（发酵工程专业论文）双歧杆菌微胶囊制备工艺及功能特性的研究.pdf

摘要 双歧杆菌作为典型的益生菌，其促进人体健康的有益作用己被公认，本研究针对 双歧杆菌制品在贮藏和消费过程中存在的问题，通过微胶囊技术对双歧杆菌进行保 护，以期在一定范围内延长双歧杆菌制剂的保存期，并尽量减少其通过胃肠道时的损 失，对挤压法和喷雾干燥法制备微胶囊的工艺进行优化，确定最优操作条件。 选择海藻酸钠为主要囊材，以果胶为辅材，通过正交试验，筛选出挤压法制备微 胶囊的最佳配方，研究了双歧杆菌微胶囊的功能特性。结果表明，双歧杆菌微胶囊的 最佳配方为：胶液总浓度为2 ，胶液：菌液为l ：1 。海藻酸钠：果胶为2 ：l ，c a c l 2 浓度为0 ，3 m o l _ l _ ；双歧抒莹微胶囊直径为1 2 m t x x ，活菌含量达到l o f u , g 以上，具 有良好的耐胃酸性、耐胆盐性、肠溶性。3 7 贮藏6 0 天，双歧杆菌存活率达到1 4 6 ， 4 c 贮藏6 0 天，存活率高达4 4 9 。 选择明胶为壁材，通过喷雾干燥的方法制成微胶囊，研究喷雾干燥过程中的固形 物浓度、进样流量、迸风温度、出墨温度对微胶囊产率及菌体存活率的影响，确定最 佳操作工艺参数为：固形物浓度为3 ，进样流量为3 6 0 m l h ，进风温度为1 0 5 ， 出口温度为5 4 5 7 ，微胶囊产率为6 5 7 ，活菌存活率为5 3 5 ，活菌含量超过 l x l 0 1 0 c 眦，微胶囊直径为5 l o t t t n 。在模拟人工胃液中放置两小时，双歧杆菌存活 率达到1 2 5 ，活菌数仍高达6 6 6 1 0 9c f i l 缝，在模拟入工肠液中两小时后，大部分 微胶囊崩解溶出。 通过双歧杆菌微胶囊在酸乳中贮藏稳定性的研究表明，微胶囊化双歧杆菌在酸乳 基质中，降低了对保藏温度的敏感性，提高了耐酸能力，活菌保藏期得以延长。在低 于p h 值4 2 的酸乳基质中，4 冷藏2 8 d ，活菌数仍在l x l 0 8c f u g 以上；在p h 值 4 2 的酸乳基质中，室温( 2 0 - - 2 5 c ) 贮藏2 8 d ，活菌数仍保持在lx 1 0 6 c f u 幢以上，挤 压法制得的双歧杆菌微胶囊在稳定性上要优于喷雾干燥法。 关键词：双歧杆菌；微胶囊化；喷雾干燥；挤压；优化 t h er e s e a r c ho f p r e p a r a t i o nt e c h n i c sa n df u n c t i o ns p e c i a l i t yo f b i f i d o b a e t e r i a m i c r o e n e a p s u l a t i o n m a s t e rc a n d i d a t e ：l in m g s u p e r v i s o r ：p r o f h o n g t a o f i a n m a j o r ：f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g a b s t r a e t b i f i d o b a c t e r i aa sat y p i c a lp r o b i o f i c s ，i t sf u n c t i o no f i n c r e a s i n gt h eh e a l t hh a v eb e e n a d m i t t e d ， a i m i n ga tp r o b l e m si nt h ep r o c e s so fs t o r i n ga n dc o n s u m i n g ，t h es t u d y p r o t e c t e db i f i d o b a c t e r i ab ym i c r o c a p s u l et e c h n i q u e t o p r o l o n gt h es t o r i l l gl 谂o f b i f i d o b a c t e r i ap r o d u c t si nac e r t a i nr a n g ea n dr e d u c et h el o s sw h e np a s s i n gs t o m a c ha n d i n t e s t i n e t h e t e c h n i q u e so fm a k i n gm i c r o c a p s u l eb ye x t r u s i o na n ds p r a y - c h - y i n gw e r e o p t i m i z e dt og e tt h eb