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天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 摘要 现代医药产业对国家的经济发展和社会进步具有重要的影响。创新药物的 研究与开发，集中体现了生命科学和生物技术领域前沿的新成就与新突破，体 现了多学科交叉的高新技术创新与集成，是新世纪科技和经济国际竞争的战略 制高点之一。在创新药物研究过程( 特别是发现阶段的研究过程) 中，需要探 索和解决一系列重大的科学问题。最根本的问题是分子标靶的确立和药物库的 建立。本世纪初，人类基因组研究测序任务顺利完成，标志着基因组研究将从 测序转向功能研究的新阶段。越来越多的有效分子药靶将被认定。近年来，生 命科学、生物技术的迅速发展，导致以高通量筛选( h t s ) 为代表的一批重要 的新技术在创新药物研究中被实际应用，新药研究的投入随之大幅增加。但是， 近年来新药研究的成果和产出，并未如所预期的那样，同步显著上升。其中一 个重要原因是药物库的组成。目前药物库的主要来源包括以下三个方面：1 组 合化学库，组合化学技术的发展已经实现了在很短时间内合成大量小分子化合 物，目前国际上积累的这种小分子化合物数目以百万计。但是由于存在结构多 样性不足及人们对这些人造的化合物生物安全性等方面的担心，因此目前真正 实现商品化的组合化学来源的小分子新药并不多。2 已知药物( p r o v e dd r u g s ) 库，目前临床应用的化学药物有几千种，发掘这些已经在临床上成功应用药物 的新疗效是新药研究领域的重要内容之一。这类药物库一般掌握在少数几大制 药公司手中，而且存在数量有限、结构多样性不足的缺点。3 天然化合物库， 传统上天然化合物一直是新药的主要来源，临床上应用的化学药物中很大一部 分是天然化合物或在改造天然化合物的基础上发展起来的。天然化合物较之组 合化学合成化合物在结构多样性和生物学活性方面具有突出的优点，并且天然 化合物更容易占有与药物靶点互补的化学部位。在结构多样、数量庞大的天然 化合物中更容易筛选到对特定药物靶点发挥调节作用的高效活性物质。不仅如 此，天然化合物在帮助确立和认识药物分子靶点方面也发挥着重要作用。然而 目前国际上将高通量筛选技术应用于天然活性物质的发现仍有一个关键的障 碍：尚缺乏一个涵盖面足够大、可以质量控制、能够用于大多数细胞和分子模 型高通量筛选的高质量天然化合物库。我国的传统中草药是一个伟大的宝库， 有数千年的应用历史，其针对多种常见疾病和疑难杂症的有效性已得到充分的 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 肯定，是一个天然活性物质比较集中的天然活性物质资源。 本文以高通量筛选技术平台和中药化学平台为依托，集中探索了如何在技 术上实现针对任何一个功能蛋白在短时间内从大量常用中草药药材中迅速找 到相对应的、活性理想的天然单体化合物的可行策略，称之为“组分筛分天然 活性物质发现体系。该天然活性物质发现平台的主要创新点是首次系统建立 了适合高通量筛选的活性物质比较集中的中药天然小分子化合物简单组分库， 应用二次筛选策略解决了从复杂的天然物质体系中快速发现单体活性物质的 难题。目前已经完成了5 0 0 种常用中药粗提物组分库的建立。利用制备型h p l c 等技术对其中的3 0 0 种样品进行了适度分离，建立一个规模为2 4 ，0 0 0 个组分， 具有( 每个组分含有低于2 0 种成分，成分之间含量相差不大且可重现性好) 和量( 每个组分有足够多的样品) 控制的中药样品组分库。针对c f t r 氯离子 通道h t s 筛选模型，对中药样品组分库实施高通量筛选，获得了8 0 0 种对c f t r 氯离子通道具有激活作用的活性组分。以中药辛夷为研究对象，系统评价新策 略的效果。利用二级筛选策略，成功地在中药辛夷中分离得到了c f t r 激活剂 木兰脂素。此外我们还对木兰脂素对c f t r 氯离子通道激活作用的分子药理学 机制进行了系统研究。 关键词：囊性纤维化跨膜转运调节因子( c f t r ) 、二级筛选、天然化合物、木 兰脂紊、激活剂 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 a b s t r a c t m o d e r nm e d i c i n e sp l a y k e yr o l e s i nt h ee c o n o m i c p r o g r e s s a n ds o c i a l d e v e l o p m e n t t o d a y i n n o v a t i o n d r u g s r e s e a r c h a n d d e v e l o p m e n t i sa m u l t i d i s c i p l i n a r yp r o c e s s ，w h i c hm a n i f e s t