（细胞生物学专业论文）催眠睡茄（withania+somnifera（l）dunal）离体繁殖与多倍体培育.pdf

摘要 催眠睡茄( 臃砌以刀砌s d 聊咒咖朋( l ) d u n a l ) 离体繁殖与多倍体培育 细胞生物学专业硕士研究生：林春来 指导老师：梁国鲁研究员 摘要 催眠睡茄( 所珐口以缸s 口朋甩咖m ( l ) d u n a l ) 属茄科( s o l 锄a c e ) 睡茄属( 晰肪口甩胁) 植物，主要生 长在印度、南非、巴基斯坦等地。主要用作壮阳药和肝脏滋补品。在抗菌、抗炎症、细胞毒 和细胞免疫等方面表现出显著的生理作用。新的研究发现它还具抗癌作用和放射增敏作用。 此外，催眠睡茄含有大量铁，可用于贫血症。随着催眠睡茄的在保健及医药中的应用，市场 前景非常广阔。 目前，国内外对催眠睡茄的研究人多集中在其二倍体药理应用方面，而在通过倍性育种 提高其药用成份方面的研究尚属空白。本研究结合组织培养和多倍体诱导技术，一方面建立 催眠睡茄离体快繁体系，为其工厂化生产育苗提供理论支持；另一方面，利用秋水仙素溶液 离体诱导，摸索最适的诱导条件，并获得四倍体突变类型，为今后催眠睡茄倍性育种以及由 此获得单株药片j 成份更高的多倍体新种质等相关研究打f 基础。 催眠睡茄离体快繁体系的研究结果表明：最佳的外植体消毒方式：茎段用洗涤剂浸泡 1 0 1 1 1 i n ，自来水冲洗3 0 m i i l ，7 0 乙醇消毒1 5 s ，o 1 升汞( 加吐温2 0 数滴) 消毒1 0 r n i n ，无 菌水冲洗4 6 次。催眠睡茄诱导芽分化的最适培养基均为m s + 1 0 m g l6 一b a + 0 2 m g ln a a ， 诱导率达到了1 0 0 ，成芽系数为4 4 以上。最利于催眠睡茄丛生芽增殖的培养基为：m s + 6 _ b a o 5m 洲a ao 0 5m g l ，增殖系数为5 5 ：最适的生根培养基为1 2 m s + i b a0 2 m i 墨l ，植 株和根系生长状况良好，生根率为1 0 0 ，移栽成活率9 5 以上。 利用秋水仙素溶液，采用浸泡法对催眠睡茄进行多倍体的诱导，结果表明：用0 5 的秋 水仙素溶液处理4 8h 诱导率最高，且得到了较多的纯合体，纯合体诱导率为1 3 7 9 。 对四倍体和二倍体催眠睡茄植株进行了外部形态、气孔、保卫细胞特性的对比观察发现： 四倍体植株的叶片增厚、叶长变短；四倍体叶厚是二倍体的1 6 2 7 ，叶长是二倍体的7 3 1 。 催眠睡茄四倍体的气孔密度下降，为二倍体的5 5 8 3 ，气孔长度明显大于二倍体，长度为二 倍体的1 7 1 7 2 ，保卫细胞中的叶绿体数目明显增多，为二倍体的1 8 8 8 7 。 对四倍体和二倍体催眠睡茄植株进行低温处理后，比较电解质外渗率和细胞膜损伤率。 结果表明：同样的低温下，四倍体催眠睡茄植株的电解质外渗率和细胞膜损伤率均比二倍体 旧南人学硕十学位论文 植株低，说明耐寒能力、抗早性都是四倍体较强。 关键词：催眠睡茄组织培养多倍体 i l a b s t r a c t s m d i e so nr a p i dp r o p a g a t i o na n dp o l y p l o i d b r e e d i n go f 臃砌以刀觑s d 聊以咖朋( l ) d u n a l c a n d i d a t e ：l i nc h u n l a i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl i a n gg u o l u a bs t r a c t 黟7 历口刀胁j 俐疗咖馏( l ) d u n a l ，p l 如t so f 助锄册胁i 1 1n l es 0 1 a n a c 船e i l y c 柚b ef o u n d g r o w i n gi ni n d i a 、s 0 u t i la 伍c a 、p a l 【i s 伽 1 sa n do t l l e rp l a c e s t h ep l a i l tm a i n l yh 弱b e e nu s e d 舔姐 印h r o d i s i aa n dl i v e rt o n i c i t sa c t i v i t ) ，i n 枷i b a c t e r i a l 、i n f l a m m a t i o n 、c y t o t o x i l l 、c e l l u l a ri m i n u n i t y s 柚ds oo n an e ws t u d yf o u n dt l l a ti t sa c t i v i t yi i la n t 沁a n c e ra n dm d i a t i o ns s i t i z i n g 1 i la d d i t i o n ， l e z 历口刀胁s d m 咒咖mc 伽i 诅i i l sal o to fi r o n ，c a nb eu s e df o ra n e i i l i a ，i t sm a r k e tp r o