（环境科学专业论文）五氯硝基苯对东北地区蔬菜大棚土壤酶活性影响研究.pdf

a b s t r a c t p c n bi sak i n do f h i g h l yl e v e le f f e c t i v e ，b r o a ds p e c t r u m a n dp o w e r f u lb a c t e r i o c i d e t h e r e s i d u a lt e r mi s 1 0 n g i ti st o x i ca n dd o s es e r i o u sh a r m e r t oe n v i r o n m e n t n o wi th a sb e e n l i s t e da sp r i o r i t yc o n t r o lp o l l u t a n t t h e r ea r em a n ys t u d y so np c n b ，b u ti th a sn o tb e e n r e p o r t e dt h a t i n f l u e n c eo fp c n bo ns o i le n z y m ei nv e g e t a b l eg r e e n h o u s e t h ep o l l u t e d s i t u a t i o no fp c n bi sn o tc l e a ri nv e g e t a b l eg r e e n h o u s e s ot h e r ei sm o r e p r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e t os t u d yt h ei n f l u e n c eo fp c n bo ns o i le n z y m e 、v i t l lt h er a p i dd e v e l o p m e n to fv e g e t a b l e g r e e n h o u s ei n n o r t h e a s ta r e a i nt h i sa r t i c l ew ei n v e s t i g a t e dt h ei n f l u e n c eo fp c n bo n i n v e r t a s e ，u r e a s e ，p h o s p h a t a s ea n dc a t a l a s ei n f o u rv e g e t a b l eg r e e n h o u s ew h e r eb e l o n g st o n o r t h e a s ta r e a t h ea c t i v i t yo fs o i le n z y m ec h a n g e dw i t l lt h ed i f f e r e n tp c n bc o n c e n u a t i o n s a n ds o i lc o n d i t i o n s t h ec h a n g er e g u l a ri ss u m m a r i z e da n dt h a tw i l ls u p p l yt h es c i e n t i f i c f o u n d a t i o nf o rr e a s o n a b l eu s i n gp c n bi nn o r t h e a s ta r e a t h es t u d ys h o w e dt h e r ea r es i g n i f i c a n ti n f l u e n c e so ni n v e r t a s e ，u r e a s e ，p h o s p h a t a s e ，a n d c a t a l a s eb yp c n bi nn o 1 s o i l ，w h i c hi s t h em o s tf e r t i l e ，a n dw i t h o u tu s k l gp e s t i c i d e p e s t i c i d eh a sb e e nu s e di nn o 2s o i la n dt h ec o n t e n to ft pi sm u c hh i g h e r i n v e r t a s ea n d u r e a s ei si n f l u e n c e dm u c h b yp c n b t h ec o n t e n to fo m ，t n ，t pi nn o 3s o i li sl o w e rt h a n o t h e r s ，i nw h i c ha l s oh a su s e dp e s t i c i d e p c n bj u s td o e si n f l u e n c eo ni n v e r t a s e i nn o 2 t h e c l a yc o n t e n ti st h el o w e s ti nn o 4s o i l p e s t i c i d eh a sb e e n u s e di nn o 4 s