st h en e w e s ta c h i e v e m e n ti nl i f es c i e n c e s a n db i o t e c h n o l o g y i nt h ed e v e l o p m e n to fn e wd r u g ，t h e r ea r em a n yd if f i c u l t i e st ob e r e s o l v e da m o n gw h i c hm o l e c u l a rt a r g e t sa n dd r u gl i b r a r ye s p e c i a l l yi m p o r t a n t w i t h t h ea c c o m p l i s h m e n to fg e n o m i c ，m o r ea n dm o r ep o t e n t i a lm o l e c u l a rt a r g e t sh a v e b e e n i d e n t i f i e d e m e r g i n g o fh t sm e t h o de n a b l e s s c r e e n i n gl a r g es c a l eo f c o m p o u n d si nas h o r tt i m ep o s s i b l e w h i l et h er a t eo fn e wd r u ga c h i e v e di sn o ta s s i g n i f i c a n ta sp r e d i c t e d m a n yr e a s o n sm i g h ta c c o u n tf o rt h eo b v i o u s l yi n e f f i c i e n c y ， d e f i c i e n tv a r i e t i e so fc o m p o u n dl i b r a r yc a nn o tb ei g n o r e d t h r e ek i n d so fl i b r a r i e s a v a i l a b l en o w ：1 c o m b i n a t o r i a ls m a l lm o l e c u l el i b r a r y c o m b i n a t o r i a lt e c h n i q u eh a s s y n t h e s i z e dm i l l i o n so fc h e m i c a l s d u et os t r u c t u r e d e f i c i e n c ya n db i o s a f e t y u n c e r t a i n t yr e a s o n s ，c l i n i c a lu s eo ft h e s ec o m p o u n d si sd i f f i c u l t 2 p r o v e dd r u g l i b r a r y t h e r ea r et h o u s a n d so fp r o v e dd r u g su s e dt o d a y i n v e s t i g a t i o nn e wf u n c t i o n o ft h e s ed r u g si so n eo ft h em o s tt h i n g si nd r u gd i s c o v e r y b u tt h e s ed r u g sa r co w n e d b yf e wp h a r m a c e u t i c a lc o m p a n i e sa n da l s oh a v et h es t r u c t u r ed e f i c i e n c yd e f e c t s 3 n a t u r a lc o m p o u n d s t r a d i t i o n a l l y ，n a t u r a lc o m p o u n d sa r et h em a i nr e s o u r c eo fn e w d r u g m a n yd r u g sw e r ed e v e l o p e df r o mn a t u r a lc o m p o u n d so rd e r i v a t e s c o m p a r e d t os y n t h e t i cc o m p o u n d s ，n a t u r a lc o m p o u n d sh a v em a n yp r o m i n e n tm e r i t s ：t h e ya r e m o r ee a s i l yt ob i n dt ob i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，p