s p e c t sa r ev e 巧 l a 唱ew i t hi tu s e di nt l l eh e a l t ha j l dt 1 1 ea p p l i c a t i o no f m e d i c i n e a tp 他s e n t ，陀s e a r c ha b o u t i 历口聆妇s d 聊盯咖阳w e r ef o c u s e di ni t s p h a n n a c o l o 百c a l a p p l i c a t i o m ，锄dt l l er e s e a r c ha b o u tm i s i i l gi t sm e d i c i m li n g r e d i e n t sb yc h a i l g em e i rp l o i d yi ss t i l l b l a i l l 【ht l l i ss t u d y ，p l a l l tt i s s u ec u l t u r ea n dc o l c h i c i n e si n d u c t i o nt e c h n o l o g yw e r ea p p l i e d f i r s t l y ， t oe s t a b l i s h e dr a p i dp r o p a g a t i o ns y s t e mo f 卵巧历口疗胁s d m 刀咖朋i nv i t r d ，p r o v i d et h e o r e t i c a ls u p p o n f o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o nf o rm en u 娼e r y s e c o n d a 呵，e x p i o r et h e 叩t i m u mc o r l d i t i o n st oo b t a i l 圮d t e t r a p l o i db yc o l c i l i c i n e si n ( 1 u c t i o nt e c h n o l o g y ni st h eb a s e so f t h er e s e a r c hn l a tp l o i d yb r e e d i n go f 聊历口咒胁s d m 刀秽锄a n dt oo b t a i l l e ds i l 玛l eh i g h e rm e d i c i i l a l i n g r e d i e n t sp o b l ，p l o i dn e wg e m l p l 舔m t h er e s u l to f 豫p i dp r o p a g a t i o nr e s e a r c hs h o w s ：t h ee x p l a n t s 、e r ed i p p e di i lt h es c o u rl o “n u t e sa n dw a s h e n3 0 i 】f l i nb yt a p 、7 l ，a t e r t h e ns t 鲥l i z e dl5s e c o n d sb y7 5 a l c o h o la n d13 m i i lb y o 1 h g c l 2 ，m s e d 和6t i m e sb ys 确l i z e dw a t e r 1 1 1 ea p p r o p r i a t em e d i u mf o ri n d u c i n gb u d s 仔咖 e x p l a n t sw 雒m s + 1 o m g l6 b a + o 2 m g ln a a ，i n d u c t i o nr a t e 、) l ，a l s10 0 锄dm e 觚o f b u d sw 舔 4 4 n eb e s to fn m i t i p l i c a t i o nm e d i 啪w 弱m s + o 5 m g l6 - b a + o 0 5 m g 几n a a ，n l u l t i p i i c a t i o n c o e f f i c i 饥tr e a c h e d5 5 1 1 1 eb e s tr o o t i n gm e d i u mw a sl 2 m s + 0 2 m g lm a ，m es t a t e so fp l 觚t i e t s a i l dr o o t s 、r eg o o d t 1 l ei n d u c t i o nr a t ew 舔l0 0 ，t h es u r v i v i i 唱r a t eo fp l 锄t l e t sw 弱a b o v e9 5 a r e rt 锄s p l a n t e dt ot h eg r o u n d t h ei n d u c i n gp o l y p l o i do f 厮锄口刀缸s d 肌甩咖mw 笛c a r r i e do u tb yi 舢e r s i