o i l ，t o o i n v e r t a s ea n d u r e a s ei sa l s oi n f l u e n c e dm u c h b y p c n b s ot h e r ea r es i g n i f i c a n ti n f l u e n c e so n b yp c n b i n f o u rt e s t e ds o i l s p c n bi n h i b i t si n v e r t a s ei nn o 1s o i l ，t h es t r o n g e ri n h i b i t i o ni so b s e r v e da t t h eh i g h e r f o rt h eo t h e rs o i l s ，u n d e rt h ep c n bc o n c e n 订m i o no f10u g k g ，i n v e r t a s ea c t i v i t y i ss t i m u l a t e d f i r s t ，t h e n i n h i b i t e d w h i l ei n v e r t a s e a c t i v i t y i si n h i b i t e da t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n ( 5 0 1 5 0 ug k g ) i ta d h e r e s t o t h er e g u l a r t h a t t h e h i g h e rc o n c e n t r a t i o no f p c n b i s ，t h es t r o n g e ri n h i b i t i o ni so b s e r v e d o nt h ec o n d i t i o no f1 0 , x g gw h i c hi sn e a rt ot h eu s e d c o n c e n t r a t i o ni nf i e l d ，i n h i b i t i o ni ss t i l ls i g n i f i c a n tu n t i ls o i l sh a v eb e e nc u l t i v a t e df o r 3 0 d a y s s oi n v e n a s ei sa d v i s e dt ob et h eb i o t o x i c a li n d e xo f p c n bi ns o i l s k e yw o r d s ：v e g e t a b l eg r e e n h o u s e ，p e s t i c i d e ，p c n b ，s o i le n z y m e ，n o r t h e a s ta r e a l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：日期：只反e 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：燃 日期：w 咀舌、，口 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：重望 日 期：型窒 电话： 邮编： 引言 土壤中所进行的生物和生物化学过程是陆地生态系统功能的基础，这些过程之所以 能够持续进行，得益于土壤中酶的作用。酶是土壤生态系统代谢的一类重要动力，土壤中 所进行的一切生物学和化学过程都要由酶的催化作用才能完成。虽然单一种类的土壤酶 的催化作用可能是专性的，但土壤中酶的来源不同，酶的种类繁多。土壤中已经被鉴定 出的约6 0 种酶活性表明，土壤酶活性与多种土壤理化指标相关，酶的催化作用对土壤 中元素( 包括c 、n 、p ) 循环与迁移有着重要作用。土壤酶活性易受环境中物理、化学 和生物因素影响，环境污染条件下酶活性变化很大，而活性的改变将影响土壤养分的释 放，从而影响作物的生长。因此，土壤酶是土壤自净容量的一个标志，也可作为土壤污 染水平的指标“。 一、壤酶的作用及其研究意义 ( 一) 土壤酶的来源及分类 通常认为土壤酶在很大程度上起源于土壤微生物，同样它也可能来源于植物和土壤 动物。由于精确判断土壤酶的来源具有一定的困难，土壤酶起源于微生物这一假说的证 据是间接的。关松荫等。1 归纳土壤酶来源于植物根系、微生物、土壤动物和动、植物残 体分泌释放。为了有效地研究和应用各种酶，必须对土壤酶进行分类。按照酶的催化反 应类型和功能，国际酶学委员会于1 9 6 1 年提出了一个分类系统，把酶可分为六大类型， 即水解酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶、异构酶和连接酶，土壤中酶活性的研究主要 涉及到前四类酶。水解酶包括各种脂类酶、糖苷酶和肽酶，它们能够分解聚多糖、蛋白 质等大分子物质，从而形成简单的、易被植物吸收的小分子物质，对于土壤生态系统中 的c 、n 循环具有重要作用；氧化还原酶是土壤中另一类研究较多的酶类，主要是催化 氢的转移或电子传递的氧化还原反应。