a r t i c u l a r l yp r o t e i n s a sar e s u l t ， n a t u r a lc o m p o u n d sa r ea b l et oi n t e r a c tw i t hm a n ys p e c i f i ct a r g e t sw i t h i nt h ec e l l a s t h e c h e m i c a ls p a c e o c c u p i e db yn a t u r a lp r o d u c t si sb o t hm o r ev a r i e da n dm o r e d r u g 。l i k et h a nt h a to fc o m b i n a t o r i a lc h e m i c a lc o l l e c t i o n s ，s y n t h e t i ca n db i o s y n t h e t i c m e t h o d sa r eb e i n gd e v e l o p e dt op r o d u c es c r e e n i n gl i b r a r i e so fn a t u r a lp r o d u c t 1 i k e c o m p o u n d s w h i l e ，d u et ot h ec o m p l i c a t eo fn a t u r a lp r o d u c t s ，i ti sd i f f i c u l tt oa p p l y t ot h em o d e r ns c r e e n i n ga s s a y aw i d ec o v e r a g e ，q u a l i t yc o n t r o l l e d ，s u i t a b l ef o rh t s d r u gl i b r a r yi so fn e c e s s a r y ar e n a i s s a n c eo fd r u gd i s c o v e r yi n s p i r e db yn a t u r a l 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 p r o d u c t sc a nb ep r e d i c t e d i nt h i s s t u d y ，an e ws t r a t e g yw a sp r o p o s e db a s e do nh t sa n dt r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e c h e m i s t r y r e s e a r c h p l a t f o r m ，i nw h i c hh i g h h i t r a t e i d e n t i f i c a t i o n s t r a t e g y w a se v a l u a t e d b yat w o s t e ps c r e e n i n gm e t h o d s m a i n c o n s t i t u t i o no ft h es t r a t e g yc o m p o s e daq u a l i t yc o n t r o l l e dt r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n ef r a c t i o n l i b r a r y c o n s t r u c t e df r o m5 0 0 t c m ，r e l a t e di n f o r m a t i o n a d m i n i s t r a t i o ns o f t w a r e a m o n gw h i c h2 4 ，0 0 0t c mf r a c t i o n l i b r a r yf r o m3 0 0 t c mh a sb e e na c c o m p l i s h e d ac e l l b a s e df l u o r e s c e n c e a s s a yf o rs c r e e n i n go f c f t ra c t i v a t o r sw a su s e dt o e v a l u a t i o nt h en e ws t r a t e g y p r i m a r ys c r e e n i n g i d e n t i f i e d8 0 0h i t s m a g n o l i nw a si d e n t i f i e df r o mo n eo ft h et e s t e dt c mt h a t c o n