（纺织工程专业论文）酪氨酸酶的提取及其参与的羊毛抗菌整理.pdf

摘要 摘要 酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ，e c l 1 4 1 8 1 ) 又称多酚氧化酶，是哺乳动物体内黑色素合 成的关键酶，是一种铜蛋白酶；乳铁蛋白( l a c t o f e r r i n ，l f ) 具有抗菌性能。本实验 的主要目的是把乳铁蛋白接枝上羊毛，使羊毛具有抗菌效果。 本文首先使用简易的方法从马铃薯中提取酪氨酸酶，并用邻苯二酚作为底物，测试 了酪氨酸酶的最佳催化条件；接着把对氨基苯磺酸钠作为模拟化合物与催化氧化了的羊 毛反应，运用紫外、红外光谱进行了分析；最后使用一浴法和两浴法接枝乳铁蛋白 ( l a c t o f e r r i n ，l f ) ，并进行了紫外、红外、电镜和抗菌性能等分析。 实验结果表踢：自制马铃薯酪氨酸酶具有一定活力，最佳的催化氧化条件为：温度 3 0 、p h6 8 、储存天数3 天。通过接枝对氨基苯磺酸钠，可以知道2 0 0 u g 、振荡速 率为3 0 r 的时候，对氨基苯磺酸钠的接枝效率最高，为4 5 3 3 ；同时织物运用紫外和红 外光谱分析也可以确定发生反应，证实了发生反应的可能性。通过红外和电镜分析可知， 一浴法能够接枝乳铁蛋白；通过紫外分析可知，经过酶处理的羊毛接枝效率为3 6 8 ， 大于失活酶处理羊毛的接枝效率( 1 2 5 ) ；通过抗菌性能测试可知，经过酶处理的羊毛 抗菌率为5 6 3 2 ，大于失活酶处理羊毛的抗菌率( 1 2 6 3 ) 。通过二浴法接枝乳铁蛋白 可知，反应的最佳p h 为9 ，最佳反应温度为6 0 ；通过抗菌性能分析可知，经过酶处 理的羊毛抗菌率为4 3 6 8 ，大于大于失活酶处理羊毛的抗菌率( 1 4 7 4 ) 。 关键词：酪氨酸酶；乳铁蛋白；羊毛；抗菌 a b s t r a c t a b s t r a c t t y r o s i n a s e ( e c i 14 18 1 ) ，a l s ok n o w na sp o l y p h e n o lo x i d a s e ，i st h ek e ye n z y m ei n m a m m a l sm e l a n i ns y n t h e s i s t y r o s i n a s ei sac o p p e rp r o t e i n ，w h i c hp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n c a t a l y t i cw a y l a c t o f e r r i ni st h ep r o t e i nw i t c hh a st h ep r o p e r t i e so fa n t i - b a c t e r i a l t h ep u r p o s e o ft h i se x p e r i m e n ti s g r a f t i n gl fo n t ow o o l ，s ot h a tt h ew o o lh a st h ep r o p e r t i e so f a n t i b a c t e r i a l t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e dt h eb e s tc a t a l y z e do x i d a t i o nc o n d i t i o no ft y r o s i n a s ef r o m p o t a t o e sw i t hs i m p l ea n de a s ym e t h o dw i t hc a t e c h o l ( c a t e c h ap h e n 0 1 ) a ss u b s t r a t e t h e n g r a f t e d w o o lw h i c hw a s c a t a l y z e db yt y r o s i n a s e w i t h a n a l o gc o m p o u n d ( s o d i u m s u l f a n i l a t e ) t h e na n a l y s e dw i t hu v a n df t i r a t r a tl a s tg r a f t e dw o o lw h i c hw a sc a t a l y z e d b yt y r o s i n a s ew i t hl a c t o f e r r i n ，t h e na n a l y s e dw i t hu v 、f t i r a t r 、s e ma n da n t i - b a c t e r i a l t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t ：s e l f - m a d ep o t a t ot y r o s i n