（外科学专业论文）脂肪间充质干细胞的培养的实验研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注雨l 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：缘九必 签字吼耳年上月斗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保 留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关 部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。 论文作者签名： 指导教师签 签字目期： 丝兰吐 日 脂肪间充质干细胞的培养的实验研究 硕士研究生： 指导教师： 专业名称： 梁久龙 刘晓燕教授 外科学 实验一兔脂肪间充质干细胞培养的实验研究 摘要 目的：建立兔脂肪间充质干细胞的体外分离培养方法，鉴定并分 析其生物学特性，并探索脂肪组织来源干细胞体外培养的最佳条件 方法：选用新西兰大白兔，无菌取出腹股沟脂肪，胶原酶法分离出兔 脂肪干细胞，并进行体外培养，取2 代以后的兔脂肪干细胞观察其形 态特征，并绘制细胞生长曲线及倍增时间。比较了不同胶原酶浓度、 胶原酶消化时间和血清浓度对于脂肪来源干细胞体外培养的不同效 果。结果：兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态：原代及传代的兔 脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长，生长分化活跃。兔脂 肪干细胞的生长曲线及倍增时间：传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈 “s ”形，倍增时间为55h 。o 兔脂肪干细胞的成脂分化诱导，经油 红染色的办法，其成脂分化的阳性率为65 采用0 5 m g m i 、 lm g m l 、1 5 m g m l 、2 m g m l 四种不同胶原酶浓度进行消化后发 威，在消化时间为1h 时，2 m g m 1 组细胞总数最多，活细胞比率与其 他组有统计学差异。在消化时间为2 h 时，细胞总数较1h 各组均增 加，同时，1m g m l 组、1 5 m g m l 组和2 m g m 1 组消化细胞总数无统 计学差异，活细胞比率1m g m l 组和1 5 m g m l 组最高。采用5 、 lo 、l5 、20 五种不同血清浓度培养后发现，15 和2 0 组生长 特性最佳，明显优于另三组。 结论：本次实验所分离出来的兔脂肪于细胞在体外具有生长稳 定，增殖较快的特点。脂肪组织来源干细胞，胶原酶浓度1m g m l 、 消化时间2 h 、血清浓度l5 是最佳的培养条件。 关键词：脂肪来源干细胞细胞培养 1 e x p e r i i l le n t a ls t u d i e so nc u l t l l r eo fa d s c so f r a b i t1 1 1v i t r o m a s t e r ：j i u l o n gl i a n g t u t or ：pr ox i a o y a n l iu s p e c i a l i t y ：s u r g er y a b s t r a c t o b j ec t i ve ：t oi n v e s t i g a t et h em e t h o d so fis o l a t i n ga n dc u l t u r i n gr a b b i t a d i p o s e - - d e r i v e ds t e mc e l l s ( a d s c s ) ， a n dt o i d e n t i f ya n da n a l y z et h e b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fr a b b i ta d s csa n dt oe x p l o r et h eo p t i m i z e d c o n d i t i o nf o ra d i p o s e d e r i v e ds t e mc e l ls ( a d s c ) c u l t u r ei nv i t r o m e t h o d s ： a d i p o s ew a sc o l l e c t e df r o mt h ei n g u i n a lr e g i o no fn e w s z e a l a n dr a b b i t sa n dt h ea d s c sw e r ei s o l a t e dw i t h a d h e r e n tm e t h o da n d c o l l a g e n a s em e t h o da n dc u l t u r e di nv i t r o t h em o r p h o l o g yo fa d s c sa f t e r p a s s a g e 2w a s a n a l y z e d t