i l gb u d sw i m c o l c h i c i n e s t h er e s u l ti n d i c a t e dt l l a t ：i tw 舔t l l em o s te 仃e c t i v e l yi n d u c e db yi m m e r s i n gb u d si n o 5 c o l c h i c i n es o l u t i o n 五d r4 8 h ，w h i c hh a dt l l em o s tt e t r a p l o i dp l a n t l e t s ， i l l d u c t i v e 舭q u e n c y w a s1 3 7 9 阳南人学硕十学位论文 t h el e a s t o i n a ，g u a r dc e l lc h a r a c t e r i s t i c so ft e t r a p l o i d sa n dd i p l o i d sf 哥钰五订甩胁s d m 刀咖，nw e r e c o m p a r e d t h er e s u l ti n d i c a t e d 也a tt e 仃a p l o i d sl e a v e sw e r et l l i c k e r b u ts h o r t e r 锄dw i t l l1 0 w e rl e a f i n d e x t h em i c k n e s sl e a v e so ft e 心叩l o i d sw e r e1 6 2 7 o ft l l ed i p l o i d sr e s p e c t i v e l y ；t l 他l e n 昏ho f l e a v e so ft e t r a p l o i d sw e r e7 3 1 o fn l ed i p l o i ( 1 sr e s p e c t i v e l y t h et e 心叩l o i d sw i t hf e w e rs t 伽眦 d e i l s i t i e sw r h i c hw e r e5 5 8 3 o f l ed i p l o i d sr e s p e c t i v e l y w i t hb i g g e rg u a r dc e l l s 1 1 l eg l l a r dc e l l s l e n g t ho ft e 舰p l o i d sw e r el7 1 7 2 o fm ed i p l o i d sr e s p e c t m y - t 1 1 en u m b e r so ft h e i rc i l l o r o p l 雒ti i l m eg u a r dc e l l si n c r e a s e de v i d e n t l ya i l dt l l e r ew e r e18 8 8 7 0 ft l l ed i p l o i d sr e s p e c t i v e l y t h et e 缸a p l o i dp l a i l t i e t sa n dd i p l o i d p l a n t l e t so ff f 7 订 口刀胁s d ”l 以台，钍、) l ，e r e c a i 五e do u tm c l o w - t e m p e 翔t l l r et 陀a t m e m ，t l l e nt h e i re x o s m o s i sm t e so fe l e c 仃o l y t ea n dr a t e so fd a i l l a g e o f c y t o m e m b r a i l ew e r ec o r n p a r e d u n d e rt 1 1 es 锄et e m p e m t u r e ，t i l ee l e c t r o l y t ee x o s m o s i sr a t ea n d d a l i l a g eo fc ”o m e i l l _ b m i l eo ft e 仃a p l o i dp l a n t sw e r el o w e rm a nd i p l o i dp l a n t s i ts h o w st l l a t m e t e 仃a p l o i d ￥历口胛胁s d m 刀痧龟m sc o l dr e s i s t a n c ea n da n t i - d r l o u g l i ta r es t r o n g e rm a nt h e s eo fd i p l o i d 臃叻口，l ms d m 刀驴龟朋 1 ( e yw o r d s ： y z t 口以j 矗s d ，靠以 ，；眦r a p i dp r o p a g a t i o np o i y p l o i d y i v 主要缩略语表 主要缩略语表 缩略字 英文名称 中文名称 l l