由于这些酶所催化的反应大多是与获得能量或放 出能量的反应有关，因此在生物体内起着重要作用：转移酶类催化某些化合物中基团的 转移，即一种分子上的某一基团转移到另一分子上去的反应，不仅参与蛋白质、核酸和 脂肪的代谢，还参与激素和抗菌素的合成和转化；裂合酶在土壤中也具有某些活性，但 直到现在对于这类酶的研究还很少。 ( 二) 土壤酶的研究意义 土壤中广泛的存在着各种酶类，这些土壤酶能够催化土壤中复杂有机化合物转化为 简单无机物，供植物生长，是土壤新陈代谢的催化剂。土壤酶活性易受环境中物理、化 学和生物因素影响，张崇邦就进行了东北黑钙土土壤有机质与酶活性动态关系的研究， 为认识和评价黑钙土中物质转化和能量流动的现状提供理论依据”3 。现在，许多地区利 用塑料大棚种植经济作物，特别是对蔬菜进行反季生产，以满足人们在不同季节对农产 j 品的需求。为了促进蔬菜生产的持续发展，人们对蔬菜大棚土壤性状作过多方面的研究， 但对大棚土壤生物学特性的研究还较为少见。因此，贾继文等”3 对大棚土壤理化性状和土 壤酶进行全面的研究，并发现土壤的理化性质对土壤酶活性有显著影响，这些性质影响 着酶活性的强弱，同时酶活性的变化也影响着这些性状的高低。土壤酶活性与土壤有机 质关系密切，测定的过氧化氢酶、脲酶、中性磷酸酶、碱性磷酸酶都与有机质含量达到 了极显著相关，说明土壤有机质不但深刻影响着土壤的理化性质，也对土壤酶活性也起 到了重要的要作，同时说明土壤有机质是土壤肥力的基础。脲酶的作用是极为专性的，它 仅能水解尿素生成氨，因此，土壤有效氮水平必然与脲酶活性有关。脲酶活性低，会造成 尿素淋失，但脲酶活性太高，尿素分解太快，则会引起氨的挥发损失，因此大棚土壤应合 理施用氮肥，控制腺酶活性，减少氮素损失和对环境的影响。影响大棚土壤过氧化氢酶活 性的主要理化性质为有机质和阳离子交换量，因此，提高大棚土壤有机质含量，增强土壤 代换能力，能有效改善土壤过氧化氢酶的活性，减轻有害物质的积累，对于减轻目前蔬菜 大棚病虫害有重要的意义。土壤磷酸酶活性不仅受土壤有机质、阳离子交换量、土壤速 效磷影响，还受土壤容重、土壤砂粒含量的影响，说明土壤物理状况也影响土壤酶活性以 及土壤酶在土壤中的复杂性。土壤酶活性与土壤管理有一定的相关性，耕作、施肥、浇 水、使用农药会影响土壤酶活性，大棚土壤管理状况的特殊性必然影响着土壤酶活性变 化，这种变化有待于进一步研究，以便更好地调控土壤酶活性，为合理培肥大棚土壤提供 依据。 环境污染条件下酶活性变化很大，而活性的改变将影响土壤养分的释放，从而影响 作物的生长。因此，土壤酶是土壤自净容量的一个标志，也可作为土壤污染水平的指标。 针对土壤酶对外来化学物质的敏感性，一些学者提出，通过研究农药对土壤酶的影响来 评价土壤生态系统，或将其作为一项生态毒理学指标，用以判断外来化学物质对土壤的 污染程度及可能对生态环境造成的影响。国内外有关化学肥料、除草剂、杀菌剂和酸雾 等对土壤酶活性的影响及其土壤酶在降解有机污染物方面的报道很多。以转化酶、脲酶、 磷酸酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化氢酶、脱氢酶、多酚氧化酶等水解酶和氧化还原酶 的研究为主。由于土壤酶活性对生态环境变化的敏感性，所以土壤酶活性被作为土壤污 染的重要生物活性指标是土壤酶学目前的研究重点之o “。关于采用室内培养试验方 法研究双氰胺对土壤酶活性的影响情况已有报道“。沈标等也已报道过氯苯、对硝基酚 对土壤脲酶、脱氢酶具有刺激作用；对转化酶则具有轻微的抑制作用“。 二、土壤酶的研究原理与方法 ( - - ) 转化酶 转化酶又叫蔗糖酶或b 一呋喃果糖苷酶，是表征土壤生物活性的一种重要的水解酶。 对增加土壤中易溶性营养物质及碳循环中有重要作用。转化酶断裂蔗糖分子键后，生成 葡萄糖和果糖。产物是植物和微生物的营养源。研究证明，转化酶与土壤许多因子有相 关性。如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关。一般情况下， 2 土壤肥力越高，转化酶活性越强。它不仅能够表征土壤生物学活性强度，也可以作为评 价土壤熟化程度和肥力水平的一个指标“”。 转化酶的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖( 滴定法或重量法) 或是根 据蔗糖的非还原性，用生成物( 葡萄糖和果糖) 能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成 的氧化亚铜的量求出糖的含量。也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质( 3 ，5 - 二硝基 水杨酸或磷酸铜) 生成的有色化合物进行比色测定。还有一种方法是根据蔗糖液酶促反 应前后光偏振面的变化( 旋光法) 进行测定。 ( 二) 脲酶 脲酶广泛存在于土壤中，是研究的比较深入的一种水解酶。脲酶酶促产物一氨是植 物氮源之一。尿素氮肥水解与脲酶密切相关。有机肥料中也有游离脲酶存在。对完成土 壤中氮素循环有重要意义。同时，脲酶与土壤其他因子( 有机质含量、微生物数量) 也 有关系。研究土壤脲酶转化尿素的作用及其调控技术，对提高尿素氮肥利用率有重要意 义”1 。 脲酶是一种专性较强的酶，它能酶促尿素水解生成氨、二氧化碳和水。脲酶的测定 的常用方法有比色法、扩散法、尿素剩余量测定法、电极法、c o ：量度法等。