示意图 p e r o x i d a s e ，h r p ) ，因此表现出很高的类似过氧化物酶的催化活性【l l 。对h b 的研 究多集中在其结构、输氧功能及其与电极之间的电子转移过程和机理。人血清中 h b 含量的测定是临床检测的一个重要内容，正常人血清中h b 的含量在1 0 0 - 2 0 0 g l 范围之内。若h b 的含量降低则有可能是各种原因造成的贫血，而其含量相对 增多则主要是由于大量体液和血浆丢失所致，因此对h b 含量的准确测定具有非 常实际的意义1 2 j 。 1 2 蛋白质直接电化学的研究进展 1 2 1 蛋白质直接电化学研究意义 一切生物的生命过程都是建立在组成它的生物大分子的结构、运动及其相互 血红蛋白在离子液体碳糊电极上的直接电化学 作用的基础之上的，生物大分子作为生命科学的基本内容，有关它的研究就显得 尤为重要，常见的生物大分子有蛋白质，核酸和生物多糖。 蛋白质( 酶) 作为一类典型的生物大分子和特殊催化剂，在生命过程中扮演 着极为重要的角色。生命过程中的新陈代谢几乎都是在蛋白质( 酶) 的催化作用 下完成的，很多蛋白质( 酶) 在催化过程中都要经历电子转移过程，在其氧化型 和还原型之间相互转化，因此非常适合采用电化学的方法对氧化还原蛋白质( 酶) 进行研究。蛋白质( 酶) 在生命体内的氧化还原反应都发生在带电荷的生物膜或 其附近，因而其电子的传递必然要受到电场的作用或影响，这与电化学研究中工 作电极或其附近的情况相似。因此，氧化还原蛋白质( 酶) 在电极上的直接电化 学研究，可以为研究生命体内的电子交换提供模型，对理解和认识它们真实的电 子转移机制具有重要意义【3 l 。 电化学生物传感器是利用生物反应的特异性，结合电分析方法的灵敏性所研 制的一种生物传感器。其中发展最迅速，并已经部分商品化的生物传感器就包括 蛋白质( 酶) 传感器。按照其发展历史可以将蛋白质( 酶) 传感器的发展分为三 代1 4 】，以葡萄糖氧化酶( g o d ) 催化葡萄糖为例加以说明如下： ( 1 ) 以氧为受体的催化为第一代： 酶反应：g o d o x + g l u c o s e - g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d g o d r e d + 0 2 - g o d o x + h 2 0 2 电极反应：h 2 0 2 0 2 + 2 旷+ 2 e ( 2 ) 基于媒介体的电催化为第二代： 酶反应：g o d o x + g l u c o s e - g l u c o n o l a c t o n e + g o d r c d g o d r e d + m o x g o d o x + m r e d 电极反应：m r c c l m o x + n o ( 3 ) 以酶的直接电化学为基础的是第三代： 酶反应：g o d o x + g l u c o s e g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d 电极反应：g o d r e d + g o d o x + n e 前两代蛋白质( 酶) 传感器都需要借助媒介体才能完成电化学催化循环，因 此均属于间接的电催化，它们由于引进了外界媒介体而给蛋白质( 酶) 电极的研 究带来了复杂性和局限性。基于蛋白质( 酶) 在电极上的直接电子转移的第三代 蛋白质( 酶) 传感器是当前蛋白质( 酶) 电极研究的新方向【4 l ，它不但在理论研 究，而且在选择性、灵敏度和测量范围等方面都有望比前两代蛋白质( 酶) 传感 器有新的突破。因此氧化还原蛋白质( 酶) 的直接电化学研究也将为开发新一代 的蛋白质( 酶) 电化学生物传感器奠定重要基础 5 1 。 但迄今为止，溶液相中的氧化还原蛋白质( 酶) 很难在裸的工作电极上表现 2 青岛科技大学研究生学位论文 出良好的电化学行为。