x m g p h m s h g c l 2 m t 6 b a k t n a a i b a a c c w d m s o t s s a f l p r a p d r f l p s s r l i t e r l u x m i l l i g r a m m 吼s h i g ea n ds k o o g n 坨i u r i cc h i o f i ( 1 e m 喇g e 孤d t u c k e r 升 勒克司( 照明单位) 毫克 酸碱度 m s 升汞、氯化汞 m t 6 舭n 剐a i i l i n o p u r i 眦 6 一苄基腺嘌呤 k i n e t i i l m p i l t l l a l e n ea c e t i ca c i d i n d o l e 一3 b u t 如ca c i d a c t i v a t e dc h a r c o a l 激动素 萘乙酸 吲哚j 酸 活性炭 椰子汁 d i m e t l l y ls u l p h o x i d e 二甲基亚砜 t o t a ls o l u b l es o l i d s 可溶性同形物 a m p l i f i e df m g m e n tl e n g mp o l ”n o r p m s m 扩增片段长度多态性 r a n d o n la m p l i f i e dp o l 舯0 r p h i cd n a 随机扩增多态性d n a r e s t r i c t i o nf m g m e n t 胁g mp o l y m o r l ) h i s m 限制性片段长度多态性 s i m p l es e q u e n c er e p e a t 简单序列重复 4 l 独创性声明 学位论文题目：i 崔8 匮睡蕴塞笠鏊堕墨多堡签墙直 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：签字日期：加孵年多月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 e i j 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：乜你保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者张黹禾锄张厂陟哆， 签字日期：坳年月日签字日期： 【二，年己月吖 日 第l 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 催眠睡茄的研究概况 催眠睡茄( 嘶口n 肠s d m 甩塘m ( l ) d u n a l ) 属茄科( s o l a n a c e a e ) 睡茄属( 惭咖口n 胁) 灌小植物，高 约1 5m ，叶为卵形，花绿色或灰黄色，浆果为红色，如下图。它的别名众多，如印度人参、 南非醉茄、心叶青牛胆、冬樱桃等，全草入药，是印度草药医学中被。泛使用的单：药之一。 1 。1 1 催眠睡茄的起源与分布 源产自西印度、北非和中东，现主要生长在印度、南非、刚果、埃及、摩洛哥、约旦、 巴基斯坦等地。因为其生长范围很广，所以在品种间有相当大的形态学和化学成分差异。 1 1 2 催眠睡茄的生物学特性 催眠睡茄是一种很小的灌木，直立有分枝，一般约0 3 1 5 m 高，通常全身披布绒毛。叶 为卵形，长约5 1 0 c m ，宽约2 5 5 c m 。叶底多毛，叶面毛稀疏。花绿色或灰黄色，浆果为呈 球形，成熟后为橙红色，春季用种子繁殖或插条繁殖，春季采收叶，秋季采收根和果实。肉 质根在干燥后都呈圆柱形，表面为褐白色，里面为白色，咪辛辣，带酸。 图l l 催眠睡茄的基本形态 f i g 1 一l t h eb a s i cp a 仕e m s 1 1 3 催眠睡茄的药用成分和应用研究 1 1 3 1 催眠睡茄的药用成分研究 目前认为，催眠睡茄中的主要活性成分是睡茄内酯类化合物。睡茄内酯( w i t h a n o l i d e ) 是 以麦角甾烷为骨架的多氧化类固醇，可转化为人体所需的生理激素的重要前体。除睡茄内酯 外，在催眠睡茄中还存在着其他的生理活性成分。研究表明，睡茄内酯中的生物碱也具有一 两南人学硕十学位论文 定的生理活性【引。目前已从印度人参中分离山1 2 种生物碱，包括异i i 榴皮碱和a 1 1 a f e r i n e ，还 有睡茄碱、假睡茄碱、莨菪碱( 托品碱) 、伪莨菪碱( 假托品) 、红吉豆碱、a n a h y 曲n e 、 d 1 i s o p i l a t i e r i n e 、s o r r m i 蠡谢n e 、w i m 舔o l t l i n i n e 等【3 】o 另外，s i n g i lb 【4 1 研究了催眠睡茄中不含 睡茄内酯的水提取物的活性。 1 。1 3 2 催眠睡茄的应用研究 催眠睡茄用于印度草医学已有3 0 0 0 多年的历史，可全草入药，主要用作壮阳药和肝脏滋 补品。临床和动物实验t 止明它可用丁治疗支气管炎、哮喘、溃疡、衰弱、失眠、以及老年痴 呆、焦虑、认知和神经混乱、帕金森症。