a s eh a sac e r t a i nv i t a l i t y , t h eb e s t c o n d i t i o n sf o rt h ec a t a l y t i co x i d a t i o ni st e m p e r a t u r e3 0 ，p h6 8 ，t h es t o r e dd a y s 茎3d a y s t h eb e s tg r a f t i n ge f f i c i e n c yi s4 5 3 3 w h e n2 0 0 u ga n d3 0 r ( o s c i l l a t i o nr a t e ) b yg r a f t e d s o d i u ms u l f a n i l a t e t h e np r o v e dt h a tt h er e a c t i o nw a sh a p p e n e db yu va n df t i r - a t r o n e b a t hw a yc a ng r a f tl a c t o f e r r i nb yf t i r - a t ra n ds e m t h eg r a f t i n ge f f i c i e n c yi s3 6 8 a t c a t a l y t i cw o o la n d12 5 a tn o n c a t a l y t i cw o o lb yu vs p e c t r u m t h ea n t i m i c r o b i a lr a t ei s 5 6 3 2 a tc a t a l y t i cw o o la n di2 6 3 a tn o n - c a t a l y t i cw o o lb ya n t i b a c t e r i a lt e s t t h eb e s t c o n d i t i o ni sp h 9a n dt e m p e r a t u r e6 0 cb yt w ob a t hw a y a n dt h ea n t i m i c r o b i a lr a t ei s 4 3 6 8 a tc a t a l y t i cw o o la n d1 7 7 4 a tn o n - c a t a l y t i cw o o lb ya n t i b a c t e r i a lt e s t k e y w o r d s ：t y r o s i n a s e ；l a c t o f e r r i n ；w o o l ；a n t i b a c t e r i a l i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：鸟寥坟导师签名： 日 期： 第一章绪论 1 1 酪氨酸酶 第一章绪论 11 1 酷氨酸酶简介 酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ，1 y r ，e c1 1 4l81 1 是一种7 5 k d 的含铜酶，是参与黑色素代 谢和儿茶酚胺合成的关键酶 t - 2 l 。l - 酪氨酸在酪氪酸酶的作用下形成l 一多巴卜”，接着多 巴被进一步催化氧化成为l 多巴醌。酪氨酸酶广泛存在于哺乳动物和植物中植物酪氨 酸酶与些水果和蔬菜加工过程中的褐变有关p 】：哺乳动物酪氨酸酶常见于黑色素细胞 中，黑色素细胞是存在于皮肤，发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞，酪氨酸 酶功能减退或缺失时，即会影响黑色素代谢，从而发生白癜风、白化病等疾病：动物与 人的染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关。不同来源的酪氨酸酶有着不 同的分子特性、分子量和等电点。哺乳动物、原核生物、真菌酪氨酸酶一般为单聚体， 而高等植物、昆虫、两栖类动物的酪氨酸酶一般为二聚体、四聚体或五聚体。 h ls 8 h 】s 5 7 s 9 0 s 2 5 0 o s 2 8 2 图卜1 酷氨酸酶活性中心的兢核铜中心结构 f i g 卜1 t h es tr u c t u f eo f t h ea c t i e n t e rc o n ta i n i n gc u o ft y r o s in a s e 酪氧酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点( c u a 和c u a ) 构成1 6 l ，如图1 - l 所示。 在催化氧化过程巾，烈核铜离子位点以3 种形畚存在，分别是氧化态、还原态和脱氧态。 研究表明与醅氨酸酶结台的取核铜离子活性中心与在血蓝蚩白中发现的活性中心非常 相似1 7 - a l ：由x 射线吸收光谱分析得知，酪氨酸酶和血蓝蛋白舍铜活性中心的铜离子位 点的几何构型都是可变的，而且主要的构象变化基本相同。 