可能的原因是：蛋白质( 酶) 在电极表面的取向不利于其 电活性中心与电极表面直接进行电子交换；多数蛋白质( 酶) 的分子量较大，其 电活性基团或氧化还原中心深埋在多肽链的内部，距电极表面较远；同时溶液中 的大分子杂质在电极表面的吸附和蛋白质( 酶) 本身的吸附变性也会阻碍蛋白质 ( 酶) 与电极间的直接电子转移【6 】。为了解决这些问题，提出了很多方法。溶液 中蛋白质的电化学研究主要是借助于媒介体和促进剂。 早期的蛋白质( 酶) 的电化学研究多借助于媒介体【7 i 们。媒介体多为一些小 分子量的具有氧化还原性质的物质，它们在所研究的电位范围内本身是电活性 的。可以通过媒介体在电极上的氧化还原反应来催化蛋白质的氧化或还原，从而 间接研究蛋白质的电子转移过程。媒介体在蛋白质与电极之间起电子传递桥梁的 作用，电子传递发生在媒介体的氧化还原电位处。因此，蛋白质在媒介体作用下 的电化学称为间接电化学。使用可溶性的氧化还原媒介体是最为简单的电催化方 式。例如，h c i n c m a n 等【l l 】在溶液中加入媒介体吩嗪甲氧基硫酸盐( p h c n a z i n e m e t h o s u l f a t e ，p m s ) ，研究了血红蛋白( i - i b ) 的间接电化学行为。溶液中的媒介体 的主要缺点是其催化效率比较低。于是，有的研究者将媒介体修饰在电极表面来 研究氧化还原蛋白质与电极间的间接电子转移。7 自t l d o n g 等【1 2 1 的研究表明，亚甲绿 媒介体修饰的碳糊电极可以有效地催化氧化伊烟碱腺嘌呤二核苷( n a d h ) 。另外， 利用媒介体催化辣根过氧化物酶( 心) 的间接电化学研究开展得比较多。如甲 基绿【1 3 1 ，硫堇【1 4 】，聚邻苯二胺等均可作为媒介体修饰在电极上用于催化m ：p 的电化反应。 以媒介体为桥梁的蛋白质的间接电化学研究的主要缺点是，它无法真正深入 研究氧化还原蛋白质的电化学性质及其电极过程，因为所有的电化学响应实质上 都来自于媒介体而不是蛋白质本身。因此，2 0 世纪8 0 年代，以促进剂( p r o m o t e r ) 为特点的蛋白质直接电化学的研究成为主流【“。促进剂通常也是小分子化合物， 但在所研究的电位范围内是非电活性的。当在蛋白质溶液中加入促进剂后，促进 剂一方面可以在电极表面吸附，另一方面又可以与蛋白质相互作用，使得蛋白质 的氧化还原中心以更有利的取向接近电极表面，从而达到实现或加速蛋白质与电 极之间的直接电子交换的目的。与媒介体的作用不同，在促进剂作用下的蛋白质 的电化学是蛋白质与电极之间的直接电子转移，故属于蛋白质的直接电化学。如 1 9 7 7 年，h i l l 等i ”1 发现4 ，4 - 联吡啶能够促进细胞色素c ( c y tc ) 在金电极上的直接 电子转移，并开创了利用促进剂研究蛋白质直接电化学的新方向。 另一种实现蛋白质直接电化学的途径是纯化蛋白质。蛋白质溶液中往往存在 一些生物大分子杂质，它们在电极表面的吸附很可能是阻碍某些蛋白质在裸电极 上实现直接电子传递的主要原因。因此纯化后的蛋白质有可能实现其与电极间的 血红蛋白在离子液体碳糊电极上的直接电化学 直接电子交换。如c y tc 在掺锡的氧化锢( i t o ) 电极上的电化学行为与c y tc 的纯度有关。当采用未经过纯化的c y tc 时，其聚合或去氨基形式的杂质比天然 c y t c 优先吸附在i t o 电极表面，阻碍了c y t c 分子与电极问的电子转移，循 环伏安图不可逆，且峰电流较低；而纯化后的c y tc 在i t o 电极上呈现稳定、 近似可逆的循环伏安行为【l ”。 近年来，利用薄膜修饰电极来研究氧化还原蛋白质为蛋白质的直接电化学研 究开辟了新的方向【1 8 1 。这里被研究的蛋白质不是处于溶液相中，而是处于被修饰 在电极表面的薄膜中。