f i r m e de f f i c i e n c yo ft h en e ws t r a t e g y k e yw o r d s ：c y s t i cf i b r o s i s ，c f t r ，t w o - s t e p s c r e e n i n g ，n a t u r a lc o m p o u n d s ， m a g n o l i n ，a c t i v a t o r 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写 或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助， 均己在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者繇铆雄 日期：舻厂 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 4 3 指导教师签名：约7 夕、岔p 笋 日期：) 彬。j 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 第一章引言 1 1 药物发现 随着人类社会的不断进步，医药产业也得到了蓬勃的发展，现代医药产业 对经济发展和全人类的健康事业都具有重要的影响。人类利用现有的药物已 经成功的治疗了许多疾病，但是仍然有许多严重威胁人类生命健康的疾病不能 得到预防及治疗，例如肿瘤、艾滋病、心脑血管疾病、糖尿病等，这些疾病不 但缩短了人的寿命，由此也带来了巨大的经济损失心6 1 。从医药产业能带来的 巨大经济效益的角度分析，国际医药销售额在1 9 9 7 年统计为2 ，2 0 0 亿美元，2 0 0 3 年增加一倍，据专家预计到2 0 1 0 年将增长两倍h 1 。在许多国家，医药工业已 经成为国民经济中的第四大创利产业，已经明显优于电讯业和计算机产业。因 此，就需要人们以传统药物为基础利用现代化的技术进行新型药物的研发随3 。 药物发现是进行新型药物研发的首要步骤，也是创新药物研究过程中的关 键。创新药物的研究需要与多种学科有机结合，特别是与生命科学和生物技术 研究的许多前沿和重大的科学问题的结合阳叫。随着生命科学为主导的时代的 到来，现代生物学将为药物发现提供强大的理论和技术支持，使药物发现获得 新的发展机遇。一方面，人类基因组学、蛋白质组学、基因芯片、生物信息学 等学科的理论及应用研究的不断深入，可以促进人们建立药物作用的靶标分子 1 2 , 1 3 】。另一方面，高通量筛选、高内涵筛选、计算机辅助药物设计等技术的不 断成熟，大大缩短了对创新药物发现的过程，拓宽了药物发现的途径屯1 6 1 。现 代的药物发现体现了生命科学的新发现及生物技术的新成果，成为了新的战略 机遇，已引发全球新一轮的科技和经济发展的激烈竞争n 引。只有掌握药物发现 的前沿理论和技术，结合实际不断调整思维和研究策略，才能在竞争日趋激烈 的国际市场上占有一席之地。创新药物发现关系我国经济和社会的发展，是我 国药物研究和医药产业面临的严峻挑战是我国医药研究和产业实现跨越性发 展的关键，已经成为了具有战略意义的国家目标n 7 | 。 目前医药产业存在的最大的问题就是以模仿为主而缺乏创新性8 i 。我国生 产的药品中9 5 以上都是仿制品，由此引发了我国医药产业的经济效益比较低 下引。而医药产业发展的经验已经明确表明：没有创新，就不会有医药产业巨 大的经济效益。要想摆脱这种落后的现状，就要立足于对创新性药物的基础研 1 天然化合物中c f i r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 究，而药物发现的根本的问题是分子标靶的确立和药物库的建立心叫。现在的发 展状况是药物库的组成限制了药物发现的进程，天然药物因其来源广泛且资源 丰富再一次成为新药研发的热点。若以天然药物为基础建立药物库，可能会使 创新性药物的发现取得突破性进展。 1 2 天然药物在药物发现的地位 天然药物是指动物、植物、和矿物等自然界中存在的有药理活性的天然 产物。天然药物结构的复杂性和生物活性的多样性令人叹为观止。天然药物 的研究对我国社会和经济发展及全人类的健康事业都有着不可忽视的作用。 天然药物往往具有活性较高且副作用小的特点，因此天然药物在新药的发现 中起着重要的作用，成为制药产业新药研发的重要资源瞻。目前全球新药的 研发模式，已经从传统的化学合成开始向从天然产物中寻找有活性的天然药 物转变，并且与最新的前沿生物技术相结合进而找出新的活性化合物。根据 美国国立肿瘤研究所( n c i ) d j n e w m a n 等人最近的一项调查，1 9 8 1 2 0 0 2 年上市的8 7 7 种小分子新化学实体药物中，来源于天然产物的占61 ，其中 6 直接来源于天然产物，天然产物的衍生物为2 7 ，5 来源于天然产物药效 团的合成物，2 3 是根据天然产物结构进行模拟设计的合生物。