比色法是 此三种方法中最常用的一种方法。它是根据脲酶酶促产物一氨在碱性介质中，与苯酚一 次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。该生成物数量与氨浓度成正比。或与奈氏试剂作用生成 黄色的碘化双汞铵。该生成物数量与氨量相关。1 。 ( 三) 磷酸醵 磷酸酶是一种水解性酶，酶促作用能够加速有机磷的脱磷速度，提高土壤磷素的有 效性。在p h 4 9 的土壤中均有磷酸酶。研究表明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关， 与有效磷含量及p h 值也有关。此外，土壤颗粒性质也影响磷酸酶的酶促效应，与土壤 颗粒表面有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。“2 “。 磷酸酶的测定主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前 一种通称为有机基团含量法，后一种称为无机磷含量法。3 。 ( 四) 过氧化氢酶 过氧化氢酶是本论文研究中唯一的一种氧化还原酶。它广泛存在于土壤中和微生物 体内，能酶促过氧化氢的分解，有效防止土壤及生物体在新陈代谢过程中产生的过氧化 氢对生物体的毒害。过氧化氢酶活性于土壤有机质含量有关，与微生物数量和土壤呼吸 也有关系。一般认为，土壤中催化过氧化氢分解的活性，有3 0 或4 0 以上是耐热的， 即非生物活性，常由锰、铁引起催化作用。土壤肥力因子与不耐热的即过氧化氢酶活性 成正比1 。 过氧化氢酶能酶促过氧化氢分解生成分子氧和水，其测定方法有气量法( 附纸片 法) 、容量法和分光光度法。其中容量法和分光光度法最为常用。 三、本文的研究内容、目的及意义 五氯硝基苯( p c n b ) 是一种高效、广谱、强力杀菌剂。是一种土壤和种子杀菌剂， 主要用于防治由尖孢镰刀菌( f u s a r i u mq r y s p o r i u m ) 及茄丝核菌( r h i z o c t o n t i a s o l a n i ) 等病菌引起的植物病害。且对土壤中存活多年的病原菌也有一定作用。并对各 类作物、多种蔬菜、药材、花卉、苗木等生长期发生的各种根病有良好防效。但由于其 残留期长，对环境有严重危害。现在一些国家已将其列为优先控制污染物”。“3 。目前在 国内对这种农药的研究很多。，但其对土壤酶活性的影响研究尚未见报道。蔬菜大棚是 一个相对封闭的生态系统，由于化肥、农药施用的不合理而出现的土壤养分不均衡和农 药残留等现象较开放的大田土更为明显。随着东北地区保护地栽培的快速发展，大棚蔬 菜生产过程中p c n b 的污染状况还不十分清楚，因此开展p c n b 对东北地区蔬菜大棚土壤 酶活性影响研究更有实际意义。本论文选取东北不同地区的四种大棚土壤为受试土壤， 以转化酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶为测定指标，通过测定p c n b 浓度变化、土壤条件 改变引起的土壤酶活性的变化，总结变化规律，为东北地区蔬菜大棚合理施药提供科学 依据。 4 第一章、实验材料与方法 一、实验材料 ( 一) 化学试剂 1 实验农药 五氯硝基苯( 2 0 粉剂，山西省临汾有机化工厂) 分子式：c 。0 。c 1 。n 分子量：2 9 5 3 4 2 测定转化酶活性所需试剂 3 ，5 一二硝基水杨酸：分析纯，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 氢氧化钠：分析纯，北京化工厂 酒石酸钾钠：分析纯，北京化工厂 磷酸氢二钠：分析纯，北京红星化工厂 磷酸二氢钾：分析纯，沈阳市试剂厂 蔗糖：分析纯，北京化工厂 甲苯：分析纯，长春市化学试剂厂 葡萄糖：分析纯，天津市大茂化学试剂厂 苯甲酸：分析纯，沈阳市试剂三厂 3 测定脲酶活性所需试剂 柠檬酸：分析纯，北京化工厂 氢氧化钾：分析纯，长春市化学试剂厂 苯酚：分析纯，北京化工厂 乙醇：分析纯，北京化工厂 甲醇：分析纯，长春市化学试剂厂 丙酮：分析纯，北京化工厂 次氯酸钠：分析纯，北京化工厂 尿素：分析纯，北京化工厂 硫酸铵：分析纯，上海试剂四厂 4 测定磷酸酶活性所需试剂 磷酸苯二钠：分析纯，上海三思试剂有限公司 氯化铵：分析纯，北京化工厂 氢氧化铵：分析纯，北京化工厂 4 氨基氨替比林：分析纯，北京西中化工厂 5 测定过氧化氢酶活性所需试剂 过氧化氢( 3 0 ) ：分析纯，北京化工厂 硫酸：分析纯，北京化工厂 高锰酸钾：分析纯，沈阳试剂厂 ( 二) 实验仪器 电热恒温培养箱：w m k 一0 2 型，南京实验仪器厂 紫外光栅分光光度计：7 2 3 0 6 型，上海分析仪器厂 恒温水浴震荡器：s h a c 型，江苏国华仪器厂 磁力恒温搅拌器：c h j 一1 型，上海南汇电讯器材厂 离心式粒度分析仪：s a c p 3 型，日本岛津公司 ( 三) 土样的采集及预处理 受试土样采自东北地区四个蔬菜大棚种植区，见表2 1 。采用随机采样法，均取土 壤表层1 1 0 c m 土样。土样采回后在室温下避光风干，过l m m 筛备用。 表卜1 受试土壤采样情况 t a b l e l 1t h ee o n d i t i o i l so f t e s t e ds o i l s 二、实验方法 ( 一) 土壤理化性质的测定 采用油浴加热k 。