在抗菌、抗炎症、细胞毒和细胞免疫等方面表现出 显著的生理作用【5 6 7 8 1 。新的研究发现它还具抗癌和放射增敏作用，即低剂量放疗便可增加 癌细胞的死亡，从而减少放疗副作用唧。此外，催眠睡茄含有大量铁，可用于贫血症【1 0 】。 1 1 4 催眠睡茄的组织培养和育种研究 目前，国内外对催眠睡茄的研究大多集中在其二倍体药理应用方面f l 卅，关于催眠睡茄的 组织培养和育种。1 ：作国外和国内相关报道不多。在催眠睡茄的组织培养方面，k u l k 锄ia a 等【l l 】用催眠睡茄的叶作为外植体得到了完整的再生植株；g i t a r a n i 等【1 2 】对催眠睡茄的体外诱 导和再生系作了研究：p a w a d e g a o n k a r 等【1 3 1 对以叶为外植体的再生苗的根诱导作了研究， 得到了较好的生根培养基；在催眠睡茄的育种方面，r a ys 等【1 4 j 利用组织培养技术和农杆菌 传染催眠睡茄根的技术，提高了催眠睡茄根中睡茄内酯的含量。 1 2 植物组织培养的兴起及应用 植物组织培养是指在无菌和人一i ：控制的营养( 培养基) 和环境( 温度、光照) 卜，研究 植物细胞、组织、器官分化发育及控制其生长的技术。植物组织培养的理论基础是细胞全能 性，该理论认为组成多细胞生物体的每一个生活细胞都具有在适宜的外界条件下独立生长发 育并形成一个完整植株的并幸卉：能力。在细胞全能性理论的指导。卜，植物学家们不断尝试对赢 等植物的器官、组织、细胞进行离体培养。作为植物生物技术支柱之一的离体培养技术，自 1 9 0 2 年h a b e 订a i l d t 首次进行了离体植物细胞培养的试验以来，历经1 0 0 多年，植物组织培养技术 迅速发展，日趋成熟，其成功培养的植物种类不断增加，由此对植物生理、生化、病理、细 胞分化、染色体遗传、基冈j ：程、细胞融合等诸多方面的研究都起到了推动作用，该技术已 经成为生物科学研究和农业经济生产上的重要手段。 1 2 1 组织培养在药用植物上的应用 1 2 1 1 药用植物快速无性繁殖 药用植物栽培中最常见的难题是收种困难，种子发芽率低，或者栽种时耗种量大，繁殖 系数小而供不应求。利用组培中的快繁技术只要用一小块组织就可以在短期内繁殖出成千上 万棵植株，育种周期人为缩短，在野生约用植物变家种过程中也可以缩短驯化过程。如：半 夏( j f 切幽f 口幼w 口缸何为期6 ，通过组织培养，直径1 c m 的块茎一年内可繁殖出2 5 x 1 0 6 株，其 2 第l 章文献综述 繁殖效率远远人于常规方法。另外，离体条件卜j 诱导植株形成微块茎，如义蕊薯蓣( d c d 抛甜f 洲 。施f ) ，是取代试管酶用作种子及种质交流的一种可行途径，因为这种微型薯蓣比小植株对 光、温度的交纯撬往更强，两髓毹够较长时闻豹保存丽不会丧失活力，相对易栽活，费耀较 低。 1 2 。1 2 培养冤病赞药瘸植物赫系 据统计，约有3 5 的药用植物采用无性繁殖，而长期的秃性繁殖易感染病毒，引起品种 邂纯。剩麓攀尖培养技本去毒的途径可以竞服这一障碍，班满足生产发展戆嚣要。如；1 9 8 3 年山东荷泽地区应用嫠尖脱毒与快速繁殖技术获得了地黄矗删口聆刀缸g 觑砌傩口) 无病毒植株， 使地黄块茎产量人幅提高，并以试管苗睁l 作外植体培育出比农家品系高产的薪品种金状元。 1 2 1 3 生产有用次生代谢物 自l 弱o 年b o n n e 等人对镊胶楚澉硝铡巍嬲轰鲻融粥融8 尹泌) 愈伤缀织培养生产天然橡胶以 来，对愈伤组织及细胞悬浮培养进行药物的商品化生产，尤其引起各臀学者的注意。目前， 国内外进行愈伤组织和细胞培养的药用薯蓣植物主要有：三角叶薯蓣( d 。如，f d 妊鲥) 、穿龙慕 蓣( d 。嘲咎翮妇) 、菊秆薯蓣( d 磁哪妇) 、蜃时纂蓣( a 撕印翻髓s 鼢 ( 谢碧霞吲，1 9 辨) 等。 l 。2 1 毒褴物额磊种诱浮帮选育 植物组织培养技术为药用橇物的品种改良和新品种选育提供了新的途径。在特定条件 ，植物缀织培养避稷可以增船植物的突交j 乙率，扶磊诱导产生耨的类受强l 。陈柏君等豺l ( 2 0 0 0 ) 利川组织培养结合秋水仙素诱导成功获得黄芩同源四倍体材料。而且利用植物组织 培养过程易产生体细胞变异这一特性进行抗性育种，现已诱导培育出了越红柿。嚣c 掰良滋翮箨 m i l l ) 、芹菜( 彳舶珊g 删琵拧s 凇，：幽缸cp c ) 等具商抗性的新矗矗种( 赵一鹏等【1 8 】，2 0 0 2 ) 。 1 2 。2 组织培养癌融质姿潼艇贮藏和交换虫的应用 人们利用组织培养技术，在试管内保存种质。其优点有：所占的空间小，像图书资料储 存库那样，萌以储存大量种质资源；可以排除病虫、病毒，便于国际交流；生产上需要可以 立邸进行快速丈量繁殖；傈存的费用较低廉。2 0 毽纪粥年代以来，又发展了种质资源冷冻 保存法，把冷冻生物学和植物组织培养结含起来，大大提高了种质保存的效果。 2 。3 组织培养在生理学研究审的应用 在人j ：控制的条件下，可以进一步研究植物细胞生长、分化与发育：细胞与细胞之间的 生理代 囊；活动与生物仓成；营养细胞与生殖细施酌转化等。