（生物医学工程专业论文）奶制品中三聚氰胺的拉曼光谱快速检测方法研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t p e o p l eh a v ep a i dc l o s ea t t e n t i o nt om e l a m i n eb ys a n l ue v e n t m e l a m i n e ，a w i d e l yu s e do r g a n i cc h e m i c a li ni n d u s t r y , w a si l l e g a l l y a d d e di n t om i l kt oi n c r e a s et h e p r o t e i nc o n t e n t o b v i o u s l y , t r a d i t i o n a lk j e l d a h lw a sn o ts u i t a b l et od e t e c tr e a lp r o t e i n c o n t e n t i ti sn e c e s s a r yt oe s t a b l i s har a p i da n df e a s i b l em e t h o df o rt h ed e t e c t i o no f m e l a m i n ei nm i l k i nt h i ss t u d y , a l la n a l y t i c a ls y s t e mw a sd e v e l o p e db ys u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r u m ( s e r s ) a n dp o r t a b l er a m a ns p e c t r o m e t e r , w h i c h p o s s e s s e df a s td e t e c t i n ga n da l a r m i n gf u n c t i o n s f i r s t l y , t h er a m a ns p e c t r u ma n ds e r sm e t h o dw e r ec o m p a r e df o rt h ea n a l y s i s o fm e l a m i n ep o w d e ra n ds o l u t i o n s e r sw a sc o n f i r m e da st h eb e t t e rm e t h o dt od e t e c t t h em e l a m i n ec o n t e n ti nm i l k i tw a sp r o v e dt h a tc o l l o i d a lg o l d sh a de v e np a r t i c l es i z e a n ds t a b i l i t y s e c o n d 、am e t h o df o rt h eq u a l i t a t i v ea n a l y s i so fd e t e c t i n gm e l a m i n ei n m i l kw a sf o u n da f t e ri d e n t i f i n gt h ec h a r a c t e r i s t i cp e a ko fm e l a m i n eb yr a m a n s p e c t r u m t h ep e a ka t7 0 9c m 1w a ss e l e c t e da st h ed e t e c t e dp e a kf o rq u a l i t a t i v e a n a l y s i s m e l a m i n ei nm e t h a n o ls h o w e dag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h er a t i o o f7 0 9c m 。1 10 8 9c m a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fm e l a m i n ea tar a n g eo f3p p m - 10p p m m o r e o v e r , m e l a m i n ei nm i l ks h o w e dag o o d1 i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h er a t i oo f 7 0 9c m 1 1 0 2 6c m a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fm e l a m i n ea tar a n g eo f3p p m - 1 0p p m t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h i sm e t h o dw a s1p p m ，a n dt h eq u a n t i t a t i o nl i m i tw a s3p p m t h