e s tc o n d i t i o n p r e p a r a t i o n so fb i f i d o b a c t e r i am i c r o c a p s u l e su s e ds o d i u m 鹕吵l a 把a sw a l lm a t e r i a l a n dp e c t i na sa s s i s t a n tm a t e r i a l b yt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ao p t i m a lm e t h o do f p r e p a g a 五o no fm i c r o e n c 删a l e db ye x t r u s i o nt e c h n i q u ew 鹬如e n e d a n d l 骶p m e d t h em i c r o c a p s u l eo fb i f i d o b a c t o r i a s t u d yt h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fm i c r o c z p s u l e b i f i d o b a c t e r i a t h er e s u l ti n d i c a t e d ：1 kp r i n l ed i c t i o 砸o fb i f l d o b a c t e r i aw a sa s f o l l o w e d ：g l u ew a s2 ，g l u e ：b a c t c r i u m = l ：2 ，s o d i 衄a l g i n a t e ：p e c t i n = 2 ：1 c a c l aw a s o 3 m o f l ：t h ed i a m e t e ro fm i c r o c a p s u l ew a s1 2 衄1 1 坞v i a b l ec e l lc o u n t so f b i f i d o b a c t e r i aw a sa b o v e1 0 r c f i l ，g ，a n dw a so fg o o da c i d - t o l e r a n t ，b i l es a l tt o l e r a n t ， i l e j 虹n e 3d i s s o l v e d t h es u r v i v a lr a t i oo fa c t i v eb i f i d o b a e t e r i aw a sa sh i g ha s1 4 6 a p , e r 6 0d a y su n d e r3 7 ca n d4 4 9 a f t e r6 0d a y su n d e r4 g e l a t i nw a sc h o s e nf o r t h ew a l lm a t e r i a l 1 1 帕b e s tt e c h n i c a lc o n d i t i o n sf o r s p r a y - d r y i n go fm i c r o e n c a p s u l a t i o no fb i f i d o b a c t e r i nw e r ed e t e r m i n e da c c o r d i n gt ot h e e x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s tc o n c e n t m f o no fw a l l - m a t e r i a lw a s3 i n l e t a i rt e m p e r a t u r ea n do u t l e ta i rt e m p e r a t u r ew e r e1 0 5 a n d5 4 5 7 r e s p e c t i v e l y , i n l e t f l o wr a t ew 笛3 6 0 m l h u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s , t h er a t eo fp r o d u c t i v i t ya n d s u r v i v a lb a c t e r i u mw e l e6 5 7 a n d5 3 5 r e s p e c t i v e l bt h ev i a b l ec e l lc o u n t so f b i f i d o b