h eg r o w t h c u r v ea n d d o u b l i n g t i m ew e r e d r a w n t h ec o l l a g e n a s ew i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o na n dd u r a t i o na n df c s w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nw e r eu s e d r e s u l t s ：f o r m a t i o no fp r i m a r ya n dp a s s a g eo fa d s c s ：a d s c sh a d s p i n d l e a n d p o l y g o ns h a p e a d h e r e n t g r o w t h ，a n d t h e i r g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o nw e r ea c t i v e g r o w t hc u r v ea n dd o u b l i n gt i m eo fa d s c s ： t h eg r o w t hc u r v ew a sl i k e s s h a p e t h ed o u b l i n gt i m eo fa d s c sw a s a b o u t5 5h o u r s t h ea d s c sa d i p o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o nw a si n d u c e da n d t h er a t eo fp o s i t i v er a t ew a s6 5 t h r o u g ht h eo i lr e dos t a i na n dp o s i t i v e c e l lc o u n t i n g b a s e do nt h ec o l l a g e n a s ec o n c e n t r a t i o n c e l l sw e r ed i v i d e d i n t of o u rg r o u p s ，i e ，o 5 m g m l ，1 m g m l ，1 5 m g m la n d2 m g m lg r o u p s w h e n t h ed u r a t i o nw a s1 h o u r ，2 m g m lg r o u ph a dt h em o s tt o t a lc e l ln u m b e r ( t c n ) a n dt h el i v i n gc e l lr a t e ( l c r ) w a ss t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n tf r o mo t h e rg r o u p s w h e nt h ed u r a t i o nw a s2h o u r s ，t c ni n c r e a s e di ne v e r yg r o u pa n dt h e r ew e r e n os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e sa m o n g1 m g m l ，1 5 m g m la n d2 m g m lg r o u p sl c r w a st h eh i g h e s ti n1m g m la n d1 5 m g m 1 2 b a s e do nf b sc o n c e n t r a t i o n t h e c e l l sw e r ed i v i d e di n t o f i v eg r o u p s ，i e ，0 ，5 ，1o ，15 a n d2 0 g r o u p s t h eg r o w t hc h a r a c t e rw a st h eb e s ti n15 a n d2 0 g r o u p s 2 。 c o n c l u s i o n ：t h ea d s c so fr a b b i t si s o l a t e di nt h i st r i a la r ec h a r a c t e r i z e d b ys t a b l eg r o w t ha n dq u i c kp r o l i f e r a t i o ni nv i t r o ，t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s f o rh u m a na d i p o s e d e r i v e ds t e mc e l l sc u l t u r ea r ec o l l a g e n a s ec o n c e n t r a t i o no f 1m g m l ，d