c r ：0 7 容量法测定土壤有机质含量，开氏法测定土壤全氮，酸 溶钼锑抗比色法测定土壤全磷，电位法测定土壤p h 值，光度测定法测定粘土矿物。“。 ( 二) 农药实验浓度的设置及土样的处理 称取1 2 0 0 9 供试土壤，均分为4 份，分别加入不同剂量的p c n b ，使其在土壤中的浓 度分别为0 ，1 0 ，5 0 ，1 5 0 g g 。调节试样的含水量至土壤最大持水量的6 0 9 6 ，置于恒 温培养箱2 5 + 1 条件下恒温培养，分别在1 ，3 ，7 ，1 l ，1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0 天取样测定 土壤酶活性，每个样品设置3 个平行。 ( 三) 土壤酶活性的测定【2 j 1 土壤转化酶活性的测定 称5 克土样，置于5 0 m l 三角瓶中，注入1 5 m l8 的蔗糖溶液，5 m lp h 5 5 磷酸缓冲 液和5 滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在3 7 。c 下培养2 4 h 。到时取出，迅速过滤。 从中吸取滤液l m l ，注入5 0 m l 容量瓶中，加3 m l3 ，5 一二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴 锅中加热5 m i n ，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3 m i n 。 溶液因生成3 一氨基一5 一硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至5 0 m l ，并在分 光光度计上于波长5 0 8 n m 处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整 个实验需做无土对照。 结果计算：转化酶活性以2 4 h 后1 9 土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖( 毫克) = a 4 式中：a 从标准曲线查得的毫克数 4 换算成1 9 土的系数 标准曲线绘制： 将葡萄糖先在5 0 5 8 。c 条件下，干燥至恒重。然后取5 0 0 m g 溶于1 0 0 m 苯甲酸溶液 中( 5 m g 还原糖m 1 ) ，即成标准葡萄糖溶液。再用标准液制成l m l 含0 0 1 0 5 m g 葡萄糖 的工作溶液。 取l m l 不同浓度的工作液，并按与测定转化酶活性同样的方法进行显色，比色后以 光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 方程为：a = o 0 4 8 8 c + 0 3 2 0 7 r 2 = 0 9 9 7 2 其中a 为吸光度，c 为葡萄糖浓度( 以葡萄糖的毫克数计算) 2 土壤脲酶活性的测定 称5 克土样，置于5 0 m l 三角瓶中，加l m l 甲苯，1 5 m i n 后加l o m l1 0 的尿素液和 2 0 m lp h 6 7 柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在3 7 c 恒温箱中培养2 4 h 。过滤后取3 m l 滤液注入 5 0 m l 容量瓶中，然后加蒸馏水至2 0 r a l 。再加2 m l 苯酚钠溶液和1 5 m 1 次氯酸钠溶液， 随加随摇匀。2 0 m i n 后显色，定容。1 h 内在分光光度计上于波长5 7 8 n m 处比色。 结果计算：脲酶活性以2 4 h 后1 9 土壤中n h 。一n 的毫克数表示。 n h 一一n ( m g ) = b 2 式中：b 从标准曲线查得的n h 。一n 毫克数 2 换算成1 9 土的系数 标准曲线绘制： 精确称取0 4 7 1 7 9 硫酸铵溶于水并稀释至1 0 0 0 m l ，则得l m l 含0 1 m g 氮的标准液。 绘制标准曲线时，再将此液稀释l o 倍供用。 吸取稀释的标准液1 ，3 ，5 ，7 ，9 ，1 1 ，1 3 m l ，移于5 0 m l 容量瓶中，然后按与测定 脲酶活性同样的方法进行显色，比色后根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。 方程为：h = o 8 2 8 3 c - 0 0 0 8r 2 _ o 9 9 1 5 其中a 为吸光度，c 为溶液浓度( 以n h 。一n 的毫克数计算) 3 土壤磷酸酶活性的测定 称5 克土样，置于5 0 m l 三角瓶中，加5 滴甲苯后再加2 0 e l0 5 磷酸苯二钠，充分 振荡后于3 7 。c 恒温箱中，培养2 h 。取培养后的滤液5 m l ，加入0 2 5 m lp h 9 8 氯化铵一 氢氧化铵缓冲液、0 5 m l4 - 氨基氨替比林液，0 5 m l 铁氰化钾液，每次加入试剂都要充 7 分摇动，最后定容至5 0 m l 。1 5 m i n 内在分光光度计上于5 1 0 n m 处比色。 结果计算：磷酸酶活性以2 h 后l o o g 土壤中p 2 0 j 的毫克数表示。 