从1 9 4 0 2 0 0 6 年，应用的l7 0 多种抗癌药物中，天然药物占5 7 心引。我国在天然药物的研 究方面取得了很大进展，截至2 0 0 5 年统计，受国家自然科学基金委资助的重 点课题已从5 2 种常见中药中分离出10 0 0 种化合物，其中2 0 0 种是新化合物， 鉴定已知化合物1 万余种，发表论文近万篇心 。并且发现了一批在心脑血管 疾病、抗肿瘤、抗炎、免疫等方面具有一定活性的化合物，例如利血平心4 1 、 长春新碱心5 1 、喜树碱心6 1 、紫杉醇心”等药都是由我国研发并生产供应的。 天然药物的来源是极其广泛，主要来自动物、植物、海洋生物和微生物 等心8 1 。植物药，顾名思义，是以植物初生代谢产物如蛋白质、多糖和次生代 谢物如生物碱心引、酚类口0 1 、萜类阳为有效成分的原料药、制剂。我国天然药 物总数已达12 8 0 7 种，其中植物来源的为11 14 6 种，动物来源的为15 81 种， 植物药在天然药物中占主导地位阳引。动物药物是从动物的组织、器官、腺体、 体液、分泌物及皮、骨、角、甲、和胎盘等中提取的。海洋是一个巨大的药 源宝库，海洋药物之所以对人类许多种疾病具有明显的疗效，主要是因为海 2 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 洋生物物种之间的生态作用，远比陆生生物复杂和广泛，许多海洋化合物的 生物活性远比陆生生物活性强口引。微生物是许多药物( 包括抗生素、免疫抑 制剂和降血脂s t a t in s ) 的丰富来源，然而这些天然药物仅是从少数微生物品 种中获得的，但是得到详尽培养和实验室研究的物种不足总数的1 ，被发现 作为药物的仅仅局限于很少几个物种( 如海绵动物和苔癣门) 引。 许多天然药物可以直接从天然产物中获取，也有许多天然产物必须通过 改造或修饰才能使活性、特异性和药代动力学性质达到需求的标准，才能作 为药物使用阳引。临床上使用的许多天然药物都是通过对天然产物进行加工后 投入治疗使用的。常见的方法有化学方法、生物方法等。化学法中常见的是 化学修饰法和化学合成法。化学修饰法要首先测定化合物的活性中心，然后 对非活性中心的其他部位进行修饰，进而使其活性增强，并同时降低毒副作 用阳6 。化学合成方法是将选定的具有相同功能基团的目标分子，利用化学方 法结合在一起。可以通过这种方法来确定天然药物结构并且可以合成具有 生物活性的衍生物。生物法主要是指生物转化法，是利用生物体系或其产生 的酶对外源性化合物进行修饰，主要方法有天然药物的微生物转化、天然药 物的酶法生物转化、天然药物的植物细胞生物转化引。科学在发展就会有更 加新颖有效的方法出现，从而加速天然药物发展的进程。 从前一种天然药物的研究及开发就要经过几十年甚至上百年的科学工作 者的研究，付出巨大的艰辛与汗水，但是时代不同了，科学技术水平和方法学 都在不断的进行改善和发展，当前在各个学科蓬勃发展的年代，要想在某一 科学领域里有所前进，就必须进行多学科的交叉。在计算机辅助药物设计技 术平台上进行虚拟筛选，获得尽可能多的生物活性和化学结构多样性的信息， 强调化学研究与生物研究的结合n 引。使天然药物的研发成为生物资源学、化 学、分子生物学、医学、数学、物理等学科相互交叉渗透的系统工程引。 1 3 传统中药在药物发现的地位 中药是中华民族文化的瑰宝，我国中医药有着完整的理论体系，这一体 系是在不断进行经验理论补充的情况下，发展完善起来的，成为具有独特治 疗和诊疗方法的中医药学。传统中医药学曾为中华民族的繁衍与保健做出了 巨大贡献，成为世代相传的财富。中药除了悠久的历史文化背景，还具有副 3 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 作用小、疗效确切、治病治本的独特优点，其中蕴含了防病治病及应用天然 药物治疗疾病的丰富经验，在治疗、预防疾病和健康保健等方面显示出独特 的优势和巨大的发展潜力。清代医学家徐灵胎总结中药的药性时说：“凡药之 用，或取其气，或取其味，各以其所偏胜而即资之疗疾，故能补偏救弊，调 和脏腑，深求其理，可自得之。 传统中药的研究资源十分丰富，对其中许多药物的研究还尚属空白，流传 于世的医药古籍中积累的经方、时方不下数十万首，这些为新药研发提供了丰 富的资源与理论依据h 。目前已经研究发现了许多有效成分，这些有效成分虽 已数量众多，但是相对于资源丰富的传统中药来看，只是沧海一粟。传统中药 的历史悠久，流传至今已有千年的历史，但许多重要中药的化学结构和作用机 理都不明确，这同时也表明了中药研究具有巨大的潜力h 纠。神农本草经序 例中记载：“药性有宜丸者、宜散者、宜水煎者、宜酒浸者、宜膏煎者，亦有 一物兼宜者，亦有不可入汤酒者，并随药性，不得违越。”可见由于中药所含 有效成分物理化学性质不同，使用也各不同。传统中药是历经千年锤炼而成， 是直接在人体实践而获得的宝贵经验，这种经验就是临床使用的经验。也就摆 脱了在药效学和毒理学研究中出现的体内研究与体外研究的差异，及动物研究 与人体研究的差异。