i g e s t i o nd u r a t i o no f2h o u ra n df b sc o n c e n t r a t i o no f15 k e yw o r d s ：a d i p o s e d e r i v e ds t e mc e l l c u l t u r ei nv i t r o 3 脂肪问充质千细胞的培养的实验研究 硕士研究生： 指导教师： 专业名称： 刖舀 梁久龙 刘晓燕教授 外科学 近年来，有研究发现人体脂肪组织提取物中存在一些类似于骨髓 间充质干细胞的细胞，其具有向多种组织分化的潜能，并称之为脂肪 干细胞【lj ；它在体外培养扩增迅速目前己证实此种干细胞可分化 为成骨细胞、软骨细胞、肌源性细胞等多种组织细胞l l 。j ，是组织 工程重要的种子细胞之一。本实验建立了兔脂肪干细胞分离方法，并 对其生物学特性进行了分析。随着脂肪组织工程研究的进展，源自脂 肪组织的干细胞( 或称为脂肪基质细胞) 的成脂潜能受到越来越多的 重视。汇常脂肪组织成分复杂，包括成熟脂肪细胞，血管及血细胞， 纤维组织等，其中具有多向分化潜能的基质干细胞。本试验在体外分 离培养脂肪间充质干细胞，绘制其生张曲线，并做油红染色。脂肪 组织来源干细胞体外培养中，有关消化酶浓度、消化时间等基本培养 条件各学者报道不一。为此，本研究对于上述基本条件进行了探讨， 旨在探索最适宜的体外培养条件，为进一步细胞大规模培养和应用提 供依据。 材料和方法 材料选用雌性新西兰大白兔，兔龄4 个月，体质量4 o k g 。麻 醉药：86 4 合剂( 速麻安) 、苔盘兰、地塞米松、e d t a 、i 型胶原 酶( s i g m a ) 、胰酶、胎牛血清、d m f m f 12 培养基( g i bc o ) 、胎牛 血清( 天津) 方法：兔脂肪干细胞分离与培养：新西兰大白兔以0 1 0 15 m l k g 86 4 合剂( 速麻安) 肌注麻醉后，n a 2 s 备皮、消毒，耿下 腹部f 中切口，至深筋膜，向两侧的腹股沟区分离，暴露双侧腹股沟 脂肪垫，并完整取出。置于培养皿中，在无菌条件下清除外包膜、明 4 显的结缔组织和肉眼可见的小血管。剪碎( 约1m m ) 、d h a n k s 清洗2 次；在37 条件下，用0 0 75 i 胶原酶在摇床上( 8 0r m i n ) 消化2h ，然后1000r m i n ，离一1 1 , 5m ir l ，除去上层脂肪及上 清，d h a n k s 洗涤沉淀2 次。用含体积分数0 1 胎牛血清的 d m f m f 12 培养基稀释，在37 ，体积分数0 05 的c 0 2 的饱和 湿度孵箱培养。5 d 后更换培养液，去除未贴壁细胞，三四天换液1 次，细胞8 0 左右融合时，用2 5g l 胰酶室温消化5m i n 左 右，用适量胎牛血清终止消化反应，用吸管轻轻吹打，转入离一t l , 管中 l00 0r m i n ，离心5m i n ，弃上清，按l ：4 比例传代。 兔脂肪干细胞形态学观察：在含体积分数l0 胎牛血清的 d m e m f 12 培养基培养脂肪干细胞。定期在倒置显微镜下，观察原 代及子代细胞形态学改变情况。 兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间测定：8 0 融合的贴壁细 胞用0 25 胰酶消化，传代，并以相同的浓度分别接种于二十四孔 平板，绘制生长曲线。接种及检测方法如下；分别于第1 、3 、5 、 7 、9 天行计数板计数制备单个细胞悬液，调整细胞浓度为5 103 m l ，接种于2 4 孔培养板，每孔0 2 m l ，3d 换液1 次，胰酶消 化，苔盘兰染色，计数活细胞数，从第2 天起每隔2 4h 计数2 个孔 的细胞数取其平均值，绘制12d 的细胞生长曲线。通过生长曲线， 用公式d t = ( t 2 一t1 ) 1 1 3 2 ( i n n 2 一n 1 ) 计算倍增时间( n1 和n 2 是时问t1 和t 2 时的细胞数) 。 细胞油红染色：取4 代以后的兔脂肪干细胞，传代时种于一次性 培养皿中，第2 ，3 天将细胞用磷酸盐缓冲液清洗时，适当固定后进 行油红染色。 细胞检测方法 ( 1 ) 细胞总数测定：采用血球计数板细胞计数法，对不同浓 度、不同时间胶原酶作用后的细胞总数进行测定，每个样本计数5 次。 ( 2 ) 活细胞比率测定：采用台盼兰染色试验。取混匀后细胞悬 液lm l 加入试管中，加入1m l0 4 台盼兰染液，混匀，染色2 分 钟。血球计数板计数，镜下可见深兰色细胞，为死细胞，活细胞不被 染色，计算活细胞比例。每个样本计数5 次。 5 统计学处理：采用s p s s l0 0 统计软件进行统计学处理，实验数 据以s 表示。细胞总数和活细胞总数采用团体t 检验，差异显著标 准为p 0 05 。 结果 l 、兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态在接种2 4 h 后可见以群 落或散在的方式贴壁生长圆形或多角形的细胞，折光性好，周围有脂 滴沉淀，( 见图1 ) ，继续培养细胞形体变大，数量增殖相当缓慢， 12 d 左右可见在较均匀平铺的细胞中有克隆时细胞增殖加速。传至第 5 代以后，细胞不再以集落方式生长，而呈均匀分布生长( 见图2 ) ， 细胞以长梭形为主。