er e c o v e r yw a si n8 9 t o10 9 w h i c hw a ss a t i s f i e dt h er e q u e s to fg b t 2 2 3 8 8 2 0 0 8 ( 8 0 11 0 ) a n a l y t i c a ls y s t e mw a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fm e l a m i n ei nm i l k m u l t i p l ef u n c t i o n sw e r ec o n t a i n e di nt h i ss y s t e m r e a s o n a b l er e s u l t sc o u l db ed e f i n e d a f t e rar a p i dd e t e c t i o nu s i n gt h i sa n a l y t i c a ls y s t e mo nc o n d i t i o nt h a tt h ec o n c e n t r a t i o n o fm e l a m i n ew i t h i n3p p mt o10p p m ar e ds i g n a lw a sd i s p l a y e dw h e nc o n c e n t r a t i o n a b o v e3p p m ，a n dt h eg r e e ns i g n a lw a ss h o w nw h e nc o n c e n t r a t i o nb e l o w3p p m i naw o r d ，t h ea p p l i c a t i o no ft h i s a n a l y t i c a ls y s t e mh a s ac o n s i d e r a b l e s i g n i f i c a n c ef o rt h ei d e n t i f i c a t i o no ff a l s ep r o t e i n ，m i l ks a f e t yc o n t r o la n dp e o p l e h e a l t hp r o t e c t i o n k e y w o r d s ：m e l a m i n e ；m i l k ；s e r s ；a n a l y t i c a ls y s t e m 2 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 k 矽， 签名：佥塑塑慨巡 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 导师签名荔恻日期：二赳 第1 章绪论 1 1 研究背景 第1 章绪论 拉曼光谱因其检测灵敏度高，测量时间短，所需样品量小等优势，被广泛应 用于医学、材料、药物、文物考古、宝石鉴定和法庭科学等领域【l 巧j ，尤其在测 定分子结构和定性定量分析方面有具大潜力 6 - 8 。便携式拉曼光谱仪的使用解决 了拉曼光谱检测在操作环境上的限制，使拉曼光谱技术得到了发展。但是，拉曼 散射效应是个非常弱的过程，一般其光强仅为入射光强的1 0 d o ，所以拉曼信号都 很弱，特别是应用便携式拉曼光谱仪对表面吸附物质进行拉曼光谱研究几乎是不 可能的。而增强拉曼的产生使这个问题得到了解决。表面增强拉曼散射( s e r s ) 是指一些分子被吸附到某些粗糙的金属( 如银、铜、金等) 表面上时，它们的拉曼 散射强度会增加10 4 1 0 1 0 倍，这种表面增强技术能够得到高质量的表面分子结构 信息，并应用于便携式拉曼光谱仪，可在快速和痕量检测中发挥巨大作用f 9 。 回顾近几年，食品安全问题不断出现，瘦肉精事件，苏丹红咸鸭蛋，广州九 肚鱼，齐二药事件，到最近的三鹿奶粉事件，无不严重威胁着人们的生命健康， 食品安全正越来越受到人们的广泛关注，而食品安全的相关检测技术也同样受到 了国家的高度重视。 早在2 0 0 7 年，美国爆发宠物食品受污染事件，事后调查表明掺杂了低于6 6 三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因f 】2 1 。继而发生的三鹿毒奶粉事 件再一次引起政府和民众的高度重视。也使三聚氰胺的特性和安全快速检测成为 研究的焦点。在食品中添j n - - 聚氰胺( 含氮量6 6 ) 能提高食品的含氮量，而国际 常用凯氏定氮法检测含氮量来推测蛋白质( 平均含氮量约1 6 ) 含型1 3 j ，从而使人 误以为该食品中蛋白质含量较高。三聚氰胺在机体内的代谢属于不活泼代谢或惰 性代谢，如果泌尿系统不发达，会比较容易在膀胱和。肾脏形成结石【1 4 , 1 5 】。因此发 展可靠、快速、现场三位一体的检测三聚氰胺含量的方法显得十分重要。本课题 研究表面增强拉曼光谱对三聚氰胺的检测，不仅解决了准确、便携、微量的检测 要求，而且针对奶制品中三聚氰胺设计的拉曼快速检测分析系统实现了奶制品中 三聚氰胺含量的即时检测以及是否超标的快速监控，对维护食品安全和人类健康 具有重要意义。 北京工业大学丁学硕士学位论文 1 2 三聚氰胺的概述 1 2 1 三聚氰胺的理化性质 三聚氰胺( m e l a m i n e ，m e l ) ，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是重要的有 机化工原料。