| 霹对，数缀脆生物学为基础，研 究组织分化、器官形态建成，梭、茎、叶、花、果的发育；营养生长与生殖生长的植物发育 生物学。由予生理学、生物学研究是在离体培养这种可控制环境条 孛。f 进行的，放悉保证了 实验数据的科学性与准确性，并能在较短时间内取得较多的成果。 3 曲南人学硕十学 市论文 1 2 4 组织培养在细胞次生代谢物质生产中应用 利用细胞培养可以生产人类需要的有机物，如蛋自质、舅旨肪、糖类、香料、色素、生物 碱、药物等。如从黄菊的愈伤组织中得到芳香油；从甜菊偬计f c lr p 蚰“d 啦n 口b ，) 的愈伤组织 和悬浮细胞培养中，可提取甜味齐i j i | 9 】；用长春花( 劬咖口m ，l 髓”s 阳s p l l s ) 细胞生产磷酸二酯酶， 可作为调味品。长春花还可以提取许多种生物碱，有的生物碱还具有抗癌效应f 2 0 j 。通过红豆 杉( 血x 船c 厅砌册s 如( p i l g e r ) r e h d ) 愈伤组织和细胞可以分离提取紫杉醇，制成具有良好抗癌作 用的生物药【z l - 2 2 1 。 1 2 5 组织培养在商业性生产上的应用 植物纽培技术是在生产中得到最广泛应用和产生了较大经济效益的一项生物技术，也是 快速繁殖植物新品种的最重要的方法。组培快繁的商业性应用始丁2 0 世纪7 0 年代美国兰花t 业，8 0 年代已被认为是能够带来全球经济利益的产业。全世界组培苗的年产量从1 9 8 5 年的1 1 3 亿株猛增到1 9 9 1 年的5 ，1 3 亿株，现在已超过1 0 亿株。由于组培苗越来越多地被生产者所接受， 导致了组培新公司的诞生就像它们繁殖的植株数量样以指数增长。据估计，目前全球有关 生物技术产业的年交易额约为1 5 亿美元，其中5 0 6 0 与农业有关。植物缎培茁的贸易额 约占总额的1 0 ，即1 5 0 亿美元，并以每年1 5 速度递增。 植物组培快繁技术在我国也得剑广泛应用，其配套技术的成熟和普及性，在国际上都居 先进水平。由科研单位完成的花卉病毒病快速检测技术；花卉脱毒种苗培育技术；通过不同 浓度灭菌液处理，提高外植体入瓶率技术；筛选不同培养基提高外植体增殖率技术；调整环 境因子促进组培苗健壮生长及提高生根率技术；研究适合当地气候条件的花卉组培苜移栽技 术：不同花卉种类需求的基质类型技术；环境调控及过渡苗培育设施技术；组培苗的栽培技 术；组培茁的包装，储运及销售措旌等实用技术的广泛应用，对促成这一常规生物技术在花 卉种苗的生产供应中发挥了极大的作用。 但由于长期以来，我国的科技人员停留在重科研，轻转化，重论文，轻效益的1 只思维模 式上，只重视科研成果的学术水平，而较少考虑市场的需求，对科研成果产业化的重要性认 识不够，至今还有认为既搞科研又搞经营太累，甚至是不务正业的意识。其次，科技主管部 门的研究经费大多投入在愈伤绗织或胚状体的形成，器官分化和试管苗再生的前期基础研究 上，而对重视和进一步产业化的投入则远远不足。相反，国外发达国家在实验研究，开发推 广和生产试验上的经费投放之比为1 ：1 0 ：1 0 0 。因此导致我国目前植物组培的产业化程度不 高，据不完全统计，目前我国试管苗的年产鼍约为0 5 亿株，与发达国家或花卉产业发展快的 印度等发展中国家相比，存在着较人差距。我国在地理气候，植物资源及技术储备上，有许 多条件与印度类似。我们应该利厢本土资源优势培育特色产品，近期以国内市场为主，不断 研究培育及引进筛选国际流行新品种，生产适销对路产品，努力开拓国际市场，促进我国组 培产业规模化发展，提高组培技术成果的商业性转化。 4 第l 章文献综述 1 3 植物多倍体 3 - l 棱物染色体工程 生物体的遗传性状由基因控制，基因主要位于染色体上，染色体在数量、结构、功能等 方蔼靛交异都会导致生物遗传牲状的改交。按照入静】预定霹标，采奔j 一定的方法和步骤，通 过染色体操纵改变生物染色体组成并进而改变其遗传性的过程称为染色体上程。“染色体r 稷”这一术语是由巍和殛疆s h 黄先提出戆，后来融鑫搭( 1 9 7 2 也使磁了这一术语。植物染 色体上程是作物改良的一条重要途径，也耀进行遗传学研究的有效手段弘引。 染色体t 程按照操作染色俸的组成霹分淹：染色体数露水平，染色体绩构水平秘染色体 组水平3 种基本类型，其中染色体数日上的染色体t 程主要包括染色体的削减、附加和代换3 种；染色体结构水平上的染色体二 程是指各种染色体的结构交异系，主要包括缺必、重复、 傍| 链瓤荔饺4 饕；染色体缓水平上麴染色舔工程包括絷色体缀钓胬减和染色体缓觞辩翻两稚e 由染色体l ：稃的概念可知，染色体i ：挥的研究内容可以概括为两人方面：一方丽是染色 体个体：l ：程，宅是以个爨染色俸或染色俗片段为单使进行的研究，帮在生物正常念子染色体 数( 2 n ) 的基础上增加或减少或替代一条或几条染色体( 或染色体片段) ，以改良栽培作物的遗传 缓成。由了：多倍体是一种很好的“缓冲器”，很容易容纳添加或替代其他种属的染色体，同时 像容易忍受染色体的旁8 减，因此，这方面的研究工作目前多在多倍体诈物与其相应的近缘种 属之间进行，如六倍体小麦( 撇f c “mn 缈咖“l ) 口4 1 、四倍体花生似凇幽鼢坳9 铲c 删l ) 矧，这 获另一个熊度超充分说明了多倍体是染色体个钵工程磅究成功进行的前提。