五六天传代1 次，可长期稳定传代。 2 、兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间兔脂肪干细胞生长曲线 呈s 形，接种后第1 ，2 天为潜伏适应期，从第3 天丌始细胞增殖加 速并进入对数生长期，第8 天达到高峰，以后进入平台期，根据生长 曲线可知兔脂肪干细胞的群体倍增时间约为55 h ，脂肪细胞培养情 况：生长曲线显示，细胞在第2 3 代生长最为活跃，之后生长速度 逐渐减缓。第15 代以后开始衰减。( 见图3 ) 3 、兔脂肪干细胞的油红染色特点兔脂肪干细胞经细胞组织油红 染色后 6 细胞形态： 图1原代细胞培养3 天后情况( 血清浓度10 ) 图2原代细胞培养l2 天时情况( 血清浓度l0 ) 1 细胞数( x 1 0 3 ) 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 生长曲线 - - - l l - - 0 * 卜5 爵一l d 。0 i 5 2 0 l 2 3 4 5 6 7 8 时间( 犬) 图3 不周血清浓度原代细胞培养生长曲线 lh 2 h 4 6 1 8 0 0 ：”2 。2 5 48 4 20 oo8 0 9 1 o o7 o 85 ! ： ，：7 2 ：8 。2 。4 。 5 0 5 5 0。，092325 。s 。，s 。 2 0 5 “ o 05 ”2 6 0 5 雌4 0 5 。1 5 1 4 20 0 07 紫蜘0 8 “。0 6 6 j 业生! ：! 较均汪：1 ：该组与上三组分别比较均p “：虬2 殂阴酌比 比较均i i i ： 谢nfll：j上三组分别比较均poop 0 5 ；i v ：该组与上三组分别比较均 o “出司- 亡= 绀分别 数最霎? 雾：誓毒萎二享鎏竺竺望碧一一2 r a g m ! i l i , q 。, 组消化细胞总 薯差翥i ，雪篓嚣：了暑苎竺笺有统计学差异。在消化时言舅1 善? 等? 裳悯2 m g 胍m 徽。? 兰耆爹萎熟蝣j 1 焉搿，三等茹 i ? m 1。黧磐冀数无统计学虢荔箍裂。mgm到ml川,*r,组。5mg1 1 m 组最高( 表1 ) 。 7 8 讨论 组织工程与基因治疗的重要课题之一是选择理想的种子细胞与靶 细胞，此种细胞应具备有易于获取，易于外源基因的导入和稳定表 达，寿命长或有自我更新能力等特点。当前，研究较多的靶细胞是造 血干细胞和骨髓基质干细胞。这两种细胞虽然都具备较强人体外增殖 力和分化能力，但它们主要分布在骨髓。由于成人骨髓量有限，而且 抽取具有创伤及并发症会给患者造成痛苦，故其应用受到限制。然 而，自z u k 等首先报道成功分离培养人的脂肪干细胞以来，虽然 发现较晚，但研究非常迅速深入。 1 关于脂肪组织工程种子细胞： 种子细胞是组织工程研究的核心问题之一。理想的种子细胞应该 具有以下特点：( 1 ) 取材方便容易获取，为今后临床工作增加可 操作性；( 2 ) 体外分离条件相对简单，增加实际应用的效价比； ( 3 ) 增殖迅速，体外培养周期短，增加实效性；( 4 ) 具有定向分 化增殖能力，可以形成其有一定结构和功能的组织和器官；( 5 ) 生 物学性状相对恒定，在体外培养和材料复合过程中，细胞的基因型和 表型特征稳定，无畸形和癌变。脂肪组织工程研究表明，脂肪细胞来 源丰富、取材容易、操作简单、充盈外形好、无排异反应等优点，因 此近年来受到广大脂肪组织研究者的注意。本实验既是旨在探索脂肪 细胞来源干细胞体外培养的条件及方法和培养过程中活性变化，初 步探索其作为种子细胞来源的可行性及最适于应用的时间段。 2 获取兔脂肪干细胞的实验动物要求、取材部位及培养特点本 实验选择的大白兔均为兔龄4 个月，雌性，体质量4 k g 以上，这主 要为获取更多的皮下脂肪和更厚的腹股沟脂肪垫，虽然有人认为不同 年龄成年兔获取的脂肪于细胞增殖分化无明显差异性”j ，所以兔龄 无特殊要求，但本实验还是选取分化代谢旺盛兔龄4 个月的雌兔。对 本实验的脂肪干细胞取材部位为双侧腹股沟区脂肪垫，其方便、量 大、刨伤小。与取用腹腔内的大网膜和腹膜后脂肪比较，还有一个显 著特点就是其所含血管少，培养后的血管内皮细胞污染机会低。兔脂 肪干细胞在原代培养仅有少量细胞贴壁，在低密度状态下呈大的散在 的扁平状单层细胞，且具有分泌脂肪颗粒的功能。在细胞长满培养瓶 趋于融合时，细胞体变得细长呈梭形，形态与成纤维细胞非常相似。 高倍镜下可见细胞颗粒较多、细胞核大，表明细胞增殖、代谢旺盛， 9 且与骨髓基质干细胞形念相似。兔脂肪干细胞在体外培养三四天即可 增殖l 倍，且体外培养的脂肪干细胞可以稳定增殖和传代，体外培养 10 代以后，细胞的增殖速度亦无明显减慢。这与sa f f or d 等”j 的实 验结果一致。兔脂肪干细胞不像骨髓间充质干细胞对培养基中胎牛血 清的来源和质量有严格要求，在加有任何批号胎牛血清的d m f m 培 养基中均能很好地扩增【6j ，这说明其更易体外培养。 3目前普遍认为的脂肪分化过程为：多能干细胞脂肪干细胞一 前脂肪细胞一不成熟脂肪细胞一成熟脂肪细胞。多能干细胞向中胚层细 胞分化如肌肉、骨骼等细胞系。故此阶段并无特异的分子表型。