早在1 8 3 4 年，首先由德i n l i e b g 用氰化钙和氯化铵加热制得，而其 大规模生产则是在1 0 0 年以后2 0 世纪3 0 年代。三聚氰胺又称三胺三嗪，三胺，别 名蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺等。分子式c 3 n 6 h 6 或c 3 n 3 ( n h 2 ) 3 ，分子量1 2 6 1 2 。 其性状为纯白色单斜棱晶体，无味，低毒，密度1 5 7 3g c m 3 ( 1 6 ) 。常压熔点3 5 4 ( 分解) ；快速加热升华，升华温度3 0 0 0 。溶于热水，微溶于冷水，不溶于醚、 苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等；在一般情 况下较稳定，但在高温下可能分解放出氰化物【l6 1 。其结构式见图1 1 。 驴2 i n 公n 少n 人 h 2 nn h 2 图1 - 1 三聚氰胺的结构式 f i g1 1s t r u c t u r a lf o r m u l ao fm e l a m i n e 三聚氰胺呈弱碱性( p k b = 8 ) ，其主要成分为氮，含氮量高达6 6 ，能与盐酸、 硫酸、硝酸、乙酸、草酸等形成三聚氰胺盐。在中性或弱碱性情况下，与甲醛缩 合而成羟甲基三聚氰胺，但在弱酸i 生中( p h 值为：5 5 6 5 ) 与羟甲基衍生物进行缩 聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液易水解，生成三聚氰酸二酰胺、三 聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸【1 7 】。 1 2 2 三聚氰胺的毒理学特性 早在1 9 8 3 年，m a s t 等【l8 j 使用1 4 c 标记的三聚氰胺喂养雄，陛f 3 4 4 大鼠，发现染 毒后2 4h 有9 0 的三聚氰胺直接通过尿液排出，在体内仅肾脏和膀胱中放射性高 于血浆。因而作者推算三聚氰胺通过尿排泄的半减期为3 0h ，三聚氰胺肾清除率 为2 5m l m i n 。该研究提示，三聚氰胺在雄性f 3 4 4 大鼠体内是不进行生物转化代 谢的。o k u m u r a 等【l9 j 同样给f 3 4 4 雄性大鼠喂养不同浓度三聚氰胺饲料3 6 周，结果 证明喂养含三聚氰胺饲料能导致f 3 4 4 鼠的膀胱结石形成，并且诱发膀胱肿瘤和输 尿管肿瘤，随着膀胱结石发生率的增加，雄性大鼠膀胱肿瘤发病率也呈现增加趋 势，而且这两个发病率之间高度相关。 第1 苹绪论 近期，我国出现大量的婴幼儿患泌尿系结石，呈群发状态，而且患儿均具有 三聚氰胺污染奶粉的喂养史，引起国内外广泛关注。据c h a r a l a m b o u s 等 2 0 】报道， 国外儿童尿路结石约占尿石症的1 3 ，其患病率有上升趋势。几乎任何年龄 的儿童都可罹患尿路结石，但2 岁以下婴幼儿的发生率较低，约有5 0 的患儿可 自行排出，双肾多发结石出现在幼儿的情况十分罕见。由此可见，近期泌尿系统 结石婴幼儿患者均是由于其饮用了含过量三聚氰胺的奶粉所致。由于三聚氰胺结 晶体不易溶解，在体内主要由肾脏排出，消除很慢，容易蓄积，可能引起慢性毒 性。尤其对于婴幼儿特殊的饮食和生理特点，例如饮水不足，肾脏发育不完全， 因而导致婴幼儿的泌尿系统结石发生率较耐2 1 j 。 1 2 3 三聚氰胺的用途 三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工原料，主要作为生产三聚氰胺甲醛 树脂( m f ) 的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。三聚氰胺 甲醛树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐 蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，在塑料、装饰、涂料和造纸等行业 有着广泛的应用。资料表明，三聚氰胺可能从环境、食品包装材料等途径进入到 食品中，但其含量很低。鲁杰等人1 2 2 j 对目前市场上市售的食品包装容器和奶制品 包装袋进行检测。结果显示，所有从中国市场上抽检奶制品包装袋$ 1 p p 、p c $ 0 品中三聚氰胺的迁移量低于检出限，虽有部分密胺制品中检出三聚氰胺，但检出 量远远低于国家标准g b t9 6 8 5 2 0 0 8 食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标 准皿3 j 中规定的三聚氰胺特定迁移量3 0m g k g ，满足中国食品包装材料的卫生要 求。 ( 1 )涂料：三聚氰胺经丁醇、甲醇醚化后，作为高级热固性涂料固体粉 末涂料的交联剂，可制作金属涂料和车辆、电器用高档氨基树脂装饰漆 2 4 1 。 ( 2 )装饰材料：三聚氰胺可制成防火、抗震、耐热的层压板，色泽鲜艳、 坚固耐热的装饰板，作为飞机船舶和家具的贴面板及防火、抗震、耐热的房屋装 饰材料【2 5 】。 ( 3 )模塑粉：经混炼、造粒等工序可制成蜜胺塑料，无毒抗污，潮湿时 仍能保持良好的电气性能，可制成洁白、耐摔打的日用器皿、卫生洁具、电器设 备的高级绝缘材料等【2 6 | 。 ( 4 )纸张增强剂：三聚氰胺用乙醚醚化后可用作纸张增强处理剂，用于 生产抗皱、抗缩、不腐烂的钞票和军用地图等高级纸张【27 | 。 ( 5 ) 水泥添加剂：用三聚氰胺磺酸盐甲醛缩合物对水泥混凝土改性，加 强水泥沙浆的粘力和弹性，与水泥的水化产物结合掺量小、减水率高、适应性好， 同时也具有传统产品的混凝土后期收缩小、制品光亮、低碱含量、表面光亮等多 北京工业大学工学坝士学位论文 种功能特性 2 8 ，2 9 1 。 ( 6 )其他：三聚氰胺甲醛树酯与其他原料混配，还可以生产出织物整理 剂、皮革鞣润剂、上光剂和抗水剂、橡胶粘合剂、助燃剂、高效水泥减水剂、钢 材淡化剂等 3 0 , 3 1 】。 1 3 奶制品中三聚氰胺检测的研究现状 目前，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局、国家质 量监督检验检疫总局发布公告，公布了乳制品及含乳食品中三聚氰胺临时管理限 量值【3 2 】。 婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1m g k g ，高于1m g k g 的产品一律不 得销售；液态奶( 包括原料乳) 、成人奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为 2 5m g k g ，高于2 5m g k g 的产品一律不得销售；含乳1 5 以上的其他食品中三聚 氰胺的限量值为2 5m g k g ，高于2 5m g k g 的产品一律不得销售。 据介绍，制定限量值是应急状态下的一项行政控制措施，将保护婴幼儿和成 人的健康作为首要目的，还考虑了三聚氰胺从环境、食品包装材料等途径进入到 食品中的问题。此公告分别得到了世界卫生组织和联合国粮农组织的认可。2 0 0 8 年1 0 月7 曰，农业部发布了检测原料乳与乳制品g b t2 2 3 8 8 2 0 0 8 标准【33 1 。根据美 国食物及药物管理局( f d a ) 的标准，三聚氰胺每日最大安全摄入量为o 6 3m g k g ( 体重) 。 从2 0 世纪6 0 年代初期，国内外对三聚氰胺的检测方法进行了很多研究，主要 分为化学检测法和生化检测法。 1 3 1 理化分析检测法 理化分析方法包括高效液色谱法( h p l c ) ，液相色谱质谱联用分析法 ( l c m s ) ，气相色谱质谱联用分析法( o c m s ) ，电位滴定法( e d ) ，浊度法，重量 法，苦味酸法和升华法等，其中浊度法( g b 9 5 6 7 1 9 9 7 ) 年i 重量法( g b 9 5 6 7 1 9 8 8 ) 有 国家标准。 ( 1 )高效液相色谱法：根据三聚氰胺的弱碱性，选择阳离子交换柱，混 合型的阳离子交换柱p c x 通过将磺酸基团( s 0 3 h ) 键合在极性高聚物聚苯乙烯- - 乙烯苯p e p 吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理。采用固相萃取法进 行样品的预处理能有效地去除样品中的杂质，提高回收率，降低检测限( 最低检 测限可达n o 8p p m ) 3 5 】。三聚氰胺在波长2 0 8n n l 和2 3 5 2n l t l 处均有最大吸收，由 于检测波长在2 0 8m 时干扰较多，故选择2 3 6n l t l 作为检测波长。h p l c 在三聚氰 胺检测方面的研究比较多【3 每弼j 。 4 第1 章绪论 ( 2 )高效液相色谱质谱法：这一种更为精确和可靠的方法，既可定量又 可定性。通过液相色谱技术对样品进行有效分离，提供与定性有关的保留时间等 信息，并计算出含量，通过与液相色谱仪相连的质谱仪，可测定分子量和化学结 构等信息。样品在进色谱仪测试之前进行处理，加入含有三氯乙酸或者甲酸的酸 性水溶液，使呈碱性的三聚氰胺生成盐来提高水溶性，加入乙醇或乙腈使蛋白质 沉淀，再进行高速离心，使蛋白质等固体物质彻底沉淀，取上层清液注入仪器内 检测。国内权威检测部门主要采取这种方法进行分析，可以大大降低检测限( 最 低检测限可达到o 0 1 0 1p p m ) ，提高了准确度和精确度，但该方法具有仪器昂贵、 需专业人员操作和耗时长等缺点【39 ，4 引。 ( 3 )浊度法：由于三聚氰胺含有的六个氮原子容易与金属离子配位生成 配合物，其中与h 9 2 + 的配合物是不溶于水的，可以使溶液产生浑浊，成为悬浊液。 三聚氰胺的含量越高，产生的浑浊度越大。通过与一系列己知浓度的三聚氰胺 h 9 2 + 配合物的悬浊液进行比较，即可得到三聚氰胺的含量。这种方法可以准确测 定1 7 0p p m 含量的三聚氰胺，最低检测限为0 3p p m 。这种方法的优点是所用仪 器简单，结果较准确，缺点是要将奶制品进行预处理，获得澄清溶液，并避免干 扰物。 1 3 2 免疫学检测法 免疫学分析方法主要包括荧光免疫测定法( f i a ) 、放射免疫测定法( r i a ) 、固 相免疫传感器( s i s ) 、酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 和胶体金免疫层析实验测定法 ( g i c a ) 。其中e l i s a 和g i c a 以其方便、敏感、特异、无污染的特性，非常适合 于三聚氰胺的现场检测。