血蓝蛋白氧化态结晶学和x 射线吸收结构光谱的研究结果表明，c u - c u 键长约为 o3 5n m ，2 价铜离子构型为正四棱锥状，受到两个强的赤道面配位原子的影响和三个相 对较弱的轴向n 配基的影响，形成5 个配位键( 结构町见图l 一1 ) 。其电子构象为3 矿， 即与蛋白上的组氨酸残基上的氪原子形成3 个配位键，外源氧分子与铜离子形成两个配 位键占据了铜离子的两个赤道面位置，并成为两个铜离予之间的桥联体。所以氧化杏活 、。 。lj 江南大学硕士学位论文 性中心可以写成c u ( a ) o c u ( b ) 。酪氨酸酶被认为是血蓝蛋白的祖先蛋白，因为酪氨酸 酶在非常原始的生物体中也有发现。氧化态的结构比血蓝蛋白的结构更紊乱，因此酪氨 酸酶相对于血蓝蛋白存在更多构象不同的底物与其活性中心结合。 还原态酪氨酸酶与o c u 离子态的酶相似，都含有两个四角形的反磁铜离子，不同 的是，桥联体是氢氧化物而不是氧化物。每个亚铜离子电子构象为3 d l o ，分别与两个吲 哚上的氮原子形成两个键长为0 1 9 n m 的配位键，与第三个吲哚上的氮原子形成键长为 0 2 7 n m 的配位键，环绕c u - c u 轴形成近似c h 3 一c h 3 的对称立体结构。当加入氧化物时， 酶从还原态变为氧化态；当缺少过氧化物时，酶由氧化态变为还原态。纯化后得到的酪 氨酸酶应该是一种由氧化态和还原态组成的混合物，研究表明其中包含8 5 的还原态 和1 5 的氧化态。 脱氧态酪氨酸酶含有一个2 价铜离子和一个l 价铜离子。2 价铜离子含有未配对的 电子，由电子磁共振分析得知，未配对的电子占据一个d x 2 啦轨道。由两个铜离子之问 电子离域的电子顺磁共振和可见光谱特征可知，在两个铜离子之间同样有桥连体的存 在。 1 1 2 作用机理 酪氨酸酶催化氧化l 一酪氨酸并最终形成真黑色素是一个非常复杂的过程。1 9 2 8 年 r a p e r 首先提出：黑色素合成是酶催化和化学反应相结合的结果，如图l 一2 所示。1 9 5 5 年，这一理论被m a s o n 证实并完善。黑色素合成的“r a p e r - m a s o n ”途径传统地被分为 两个阶段，酶催化步骤和混合反应步骤，酶催化步骤包括单酚( l - 酪氨酸) 和多酚( l - 多 巴) 的酶氧化，由含铜酪氨酸酶催化氧化形成l 多巴醌；混合反应步骤包括化学反应和 酶反应，发生在l - 多巴醌形成以后，最终合成真黑色素【9 】。从生物学的观点可以看出， 酶催化步骤是黑色素形成的关键步骤。酪氨酸酶有两个主要功能：作为单酚酶经羟基化 单酚生成邻二酚，作为双酚氧化邻二酚生成邻醌【1 0 。2 1 。酪氨酸酶催化氧化的两种不同反 应【1 3 1 4 】：l 酪氨酸一l - 多巴( 单酚氧化酶活性) 和l - 多巴一l _ ( 多酚氧化酶活性) ，这两种 反应都需要分子氧，1 8 0 标记氧原子的同位素研究证明：在羟基化过程中，来自分子氧 的氧原子渗入到单酚中。有关酪氨酸酶作用机制的报道主要集中在解释单酚酶和二酚酶 活性特征。 2 第一章绪论 5 ，6 - 吲哚醌 5 ，每二羟基吲哚羧酸 5 ，6 - 吲哚醌羧酸 混合黑色素 图1 - 2 酪氨酸酶催化生成黑色素过程 f i g 1 2 t h ep r o c e s so f t h em e l a n i nb i o s y n t h e s i sc a t a l y z e db yt y r o s i n a s e 1 1 3 研究进展 至今已纯化出许多不同来源的酪氨酸酶，并在不同程度上进行了表征。其中，已经 对来自蘑菇、马铃薯和老鼠的酪氨酸酶，在结构和功能上作了广泛的研究【1 5 16 1 。1 9 8 9 年w i t t b j e r 等人从黑色素细胞中分离出人体的酪氨酸酶，同年s h i b a h a r a 、t a k e d a 等人， 克隆出人的酪氨酸酶基因。1 9 9 6 年d e lm a r m o l 和b e e r m a n n 的论述对酪氨酸酶基因表达 的认识取得了相当大的成就，奠定了现代研究酪氨酸酶的基础。由k w o nb s 等人分别 从正常人体黑色素细胞和老鼠b 1 6 黑色素瘤细胞中分离得到酪氨酸酶的c d n a 以来，对 酪氨酸酶的一级结构及其功能进行了大量的研究，其一级结构的各个区域的功能己研究 的比较充分；同时还确定了酪氨酸酶含有6 个糖基化位点，以及它们在酪氨酸酶活性中 的各自作用。但是，由于技术的欠缺，目前只能获得的野生型和少量变异型的酪氨酸酶， 这限制了酪氨酸酶的生化性质的研究。 目前，国内外有关酪氨酸酶的研究主要集中在它与疾病的关系。酪氨酸酶的突变及 表达异常，往往引起恶性黑色素瘤、白化病、白癫风等疾病，使得人们迫切的需要去认 识酪氨酸酶。目前黑色素中酪氨酸酶的分离也早有研究，其中，蘑菇酪氨酸酶已商品化。 八十年代初，随着人们对酪氨酸酶催化的产物多巴和黑色素特殊功能及其多种用途 的新认识，对编码该酶的基因酪氨酸酶基因的研究也日益引起人们的广泛兴趣和重 视。 3 江南大学硕上学位论文 1 2 乳铁蛋白 1 2 1 乳铁蛋白简介 乳铁蛋白( l a c t o f e r r i n ，l f ) 是一种铁结合糖蛋白，纯品为红色，故又称为红蛋 白，存在于多种哺乳动物的分泌物中，可以从人乳和牛、马、猪、羊等动物的初乳中分 离出来。