脂肪 干细胞是多能干细胞接受相关刺激，如寒冷、激素、生物活性因子、 体外实验性诱导剂刺激后，由多能变为单能定向分化的起始阶段 10 ， 此阶段仍具有干细胞活跃增殖的特性，是否有特异的基因表达，尚未 见报道。前脂肪细胞作为脂肪细胞的确定前体细胞，人们对它的研究 很多。它包括各种实验动物和人皮下白色脂肪，血管间充质等部位的 棕色脂肪和鼠胚胎前脂肪系3 t 以及骨髓起源的前脂肪细胞。过氧化 酶增殖剂受体p p a r 一 1 1j 以及c a a t t 增强子结合蛋白( c e b p ) 是 成脂的转录因子，在成脂的早期表达，且它还调控其他脂肪细胞特异 性基因的表达，从而调控成脂分化。脂蛋白酶( l p l ) m r n a 的出 现，也是作为干细胞分化为前脂肪细胞重要的标志，但它不仅在分化 早期表达，在前脂及成熟脂肪细胞均可表达，以后随晚期分子标记而 逐渐趋于稳定。脂肪酸转运蛋白( f a ) 也是该阶段早期表达产物之 一。类胰岛素生长因子一1 ( i g f 一1 ) 及其受体在此阶段也有表达。 4 脂肪干细胞在组织工程中的应用前景组织工程学是应用细胞生 物学和工程学的原理研究丌发修复、改善损伤组织结构和功能的生物 替代物的一门科学。基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织吸 附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上，形成复合 物，再将细胞生物复合物植入机体组织器官病损部位“，细胞在 生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中，形成新的具有形态和功能的 相应组织或器官，达到修复创伤和重建功能的目的。组织工程学的核 一i i , 是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，即优化选择细胞 和细胞外基质及二者的相互作用。另外，组织和血供网络也是这个动 态过程中必不可少的因素。脂肪和软组织的组织工程学在研究修复衰 老变形组织、烧创伤创面的缺损和先天性畸形中有着广阔的前景。而 由脂肪干细胞分化而来的前脂肪细胞由于获取方法简单、细胞量大， 】0 无疑是很好的种子细胞来源。因此，建立一套前脂肪细胞的培养模型 对于现代细胞学中的脂肪细胞和组织工程的种子细胞的优化都是很重 要的。目前，多潜能干细胞在组织工程及基因治疗方面具有巨大的潜 力，一般来说，主要涉及两种类型的干细胞，即胚胎干细胞和成体干 细胞，但从伦理和细胞调控方面考虑，自体干细胞从性质上与胚胎干 细胞相比，不存在免疫排斥及一些伦理学问题。骨髓干细胞有以下优 势，取材方便、对机体无害、由之诱导的组织不存在配型及免疫排斥 问题且分化的组织类型广泛，因此具有重要的临床价值 13 1 。但从实 际应用角度来说，骨穿时疼痛，获取细胞数量少。而理想的干细胞应 该是容易获得，取材时痛苦小，量大易扩增。脂肪于细胞完全符合以 上要求，从脂肪抽吸术中获得的脂肪干细胞可以达到变废为宝的目 的，因此在临床中引起了极大的关注。脂肪干细胞由于存在于脂肪组 织内，提供脂肪组织终生的自我更新，在脂肪代谢的过程中保持着一 种动态平衡，因此是脂肪移植合适的靶细胞，受到人们的关注。在组 织工程方面，由于其具有多向分化潜能，也同样得到重视，因此是组 织工程理想的种子细胞【j 。脂肪组织工程有望在乳房再造术【”】、 除皱术及凹陷畸形矫正术中发挥作用。其治疗策略包括：用细胞和 支架进行体外脂肪组织工程构建，然后植入体内f1 6 】：体内直接注 入细胞和支架，原位进行脂肪组织工程构建【l 7 1 。这两种方法需根据 要重建组织的大小来决定。在这两种方法中，涉及到自体脂肪和新生 脂肪的区分，绿色荧光蛋白是很好的示踪剂【1 乳” 。另外，这两种方 法的使用需要时间和技术的进步，但目前至少可以做到应用富集的脂 肪干细胞，在一定的体外条件下培养扩增，诱导其向成脂方向分化， 使之成为前脂肪细胞，注入需要填充的软组织缺损处，通过其在体内 分化为有活力的脂肪细胞，从而达到永久修复的目的。 5在整形与再造外科领域，自体脂肪移植已有百年历史。 ne u b er 于18 93 年首次报道应用该方法充填瘢痕区凹陷畸形。其后 的一百多年时间里，游离脂肪组织移植被用于多种充填手术。但应用 后发现，该方法存在着远期效果不稳定、吸收率高、易囊性变等不 足，因此临床应用逐年减少。分析其原因与移植物血运不佳、细胞坏 死有关1 2 ”】。近年来，随着细胞生物学的研究进展，脂肪组织基质 成份中含有大量干细胞已为许多研究证实。这些细胞不仅可以自我更 新、不断增殖，而且可以分化成为多种细胞，这为脂肪组织应用提供 了新的思路。因其取材容易，来源充分，受到越来越多的关注。在整 1 1 ， 形与重建外科领域最近有学者提出，将颗粒状自体脂肪组织与脂肪组 织来源干细胞同时移植可以明显改进脂肪远期移植效果【”】。 脂肪组织来源干细胞分离培养目前常用胶原酶消化、d m e m 培 养液培养法。但是，对于一些培养基本条件，各报道中应用情况不 同。为此，本研究在此方面作了一些工作。通过不同胶原酶浓度与消 化时间研究后发现，在消化时间为1h 时，2 m g m l 组消化细胞总数 最多，提示消化过程中有浓度依赖性。同时也发现，该组在活细胞比 率上低于其他组，说明胶原酶对于细胞活性虽然影响较小，但是也是 有一定影响的，因此随浓度增加活细胞比率略有降低。