传统中药的理论精髓是强调整体、辨证施治、因人而异的 理念，这个整体是一种复杂的体系，综合各种药物若干的特性和作用来对某种 疾病进行治疗，而并非局限于“头痛医头，脚痛医脚”，治疗的出发点是扶正， 药物是援助手段，着眼点是培育调整人自身的愈合力h3 1 。这些理念弥补了西方 医生在诊治上的不足之处，在疾病的治疗和预防上具有导向性的作用。这一理 念具体体现在传统复方上，传统复方药是从单味药组分研究发展到复方研究， 这是传统中药研究发展的一个重要趋势。传统复方是将多味中药组合起来，实 际上是组方剂，具有一方多味，一味多成分的特征，传统中药依赖这些化学成 分，形成有主次、多靶点、有机的、整体的体内作用机制3 。对这一复杂体系 中起作用的各个部分研究不够充分和明确，未来传统中药的发展方向，就是要 针对复杂体系中各种有效成分进行深入研究。传统中医药学的产生和发展，不 但加深人们对自然界的了解，而且还由此孕育了生物药学和植物化学两门学 科，同时这两门学科的发展，又为传统中药的发展提供了更加先进的技术，促 进了传统中药的发展引。 4 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 根据传统中药理论，应用现代化的技术，人们己成功的提取出许多有效 成分，同时研究了这些有效成分的活性。从中药黄花蒿中提取出的青蒿素， 研究表明具有良好的抗疟效果引。从千层塔中分离得到的杉碱甲，可以改善 记忆缺损并可望治疗老年痴呆症7 1 。从五味子中分离得到的五味子素，具有 抗肝炎的功效钆例。从珍稀植物紫杉中提取的紫杉醇能有效治疗卵巢癌、乳 腺癌等妇科癌症哺玑5 。从中药川芎中分离得到的川芎嗪或四甲基吡嗪都有治 疗缺血性脑血管疾病的作用幻。还有虫菊酯及其衍生物被作为天然农药，栀 子黄素、紫草素被用作天然色素，甜菊苷和甘草甜素被用作天然甜味剂哺3 咱5 1 。 这些天然产物都是根据传统中药记载和理论分离提取得到的，已经被广泛应 用在医疗、农业和工业生产中，并扮演着中药的角色。 随着科学技术的迅猛发展，当前生物药物、天然药物和中药产业是21 世纪具有发展空间的高增值产业，传统中药进入了全新的历史阶段。传统中 药在我国医药产业中占有不可替代的地位，约占我国医药消费总额的一半 6 1 。目前全球中成药贸易额在4 0 0 亿美元以上，并仍以10 的速度递增，中 药产业正在成为新的经济增长点，是开展天然药物开发研究的有利因素7 1 。 现在传统中药以其独特优势和巨大的发展潜力引起全球范围更大的关注。随 着社会的发展，人们越来越关注化学药品给人类自身健康及生活环境带来的 负面影响，由于西药的副作用大，而西医对治疗疑难杂症方面的效果不尽如 人意，中药成为药物研发的热点哺引。中药在回归自然、保护环境的世界潮流 中再次焕发出强大的生命力，并展示出广阔的发展前景。 时代不断前进，科学技术在不断更新，传统中药也要把握好时代和科技的 契机，根据自身的特点和优势，利用现代科技，深入进行研究来寻求发展，实 现中药现代化。中药现代化是当前我国传统中药行业面临的紧迫任务，是挑战 也是机遇，其目标不仅要使中药走向世界，更重要的是丰富其内涵。中药用药 讲究辨证施治、配伍、炮制等等。中药组分作为药物库在生物安全性、结构多 样性、活性分子组成等方面均优于组合化学药物库9 6 0 3 。然而传统中成药及方 剂所形成的药物组分复杂，活性广泛。由于其有效药物分子与体内组织细胞上 的分子药靶两方面都不明确而缺乏现代科学依据，限制了其发展和国际化。因 此建立适合高通量筛选的中药样品库是从传统中药中快速发现针对特定药靶 的新药的关键。进行中药现代化的研究，就要应用现代医药学的研究成果，借 5 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 助现代化的技术手段，探索、认识、发展传统中药学。 1 4 天然药物及传统中药面临的困难及解决的策略 生物资源的多样性和特殊性，为创新药物的研究提供了得天独厚的资源与 优势。传统上天然化合物一直是新药的主要来源，已经发现许多天然来源的化 合物具有独特的生理活性，这些天然化合物已经被开发成具有特殊治疗作用的 药物阳。临床上应用的化学药物中很大一部分是天然化合物或在改造天然化合 物的基础上发展起来的。天然化合物较之组合化学合成化合物具有结构新颖、 较高的生物活性、副作用小的突出优点，并且天然化合物更容易占有与药物靶 点互补的化学部位阳2 6 3 1 。在结构多样、数量庞大的天然化合物中更容易筛选到 对特定药物靶点发挥调节作用的高效活性物质钔。不仅如此，天然化合物在帮 助确立和认识药物分子靶点方面也发挥着重要作用5 删。现在对天然药物的研 究主要是在传统中药原有药用功能的基础上进行活性成分的提取和分离。以活 性成分为先导化合物，用适当的药理模型筛选得到高效低毒的新药。 高通量筛选技术成为目前依据反向药理学理论寻找、筛选新的候选药物的 一种重要手段7 1 。高通量筛选技术的特点是微量化、自动化、规模化和高效率 哺引。高通量药物筛选需要大量的样品，可以选用高效的样品制备方法和设备， 积累各种中药样品，建立样品库，供不同的筛选模型使用，使样品的利用率提 高。