免疫学测定的基础是生产特异、敏感的抗体，国内外在 此方面报道较少。免疫学测定简便、灵敏、特异、检测限低、可同时检测多数样 品。但缺点是容易出现假阳性，此法具有半定量和一定的定量能力，提供了待测 物的初步信息，可以用做三聚氰胺的快速筛选。 ( 1 )酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 利用标记物的酶催化底物的显色反应 来反映抗原抗体的结合过程，将酶催化底物的灵敏性与抗原抗体的特异性相结 合。因此可定量或定性的测定抗原或抗体 4 1 , 4 2 j 。e l i s a 法可对三聚氰胺进行半定 量和定量分析，可分析单个样品，也可成批分析样品，操作简便易行。特异性强、 灵敏度高、酶标板上一次可做多份样品检测。目前e l i s a 试剂盒已得到广泛应用， 市场上针对兽药、毒素检测的商品化试剂盒许多，例如英国的r a n d o x 公司、德国 r b i o p h a r m 公司、意大：幂l j t e c n a 、美国i d e x x 幂1 3 a u v o n 公司的产品。近日，兰州大 学”3 】也研究出一种专门用于快速检测三聚氰胺的化学试剂，将试剂加入到牛奶等 食品中，通过食品颜色变化就能够快速认定该产品是否含有三聚氰胺。但是 e l i s a 法检测三聚氰胺的精确度有限，同时还不排除其他类似化合物也会出现同 北京工业大学工学硕士学位论文 曼曼! ! 曼! 曼曼! ! ! ! ! ! 皇曼! ! ! ! ! ! ! 曼! 曼! ! ! ! ! i i 曼曼曼! ! 曼! 曼! 曼曼! ! ! 苎皂曼曼! ! 鼍! 曼! 曼曼曼! ! 曼曼曼! 曼! 曼! 曼! 曼曼! ! ! 曼 样的检测结果( 假阳性) 。 ( 2 )胶体金免疫层析实验测定法( g i c a ) ：胶体金免疫层析诊断技术是根 据免疫反应原理，利用大孔径微孔滤膜为载体，以胶体金做为固相标记物，来定 性、半定量或定量检测样本中待测物质的一种胶体金快速免疫分析技术。目前市 面上已出现大量的三聚氰胺胶体金快速检测卡，但由于其容易出现假阳性，还不 能广泛使用 4 4 , 4 5 。 1 4 拉曼光谱检测法 拉曼散射是光散射现象的一种，即当激发光的光子与作为散射中心的分子相 互作用时发生了非弹性碰撞而使光的频率发生改变的现象。1 9 2 3 年德国物理学家 a s m e k a l 首先预言了光的非弹性散射。1 9 2 8 年印度物理学家r a m a n 观察到苯和甲 苯对光的非弹性散射效应，并命名为拉曼效应。随后以拉曼效应为基础，建立了 拉曼光谱分析法，到6 0 年代，使用激光器作为拉曼光谱的激发光源，使拉曼光谱 技术有了很大发展。近年来，纳米技术研发及应用给拉曼光谱提供了新的生命力。 表面增强拉曼光谱技术使其检测限提高了4 1 0 个数量级，其检测限值已达到十万 亿分之一。 快速和高效检测是拉曼光谱技术的独到之处。一般情况下，检测一个样品仅 需要耗时1 1 0 秒钟。拉曼技术能够最大限度减少化学物质间的相互干扰小，能有 效的检测同分异构体和光学异构体。 非侵入、无损伤、现场检测是拉曼光谱另一大特点，不仅可以立刻得到检测 结果，鉴别有毒、有害及违禁药品、进行痕量生化物质的检测，而且能最大限度 的保护操作人员的安全。 1 4 1 表面增强拉曼光谱法简介 近年来表面增强拉曼( s u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns p e c t r u m ，s e r s ) 越来越受到 各国的重视，在这个领域里的科学研究论文每年以指数形式增长，在反恐刑侦、 物证鉴定、食品安全、医学检疫等方面的应用领域越来越广阔。 s e r s 发现之后在表面科学、分析科学和生物科学等多种领域得到了广泛的 应用。由于s e r s 具有很高的灵敏度，能够检测到吸附在金属表面的单分子层和 亚单分子层的分子，还能给出表面分子的丰富的振动结构信息，所以被认为是一 种很好的表面研究技术。 对于s e r s 的增强机理，已提出的理论模型可分为两大类：物理增强和化学 增强。物理增强模型s e r s 效应起源于金属表面局部电场的增强，金属基底和被 吸附分子之间的相互作用较弱。化学增强认为拉曼散射信号的增强是由于吸附在 第1 章绪论 i|_ _ii_ii i 粗糙金属表面的物质分子极化率改变引起的。迄今提出的多种理论模型都能在某 一特定情况下解释s e r s ，但均存在一定的局限性，s e r s 是个复杂过程，可能既 包括物理增强又有化学增强，还需进一步研究1 4 6 | 。 在对s e r s 效应做了大量研究后已获得了一些规律【47 j ： ( 1 ) 许多分子都能产生s e r s 效应，但只有在少数几种基体上，如：a g 、 c u 、a u 、l i 、n a 、k 等的表面产生增强效果，其中银基体的s e r s 效果最为明显， 可使拉曼散射截面增大5 6 个数量级。 ( 2 )s e r s 效应与基体的粗糙度有密切关系。金属表面的粗糙化是产生 s e r s 的必要条件。 ( 3 )s e r s 效应表现有长程性和短程性，前者分子离开平面几纳米至十纳 米仍有增强效应，而后者离开表面0 1 0 2n m 增强效应即减弱。 ( 4 )研究了一些化合物的s e r s 激发谱，发现s e r s 的强度并不与激发光频 率4 次方成正比。