牛乳铁蛋白的分子量大约是8 0 k d ，p 1 约为8 0 。一分子乳铁蛋白含有两个铁结 合位点，含有1 5 - 1 6 个甘露糖，5 6 个半乳糖，1 0 - 1 1 个乙酰葡萄糖氨和1 个唾液酸n 7 1 8 1 。 l f 的二级结构以q 螺旋和6 结构为主( 7 0 以上) ，二者沿蛋白质的氨基酸顺序交 替排列，而且q 螺旋大大多于1 3 结构。其多肽链上结合有2 条糖链，含量约为7 左右， 糖的组成有半乳糖、甘露糖、n 一乙酰半乳糖、胺岩藻糖以及涎酸等。 l f 的立体结构主要呈“二枚银杏叶型 ，如图1 - 3 所示，分别在分子的n 一端和 c 一端形成2 个环状结构，在每叶( 环状结构) 的内部隙缝处都有一个铁结合位点。此二 叶结构有较多的重复性，即n 端大约有4 0 的组成与c 端相似，因此这两叶可被分解为 独立的两部分，每部分都有一个单独的铁结合位点。这两部分每叶都有2 个相似的 q b 区域，其不同之处主要在于其中一叶有6 束层状结构，另一叶则只有5 束b 层 状结构，目前x 衍射的最大分辨率( 2 8 a ) 尚不能完全区分此2 个铁位点的不同n 蚴1 。每 个铁原子与l f 上的4 个氨基酸残基相连( 2 个酪氨酸，1 个天冬氨酸，1 个组氨酸) ，同 时这个铁原子还连接着一个碳酸根离子，此阴离子占据了铁离子与l f 上2 个带正电的 氨基酸( 精氨酸和n 端) 的空隙，这样它就能中和这2 个氨基酸的电负性。l f 的铁结合稳 定性主要是由于n 一端叶与c 一端叶之间相互作用的结果，但l fn 一端与c 一端铁结合稳定 性并不相同，研究表明，n 一端对酸显出更不稳定性。 铁离子结合到l f 后会引起后者的空间构象的变化，使l f 分子结构更加紧密乜。铁 离子进入到每个叶敞开的缝隙内部之后，这个区域就会相应的闭合，使该区域的结构变 紧密。l f 的这种构象变化也解释了铁饱和”比脱铁”更不易变性和水解的原因( 特别 是对c 一端结构，因为闭合之后，它的结构比n 一端更紧密) 。而l f 比铁蛋自具有更强的 铁结合要求，这也是l f 铁结合功能的关键性质。l f 不仅可以和铁离子结合，也可以和 其他一些过渡金属离子如铜离子、钙离子、铝离子结合。 4 第一章绪论 l a p r k n v r w c u s o p i w ( f k c r r w q w r m k k l g a p i i c v r r a f ) a i 迎c i r a i 5 0a e 融a i ( d ) g g m e a c r d p 砌也r p v a a e i y g t k e s p q t h ( y ) y a v a vv x 10 0k g s n i q i d q i q g r k s c h t g l g r s a g 、7 l ，p m g i l r p y l s w t e s l e f l o g a v 15 0a k f i s a s c v p c i d r q a y p n l c q l c k g e g e v n q c a c s s r e p y f g ( y ) s g a f kc l 2 0 0q d g a g d v a f v k e t 】 下e n l p e k a d r d q y e l l c l n 奉n s r v a p v d a f k e c h l a q 2 5 0v p s ( h ) a v v a r s v d g k e d l i w k l l s k a q e k f g k n * k s r s f q l f g s p p g q r d ll 3 0 0f k d s a l g f l r i p s k v d s a i y l a s r y l l r i t l k n l r e t a e e ( a r y n v v w c a 3 5 0v g p e e q ( k k c q q w s q q s c q n * v t c a t a s t ) 并t d d c i v 】l v l k g e a da l nl d ) g g 4 0 0y 1 a g k c g l v p v l a e n r k s s k y s s l d c v l r p i e g ( y ) l a v a v ( k a n e g l t w n 4 5 0s l d k k s c h t a v d r t a g w n i p m g l i v n * q t g s c a f d e f f s o s c a p g i m p k s 5 0 0r l c a l c a g d d q g l d k c v p n s k e k y y g ( y ) t g a f r c l a e d v g d v a f v k n * d t v w 5 5 0e n t n g e s t a d w a k n l m 也d f i 也l c l d