在消化时间为 2 h 时，消化细胞总数较1h 各组均增加，提示时间延长有利于细胞的 分离：同时，1 m g m l 组、1 5 m g m l 组和2 m g m l 组消化细胞总数 无统计学差异，活细胞比率1 m g m l 组和1 5 m g m l 组最高，提示浓 度为1m g m l 时即可以达到最佳的消化效果。通过不同血清浓度作用 下生长曲线绘制发现，在血清浓度为15 和2 0 时在最短时间内细 胞进行平台期，达到细胞增殖高峰期，因此这两种浓度可以作用细胞 培养的较适宜浓度。同时，综合考虑性价因素，实际应用中可以将 15 作为血清的最适宜浓度。同时通过两代生长曲线绘制也可以发 现，第二代细胞较原代细胞更快进入增殖高峰，即细胞在最初传代 后，生长加快，这一点与实际培养中所见的适度传代促进增殖相一 致。 同时需要强调，虽然研究中采用的是公认的分离培养流程，但实 际上培养得到的仍是一种混合细胞，其中可能混杂有部分前体细胞， 如何纯化和鉴别干细胞是该领域目前尚未解决的问题，是下一步研究 的方向。 6免脂肪干细胞生化特性与生长增殖特点本实验中分离培养的 兔脂肪干细胞的细胞生物化学染色中，作者分离的兔脂肪于细胞体外 培养细胞传己经15 代，这些细胞生化特性与细胞生物学特性无明显 变化，说明其生物学性能非常稳定。本实验还发现兔脂肪干细胞的增 殖分化时日j 为55 h ，并且z u k 等认为脂肪组织来源干细胞是生长最 快的干细胞。脂肪细胞是由许多细胞组成的混合体，含有血细胞和脂 肪基质细胞成分。此实验显示，来源脂肪的干细胞在篼2 、3 、4 代 阶段生长旺盛，活力最佳，此时最适于进行细胞利用，如进行体外或 体内的组织重建。 1 2 总之，兔脂肪干细胞的脂肪组织来源丰富，容易获取，痛苦小， 且对供区损伤较小，且脂肪干细胞具有强大的体外增殖力和分化能 力，极容易培养并对培养基的要求低，体外扩增能力强、增殖时间 短，且具有多向分化潜能。本实验成功地分离培养了兔的脂肪干细 胞，其将为建立兔动物移植模型以及转基因研究等方而提供足够的种 子细胞；兔脂肪干细胞的生物学特性研究为将来临床应用脂肪干细胞 提供有效的依据。这使得脂肪干细胞自然成为基因治疗靶细胞的来源 成为可能。但是目前对脂肪干细胞研究才刚刚起步，有待于对脂肪干 细胞的分离培养、表现型及细胞生化、增殖特性作进一步的了解和认 识。 1 3 结论 l 、实验建立了动物脂肪来源干细胞体外分离、培养模型，该细 胞帖壁生长良好，增殖迅速，因此可以作为脂肪组织种子细胞良好来 源。 2 、活力在2 4 周繁殖活跃，最适于应用组织工程。 3 、消化酶的作用时间在l 一4 小时间范围内对细胞培养的效果 没有影响。 4 、同其他干细胞相比脂肪干细胞具有取材容易，取材量大， 能反复取材，损伤较小，细胞增殖快速等优点，因此有望成为优秀的 自体组织工程的种子细胞。 1 4 参考文献 1 、z u kp az h um i z u n oh et 0 1m u l t i i i n e a g ec e l lsf r o mh u m ana d i p o s et is s u e ： m p l i c a t i o n sf o re e l l b a s e dt h e r a p i e st i s s u ee n g2 0 0 l ：7 ( 2 ) ：2 ii 一2 8 2 、h u a n gj lz u kp a j o n e sn f e to l c h o n d r o g e n i cp o t e n t i a lo fm u h i p ot e n t i a lc e l l s f r o mh u m a na d i p o s et i s s u e p i a s tr e c o n s t rs u r g2 0 0 4 ：il3 ( 2 ) ：5 8 5 9 4 3 、m i z u n oh z u kp a 。z h um e tm y o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o nb yh u m a np r o c e s s e d l i p o a s p i r a t ec e l l sp l a s tr e c o n s t rs u r g2 0 0 2 ；10 9 ( 1 ) ：1 9 9 2 11 4 、d eu g a r t ed a ，m o r i z o n ok ，e l b a d ) a r ya e t o l c o m p a r i s o no fm u 一l i n e a g e c e l l sf r o mh u m a na d i p o s et i s s u ea n db o n em a r r o w c e l l st i s s u eo r g a r 2 0 0 3 ：1 7 4 f 3 1 ：1 0 1 9 5 、s a f o r dk m h ic o kk c ，s a f f o r ds d e t0 1 n e u r o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no f m u r i