在薄膜所提供的不同于水溶液的独特而有利的微环境中， 氧化还原蛋白质往往可以与电极进行直接快速的电子交换，从而表现出良好的电 化学活性，避免了由于引入外界媒介体而给电极反应带来的复杂性与局限性，使 蛋白质和酶的直接电化学研究成为可能，也为第三代生物传感器的研制和开发提 供了新的思路1 1 ”。同时在薄膜修饰电极中，蛋白质和酶的用量极少，这为蛋白质 的直接电化学研究提供了极大的便利。 1 2 2 蛋白质在电极上的固定方法 为了研制价格低、灵敏度高、选择性好和寿命长的生物传感器，生物识别分 子固定化技术显得非常重要。经过近2 0 年来的不断工作，己经建立了各种不同生 物分子的固定化方法，主要包括夹心法，吸附法，包埋法，共价键合法，交联法 等。现己报道的较为成熟的固定方法可归纳如下【2 0 】。 1 2 2 1 吸附法 吸附法相对比较简便，操作条件温和，对生物分子活性影响小，但生物识别 分子与固体表面结合力比较弱，容易导致生物分子的泄露或脱附。而且生物分子 暴露在外，容易受温度、p h 、离子强度等环境因素的影响。 1 2 2 2 共价键合法 共价键合法是通过共价键将生物分子固定在固体表面，相对比较稳定，不易 发生脱附。但是与固体本身键合导致灵敏度降低或生物分子失活，操作复杂，耗 时，成本高。 1 2 2 3 交联法 使用戊二醛等双功能团试剂，使生物分子以共价键交联在固体表面，其缺点 是难以控制，形成的生物分子层比较膨松，导致扩散阻力大，且需要的试剂量比 较大，容易引起生物分子活性降低。 4 青岛科技大学研究生学位论文 1 2 2 4 包埋法 包埋法是将生物分子包埋在聚合物膜等三维空间网状结构中，包埋物质不易 渗漏，最早是采用n a t i o n ，聚氯乙烯等高分子膜，但发现有生物活性降低的问题。 1 2 2 5 夹心法 夹心法是将酶封闭在双层滤膜或电极滤膜之间，这种方法用于酶反应器和早 期的传感器中。 1 3 血红蛋白在不同修饰电极上的电化学 1 3 1 染料修饰电极 较多的报道是以各种染料作为媒介体的修饰电极对h b 的电化学性质进行的 研究。自从1 9 7 1 年k u w a n a 等发现染料分子可以催化h b 的反应以来，许多种染 料被用做媒介体来对i - i b 进行研究，它们主要起到在电极表面与h b 之间传递电子 的作用。这些染料多具有氧化还原活性，其在电极上的固定方法有吸附、共价桥 联、聚合或电沉积，已用的基体电极有玻碳、石墨、碳颧、碳纤维、铂、银电极 等。y e 2 i 】等人用亚甲蓝吸附于石墨电极表面用于流动体系中h b 和肌红蛋白的测 定。陈洪渊【2 2 】等人则将甲酚固紫、甲苯胺蓝等染料吸附在石墨电极表面制成相应 的修饰电极对h b 的电化学性质进行了研究，如在甲苯胺蓝修饰石墨电极上可以 催化h b 还原，h b 的加入使甲苯胺蓝的还原峰不断增加，其氧化峰相应的减小， 原因在于扩散至电极表面的h b 能与电极表面反应生成的还原态甲苯胺蓝发生化 学反应而被催化还原，甲苯胺蓝被氧化再生，使电极反应生成的甲苯胺蓝还原态 量相应的减少，电位反扫时氧化峰电流下降。用吸附法制备染料修饰电极方法简 单、易于操作，但随着实验时间的延长，部分染料分子会从电极表面脱落而降低 电极活性。鞠烷先【2 3 l 等人则利用亚甲蓝肘a 矗o n 修饰微柱碳纤维电极对h b 的电化 学性质进行了研究，利用n a t i o n 膜将亚甲蓝固定在碳微电极的表面，降低了媒介 体的传质速率，大大提高了微电极的电催化效率和使用寿命，在弱酸性介质中有 效的加速h b 的氧化，峰电流的增加与h b 浓度在5 0 x 1 0 o l o 5m o l l 范围 内有良好的线性关系，可用于人血清中h b 含量的测定。另一种有效的固定方法 为聚合物膜修饰电极法，该法制备的电极稳定性和重现性好、寿命长、灵敏度高。 董绍俊等人制备了聚吡咯掺杂亚甲蓝修饰电极，在该电极上h b 反应迅速，异相 电子转移速率可达1 8 x 1 0 4c n 炸。