a c t e r i aw a so v e r1 0 l o c f i l g , t h ed i a m e t e ro f m i e r o c a p s u l ew a sl 2 p m ，皿es u r v i v a l r a t i oo f a c t i v eb i f i d o b a c t e f i aw a sa sh i 曲a s1 2 5 f o r2 h o u r si ns i m u l a t e dg a s t r i c ，m o s to f t h em i c r o e n c a p s u l a t i o no fb i f i d o b a c t e r i ab r o k e nd o w nf o r2h o u r si ns i m u l 删i n t e s t i n a l f l u i d ， s t u d yt h es t o r a g es t a b i l i z a t i o no fm i c r o c a p s u l e b i f i d o b a c t e f i ai ny o g h u r t 啊硷r e s u l t i n d i c a t e d ：t h em i c r o e n c a p s u l e db i f i d o b a c t e r i as t o r i n gi nc a r r o tj l l i m i l l 【d e c r e a s e dt h e s e n s i b i l i t yt o s t o r et e m p e r a t u r e ， i n c r e a s e d t h ea b i l i t yo fa c i d - t o l a a n t , i m p r o v e dt h e s t a b i l i t yo fs t o r a g ea n dp r o l o n g e dg r e a t l yt h es t o r et i m e m i c r o c a p s u l e d b i f i d o b a c t e r i a s t o r e di ny o g h u r t 、i t hp hb e l o w4 2 ，4 0 f o r2 8 d ，t h ev i a b l ec e l lc o u n t sw a ss i l l la b o v e l 1 0 。c f i l m l ，s t o r e di ny o g h u aw i t hp he q u a l4 2 ，2 0 3 0 f o r2 8 d t h ev i a b l ec e l l c o u n t sw a ss t i l la b o v el x1 0 6c f u m l c o m p a r e dt os p r a y - d r y i n gt e c h n i q u e ，t h es t o r a g e s t a b i l i z a t i o no f m i c r o c a p s u l e b i f i d o b a c t e r i ab ye x - l 邶i o nt e c h n i q u ew a sb e n e l k e y w o r d s ：b i f i d o b a c t e r i a ：m i c r 饿m 唧s i n e d ；s p r a y - 粤y m g ；e x t r u s i o n ：o p t i m i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得亟些壅些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名：参宁 签字日期： 佣7 年月，7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些壅些盘茎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑韭盔些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：争宁 导师签名： 签字日期：凇7 年f 月7 日 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 朗吕诱 电话： 邮编： 年月，日 取歧杆菌微胶囊制备工艺及功能特性的研究 1 1 双歧杆菌的特性 1 引言 双歧杆菌( b i f i d o b a e t e r i a ) 最初是由法国巴斯德研究所的- f i s 8 1 2 , 1 - 博士在1 8 9 9 年从 母乳喂养婴儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌【1 川，经过人们多年研究， 认识到该菌是人体肠道中重要的生理性益生菌，在调节肠道微生态平衡过程中起重要 作用，其在肠道定殖数量的多少与健康息息相关。