p 2 0 ；( m g ) = a 8 0 x 0 3 2 2 2 9 式中：a 5 1 滤液中酚的毫克数 8 0 换算为l o o g 土壤的系数 0 3 2 以磷单位表示结果的系数( 在磷酸苯二钠中，1 个重量单位的酚，相当 于0 3 2 重量单位的磷) 2 2 9 将p 换算为p 2 0 ； 标准曲线绘制： 取1 9 重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至l l ，绘制标准曲线时，再将此液稀释1 0 0 倍( 每毫升含 0 0 1 m g 酚) 备用。 取稀释的酚工作液1 ，3 ，5 ，7 ，9 ，1 1 ，1 3 m l ，置于5 0 m l 容量瓶中，分别加入2 0 m l 水。 然后按测定磷酸酶活性所述方法显色。比色测定，最后绘成标准曲线。 方程为：a = 5 9 3 1 3 c 0 0 5 7 7 群= 0 9 9 3 7 其中a 为吸光度，c 为溶液浓度( 以酚的毫克数计算) 4 土壤过氧化氢酶的测定 取2 克土样，置于l o o m l 三角瓶中，并注入4 0 m l 蒸馏水和5 m l0 3 过氧化氢溶液。 将三角瓶放在振荡机上，振荡2 0 m i n 。而后加入5 m l3 m o l l 硫酸，以稳定未分解的过氧 化氢。再将瓶中悬液过滤。然后，吸取2 5 m l 滤液，用0 1 m o l l 高锰酸钾滴定至淡粉红 色终点。 结果计算：用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量( 毫升数) 为b ，用于滴定2 5 m l 原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量( 毫升数) 为a 。 ( a b ) t 即为过氧化氢酶活性。以2 0 m i n 后1 9 土壤的0 1 m o l l 高锰酸钾的毫升 数表示。式中t 为高锰酸钾滴定度的校正值。 第二章、结果与讨论 一、实验土壤的理化性质及酶活性 四个大棚土壤的理化性质见表2 一l 。 表2 1 供试土壤的理化性质 t a b l e2 - 1t h e p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so f s o i l st e s t e d 未经p c n b 处理过的大棚土( 对照组) 三种土壤酶( 转化酶、脲酶、磷酸酶) 的活性 值见表2 2 。 表2 - 2 大棚土壤酶活性测定值 t a b l e2 - 2a c t i v i t i e so f e n z y m ei ns o i l s 注：土壤酶活性值为监测周期内平均值。 由表1 1 、2 - 1 及2 2 可见，土壤耕种年限、施药情况以及土壤理化性质不同其土壤 酶活性强弱也有所差异。1 号土壤耕种年限最长，又无施药史，土壤肥力高，其有机质 含量、粘土含量最高，且氮磷含量较高，土壤生态环境受损坏程度最小。因此其转化酶、 脲酶、磷酸酶活性也最强。2 号土壤与4 号土壤的转化酶活性值极为相近，这是由于二 者有机质含量也近似相等，而有机质含量与转化酶活性又高度相关的结果。3 号土壤有 机质含量最低，其转化酶活性也相应最弱。2 号土壤采自辽宁，土壤呈棕黄色，根据土壤 9 的地带性分布，2 号土壤很可能是由棕壤培育成的人工土，其他3 种大棚土是由黑土、草 甸土或暗棕壤培育而成的人工土，而棕壤的脲酶活性值较这三类土壤的要低。此外，2 号土壤含磷量过高，影响脲酶酶促反应速率，阻碍微生物的合成作用，导致脲酶活性减 弱”。这可能是2 号土壤脲酶活性比其他大棚土弱的另一原因。土壤中的脲酶除- - 4 , 部分存在于土壤溶液中外，大部分被土壤粘粒、腐殖质等物质所吸附，呈吸附态酶”“”1 ， 4 号土壤粘土矿物含量最低，因而其脲酶活性较3 号土壤低。2 号、3 号、4 号土壤磷酸 酶活性均低于l 号土壤，这可能与其有施药史有关。 = 、i 0 n b 对土壤转化奠活性的影响研究 ( 一) p c n b 对1 号土壤转化醇活性的影响 由图2 1 可见，施用1 0 、5 0 、1 5 0 9 9 g p c n b 后的1 3 d ，1 号土壤转化酶活性变 化不显著。这可能是由于1 号土壤有机质含量高，施药后，原来与胶体结合，无法发挥 作用的转化酶，可因与p c n b 分子在有机胶体上发生竞争吸附，从而使胶体上结合的酶 释放出来，参与酶促反应，致使p c n b 对转化酶活性没有表现出显著的激活或抑制作用 。“1 。培养第7 d ，低浓度( 1 0 斗g g ) p c n b 对转化酶活性影响仍不显著，高浓度( 5 0 、1 5 0 9 9 g ) 对转化酶活性开始有抑制。7 d 后3 个处理土样的转化酶活性均处于被抑制状态，之后抑 制率逐渐增大，至第l l dp c n b 对转化酶活性抑制率达到最大值。其中，1 5 0 肛g g p c n b 对转化酶活性的抑制作用最强，抑制率为7 7 。培养”d 后，转化酶活性开始恢复，抑 制率减小，在1 5 3 0 d 里，1 0 p g g p c n b 对转化酶活性作用规律为恢复一抑制；其余2 个处理转化酶抑制率在第2 5 d 出现拐点，转化酶活性受到激活，培养第3 0 d 转化酶活性 又受到抑制。