袁倬斌m , 2 5 1 等人则利用天青i 或大黄酸等易于 聚合的物质，用循环伏安法或恒电位氧化电解聚合法制备了聚合物膜修饰电极， 考察了其对h b 的电催化还原，如在天青i 修饰电极上，随着h b 的加入，第一还 血红蛋白在离子液体碳糊电极上的直接电化学 原峰电流逐渐减小而第- - h i 原峰电流逐渐增大，氧化峰电流降低，这是由于氧化 态f i b 扩散到聚合物溶液界面并发生电子交换，整个过程由溶液中h b 的扩散速度 控制，峰电流的大小与h b 浓度在0 5 , - 6 0m g l 范围内呈线性关系，可用于h b 的测定。其它被研究的染料还有天青a 【2 6 1 、亮甲酚蓝等f 2 7 1 。 1 3 2 模拟生物膜修饰电极 某些具有双链的表面活性剂可以通过吸附、涂布、共价键合或l b 膜转移等 方法引入电极表面，由于它们的自组装作用，可在电极表面形成有序排列的双分 子结构，这种由表面活性剂所组成的双分子层与生物细胞膜中类脂所组成的双分 子层结构很类似，而且类似于h 1 ) 在生命体内的电子转移，因此研究h b 在该模拟 生物膜上的直接电化学对于研究生命体内的电子转移机制有着实际的意义。 r u s l i n g i 冽等人探讨了h b 在涂布于石墨电极上的溴化双十二烷基二甲基铵 ( d d a b ) 多双层表面活性剂薄膜上的可逆电化学信号。沈含熙【2 9 1 等人则利用天然 磷脂胆固醇月桂酸膜修饰的玻碳电极作为工作电极，h b 在p s6 0 的磷酸盐缓 冲溶液中于0 4 0 v ( w a g a g c i ) 处出现一个灵敏的不可逆还原峰，该峰的出现 一方面是由于该修饰电极能够促进h b 的电子转移速率，另一方面是带正电的h b 与带月桂酸阴离子的磷脂层之间存在静电吸附作用，利用峰电流可以测定f i b ， 线性范围为1 2 5 x l o - s 4 3 1 x 1 0 7 m o l l ，检测限为1 2 5 x 1 0 - 8m o l l 。胡乃非【3 1 1 等 人则利用在多双层表面活性剂薄膜中引入离子型聚合物或离子交换型粘土作为 骨架材料来提高薄膜的稳定性，并在该类修饰电极上研究了h b 的直接电化学性 质和电催化。如以双十二烷基二甲基铵聚乙烯硫酸盐多双层复合薄膜修饰热解石 墨电极为工作电极研究了h b 的电化学行为1 3 ”，在p h5 5 的缓冲溶液中，h b 在 o 1 8 v ( 谘s c e ) 左右有一对相当可逆的氧化还原峰，为h b 血红素辅基 f e ( 1 1 1 ) w e ( i i ) 电对的特征峰，在- 1 0 8v 左右v e ( 1 8 进一步被还原成为f e ( i ) ，该 修饰电极极大的促进了f i b 与电极之间的电子传递速率。 1 3 3 纳米修饰电极 纳米科学研究的领域是非宏观、非微观的中间领域，开辟了人类认识世界的 新层次，也使人们改造自然的能力直接延伸到分子、原子水平，纳米科学的发展 为其它学科提供了新的研究内容。由于纳米微粒具有特殊的结构层次，因此具有 既有别于体相材料又不同于单个分子的特殊性质，在化学化i t 3 3 1 、光电材料1 3 4 1 、 传感材料【3 5 1 、生物医掣坷等方面具有非常重要的应用前景，成为各个学科研究的 热点。 纳米修饰电极是将纳米技术与化学修饰电极相结合的一个新的研究领域，是 6 青岛科技大学研究生学位论文 随着纳米科学发展起来的一门新技术。纳米粒子是尺寸介于1 - 1 0 0n m 之间的细小 颗粒，包括金属纳米粒子、合金纳米粒子、半导体纳米粒子和陶瓷纳米粒子等。 由于它尺寸小，拥有大的比表面积，表面能和表面张力随粒径的下降急剧增加， 产生了量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应及宏观量子隧道效应。纳米粒子具 有这些独特的性质，将其修饰到固体电极表面，不仅可将材料本身的物化性质引 入电极表面，而且也使电极表面拥有纳米材料的特性，增强了电极表面的导电性 和催化效应等。