目前国际上公认的能安全应用于食 品的5 种双歧杆菌：两歧双歧杆菌b i f i d u m ) 、青春双歧杆菌僻a d o l e s c e n t i s ) 、婴儿双 歧杆菌 i n f a n t s ) 、长双歧杆菌1 0 n g u m ) 和短双歧杆菌c 丑b r e v e ) 。 1 1 1 双歧杆菌分类地位 双歧杆菌开始归类于乳杆菌属【2 】，直到1 9 5 8 年日本的光冈等人根据双歧杆菌的 形态和培养性状，认为把双歧杆菌归类于乳杆菌属之中并不妥当，提议独立设双歧杆 菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) ，确立了双歧杆菌的分类体系【3 】。伯杰氏鉴定细菌学手册第8 版 ( 1 9 7 4 ) q b 采纳了国际分类命名委员会双歧杆菌属小组委员会的建议设1 1 个种，即： 青春双歧，星状双歧，两歧双歧，短双歧，棒状双歧，印度双歧，婴儿双歧，长双歧， 假长双歧，猪双歧，嗜热双歧。其后又不断发现和分离出其它许多种，至1 9 9 4 年第 9 版的伯杰氏系统细菌学手册中共载有双歧杆菌属2 4 个种：现发现2 8 种，其中1 0 种是从人体分离的，1 3 种是从动物分离的，3 种是从蜜蜂分离的，还有2 种是从水污 物中分离的【4 】。 1 1 2 双歧杆菌形态和生理生化特性 双歧杆菌的细胞呈现多种形态：有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球 形、长而稍弯曲状、各种分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、v 型、栅栏状排列， 或聚集成星状。不能游动，无芽孢、荚膜及鞭毛。其典型形态是有分叉的杆菌，但同 种不同的菌株形态也不尽相同，即使同一株菌在不同时期或培养于不同的培养基也可 能显现不同的形态，这种表型变异是可逆的。双歧杆菌菌落光滑、凸圆、边缘完整、 奶油色至白色、质地柔软有弹性。 双歧杆菌革兰氏染色呈阳性，美蓝等染色菌体着色不均。无运动性，专性厌氧， 不耐酸，不形成芽孢，无荚膜，过氧化氢酶阴性，不还原硝酸盐，吲哚反应阴性，明 胶液化阴性，联苯胺反应阴性。最适生长温度为3 7 4 1 ，最低生长温度为2 5 2 8 1 2 ，最高生长温度为4 3 4 5 c ，起始生长最适p h 为6 5 7 0 ，在p h 4 5 5 0 以下或 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 8 0 8 5 以上不生长。双歧杆菌对糖类等碳水化合物的分解代谢途径不同于乳酸菌的 同型发酵或异型发酵，而是经由特殊的双歧支路，其中果糖一6 一磷酸磷酸酮酶起关键 作用。对葡萄糖代谢是按果糖6 磷酸磷酸酮酶( f 6 p p k ) 途径水解，最后生成乙酸和乳 酸，两者摩尔比为1 5 ：l ，不生成c 0 2 、丁酸、丙酸；最适发酵温度3 5 4 0 ，d n a 碱基组成摩尔百分比为5 7 6 8 1 2 - 6 1 。 1 1 3 双歧杆菌对人体的生理功能 双歧杆菌作为一种典型的益生菌，通过改善肠道微生态区系的平衡增强宿主的健 康。欧洲食品与饲料菌种协会( e f f c a ) 对益生菌的最新定义为：益生菌是活的微生物， 通过摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经论证的功能性健康的益处。双 歧杆菌通过改善肠道微生物菌群的平衡而发挥保健功能1 2 一叫。 ( 1 ) 生物拮抗性。当肠道内有高浓度水平的双歧杆菌时，外侵的病原大肠埃希菌，痢 疾志贺菌，伤寒沙门菌，变形杆菌，金黄色葡萄球菌，白假丝酵母菌或内源的腐生茵、 条件致病菌就会受到抑制i i o 】。机制之一是双歧杆菌在肠上皮细胞的粘附与其他细菌形 成的特异性微生态位，从而产生特异生态效应。形成有益菌屏障，密布于肠粘膜形成 细菌生物膜增强肠道的定殖抗力，抑制肠道致病菌和条件致病菌的定殖和易位【】”。之 二是双歧杆菌发酵葡萄糖产生多种有机酸，使肠道p h 值下降，使肠道酸化，阻止致 病菌增殖。还产生抗菌物质b i f i d i n ，抑制腐生菌，使人体内的吲哚、酚氨、尸胺、亚 硝胺素显著减少，双歧杆菌的酸性菌体外多糖耐受胃酸和胆汁，增强对黏膜的粘附作 用，拮抗致病菌占位。