g t rk p v t e a o s c i i l a 心n m ) a w s 6 0 0r s d r a a h v k q v l l h q q a l f g k n g k n c p d k f c l f x s e t k n l l f n d n t e c l a 6 5 0k l g g r p l 皤e e y l g t e y v t a 认n l k k c s t s p l l e a c a f l t r 图1 - 3l f 的分子特征 f i g 1 3 t h em o l e c u l a rc h a r a c t e r is t i c so fl f 注：( ) ：和( ) 表示n 端和c 端2 个相对应的圆环结构氨基酸残基组成；括号表示推测的铁结合 氨基酸残基；带星点的氨基酸位表示潜在的糖键结合位点 1 2 2 乳铁蛋白作用 1 2 2 1 抗细菌： 乳铁蛋白能够牢固地与铁离子结合，使铁离子不能被细菌所利用，从而不能大量繁 殖，其机理相当复杂【2 2 。2 5 1 。从牛奶衍生的乳铁蛋白能够抑制浓度为0 3 3 0 l am o l k g 的 各种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的繁殖。芝加哥医科学校进行的一项动物试验研究发 现，乳铁蛋白可能具有预防脓毒性休克症状的作用；亦有报道指出，乳铁蛋白对几种人 体病毒具有抵抗作用。 1 2 2 2 抑制游离基形成 乳铁蛋白所具有的另一项生理功能，是通过清除催化形成的游离基，以预防氧化所 带来的各种危害【2 6 铆】。超氧化物及羟基自由基是引起许多皮肤损害的主要原因，如皱纹 形成及其他老化症状，因此，乳铁蛋白可以作为化妆品及个人保健制品的成分。 1 2 2 3 铁质转移 一些研究证实，铁饱和的乳铁蛋白是膳食中铁质转移的一种有效形式。一般可在婴 儿食品配方中采用乳铁蛋白来改善体内铁质的平衡。铁饱和的乳铁蛋白是易于被生物利 用的铁添加剂的良好来源，可作为膳食补铁剂，在运动饮料，以及为妇女而设的食品中 应用。乳铁蛋白不象使用无机铁添加剂那样会引起便秘，目前，日本正重点研究采用乳 铁蛋白来强化食用脂肪和油中的铁营养元素。 1 2 2 4 促进细胞生长，提高免疫能力 乳铁蛋白对肠道的细胞生长具有有益作用，能使肠道的消化功能迅速恢复正常。最 5 江南大学硕e 学位论文 近的一些研究更发现，乳铁蛋白能刺激人体免疫系统活动，在膳食中添加乳铁蛋白，将 有益于老年人或免疫系统受损人群的健康。 1 2 2 5 促进双歧杆菌增殖 据报道，乳铁蛋白办能促进双歧杆菌的生长。这样乳铁蛋白可作为配制含有有益菌 的功能性食品添加剂。 1 2 3 乳铁蛋白研究进展 乳铁蛋f 刍( l a c t o f e r r i n ，lf ) 最早于1 9 6 0 年由科学家m o n t r e u i l j 和j o h a n s o n b 等在母 乳乳汁中发现。随后，b a s e l o l i n i 等科学家在一些生物体的体液和各种细胞中亦发现了 这种蛋白质，遂将这种蛋白质命名为乳铁蛋白，并进行了大量的研究。 1 9 9 3 年在日报召开了第一届乳铁蛋白的结构和功能国际会议，会上研究者就乳铁蛋 白的铁结合机制、生物功能、医药和食品上的应用进行了探讨，标志着乳铁蛋白特有的 生物学意义己受到世界范围的广泛重视。 1 3 抗菌研究进展 羊毛是纺织工业的重要原料，具有弹性好、吸湿性强、保暖性好、光泽柔和等特点， 这些性能使毛织物具有各种独特风格。羊毛纤维及相关材料主要是由角蛋白构成的，角 蛋白是含硫蛋白质的复合体。尽管分子间存在的二硫键、盐式键和范德华力使毛纤维对 于蛋白水解酶的水解作用有较强的抵抗作用，但在适宜的温度和湿度条件下，毛纤维会 成为细菌和真菌生长的合适媒介，这会导致毛纤维降解【2 引。因此羊毛织物应该进行防微 生物处理，以避免微生物的生长和传播以及毛纤维的损坏。 抗菌剂按照结构分【2 9 1 ，一般分为三类：无机类、有机类和天然生物抗菌剂，如表 1 1 所示。 1 3 1 无机抗茵剂 耐热性好，但用于纺织品后整理时难以获得耐久的效果，并且大部分品种存在重金 属毒性问题。无机抗菌剂以新型光催化型和载银的纳米复合型抗菌材料为主要发展趋势 【3 0 1 ，其中光催化型无机抗菌剂依赖光致激发的强氧化自由基而起杀菌作用；载银等金属 离子型抗菌剂通过与活性基团如巯基键合或置换金属离子辅基等方式使微生物的生命 活性物质失活而起到抗菌作用【3 1 3 3 1 。 1 3 2 有机抗菌剂 以开发专效于生物分子( 如微生物代谢酶、膜受体等) 的抗菌剂为其拓展方向，其 通过作用于细胞壁和细胞膜系统、生化反应酶、遗传物质等达到抗菌或杀菌作用。有机 抗菌剂效果好、品种多，是目前使用最为广泛的一类抗菌剂，但存在耐高温稳定性差等 问题，难以用于合成纤维纺丝工艺。 1 3 3 天然生物抗菌荆 来源于所有生物体，主要包括多糖、多肽及糖肽聚合物类物质，以及杀菌植物、矿 物，是未来抗菌材料的主要发展方向【3 4 】；他们作用于微生物细胞外层或酶等生物活性物 6 第一章绪论 质，影响微生物的运动、跨膜物质运输或生化反应等。