另一方瑟是染色 体纽l ：程，它是以染色体组为单位添加、削减或替代同种或异种染色体组，形成不同染色体 缀数的整倍体薪类型。皇1 9 3 7 馨秋水仙素应用于生物学上以来。添加染色体组的技术早为人 们所熟悉，入工合成了许多同源线异源多倍体植物，四倍体_ 大麦( 渤廊妇m 珊智踟毛) 和八倍 体小黑麦都是由秋水仙素诱导而来。近年来，由于原生质体分离、融合和培养技术的发展， 擞可以通过鳆生震体融合嚣体缫缒杂交怒烈多倍俸；至- 丁戮减染色体缀，燃可经藐楚缭养扶 小孢子得到单倍体植株1 2 6 】：通过花粉培养得到单倍体植株等方法和技术的成功应用，使得植 物多倍体育种的前景因箍j “阔，倍性育种在植物育种领域中具有了不可替代的地馕。现在有 些物种的多倍体新类型已广泛应用于生产，效益显著。铡如小麦。由藏w 觅，通过染色体工 程培育植物多倍体新类型是一个极有前途的育种途径，因此我f i 、j 有必要了解一下植物多倍体。 3 。2 多倍体的概念、种类与由来 任何物种的体细胞染色体数目( 2 n ) 都是相当稳定的。一个属内各个种所特有的、维持 其生活枫蘸鹃最低限度数弱熬一缀染色体，嘲染色体维。各个染色体缝所含有静染色体数舀 称染色体基数x 。多倍体即体细胞染色体组在两个( 2 x ) 以上的个体。多倍体的几组染色体全 部来自同一物种，或者说由阕一个物种镌染色体缀加倍两成，则称为同源多倍体，露把由来 自不同种、属的染色体组构成的多倍体或者说由不同种、属问个体杂交得到的f 。群经染色体 加倍得到的多倍体，则叫做异源多倍体。同源异源多倍体，含有来自一个种的两个或两个以 5 跨南人学颈士学位论文 上的染色体组，和至少一一个米白另一个物种的染色体组；区段异源多倍体，义称h 段异源多 倍体或部允异源多倍体，其不周染色体组间只是大部分同源，另外一部分异源。 多倍体在植物界狠普遍。被子禳物中大约有一半的物种是多倍体，其中以蓼科 ( p o l y 9 0 n a c e a e ) 、景天科( c r a s s u l a c e ) 、蔷薇科( r o s a c e 辩) 、锦葵科( m 鑫l v a c e 瑟) 、蕞茄辩 ( s 0 1 a i l a c e a e ) 、莱本科( 锨h 1 i n e a e ) 和鸢尾辩( l r i d a c e a e ) 最多，最常觅的楚圜倍体和六德体。汞本 科里约有四分之三的物种是多倍体。在植物的迸亿过程中，染色体的多倍仡现象起了莛要作 用，同时也参与了许多物种的形成。杂合性是多倍体的基本特征，多倍体比二倍体具有更多 的杂合位点和更多的互作效应。 现已查明多倍体形成的细胞学机制，是由予细胞分裂时染色体不分离而引起。大体有两 种情琵，是减数分裂时，全组或部分染色体没有减数，仍停嚣在一个细胞核里，从丽形成 二倍 燮的生殖细胞，这种未减数的2 藏雄配子与带有2 n 的雌配乎结合，发育成四倍体；但由 于2 n 雄配子在授粉j 逢程中常竞争不过经减数分袈的雄耗子( n ) ，因而会出现来减数的雌配 子与减数的雄配子褶结合，形成天然= 倍体裢物；男一种是有丝分裂时，染色体虽然复制了， 僵细胞没有相应地发生分裂，从而搜细胞核墨惫含了耽原来多一倍的染色体，产生了一二倍体 与多倍体的嵌合体，由多倍体细胞发育成的个体就楚多倍体。所以，除生殖纲胞外，体细胞 染色体也可能加倍。许多花卉植物由于多次摘心、切伤、愈伤缀织缨胞的染色体有时也加倍， 但体细胞自然加倍的儿率远返低子生殖缅胞，这是由于生殖细胞比体纲胞敏感，任何外界条 件的激烈变化都有可能导致减数分裂行为异常，使形成的生殖细胞染色体没有减数。 多倍体是由二倍体进化焉来，现在采用染色体组分析的方法，更证明多倍体是由不同的 二二倍体物释进化两来。嚣要指出，染色体自然船嫱灼外部原网可能与细胞分裂对受剑的环境 条件的影晌有关。众多的研究认先，在自然条件卜，温度的剧变、紫外线辐射和恶劣多变的 气候条件，是产生多倍性细胞的重要原羧。妇蹋本学者松暖秀雄发现，在炎热的夏季，紫矮 牵牛( 舰蔽痢纭e 麟渤疵) 的花粉中往往混杂有比通棠更多始巨大约花粉粒，其染色体数目 比通常的多一倍。类似的现象也常常在农作物中发生，夏季在稻田里往往发现有魍然产生的 单倍体、三倍体或圈倍体檀株。杜鹃属( 霆矗蒯酾妇毋涨) 及醉鱼草属( 殛娥妇敬) 的植物的多 倍体多分布在我函西南部海拔高、溢度变化捌烈、紫外线辐射较强的离出地区，两二倍锩种 只分布在平原地隧。在接近植物分布透缘地区，植物多倍体葺分率较高，表明了多绥体的产 生易受环境因素的影响；同时也说明，多倍体的产生魑植物对不利条件豹适应，楚自然选择 的结采，从而进化发展成新的变种或物种。 1 。3 。3 人工诱导多倍体 多倍体育种包括两大领域，朗自然多倍体的发掘和人工多倍体的诱导。一般来说，踟于 自然多倍体已经经历了长时间的适应与选择，因而在生长表现上往往好予新生的入_ l 二多倍谇， 因此也更具有利用价值，但是种群中的自然多倍体数量毕竟是有限的，不可能达到多倍体育 种所需要的具有丰富遗传背景的火餐群体。因此，入l = 多倍体诱导成为众多多倍体育种工作 者的更好选择。 