大多数分子的s e r s 强度在黄到红激发光区有一个极大值，而且 不同分子或同一分子的不同s e r s 谱峰极大时的激发光波长各不相同。 ( 5 )s e r s 谱峰的退偏度与正常拉曼谱峰不同，不同类型的正常拉曼峰的 退偏度有很大差别，但所有的s e r s 谱峰的退偏度很相近。 ( 6 ) 分子的振动类型不同，则增强因子也不相同，增强极大和激发频率 关系曲线也不相同。 ( 7 )有时仅为红外活性的振动类型也会出现在s e r s 光谱中。 ( 8 )当在分子的吸收带频率内进行激发时，可获得更大的s e r s 信号，其 增强因子可达1 0 4 1 0 1 0 。 同时，拉曼光谱用于分析也有其不足之处：不同振动峰重叠和拉曼散射强度 容易受光学系统参数等因素的影响：荧光现象对傅立叶变换拉曼光谱分析的干 扰；在进行傅立叶变换光谱分析时，常出现曲线的非线性的问题：任何一物质的 引入都会对被测体体系带来某种程度的污染，这等于引入了一些误差的可能性， 会对分析的结果产生一定的影响。 1 4 2 表面增强拉曼光谱法在食品检测中的应用 表面增强拉曼光谱技术已经成为成为表面科学和电化学领域有力的研究手 段，在痕量分析乃至单分子检测、化学及工业、环境科学、生物医学体系、纳米 材料以及传感器等方面的研究中得到了广泛应用。尤其是近几年食品分析中的应 用越来越越广泛，主要集中在对糖类、蛋白质、脂肪、d n a 、维生素和色素等 成分的分析，在食品工业快速检测、质量控制、无损检测等方面起到了巨大作用。 s t e f a nk e l l e r t 4 8 j 等人较早的将拉曼光谱技术用于对原料和产品质量的在线控 制，快速得到脂质中c = c 的总量和结构，蛋白质和碳水化合物的类型和总量，以 北京工业大学工学硕士学位论文 及食品的成分，很适用于产品的在线检测，加之与s e r s 的结合可以进行痕量检 测。l e ey h l 4 9 】等人开发了一种内壁涂有拉曼增强试剂的样品瓶，将其放入拉曼 光谱仪中，专门用于检测食物中的杀虫剂是否超标，对研究农药残留和维护食品 安全具有重要意义。a l e x a n d e rt a s o 等人采用s e r s 技术来进行细菌芽孢的研究， 用粒子直径为6 0n l t l 的金胶体作为基底来探查几种细菌的芽孢膜成分，作为鉴定 细菌芽孢的依据。这种新的方法既可以有效检测生物制剂是否有害，也可以作为 无菌环境监测系统( 如食品准备区域和医疗诊断区域) 的辅助设备，进行无菌监 测。p e i c a n t 5 1 】等人研究了食品添加剂中的苯甲酸钠，其拉曼光谱显示了苯甲酸 钠由未离解状态到阴离子形式的转变，并证明了安息香酸盐与银胶颗粒的化学相 互作用。得到的苯甲酸钠在各种状态的拉曼光谱图对更深入研究食品添加剂含量 奠定了基础。 1 4 3 便携式拉曼光谱仪 随着光纤样品探头、微型二极管激光器、近红外区高灵敏性光电耦合器件以 及组合光学设计、计算机数据处理分析等技术的发展，出现了体积小、易于操作 的便携式拉曼光谱仪。其自重只有1 2k g ，适合现场、快速拉曼光谱检测。 本实验使用的便携式拉曼光谱仪( r a m a nt r a c e r 2 0 0 t m ) 主要包括四部分： ( 1 ) 光源：激光光源由于其强度高、单色性好、分辨率高、方向性好和偏振 性好等特性被广泛应用于拉曼光谱仪，是非常理想的光源。本实验采用的r a m a n t r a c e r 的激发波长为7 8 5n l n ，功率为0 3 0 0m w 。 ( 2 ) 样品装置：使激光聚焦在样品上，从而对样品进行照射来采集拉曼光谱。 r a m a nt r a c e r 采用9 0 。照射方式，能改进拉曼与瑞利两种散射的比值，使低频振 动测量较容易。 ( 3 ) 单色仪：是拉曼光谱的核心部分。其主要作用是对散射光进行分光，即 把不同频率的拉曼散射光分光并减弱瑞利散射光和其它杂散光的强度，也称为分。 光系统。激光照射到样品上后，除了产生所需要的拉曼散射光外，还有频率十分 接近于拉曼散射光的瑞利散射以及其它一些杂散光，特别是瑞利散射，它的强度 非常大，几乎是拉曼散射的1 0 0 倍以上，对拉曼光谱构成严重的干扰。因此要求 拉曼光谱仪的单色器除了具有高分辨率、高通光本领外，还要有强的抑制杂散光 的能力。 ( 4 ) 检测和记录系统：其作用是对不同频率的拉曼散射光进行放大、记录和 分析处理。本仪器探测系统采用多道探测。通过c c d 电荷耦合器件检测器得到空 间分布光谱，提高了记录速度。为了减小暗电流，采取小光阴极面积并采取冷却 措施。制冷型c c d 型电子藕合器件检测器大大提高了检测器的灵敏度。由光电倍 增管输出的信号经过放大，由记录仪器记录。 8 第1 章绪论 1 5 课题研究目的和内容 在食品中添加三聚氰胺提高含氮量，通过凯式定氮法检测，导致食品中蛋白 质含量的检测结果错误。因此，针对市场频繁出现的三聚氰胺非法添加的现象， 急需开发一种快速，准确，快速，便携的检测方法。本课题利用便携式拉曼光谱 仪，通过增强拉曼光谱检测奶制品中的三聚氰胺，并开发一种专门用于快速测定 奶制品中三聚氰胺含量的分析系统，进行奶制品的快速检测和超标报警。研究内 容主要有以下几方面： ( 1 ) 通过对微量三聚氰胺的拉曼光谱与增强拉曼光谱检测方法的比较，确定 实验检测方法。对增强试剂金溶胶进行质量分析。研究三聚氰胺的拉曼特征峰， 确定定性分析方法。 ( 2 ) 对系列标准浓度三聚氰胺甲醇溶液进行增强拉曼检测，得到三聚氰胺拉 曼光谱图，用内标法进行定量分析，研究三聚氰胺溶液的线性关系，确定定量方 法。 ( 3 ) 本试验选取液态奶作为检测对象，将不含三聚氰胺的液态奶进行三聚氰 胺加标，并将加标液态奶进行预处理，进行增强拉曼光谱检测，得到含一定浓度 三聚氰胺液态奶的标准拉曼谱图，研究加标液态奶的线性关系，确定定量方法， 并作为三聚氰胺超标报警的依据。 ( 4 ) 开发专门用于检测奶制品中三聚氰胺含量的快速分析系统。将得到的所 有标准拉曼光谱图存储到数据库中，实现谱图检索，编辑，超标报警和快速检测 功能。 1 6 本章小节 本章通过对三聚氰胺的性质、用途、奶制品中三聚氰胺检测现状，拉曼光谱 检测等研究背景进行综述，提出利用增强拉曼光谱分析技术检测奶制品中的三聚 氰胺含量，开发专门用于检测奶制品中三聚氰胺含量的光谱分析系统，作为本论 文的主要研究内容。 9 第2 章三聚氰胺的拉曼光谱检测 ! 皇曼! 曼! ! ! ! 曼曼曼曼! 曼苎曼曼! 曼曼曼! ! ! 曼! ! ! i i ii i ii ；一i ! 皇! ! 蔓曼! 曼! 第2 章三聚氰胺的拉曼光谱检测 2 1 主要试剂和仪器 2 1 1 主要试剂 试剂名称化学分子式规格生产厂家 三聚氰胺 c 3 h 6 n 6 甲醇 c h 3 0 h 金溶胶 2 1 2 主要仪器 仪器名称 电子天平e r 1 8 2 a 分析纯天津市福晨化学试剂厂 分析纯 北京化工厂 欧普图垂斯光学纳米科技公司 生产厂家 上海天平仪器厂( 精度0 0 1 m g ) q l 一9 0 1 型旋涡混合器江苏海门市麒麟医用仪器厂 h e r m l ez 3 2 3 k 型高速离心机 德国h e r m l e 公司 便携式拉曼光谱仪 欧普图垂斯光学纳米科技公司 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 粒度检测仪( n a n o t r a c t m1 5 0 )美国d u k e 公司 紫外可见分光光度计日本日立 c t y v - 3 0 1 0 ) 其它：1m l 、5m l 、1 0m l 、5 0m l 移液管；1 0m l 、1 0 0m l 容量瓶；锥形 瓶；烧杯；微量移液枪。 便携式拉曼光谱仪( r 锄a nt r a c e r - 2 0 0 t m ) ：光谱分辨率： 6c m 一；光谱范围： 2 5 0 - 2 4 0 0c m ；激光光源：7 8 5n l t l ，激光强度：0 - 3 0 0m w 。 北京工业大学工学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 。2 1 标准溶液的配置 1 、三聚氰胺甲醇溶液作为储备液的制备：用电子天平称量0 0 1g 三聚氰胺粉末， 置于1 0 0m l 锥形瓶中，加入约5 0m l 甲醇溶解，3 0 超声1 5m i n ，至三聚 氰胺粉末完全溶解后，转移至1 0 0m l 容量瓶中，用甲醇定容至1 0 0m l ，配 置成浓度为1 0 0p p m 三聚氰胺甲醇溶液。 1 ) 浓度为1 0p p m 三聚氰胺甲醇溶液的配置：取浓度为1 0 0p p m 的三聚氰胺 甲醇溶液1m l 于1 0m l 容量瓶中，再用甲醇溶液定容。 2 ) 以类似方法分别配置浓度为2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0p p m 的三 聚氰胺甲醇溶液。 2 、标样的配置：即标准系列浓度( 1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0p p m ) 三聚氰 胺甲醇溶液的制备： 1 ) 浓度为1p p m 三聚氰胺甲醇溶液的配置：取浓度为1 0p p m 的三聚氰胺甲 醇溶液1m l 于1 0m l 容量瓶中，再用甲醇溶液定容。 2 ) 浓度为2p p m 三聚氰胺甲醇溶液的配置：取浓度为2 0p p m 的三聚氰胺甲 醇溶液1m l 于1 0m l 容量瓶中，再用甲醇溶液定容。 3 ) 以类似方法分别配置浓度为3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0p p m 标准三聚氰 胺甲醇溶液，待测。 2 2 2 三聚氰胺检测条件的确定 l 、三聚氰胺粉末的拉曼光谱检测 将三聚氰胺粉末放入检测玻璃瓶中进行检测。检测条件：激光功率：2 0 0m w ， 测量次数：1 0 1 2 ，光谱范围：2 5 0 2 4 0 0c m 一，检测结果如图2 1 。 图2 1 三聚氰胺粉末的拉曼光谱图 f i g2 1r a m a ns p e c t r u mo fm e l a m i n ep o w d e r 1 2 第2 章三聚氰胺的拉曼光谱检测 2 、1 0 0p p m 三聚氰胺甲醇溶液和甲醇溶液的拉曼光谱检测 取配置好的浓度为1 0 0p p m 三聚氰胺甲醇溶液5 0 0g l ，获得的拉曼光谱图 如图2 2 所示。同样取甲醇溶液5 0 0g l ，用相同检测条件进行检测，得到拉曼光 谱图如图2 3 所示。检测条件：激光功率：2 0 0m w ，测量次数：1 0 1 幸2 ，光谱 范围：2 5 0 2 4 0 0c m 一。 图2 21 0 0p p m - - - 聚氰胺甲醇溶液的拉曼光谱图 f i g2 - 2r a m a ns p e c t r u mo f10 0p p mm e l a m i n ei nm e t h a n o l o 8 2 2 g n o 8 瓮 。 