如果将生物大分子和纳米粒子同时修饰到电极表面，细小的纳米 粒子可渗透到生物大分子内部接触到生物大分子的电活性中心，从而缩短生物大 分子活性中心与电极表面的距离，加快直接电子传递的速度。 常见的纳米修饰电极按纳米材料不同可分为碳纳米管修饰电极、纳米t i 0 2 膜 修饰电极、纳米金修饰电极、半导体纳米粒子修饰电极等。 h b 的电活性基团被深埋在其多肽链的内部，很难与电极表面进行直接交换电 子，得不到有效的电流响应，使其直接电化学研究受到很大的限制。许多研究者 致力于电子传递媒介【3 7 】、促进剂p 8 1 和特殊电极材料3 明的研究来活化h b 的氧化还 原中心，并加速h b 与电极之间的电子传递。纳米粒子就是一个很好的电子传递 媒介体和催化剂。李清文【加l 等将h b 吸附于纳米氧化钛涂层电极上，实现了i - i b 在 该电极表面的直接电化学，并通过研究h b 与n o 的相互作用来寻求监测n o 的 各种途径。金利通f 4 】f4 2 等人研制了以玻碳电极为基体的棒状纳米氧化锌修饰电极 和纳米聚硫堇修饰电极，并研究了h b 在该修饰电极上的直接电化学行为，结果 表明h b 在这两个修饰电极上均有良好的电流响应，且电极的响应电流与被测h b 浓度呈良好线性关系，流动注射分析结果进一步表明这两个纳米修饰电极具有高 的稳定性和好的重现性，可望应用于生物体系中h b 的分析测定。李平1 4 3 垮制备 了聚乙烯吡咯烷酮硫化镉量子点修饰玻碳电极，h b 在该修饰电极上有良好的电 流响应，在1 0 x 1 0 吻0 x 1 0 4m o l l 浓度范围内，l i b 的浓度与其响应电流呈良好 的线性关系。 1 4 离子液体在电分析化学中的应用 1 4 1 离子液体的理化性质 室温离子液体是指在室温及临近温度下完全由离子组成的有机液体物质，与 其它常见的固体或液体物质相比，离子液体具有独特的物理化学性质，是一类新 型的介质或软功能材料。由于离子液体可以根据需要设计其阴阳离子的组成并 改变其取代基，进而改变其性能，在一定程度上可以实现人为设计，使其能够符 合化学学科各个方向的研究需要，在有机化学、催化化学、电化学、萃取分离等 7 血红蛋白在离子液体碳糊电极上的直接电化学 领域有了一定程度的应用【4 5 ，4 6 j ，并且已经渗透到功能材料、能源环境和生命科学 等其它学科。 离子液体一般是由特定的体积相对较大的有机阳离子和体积相对较小的无 机阴离子构成，大体可以分为a 1 c h 型离子液体、非a i c l 3 型离子液体和其它特 殊离子液体。常见的阳离子有烷基铵盐、烷基磷酸盐、吡啶离子、昧唑离子等， 常见的阴离子有卤素离子、含f ，p ，s 的离子等。特殊功能化离子液体是针对 某一性能或应用设计的具有特殊官能团或取代基的离子液体。离子液体特点有： 几乎没有可测量的蒸汽压，不易挥发；液体状态温度范围广，最高可达3 0 0 0 c ； 不可燃、稳定性好、离子导电率高、电化学窗口宽；对有机物、无机物都有良好 溶解性，使许多化学反应得以在均相中完成，且反应器体积大为减小；密度大， 与许多溶剂不互溶。而且离子液体的可设计性使其成为特殊的“固体”液体，从 理论上讲可以有超过万亿种高性能的离子液体，这些特殊性质的存在使其在化学 、材料及生命科学中的应用成为可能。离子液体所具有的热稳定性、低挥发性等 特点使其在分析化学中具有潜在的应用前景 4 , 4 5 1 。 1 4 2 离子液体在电分析化学中的应用 由于离子液体具有导电率高、电化学窗口宽的特点，使其在电化学和电分析 化学领域中具有较明显的优点，而且其挥发性小、溶解性好、酸碱性可调，使其 在电化学的许多方面都有巨大的应用前景。b u z z e o 4 9 l 和e n d r e s l 卯1 就室温离子液体 在电化学中的应用进行了综述，详细地介绍了室温离子液体在各种电化学过程的 应用