n ea n dh u m a na d i p o s e - d e r i v e ds t r o m a lc e l i s b i o e h e mb i o p h y sr e s c o m m u n2 0 0 2 ：2 9 4 ( 2 ) ：3 7 1 - - 9 6 、 富华，李青峰脂肪于细胞的研究进展i j l 中华摧形外科杂志，2 0 0 3 ，1 9 ( 6 ) ： 4 6 5 6 7 、d eu g a r t ed a a 1 f o n s ozz u kp a e t 0 1 d i f e r e n t i a l e x p r e s s i o no fs t e m c e i l m o b i l i z a t i o na s s o c i a t e dm o l e c u l e so nm u l t i - l i n e a g ec e l l sf r o ma d i p o s et i s s u e a n db o n em a l t o wl m m u n o ll e t t2 0 0 3 ；8 9 ( 2 3 ) ：2 6 7 7 0 8 、g r o n t h o ss f r a n k l i nd m ，l e d d y h a ，e t 0 1 s u r f a c e p r o t e i n c h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a n a d i p o s et i s s u e d e r i v e ds t r o m a lc e l l s jc e l lp h y s i o i2 0 0 1 ：18 9 ( i ) ：5 4 6 3 9 、 余方圆，卢世璧，袁玫，等脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的被步研究f j l 中国矫 形夕 科杂忠、2 0 0 4 ，1l ( 1 2 ) ：7 6 2 4 1 0 、 崔磊，尹烁，杨平等脂肪干细胞h i i a 分子表达与体外抑制淋巴细胞增殖 的实验研究i j l 中华医学杂志，2 0 0 5 ，8 5 ( 2 7 ) ：1 8 9 0 4 11 、b o r d j ik ，g r i l l a s c aj p ，g o u z ej n ，e t e v i d e n c ef o rt h ep r e s e n c eo fp r o l i f e r a t o r a c t i v a t e dr e c e p t or ( p p a r ) a l p h aa n dg a m m aa n dr e t i n o i dzr e c e p t o ri n c a r t i l a g e p p a rg a m m aa c t i v a t i o nm o d u l a t e st h e e f e c t so fi n t e d e u k i n 1 b e t ao nr a tc h o n d r o c y t e s 【j 】jb o i lc h e m ，2 0 0 0 ，2 7 5 ( 16 ) ：4 3 - 5 0 12 、c o w a nc m s h iy y a a l a m j a d i p o s e - d er i v e da d u i ts t r o m a lc e i lsh e a l c r i t ic a l - s i z em o u s ec a l v a r i a lde f e c t s 【j 】n a tb i o t e c h n o l2 0 0 4 ，2 2 ( 5 ) ：5 6 0 - 5 6 7 1 5 1 4 、 16 、 1 7 、 l8 、 1 9 、 2 0 、 2 1 、 2 2 、 2 3 、 d eu g a r t ed a ，m o r i z o n oe l b a r b a r ya c o m p a r i s o n n e a g ec e l l s f r o mh u ma n a d i p o s et i s s u ea n d b o n em a r r o w 【j 】c e l i t i s s u eso r g a n s 2 0 0 3 ，17 4 ( 3 ) ：10 1 - 10 9 p a t r i c kc wjr ，z h e n gb ，j o h n s t o nc ，e t a 1 l o n g t e r r ai m p l a n t a t i o no f p r e a d i p o c y t e s e e d e dp l g as c a f o l ds j 】t i s s u ee n g r 2 0 0 2 ，8 ( 1 ) ：2 8 3 s h e n a qs m ，y u k s e le n e wr e s e a r c h i nb r e a s tr e c o n s t r u c t i o n ：a d i pu s e t i