双歧杆菌还可使偶联型握汁酸分解为游离型胆汁酸，该种酸对 细菌抑制作用更强。 ( 2 ) 营养作用。双歧杆菌在人体肠道内能够合成维生素b j 、b 2 、b 6 和k 等，由人体 缓慢地吸收，b 族维生素的生成量可达1 2 0 3 t t g 1 0 0 m l 双歧杆菌；双歧杆菌可以合成 丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等人体必需的营养物质，使人体通过合理的膳食 即可摄取足量的多种营养素，对于人体具有不容忽视的重要营养作用，尤其对加强孕 产妇、哺乳妇女、儿童、老年人的营养有重要的意义；双歧杆菌可分泌多种酶类，促 进食品的降解与吸收；双歧杆菌维持肠道酸性环境，有利于c a 2 + 、f c 2 + 和维生素d 的 吸收，有助于防止缺铁性贫血和软骨病；双歧杆菌发酵乳糖产生半乳糖，是构成脑神 经系统中脑苷脂的成分，与婴儿出生后脑的迅速生长有密切关系，可提高“乳糖不耐 症”患者对乳制品的利用率。 ( 3 ) 双向调理胃肠功能1 9 , 1 2 1 。双歧杆菌分泌的大量短链脂肪酸，酸化肠道，控制有害 菌引起的异常发酵，使肠道内渗透压增高，刺激胃肠蠕动；双歧杆菌能够产生醋酸和 乳酸，促进肠运动。d o n s k i k h 1 3 l 的研究证实了双歧杆菌能够产生乳酸、醋酸、甲酸。 何道生l “j 说，当有许多难消化的寡糖在大肠中堆积，而又缺少双歧杆菌时，患者就会 出现腹胀、腹痛、便秘，但有足够的双歧杆菌时，双歧杆菌就能酵解寡糖产生醋酸和 乳酸，能促进肠的运动。通过口服微囊化双歧杆菌对慢性腹泻患者临床观察研究表明， 在服药两周以后，患者大便次数、形状正常，临床症状消失，其总有效率为9 0 3 ， 2 双歧杆菌微胶囊制备工艺及功能特性的研究 复发率低 9 1 。 ( 4 ) 抗癌作用。双歧杆菌能非特异性增加肿瘤的局部反应，改善肿瘤患者淋巴细胞亚 群分布及增强其杀伤活性，促进细胞免疫功能，激活巨噬细胞的吞噬活性而抗癌i i 卯。 双歧杆菌活体、灭活菌体，以及完整的细胞壁肽多糖( w p o ) 、胞外多糖及细菌素等， 均有较高的抗肿瘤活性。双歧杆菌能分泌一种n 亚硝胺降解酶使亚硝胺致癌物降 解，降低了肠癌的发病率【l q ，对血管内皮抑制素抗胃、肝和消化道肿瘤均有协同增效 作用【1 7 】。双歧杆菌能诱导血液中一氧化氮水平升高，激活了巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的 活性，并通过与肿瘤代谢关键酶活性部位f e s 结合失去活性，或与氧结合形成强有 力杀伤性的羟自由基，促使癌细胞凋亡而产生抗癌作用i l 硼，并能有效地抑制肠道中的 b 葡萄糖苷酸酶和偶氦还原酶等细菌酶的活性，催化致癌物质转化为粪臭素，减少了 致癌物质在肠道内的形成。 ( 5 ) 免疫调节功能双歧杆菌能影响涉及到免疫应答的体液免疫、细胞免疫和非特异 性免疫三个方面。 双歧杆菌体液免疫调节功能 双歧杆菌在胃肠道内能够刺激b 淋巴细胞活化增殖和分泌抗体来发挥体液免疫， 机体具有抗感染作用和抗肿瘤作用【1 9 1 ；近年来，专家学者们研究发现肠道内双歧杆菌 可增加机体免疫监视功能，尤其是通过口服可增加抗体的产生田。 双歧杆菌的细胞免疫调节功能 双歧杆菌作为机体消化道内的优势菌群，可以明显激活作为机体天然抵抗力的一 个重要组成部分一吞噬细胞的活性，进而增强机体的非特异性免疫功能【2 l 】：双歧杆菌 具有赋活机体t 细胞介导的免疫功能的能力，可以使机体的淋巴因子增多或者使淋巴 细胞的增殖反应增强圆；双歧杆菌可激活n k 细胞瞄】，抑制肿瘤的发生；双歧杆菌 可提高红细胞的免疫粘附功能 2 4 j ，增强其清除循环中免疫复合物的功能，进而提高机 体免疫力，防止感染的发生。 双歧杆菌对细胞因子诱生作用的影响 双歧杆菌完整肽聚糖能激活机体免疫系统中的巨噬细胞，提高其吞噬能力和能量 代谢水平，同时分泌几一2 6 和n o 等具有杀瘤活性的重要介质口5 工6 】，但刺激免疫的机 制是否通过改变非特异性免疫应答，抑或二者兼而有之，至今不能下定论。所以探寻 双歧杆菌免疫调节机制仍是长期而艰巨的任务。 ( 6 ) 抗衰老作用。自由基和过氧化脂质被认为是机体在代谢过程中产生的对宿主细胞 有害的物质，它们能加速细胞的衰老与死亡。双歧杆菌体内含有过氧化物酶、过氧化 物歧化酶s o d 等，有清除自由基及过氧化脂质的能力，可减少自由基等致衰老物质 的产生，因而能净化人体内环境，延缓细胞的衰老，促进人体健康。 3 翌j ! 奎些查堂堡主兰垒! 兰些! 堕苎 1 2 双歧杆菌制品的开发利用及存在的问题 1 2 1 双歧杆菌制品的开发利用 双歧杆菌作为人体肠道中典型的有益微生物菌群。