从整天趋势来看，p c n b 对1 号大棚土转化酶活性作用主要以抑制为主， 在培养前中期抑制作用最强，此后抑制作用有所减弱。 ；一：氛 一一：夕矧 一r 一7 yy 1371 11 52 02 5 3 0 时间( 天) 图2 1p c n b 对l 号土壤转化酶活性影响 f i g u r e 2 1 i n f l u e n c eo fp c n bo ni n v e r t a s ea c t i v i t yi n n o 1s o i l 吣腓矾帆蹦瓣骗嗍 加，0 0 屯 o 加 斟痞幂 ( 二) p c b l b 对2 号土壤转化酶活性的影响 从图2 2 可看出，培养1 - 3 d 1 0 、5 0 i tg g p c n b 对2 号土壤转化酶活性作用不明显， 而l j o i tg g p c n b 对转化酶活性的抑制率己达到3 0 ，在培养前1 5 d ，施用高浓度( 5 0 、 1 5 0i tg g ) p c n b 处理的土壤转化酶活性被抑制，抑制率逐渐增大，第1 5 d 时达到最大值， 分别为5 2 和8 7 。这说明p c n b 的浓度过高，超过了土壤微生物对p c n b 的耐受浓度 范围，致使微生物数量减少，而转化酶活性是绝大多数微生物所固有的，它与土壤微生 物数量有直接关系，因而又导致转化酶活性降低”。1 5 d 后抑制率下降，这可能是由于 一部分p c n b 被降解生成毒性较p c n b 低的氯代苯胺类，使微生物数量得到一定的恢复， 进而转化酶活性有所提高，但仍低于对照水平。1 0pg g p c n b 在1 1 5 d ，对转化酶活性 有激活作用，第1 5 d 达到最大激活，激活率为9 4 。说明开始时，土壤中存在某些能够 分解低浓度p c n b 的微生物类群，不但降低了p c n b 的毒性，还为许多其他微生物提供了 养料，进而使微生物数量增加，转化酶活性也随之提高“3 。1 5 2 0 d 转化酶活性开始恢 复，2 0 一3 0 d 转化酶活性受到抑制，且各处理土壤转化酶活性均处于相对稳定的抑制状 态。 乡孑一 1371 11 52 02 5 3 0 时间( 天) 图2 2p c n b x 扭号土壤转化酶活性影响 f i g u r e 2 2i n f l u e n c eo fp c n bo nj n v e r t a s ea c t i v i t yi n ( 三) p c n b 对3 号土壤转化酶活性的影响 p c n b 对3 号土壤转化酶活性的影响见图2 - - 3 ，1 0 9 9 j g p c n b 处理土壤转化酶活性 变化规律与2 号土壤相似，在培养第1 d ，激活率已经达到2 3 ，也在第1 5 d ，转化酶活 性达到最大值，激活率为3 2 ，第2 0 d 对转化酶的抑制作用最强。抑制率4 1 。5 0 9 9 g p c n b 除在培养第2 5 d 对转化酶活性表现为激活外，均对转化酶活性抑制，在培养第7 d ，抑制 率最大( 6 9 ) 。1 5 0 p g gp c n b 对转化酶活性有显著抑制，抑制率在1 7 6 5 范围内变 化。由于3 号大棚土有机质含量最低，转化酶活性也最低，转化酶对高浓度( 1 5 0 9 9 g ) p c n b 更为敏感，培养第1 d 转化酶活性已达到最低值，抑制率为6 5 。 il；删矾飘i蒡慨 o 7 5 2 2 5 7 0 料暴露 溉 l 1371 i1 52 02 5 3 0 时间( 天) 图2 3p c n b 对3 号土壤转化酶活性影响 f i g u r e 2 3i n f l u e n c eo fp c n bo ni n v e r t a s ea c t i v i t yi n n o 3s o l l ( 四) p c n b 对4 号土壤转化群活性的影响 如图2 - 4 所示，培养的第1 d ，p c n b 对4 号土壤转化酶活性作用不显著，随着培 养时间的推移，转化酶活性开始受到影响：低浓度( 1 0 、5 0 p e j g ) p c n b 对转化酶活性 影响过程是激活一恢复一抑制，；高浓度( 1 5 0 肛e d g ) p c n b 对转化酶活性的影响过程则 是抑制一激活一再抑制的作用规律；在第1 i d 里，1 5 0 e j 妒c n b 对转化酶活性抑制作用 最强，抑制率为7 4 。在培养第1 5 d 时，三种浓度的p c n b 对转化酶活性均有明显的 激活作用，且达到最大激活，激活率分别为：9 3 、4 6 和4 3 。 么众彩 一v 1371 11 52 02 5 3 0 时间( 天) 图2 4p c n b 栅土壤转化酶活性影响 f i g u r e 2 4i n f l u e n c eo fp c n bo ni n v e r t a s ea c t i v i t yi n n o 4s o l l ( 五) p c n b 对大棚土转化蘸活性影响的比较 1 号土壤耕龄长，土壤肥力高，粘土矿物含量高，由于土壤的吸附作用使得微生物 嘶踹毗踹嘶腓嘶蹦嘶 m ，0 0 屯七1 m 辟器晕 孙o 2 昌跗 1 一 一l 褂器嚣 受p c n b 的影响较小，导致培养j i 期转化酶对p c n b 有一定的耐受能力，但由于无施药史， 土壤微生物对p c n b 较其他大棚土更为敏感，所以即使施用低浓度的p c n b ，在第1 1 d 也产生强烈抑制，其抑制率达4 4 。