但其应用范围狭窄，多数严重影 响织物的色光；不同的抗菌剂对于同一种病原菌有不同的抗菌作用机理和有效性，同一 种抗菌剂对于不同的病原菌也有不同的抗菌作用机制和抑制范围，因此为了得到既长效 又广谱、既高效又安全的抗菌剂，对其抗菌机理的研究十分重要。 表1 1 抗菌剂的分类及其特点 t a b 1 1t h ec l a s s i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r is t i t so fa n t i b a e t e r i a la g e n t s 1 4 本课题的目的和意义 目前，国内对酪氨酸酶的研究主要集中在酶的催化机制、活性调控以及酪氨酸酶基 因及其在生物体内的生理作用等方面。至今仍没有在纺织领域应用，羊毛和蚕丝中都含 有酪氨酸残基口别，其中每克羊毛织物含有0 3 5 m m o l 酪氨酸残基，所以酪氨酸酶应用于 羊毛织物的改性具有可行性嘶1 。目前所使用的酪氨酸纯酶大都是s i g r n a 公n 提供的口 ， 价格昂贵( 大约每2 5 0 0 u 花费1 2 0 0 元1 6 0 0 元) ，不适宜大规模应用。 本实验借鉴国内外提取酪氨酸酶的方法，运用简便方法制取酶液，以便于大剂量使 用。酪氨酸酶的反应底物一般采用l 一酪氨酸或者l 一多巴，其中l 一酪氨酸价格便宜，但是 反应产物较复杂，而l 一多巴价格较昂贵，本实验采用了邻苯二酚( 儿茶酚) ，因为邻苯 二酚价格便宜，且产物单一，能够在4 1 0 n m 处很好的测定产物吸光度值。酶处理后的羊 毛由于含有多巴醌结构，能够在较缓和的条件下与- - n h ：和- - s h 等基团反应；乳铁蛋白具 有很好的抗菌性能，且能够为本反应提供- - n h 。，使得本实验存在一定的可行性。 另外，提取完的剩渣中含有大量的淀粉，可以进一步的提取淀粉，符合生物环保的 要求矧。 本实验已经做了以下几方面的工作： ( 1 ) 自制酪氨酸酶存在一定活性。 ( 2 ) 用模拟化合物能够证明发生反应的真实性。 7 江南大学硕：仁学位论文 ( 3 ) 采用一浴法能够接枝乳铁蛋白。 ( 4 ) 采用两浴法能够接枝乳铁蛋白。 8 第二章实验部分 第二章实验部分 本实验所需要的仪器如表2 - 1 所示 表2 - 1 试验仪器 t a b 2 - 1a p p a r a t u so fe x p e r i m e n t a t i o n 9 第三章自制马铃薯酪氨酸酶性能测定 第三章自制马铃薯酪氨酸酶性能测试 3 1 实验 3 1 1 实验方法 3 1 1 1 酪氨酸酶的提取 在榨汁机中放入1 0 0 9 经过预冷的的x ( x 为马铃薯、蘑菇、苹果和香蕉) ，加入1 0 0 m l 预冷磷酸钠缓冲溶液( p b s ) 和2 9 聚乙烯吡咯脘酮，榨汁，l m i n 后用四层纱布滤出提取液， 加入研磨细的硫酸铵，使达到1 0 饱和度，离心分离( 约3 8 0 0r p m ，1 5 m i n ) ，倾出上 层液，加入硫酸铵，使达到7 0 饱和度，离心( 3 8 0 0 r p m ，2 5 m i n ) ，取出沉淀定溶于2 5 0 m l 容量瓶，保存于冰箱中待用洲。 3 1 1 2 不同来源酪氨酸酶的比较 根据3 1 1 1 方法分别提取马铃薯、蘑菇、苹果和香蕉酪氨酸酶，根据单位活性的 价格，选择一种最经济实用的作为原料来进行后续的实验。 3 1 2 实验测试 3 1 2 1 自制酪氨酸酶活性测定 取4 m l 含5 m m o l l 邻苯二酚的p b s 溶液，置于3 0 水浴中保温1 0 m i n ，加入l m l 马铃 薯酶液后迅速混匀，每2 m i n 于4 1 0 n m 处测定吸光度值。以吸光度值的大小作为酶活力高 低的计量标准( 定义在5 m l 反应体系中吸光度值每分钟变化0 o l 为一个单位活度) 口利。 3 1 2 2 不同来源酪氨酸酶的比较 取4 m l 含5 m m o l l 邻苯二酚的p b s 溶液，置于3 0 水浴中保温1 0 m i n ，加入l m l 马铃薯、蘑菇、苹果或香蕉酶液后迅速混匀，8 m i n 后于4 1 0 n m 处测定吸光度值。 3 1 2 3 最佳p h 测定 配| t i t j p h 3 0 、6 0 、6 2 、6 4 、6 6 、6 8 、7 0 、7 2 的含5 m m o l l 邻苯二酚的p b s 溶液各 4 m l ，加酶液l m l ，3 0 保温振荡8 m i n 后，于4 1 0 n m 处测定吸光度值。 3 1 2 4 最佳反应温度测定 取4 m l 含5 m m o l l 令g 苯二酚的p b s 溶液6 份，各加l m l 酶液，分别在2 0 、2 5 。c 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、8 0 c 水浴中保温振荡8 m i n 后，于4 1 0 n m 处测定吸光度值。 3 1 2 5 保存稳定期测定 把马铃薯提取液放于冰箱( 4 ) ，分别放置o 天、l 天、2 天、3 天、4 天、5 天、6 天、7 天，然后分别在4 1 0 n m 处测定活性。 