宕 2 。 l 图2 3 甲醇溶液的拉曼光谱图 f i g2 - 3r a m a ns p e c t r u mo fm e t h a n o l 3 、1p p m 三聚氰胺甲醇溶液和甲醇溶液的增强拉曼光谱检测 取配置好的浓度为1p p m 三聚氰胺甲醇溶液5l l l ，加入金溶胶6 0 0g l ，振 荡混匀后进行检测，获得的拉曼光谱图如图2 4 所示。同样取甲醇溶液5 “l ，加 入金溶胶6 0 0g l ，振荡混匀后，用相同检测条件进行检测，得到拉曼光谱图如 图2 5 所示。检测条件：激光功率：2 0 0m w ，测量次数：4 0 * 3 * 2 ，光谱范围： 2 5 0 2 4 0 0c m 一。 北京工业大学工学硕士学位论文 i i i 图2 41p p m - - 聚氰胺甲醇溶液的增强拉曼光谱图 f i g2 - 4s e r ss p e c t r u mo f1p p m m e l a m i n ei nm e t h a n o l r 瑚矗s h i f t ( c m 1 ) 图2 5 甲醇溶液的增强拉曼光谱图 f i g2 5s e r ss p e c t r u mo fm e t h a n o l 4 、拉曼光谱检测结果分析 由三聚氰胺粉末的拉曼光谱图可知，其拉曼峰分别为：3 7 6 ，5 7 9 ，6 7 3 ，7 7 6 ， 9 8 1 ，1 0 3 6 ，1 4 4 0 ，1 5 5 2c m 。其中，6 7 3c m 。1 主要表现为n h 2 的弯曲振动，9 8 1 c m q 主要表现为c n 伸缩，由于三聚氰胺是环状结构，同时含有三个- n h 2 ，三。 个c n ，它们共同作用使6 7 3c m d 和9 8 1c m d 为拉曼散射的最强峰，由图2 - 1 也 显而易见。因此6 7 3c m 以和9 8 1c m d 这两个峰可以作为三聚氰胺的特征峰。 图2 1 、2 2 、2 3 中，对三聚氰胺甲醇溶液、粉末以及甲醇的拉曼光谱检测 采用的是常规的拉曼检测技术，直接将粉末和配置好的标准溶液进行检测。从浓 度为1 0 0p p m 三聚氰胺甲醇溶液与甲醇溶液的拉曼光谱图比较可见，即使是三聚 氰胺纯溶液且浓度相对较高( 1 0 0p p m ) 的情况下，也没有从拉曼谱图中观察到6 7 3 c m 。和9 8 1c m 以的特征峰，三聚氰胺溶液与甲醇谱图中的拉曼峰几乎完全吻合， 说明不能检测出甲醇溶液中的三聚氰胺。 图2 4 和2 5 是针对三聚氰胺甲醇溶液和甲醇进行的增强拉曼检测，从增强 拉曼光谱图中可见，三聚氰胺在7 0 9c m 以处有明显区别于甲醇的拉曼峰出现，且 与三聚氰胺粉末的峰位6 7 3c m 以仅相差3 6 个波数，可以判断，此峰位归属于三 1 4 第2 章三聚氰胺的拉曼光谱检测 聚氰胺。 实验结果表明，常规的拉曼检测技术由于其拉曼信号较弱，无法完成对三聚 氰胺的检测。因此，需要将拉曼信号增强，来实现对痕量物质的检测。增强拉曼 的检测结果表明采用此技术可以检测出三聚氰胺。因此，实验最终采用增强拉曼 光谱技术对三聚氰胺进行定性检测。 增强拉曼检测所使用的增强试剂为金溶胶，由于本课题除了对三聚氰胺进行 定性分析外，还要进行定量分析，且由于金溶胶本身的不稳定性，需要对金溶胶 进行质量分析实验，来确定其对实验检测的影响以及后续实验的使用。 2 3 金溶胶的质量分析 实验中所使用的增强试剂是金溶胶，为了保证实验中使用高质量、稳定的金 溶胶，应对每次使用的金溶胶均加以鉴定，以避免金溶胶对实验测定的不准确。 主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度，有无凝集颗粒及金溶胶在放置一段 时间后的稳定性等。在日光下观察比较金溶胶的颜色，可以粗略估计金溶胶的颗 粒大小。良好的金溶胶应该是清亮透明的，若金溶胶浑浊或液体表面有漂浮物， 说明金溶胶有较多的凝集颗粒。 金溶胶又叫胶体金，是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金 颗粒由一个基础金核( 原子金a u ) 及包围在外的双离子层构成。紧连在金核表面 的是内层负离子( a u c l 2 ) ，外层离子层旷则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金 游离子溶液间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的 胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒( 一般指大于3 0r l l t l 以上的) 多呈 椭圆形。电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。胶体金具有以下3 个特性【52 l 。 ( 1 ) 胶体性质：胶体金大小多在1 1 0 0n m ，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈 单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金具有胶体的多种特性，特 别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体 的稳定状