同时，1 号土壤对p c n b 的缓冲能力也较强，在培 养周期内转化酶活性的激活率和抑制率数值范围都明显较2 4 号土壤小。这说明1 号 大棚土较其他大棚土的土壤自身修复和自净能力要强。低浓度p c n b 对有施药史、土龄 短、肥力一般的2 4 号土壤转化酶活性在培养前1 5 d 一般表现为激活作用。1 5 d 后，转 化酶活性开始恢复一抑制。施用高浓度的p c n b 对大棚土转化酶活性的抑制是显著的。 因此p c n b 对所监测的四种大棚土转化酶活性影响基本属于低浓度前、中期激活，后期 抑制；高浓度抑制的作用规律。 三、p c n b 对土壤脲酶活性的影响研究 ( 一) p c n b 对1 号土壤脲酶活性的影响 p c n b 对l 号土壤脲酶活性影响见图2 5 。结果表明，在培养前1 5 d 内各处理土壤 脲酶活性无显著变化。培养第2 0 d 时，低浓度( 1 0 p e d g ) p c n b 对脲酶活性有抑制，高 浓度( 5 0 、15 0 1 x g 9 1p c n b 对脲酶有激活作用。第2 5 d 三个处理土壤脲酶活性均受到激活， 1 5 0 p g g p c n b 对脲酶活性的激活率最大，为5 0 ，说明1 号土壤微生物能将p c n b 及 其降解产物作为碳源所利用。之后脲酶活性开始恢复，至第3 0 d 脲酶活性基本恢复到 对照水平。 1 0 0 7 5 5 0 壁2 5 差 o 一2 5 - 5 0 - 7 5 - 1 0 0 一 + 1 0ug g + 5 0ug g + 1 5 0 1 tg g 一：。，- 、。八 ：一一一弋7 1371 11 52 02 5 3 0 时间( 天) 图2 5p c n b 对1 号土壤脲酶活性影响 f i g u r e 2 5i n f l u e n c eo fp c n bo ru r e a s ea c t i v i t yi n ( - - ) p c n b 对2 号土壤脲醇活性的影响 p c n b 对2 号土壤脲酶活性的作用较为显著，见图2 6 ，这与其脲酶活性的对照值最 低有关。在施药的第1 d ，低浓度( 1 0 ug g ) p c n b 对脲酶活性有激活作用，且脲酶活性 达到最大值，激活率为2 7 。培养3 d 以后，p c n b 对脲酶活性开始抑制，且抑制作用逐 渐增强，第7 d 脲酶活性受到最大抑制，抑制率分别为7 2 ( 1 0ug g ) 、6 9 ( 5 0 “z g ) 、 7 0 ( 】5 0 ug g ) 。从第1 1 d 脲酶活性开始恢复，至第3 0 d 除1 5 0 ug g p c n b 对脲酶活性 有相对显著的抑制作用，抑制率为2 6 ，其他处理土壤基本恢复对照水平。这可能是 p c n b 与脲酶分子中的活性部位巯基和含咪唑的配体等结合，产生了与底物竞争性抑 制作用。这种抑制作用是一种暂时现象，经过一段时间后，脲酶活性能得到一定程度的 恢复，甚至激活“3 。至于为何施用高浓度p c n b ( 1 5 0 ug g ) 在1 5 d3 0 d 脲酶活性出现先 激活后抑制的动态变化，还需要进一步的研究。 1 0 0 7 5 5 0 壁2 5 鉴o 鞴一2 5 一5 0 一7 5 一1 0 0 j 奈一 一- 酋蓼乏 1371 11 52 02 53 0 时间( 天) 图2 6p c n b x d 2 号土壤脲酶活性影响 f i g u r e 2 6 i n f l u e n c eo fp c n bo nu r e a s ea c t i v i t yi n ( 三) p c n b 对3 号土壤朦醇活性的影响 如图2 7 所示，p c n b 对3 号土壤脲酶活性的影响不显著，主要表现为激活。激活 率不超过2 0 。 1 0 0 7 5 5 0 墼2 5 蓑 o - 2 5 一5 0 - 7 5 一1 0 0 一 + 1 0 1 1g g + 5 0ug g + 1 5 0 ug g - ，_ ，p iifl z - 写：，一- 冒 371 11 52 02 53 0 时间( 天) 图2 7p c n b x 扭号土壤脲酶活性影响 ( 四) p c n b 对4 号土壤腙酶糈性的影响 施用p c n r 后4 号土壤脲酶活性的变化如图2 。8 。培养前7 d ，三个处理土壤脲酶活 性处于被抑制状态，此后抑制率逐渐减小，l l d 后，1 0 1 jg g 、5 0 ug gp c n b 对土壤脲 酶活性激活，1 5 0ug gp c n b 处理土壤脲酶活性接近对照水平，至第2 0 d 三个处理土壤 脲酶活性均受到激活。2 0 d 后p c n b 对脲酶的激活能力有所减弱，培养第2 5 d 时，脲酶 1 4 活性均低于对照水平，被抑制。2 5 d 后除1 0 ug g p c n b 处理土壤的脲酶活性仍被抑制( 3 0 d 达到最大抑制，抑制率为4 8 ) ，其他处理土壤脲酶活性得到恢复和激活。至于原因还 有待于进一步研究。 1 0 0 7 5 5 0 壁 2 5 鉴 o ”一2 5 一5 ( ) 一7 5 一1 0 0 一p 1 0ug g p5 0ug g 1 5 0ug g _ ) ，公 一一影 1371 11 52 02 53 0 时间( 天) 图2 8p c n