可根据筛选后的结果一方面可以评价中药的药理学作用，同时可以作为提 取样品中活性成分的依据，对活性成分进行跟踪提取。传统中药学根据药物的 性、味、寒、热等性质分类，作为药物应用的依据。根据传统中药的分类方法， 按照不同类别进行大规模的比较筛选，研究不同类别的药物的共性和特点，可 以丰富中药药理学的内容。 高通量筛选依据现代药理学理论以药物的基本药理作用为起点，针对 药物作用的分子靶点或细胞上的作用位点进行药物筛选，在获得比较满意的活 性化合物后，通过体外细胞实验，研究药物作用的分子机理，进而，在组织、 器官水平以及疾病相关动物模型上进行药效学研究，确认为候选化合物后进入 药物开发研究。然而目前国际上将高通量筛选技术( h i g ht h r o u g h p u ts c r e e n i n g ， h t s ) 应用于天然活性物质的发现仍有一个关键的障碍：尚缺乏一个涵盖面足 够大、可以质量控制、能够用于大多数细胞和分子模型高通量筛选的高质量天 6 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 然化合物库。我国的传统中草药是一个天然的、资源丰富的巨大宝库，其针对 多种常见疾病和疑难杂症的有效性己得到充分的肯定，是一个天然活性物质比 较集中的天然活性物质资源。我们利用本团队已经建立的高通量筛选平台和中 药化学平台，集中探索了如何在技术上实现针对任何一个功能蛋白在短时间内 从大量常用中草药药材中迅速找到相对应的、活性理想的天然单体化合物的可 行策略，称之为“组分筛分天然活性物质发现体系 。总体设计如图1 所示。 该天然活性物质发现平台的主要创新点是首次系统建立了适合高通量筛选的 活性物质比较集中的中药天然小分子化合物简单组分库，应用二次筛选策略解 决了从复杂的天然物质体系中快速发现单体活性物质的难题。由于h t s 可以对 同一样品进行多模型的检测，经过一定的多模型的检测，可以得到同一样品在 不同模型上的活性结果，应用综合分析技术，对多种生物活性进行分析更符合 中药多靶点作用的特点，由此可以深入认识中药的作用机理，丰富中药药理学 内容9 1 。 药物作用靶点的确定是在生命科学和现代医学基础上进行的，在研究大量 生理及病理现象中，找出与疾病相关的基因和或生物靶 0 1 。药物的发现则是 以药靶为对象，有针对性地寻找、发现能对这些生物靶发挥作用的药物的过程 h 1 1 。本研究拟在前期工作基础上，采用氯离子敏感型荧光绿蛋白突变体 e y f p - h 14 8 q v 16 3 s 作为细胞内容积指示剂建立c f t r 氯离子通道激活剂的高通 量筛选细胞测定模型，对上述中草药小分子组分天然药物库进行系统的筛选， 获得阳性组分后进一步拆分筛选，获得高活性单体化合物。 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 图1 m s 1 5 本研究的目的意义 本文工作的目的是创建一种现代化的科学的从中药中发现具有活性的天 然药物组分的方法，应用该法得到纯度较高的具有活性的单体化合物，然后 通过解析化合物的结构，对该化合物的分子药理学活性进行分析，来证明这 种方法的科学性和可行性。对5 0 0 种常用中药建立粗提物组分库，利用制备 型h p l c 等对其中的3 0 0 种样品进行分离，建立中药样品组分库，然后从样 品库中筛选出具有生物活性的天然药物组分。首先，我们用9 5 医用酒精对 中药粉末进行l2 小时回流提取，得到粗提产物。粗提样品经过前处理之后， 用制备型h p l c 对中药粗提产物进行适度分离，并同时用l c - m s 技术进行质量 监控，建立中药样品组分库。用含c f t r 和一种对卤族元素碘高度敏感的荧光 绿色蛋白的突变体e y f p h i4 8 q 的表达质粒共转染f is c h e r 大鼠甲状腺 ( f is c h e rr a tt h y r o id ，f r t ) 上皮细胞，作为高通量筛选的c f t r 氯离子通 道荧光测定模型。利用高通量筛选技术( hig h t h r o u g h p u ts c r e e nin g ，h t s ) 8 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 筛选能够有效促进c f t r 氯离子通道开放的激活剂，确定是哪种中药的组分。 然后，经过对具有活性的某种中药组分的进一步分离和纯化，得到纯度较高 的化合物，使用m s 、红外及核磁来解析该化合物的化学结构。最后，对该活 性物质激活作用的性质和作用机理进行系统的分析。我们选择了一种激活作 用较好的中药一辛夷，经过活性检测和分离纯化，得到辛夷中具有激活作用 的单体化合物，通过结构鉴定证明是木兰脂素。结合荧光细胞功能测定法、 电生理分析方法、放射免疫分析方法对木兰脂素对c f t rc 1 一通道的激活作用 的性质和作用机理进行了系统的分析。发现木兰脂素具有特异性较强、作用 迅速、可逆、无毒等特点。