3 1 3 实验材料 提取原料：马铃薯、蘑菇、苹果和香蕉( 购买于农贸市场) 。 江南大学硕： = 学位论文 试验药品及试剂：邻苯二酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸铵、聚乙烯吡咯脘酮 均为分析纯( a r ) 。 3 1 4 实验原理 o h o h m - - - - - - - - - - - - l ， 0 2 o 图3 - 1 酪氨酸酶催化反应 f i g 3 1c a t a l y ti cr e a c ti o n o ft y r o si n a s e 3 2 实验结果与分析 3 2 1 自制马铃薯酪氨酸酶活性分析 以邻苯二酚为底物，每隔2 m i n 在4 1 0 n m 处测定吸光度，结果如图3 2 所示。 a o5l o1 52 02 5 时间m i n 图3 - 2 酪氨酸酶活性曲线 f i g 3 - 2t h ea c ti v it yc u r v eo ft y r o si n a s e 注：处理温度3 0 x 2 、p h6 8 从实验中可以观察到，无色的邻苯二酚在短时间内就被氧化成了褐色的邻苯二醌 ( 邻苯二酚在空气中氧化速度极慢) ，说明提取物确实是酪氨酸酣矧。 图3 2 表明：前8 m i n 的a a ( 吸光度差值) 具有良好的线性( r 2 = 0 9 9 1 ) ，因此可 根据嘀i i s m i n 吸光度值的变化算出自制酶液的每毫升的酶活厶以 u = l o o a t 其中：厶 为反应的时间( m i n ) ，酶活的单位为u 。 由于本实验的酶液需试验前制取，为了统一反应活力，可根据此公式算出比活力。 1 2 第三章自制马铃薯酩氨陆穗性盹翻定 3 2 2 不同来源酪氨酸酶的比较 从马铃薯、蘑菇、苹果和香蕉这四种物质中提取酪氨酸酶，测试出每l o o g 中含有 的酶活，如图3 - 3 所示： 乌铃薯 歹 l 墨 图3 - 3 不同来湃酪氧酸酶活性比较 f i g3 - 3a c t i v i t yc o m p a r ls o no fd i f f e r e n tt y r o s i n a $ 6 从图3 3 中可以看出，相同质量的物质提取出的酶液的酶活，蘑菇最大_ i 5 = 果最小。 所以理论上应该选用蘑菇做为材料，但是考虑到蘑菇的储存时阳j 太短，且竹格不如马铃 薯便宜，所咀在后续的实验中选择马铃薯做为提取酪氩酸酶的原料。 3 2 3 最佳反应p e 分析 在不同的p hf 测定，结果如图34 所示。 图3 4p i t 对马铃薯酪氨酸酶催化活- 陛的影响 f i g3 - 4e f f e c to ft 锄d e r a t ne n z y m t i ca c t i v i t yo fp o t a t o t y r o s i n a s e 注：处理温度3 0 ，时间8 m i n 从图3 4 中可以看h ，在p h 为68 时，土豆酪氨酸酶的反应活性晟高，且在p h 6 2 7o 范围内有较高的活性。当p l l t j , 于3 或者大于1 0 时，酶基本失活，所以酸或者碱可以作 为酶抑止剂。 _ 删b 8 ； 剐 赫 溪雾 蓦； 坫 垢 m 0 0 o 0 0 0 0 0 o 江南大学硕上学位论文 3 2 4 最佳反应温度分析 在不同的温度下测定厶彳，结果如图3 5 所示。 l o3 0 温度 7 0 图3 - 5 温度对马铃薯酪氨酸酶催化活性的影响 f i g 3 - 5e f f e c to fp ho ne n z y m a ti ca c ti v it yo fp o t a t ot y r o si n a s e 注：处理时间8 m i n 、p h6 8 从图3 - 5 中可以看出，在温度为3 0 c 时，土豆酪氨酸酶的反应活性最高，且在2 0 4 0 范围之内仍保持较高的活性，而温度达到8 0 时，酶基本失活。 3 2 5 储存稳定性分析 测试不同储存天数酶液的活性，结果如图3 - 6 所示： o 3 o 2 5 o 2 0 1 5 o 1 0 0 5 0 o2468 储存天数 图3 - 6 储存天数对吸光度的影响 f i g 3 - 6e f f e c to f8 t o r a g et i m eo ne n z y m a t i ea c t i v i t yo fp o t a t ot y r o s i n a s e 从图3 - 6 中可以看出，随着储存天数的增加，提取酶液的活性一直在降低，但在前 3 天的时候，活性仍然较高。根据这个实验，我们可以看出，每次提取的酶不能长时间 的保存，尽量做到当天提取当天使用，如果要保存，那也应该控制在3 天之内。 1 4 o o o 0 o o o 6 5 4 j 2 1 o l 第三章自制马铃薯酪氨酸酶性能测定 3 3 本章小结 根据本章实验可知： ( 1 )考虑到活性、储存性和价格，在后续的实验中选用马铃薯做为提取酪氨酸 酶的原料。 ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( 5 ) 根据前8 m i n 吸光度值的变化算出自制酶液的每毫升的酶活4 以 自制酪氨酸酶具有一定的活性，且反应的最佳条件为p h 为6 8 ，温度为 3 0 。 自制酪氨酸酶的失活条件为p h 小于3 或者大于1 0 ，或者温度大于8 0 c ， 后续实验都采用加温失活的方法。 自制酪氨酸酶的储存稳定性欠佳，后续实验所需酶液应当天提取。 1 5 第四章羊毛接枝模拟化合物 第四章羊毛接枝模拟化合物 4 1 实验方法 4 1 1 实验方法 4 1 1 1 羊毛预处理 织物热水浸渍一高锰酸钾溶液氧化( 高锰酸钾张o w f ，j f cl g l ，p h 值3 5 ， 温度4 0 c ，时间3 0 m i n , 浴比1 ：2 0 ) 一皂洗( 4 5 ，1 5 m i n ) 一中和洗( 纯碱2 o w f )一清水冲洗一5 0 烘干一脱色( n a h s 0 36 o w f ，h a c1 v v ，温度4 0 ，时间3 0 m i n ，浴比l ：2 0 ) 一冲洗一烘干待用【4 2 1 。 4 1 1 2 不同酶活处理羊毛 将1 9 羊毛织物浸入装有酪氨酸酶提取液( 5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、2 5 0 、3 0 0 u 酶液，对 氨基苯磺酸钠0 0 5 9 ，氨水2 m l l ，浴比l ：1 0 0 ) 的烧瓶，置于振荡水浴锅( 3 0 c ，3 0 r ) ，处 理2 4 h ，取出皂煮( 温度4 5 c ，时间3 0 m i n ，浴比l ：5 0 ) ，然后清水冲洗，5 0 c 烘干待用。 4 1 1 3 失活酶处理接枝模拟化合物 酶液失活处理( 按5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、2 5 0 、3 0 0 u 量取酶液，8 0 c 处理1 0 m i n ，然后 加入1 9 羊毛，对氨基苯磺酸钠0 0 5 9 ，氨水2 m l l ，浴比l ：1 0 0 ) ，按4 1 1 2 方法处理 羊毛。 4 1 1 4 不同振荡速率处理羊毛 将1 9 羊毛织物浸入装有酪氨酸酶提取液( 2 0 0 u 酶液，对氨基苯磺酸钠0 0 5 9 l ，氨水 2 m l l ，浴比1 ：1 0 0 ) 的烧瓶，置于振荡水浴锅( 3 0 ，o r 、1 5 r 、3 0 r 、4 5 r 、6 0 r ) ，处理2 4 h ， 取出皂煮( 温度4 5 c ，时间3 0 m i n ，浴比1 ：5 0 ) ，然后清水冲洗，5 0 c 烘干待用。 4 1 1 5 最佳接枝方法 将1 9 羊毛织物浸入装有酪氨酸酶提取液( 2 0 0 u 酶液，对氨基苯磺酸钠0 0 5 9 l ，氨水 2 m l l ，浴比1 ：1 0 0 ) 的烧瓶，置于振荡水浴锅( 3 0 ，3 0 r ) ，处理2 4 h ，取出皂煮( 温度4 5 ，时间3 0 m i n ，浴比1 ：5 0 ) ，然后清水冲洗，5 0 烘干待用。 4 1 2 测试方法 4 1 2 1 对氨基苯磺酸钠标准曲线制定 分别配置0g l 、o 1 9 l 、0 2 5g l 、0 5g l 、l g l 、2 9 l 的对氨基苯磺酸钠溶液， 在2 7 5 n m 处测定吸光度值，作标准曲线图。 4 1 2 2 反应残浴吸光度值测定 分别在2 7 5 n m 处测定4 1 1 2 、4 1 1 3 和4 1 1 4 的反应残浴的吸光度值。 1 7 江南大学硕十学位论文 4 1 2 3 织物的紫外一可见光分析 按4 1 1 5 方法接枝模拟化合物，然后放入t u - 1 0 9 1 双光束紫外可见分光光度计中进 行紫外一可见光分析，吸收波长选择在1 9 0 6 8 0 册处，测得羊毛的透过光谱。 4 1 2 4 织物的红外分析 制样方法：o m n i 采样法；扫描次数：6 4 次，分辨率：4 c m 一。 4 1 3 实验材料 载体材料：羊毛织物( 全毛华达呢，2 2 0 9 m 2 ，无锡协新毛纺厂) 。 提取原料：马铃薯( 购买于农贸市场) 。 试验药品及试剂：邻苯二酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸铵、氨水、聚乙烯吡 咯脘酮、对氨基苯磺酸钠、高锰酸钾、亚硫酸钠均为分析纯( a r ) 。 4 1 4 实验原理 酪氨酸酶催化氧化羊毛原理如下图所示【4 3 删： t y r _ - _ - - - - - - _ _ _ - - - - 0 2 o 图4 - 1 酪氨酸催化氧化反应式 f i g 4 一lc a t a l y ti cr e a c t i o n o ft y r o si n a s e s o l 图4 - 2 接枝对氨基苯磺酸钠 f i g 4 - 2g r a f ti n gw i t hs o d i u ms u l f a n il a t e 4 2 实验结果与讨论 4 2 1 模拟化合物标准吸收曲线 分别测试不同浓度对氨基苯磺酸钠溶液的吸光度值，制定标准吸光度曲线，如图4 - 3 所示： 第四章羊毛接枝模拟化合物 3 2 5 2 1 5