s s u ee n g i n e e r j 】c l i np l a s ts u r g ，2 0 0 2 ，2 9 ( 1 ) ：l l1 一】2 5 h o t t o r ih ，m a s u a k as a t em ，e ta 1 b o n ef o r m a t i o nu s i n gh u m a na d i p o s e t i s s u e d e r i v e ds t r o m a le e l i sa n dab i o d e g r a d a b i es c a f o l d 【j 1 jb i o m e d m a t e rr e sba p p lb i o m a t e r ，2 0 0 6 ，7 6 ( 1 ) ：2 3 0 - 2 3 9 e s t y f ，h o a r e a u lb e sh o u rm a n nss u r f a c ep r o t e i n se x p r e s s i o nb e t w e e n h u m a na d i p o s et i s s u e - d e r i v e ds t r o m a lc e l l sa n dm a t u r ea d i p o c y t e s j h i s t o e h e mc e l l b i o i ，2 0 0 5 1 2 4 ( 2 ) ：1 1 3 1 2 1 k a l a j z i ci ，k a l a j z i cz ，k a l i t e r n am ，e t a u s eo f t y p e i c o l l a g e ng r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i na n s g e n e st oi d e n t i f ys u b p o p u l a t i o n so fe e l i sa td i f e r e n t s t a g e so f t h eo s t e o b l a s tl i n e a g e j 】j b o n em i n e rr e s 2 0 0 2 ，t 7 ( 1 ) ：15 - 2 5 ， 高宏，刘晓静，杨磊，等绿色荧光蛋白体外转染与体内示踪成骨细胞的研究 【j 中华整形外科杂志，2 0 0 4 ，2 0 ( 6 ) ：4 3 9 - 4 4 2 s h e nf h ，z e n gq ，l vq ，e ta 1 o s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no fa d i p o s e - d e r i v e ds t r o m a lc e l l s t r e a t e dw i t hg d f - 5c u l t u r e d0 nan o v e lt h r e e d i m e n s i o n a l s i n t e r e dm i c r o s d h e r e m a t x p i n e j 2 0 0 6 n o v d e c ；6 ( 6 ) ：6 1 5 - 2 3 d i m u z i op ，f i s c h e rl ，m c i l h e n n ys ，e ta 1 d e v e l o p m e n to fat i s s u e e n g i n e e r e d b y p a s sg r a f ts e e d e dw i t hs t e mc e l l sv a s c u l a r2 0 0 6 ；14 ( 6 ) ：3 3 8 - 4 2 b u r k sc a ，b u n d yk ，f o t u h ip ，e ta 1 c h a r a c t e r i z a t i o no f7 5 ：2 5p o l y ( 1 - l a e t i d e c o e p s ii o n e a p r o l a c t o n e ) t h i nf i l m sf o r t h ee n d o l u m i n a ld e l i v e r yo f a d i p o s e - d e r i v e ds t e m c e l l st oa b d o m i n a la o r t i c a n e u r y s m s t i s s u ee n g 2 0 0 6 ；1 2 ( 9 ) ：2 5 9 1 6 0 0 w e iy ，h uy ，l vr ，l id r e g u l a t i o no fa d i p o s e d e r i v e da d u l ts t e mc e l ls d i f f er e n t i a t i n gi n t o c h o n d r o c y t e sw i t ht h e u s eo fr h b m p 一2 c y t o t h e r a p y 2 0 0 6 ；8 ( 6 ) ：5 7 0 - 9 1 6 实验二源自人体脂肪