该激活剂将在阐明c f t r 活性机制及开发囊性纤维 化治疗药物等方面具有重要用途。同时也证明了，我们所创建的这种从中药 样品库中获得活性化合物的方法是科学且可行的。 9 2 1 中药 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 第二章实验材料 5 0 0 种中药材均购买于吉林省药监局，单体化合物购于中国药品生物制品检 定所( n a t i o n a li n s t i t u t ef o rt h ec o n t r o lo fp h a r m a c e u t i c a la n db i o l o g i c a lp r o d u c t s i nc h i n a ，n i c p b p ) 。 2 2 细胞 f i s h e r 大鼠甲状腺上皮细胞( f i s c h e rr a tt h y r o i d ，f r t ) 由本实验室培养及保 存。 2 3 试剂 f 1 2c o o n s 细胞培养液，g e n i s t e i n 购于s ig m a 公司( s i g m ac h e m i c a lc o u s a ) 。胎牛血清购于h y c l o n e ( h y c l o n ec o m p a n y ，u s a ) 。其它试剂均为分 析纯。 2 4 主要设备 制备型高效液相色谱仪( w a t e r s ，美国) ，分析型高效液相色谱仪 ( w a t e r s 2 6 9 5 ，美国) ，质谱仪( w a t e r s ，美国) ，荧光显微镜( o l y m p u s ，日本) ， f l u o s t a ro p t i m a ( b m gb i o t e c h ，德国) ，细胞培养箱( h e r ac e l l1 5 0 ，h e r a e u s ， 德国) ，u s s i n gc h a m b e r ( p h y s i o l o g i ci n s t r u m e n t s ，i n c ，美国) ，高速冷冻离心 机( m i c r o f u g e2 2 r ，b e c k m a nc o u l t e ri n c ，美国) ，冰柜( h e r a e u s ，德国) 。 1 0 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 第三章实验方法 本实验的总体思路见图2 对有活性的化合物进行分析 发现新的天然药物组分 圆圆圆圆 图2 总体思路 3 1 中药粗提物的获得 将购买的中药材在干燥箱内烘干后，用粉碎机进行粉碎。准确称取各种药 物粉末2 0 0 9 ，分别用滤纸筒分装好。用脂肪抽提器在水浴锅上进行12 h 回流提 取，将提取的药液用旋转蒸发器进行浓缩。醇提物的制备是样品库建立的关键。 目前最常用的提取溶剂为水、亲水性溶剂和亲脂性溶剂，因此本实验室在提取 时使用的有机溶剂是乙醇。随着工作的不断进展，将来还要使用其他有机溶剂 进行提取来获得粗提产物，如氯仿和石油醚等。把浓缩后的粗提产物装入5 0 m l 离心管内，放入一2 0 冰柜内保存，作为粗提产物的样品库。 3 2 样品进行分离的前处理 将浓缩的粗提产物装入表面皿内，在水浴锅上烘干。为了除去糖和一些 水溶性大分子的干扰，将烘干的样品用纯净水充分混匀之后，放入离心管， 用l2 0 0 0 转分离心3 0 分钟，取出沉淀。将沉淀用配好的8 0 甲醇溶液充分 1 1 天然化合物中c f t r 氯离子通道激活剂的筛选及策略 混匀之后，用12 0 0 0 转分离心3 0 分钟，取出上清。将上清过滤膜进行处理， 过滤后的溶液放入e p 管内，作为用来分离的样品。 3 3 用制备型h p l c 进行分离 本实验室根据中药所含的不同组分在色谱柱内的保留时间的不同，对每 种中药进行分离。每次进样9 0 0 p l ，用o 9 0 的甲醇溶液进行梯度洗脱。每管 收集4 5 m l ，进行连续收集，一共收集8 0 个管。如果收集8 0 个管之后，还 存在没有被收集的色谱峰，那么就要增加收集管的数量，以保证分离得到的 色谱峰全部被收集。同时用l c m s 进行质量监控，以确保每管收集的小分子 不超过2 0 个。如果每管内的小分子超过了2 0 个，就需要调整制备型h p l c 的液相条件，通常是延长分离的时间，来达到分离效果。 3 4 中药样品库的建立 将收集的每种中药的分离产物按收集的先后时间顺序编号，然后将编号 的样品放到对应编号的表面皿里，放在水浴锅上烘干。烘干后的样品用尽量 少的8 0 甲醇重新溶解后，装进9 6 孔深板。将这些9 6 孔深板烘干后放到- 2 0 冰柜里进行保存。每个9 6 孔深板代表一种中药，结合分离样品的液相条件， 建立中药样品组分库。对每孔中的样品进行称重，用d m s 0 溶液将组分溶解后 放入9 6 孔浅板中，建立与组分库相应的中药样品筛选库。对样品库中每种中 药进行编号。 3 5 实验试剂的配制 将待测样品配制成浓度为2 0 m