6 第1 章文献综述 1 3 3 1 物理因素诱导多倍体 物理因素包括温度剧变、机械创伤、电离射线、非电离射线和离心力等。早期利用创伤 与嫁接诱导多倍体，植物组织在创伤的愈合部位的染色体易加倍，其上面的不定芽发展成多 倍体，用此方法在茄科( s o l a l l a c e a e ) 植物上得到了多倍体【2 7 1 。l 己锄d o l p h ( 1 9 3 2 ) 将授粉2 0 h 后的 玉米( z 扔8 峪l ) 幼胚，突然放到4 2 4 3 的条件下2 0 3 0 m 协，正在分裂的细胞由丁骤遇高 温而停止分裂。当温度恢复正常时，受处理的有些细胞就变成为多倍体细胞，从而得剑四倍 体玉米【2 8 1 。k w i s ( 1 9 8 0 ) 对白梨( 帆6 旭窍c j i l 玎p 娩一) 的带芽枝条进行热处理，获得了三倍体p 9 】。 杨今后等( 2 0 0 4 ) 通过桑树c 如，淞点印) 无性系辐射诱导得到r 一8 1 1 、湖桑1 9 9 和红沧桑等3 个 四倍体【3 0 1 。 1 3 3 2 化学因素诱导多倍体 化学方法诱导是目前应用最广泛的方法。运用秋水仙素处理诱变植物结合离体培养技术 是农作物多倍体选育的一条重要的育种途径。秋水仙素处理效果最好，是使用最广泛的染色 体加倍剂。秋水仙素的作削机理在r 它能抑制细胞分裂时纺锤体的形成，染色单体分离但胞 质不分离导致细胞染色体数日加倍。到目前为止，国内外研究者已在苹果( 胁船p “掰妇肘硼) 、 草莓( 脚，缸口刀鲫伽口d “咖人大蒜( a & 仇谊肌l ，- p 如瑶聊w ，lr 昭p 从黄瓜( c k c 甜肌括 阳f f 铘加刀) 等农作物上诱变成功m3 2 3 引。二甲基亚砜能促进秋水仙素浸透刨植物组织中， 用1 4 的二甲基弧砜与一定浓度的秋水仙素混合，可提高染色体加倍的效果。但秋水仙 碱类的化学药晶相对来说含有较多的有害物质，而且还会导致花期延迟，降低结实率。近年 来，许多研究者试图寻找能够替代秋水仙碱的染色体加倍试剂，比如水稻素( o 呵z a l i n e ) 、 s u r n a n 等，这些试剂属丁灭虫剂或者除草剂，其作h j 机理主要是抑制植物的彳j 丝分裂，从而 收到染色体加倍的效果。特别是水稻素目前已广泛应用丁植物的染色体加倍的研究中，比如 甜菜( 曰w 鑫矽墒) 【3 4 1 、梨属亿硗p 纪以历淞) 【3 乳、杜鹃僻j l 谢d d 朗西硼s 砌s 打p 如疗c 硝3 q 等。 1 3 3 2 1 活体条件下的诱导 秋水仙素是对正在分裂的细胞产生作用，因而生产上常选用萌动或萌发的种子、幼苗、 正在生长的嫩梢及芽为处理材料，用一定浓度的秋水仙素或乳剂对材料进行浸渍、涂抹、滴 液、注射等方法处理诱导。多种果树采用此方法均获成功，如葡萄( 豫括，协妇) 【3 7 1 、猕猴桃 似c 砌i 讹西仂嘲括) 【3 引、香蕉拟s 口口c “m 加口细) 等。 1 3 3 2 2 离体条件下的诱导 组织培养技术的发展使以单个细胞或少数细胞为诱导材料，再由诱导加倍的细胞分化成 植株成为可能，它不仅能减少或避免常规处理易产生嵌合体的干扰，获得同质的多倍体，提 高诱变效果，而且能在人为控制实验条件下反复多次试验，提高诱变率。此外，诱变群体多 也能保证多倍体筛选、选择的成功，并且一口筛选出的多倍体能在短时间内迅速繁殖出人量 纯度高、质量好、无病虫害的试管苗，便于进行田间鉴定，示范推广。 1 3 3 3 生物学途径 7 熊南人学硕七学位论文 l 。3 3 。3 。l 有性杂交培育多倍体 有性多倍化比体细胞多倍化有更多的生物学优点，如更高的杂台性和更高的育性，且与 多倍体臼然形成的过程有相似之处：一是利用2 n 配子，如陆奥、乔纳金等苹果c m p 甜m 渤m i l l ) 三倍体黼种都是二倍体品种问杂交育成的。二是剃爝多倍体亲本。剩耀二倍体和二倍体、多 倍体杂交、多倍体之间杂交均可获得多倍体。实践证明，为了获得较多的多倍体，最好用多 倍体与二倍体、多倍体之间进行杂交，如在葡萄( 懈咖枷) 、苹果 印甜m 池m i l l ) 和白梨 配确嘞r 嚣殛瓣夕等遗取褥较犬成功阍。 1 3 。3 3 。2 胚乳培葬 在被子捷物中，憝乳是双受精的产物，当雄配予进入胚囊时，幽两个极核和一个雄配予 融合而形成的胚乳核发育而成，所以在倍性上大多属丁三倍体。胚乳为三倍体组织，可以通 过胚乳培养获得三倍体植株，如苹采、枣z 嘲确淞膨拓施赫、杨桃搿嘲柏溯翻煅珑幻酝l ) 、 拶毋嚣摊销& 瑙妇l 。) b 皱幽) 、疆罨莲勰咧勋煺础蕊s i 嫩s 。) 、棒p 妇叻粕s 勋级l ) 、柑桔 ( a 仇岱l ) 、梨( b 例sp y r 扣妇n a k a i ) 、猕猴桃似c f m 砌d 如，f c 此塔口( a c h e v - ) 等【4 1 l 。胚乳离体 培养为无核巢树黼种培育提供了一条新途径，篮沈2 x 和4 x 杂交获得三倍体快褥多。座东红 等( 1 9 9 5 ) 通过柿子的胚乳培养还获缛耀倍体的再生植株1 4 2 】。 l 。3 ，3 1 3 。3 细胞融合 细胞融合，也称体细胞杂交，是用人工的方法把分离的不同属域种的原生质体诱导成为 融合细胞，然后再经离体培养、诱导分化到再生完整植株的整个过