其促进人体健康的有益作用远 远超过其它乳酸菌1 2 7 , 2 9 j 。但由于机体衰老、环境污染、饮食改变、滥用抗生素、放化 疗等原因，往往使人体肠道的双歧杆菌数量下降，导致肠道微生态失调，引起菌群易 位，诱发内源感染，造成机体病交。因此利用外源方式( 如双歧制剂和双歧食品) ，增 加人体肠道中双歧杆菌的数量，将有利于促进人体健康捌。 在二十世纪八十年代以前，双歧杆菌在食品中的应用很大程度上趋向予具有医疗 效果的食物和饮料，最早的双歧杆菌产品是双歧乳，随着双歧杆菌产品日趋增多的益 生作用的报道，产品越来越多，包括酸性稀奶油、酪乳、酸奶、奶粉、饼干以及冷冻 甜点等。 双歧杆菌酸乳是以双歧杆菌为主要菌种生产的发酵乳，既有单菌株制品，也有联 菌株制品。联菌株主要是和酸奶菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵，避免了由 单一菌株发酵产生的醋酸味。 m e t c h n i k o f f 的科学实验所证实地发酵乳制品营养和健康价值地报告。促进了许 多国家对发酵微生物以及构建新型理想发酵产品进行的广泛研究 3 0 3 引。在日本，第 一个双歧杆菌制品是由m o r i n a g em i l ki n d u s t r y 公司于1 9 7 1 年开发的，此产品是一种 发酵乳制品，含有长双歧杆菌和嗜热链球菌，日本1 9 9 0 年酸奶的销售量几乎是过去 十年的两倍，含有双歧杆菌的酸奶大约占整个酸奶的三分之一与日本的情形相似， 截至1 9 9 0 年，法国所销售酸奶的1 】都含有双歧杆菌。美国双歧杆菌产品开发相对 较晚，但最近几年，美国此类产品的增长速度惊人，2 0 0 0 年l o 月b cd 因素 表5 结果表明：四个因素中，对双歧杆菌微胶囊常温稳定性的影响顺序为：胶液 总浓度( 妒胶液：菌液( b ) 海藻酸钠：果胶( c ) c a c k 浓度( d ) ；斜微胶囊1 5 d 时双歧 活菌数保持1 0 s c f l 】g 以上，菌体存活率为1 8 。5 。 双歧杆菌微胶囊制各工艺及功能特性的研究 凡艚a 8 ) = 4 0 7 - r i ( 3 8 ) 一7 5 9 由表6 进行方差分析可知，胶液总浓度，胶液：菌液，海藻酸钠：果胶，c a c l 2 浓度差异均极显著 o 0 1 ) 。 通过以上结果的分析可以确定，从理论上考虑，最佳微胶囊配方为4 号。其配比 为：a 2 b i c 2 d 3 ，即胶液总浓度为2 ，( 胶液：菌液) 为l ：1 ，( 海藻酸钠：果胶) 为2 ： l ，c a c l 2 浓度为0 3 m o l l 。后续试验选择4 撑微胶囊做耐胃酸试验，肠溶性试验，耐 胆盐试验，进一步验证微胶囊的最佳配方。 3 1 2 耐胃酸试验 考察双歧杆菌微胶囊的耐胃酸性，对于评价双歧杆菌能否经过胃酸的低p h 值环 境而顺利进入人体肠道，具有重要意义。各种食物在胃里停留的时间各不相同，水为 2 - 3 r a i n ，碳水化合物为2 h 左右，脂肪类最长，为5 h 以上【7 射。因此，将微胶囊化前 后的b b 按1 0 放入盛有9 m l ，p h - - - - - - = 2 0 的人工胃液的灭菌试管中3 7 士1 恒温振荡， 每1 小时取样检测微胶囊化前后的双歧杆菌活菌数。同时以不添加果胶的海藻酸钠单 层包埋的微胶囊作对照( 即胶液总浓度为2 ，胶液：菌液为l ：l ，c a c l 2 浓度为o 3 m o i 几) 。结果见表7 。 寰7 曲徽胶囊和非徽腔囊在模拟胃酸中活菌散的变化 t a b l e 7t h es u r v i v a b i l i t ya mo f b bm i 酬e d a n dn o w m i c m e n c a p s u l e di ns d m u l a t i v e j u i 冻干菌粉1 5 3 x 1 0 ”8 7 5 x 1 0 e 2 4 4 x 1 0 4 一 i i ：；嚣丢芋 s ，o ， t ，9 o 。 s s s x 旷 ，9 5 o t - j 裹示检一不刊活曾量 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 由表7 可以看出未进行微囊化的冻干菌粉耐酸能力很差，两小时后的活菌数只有 2 4 4 x 1 0 4c f u g ，活菌存活率不到初始状态下的百万分之二；以海藻酸钠单层包埋制得 的微胶囊虽然使双歧杆菌的耐酸能力得到提升，但两小时后的活菌存活率并不高，只 有初始状态的0 3 1 ，活茵数也只有5 6 5 x 1 0 6c f u g 。没有达到双歧杆菌发挥其保健功 效所要求的i x l 0 7c f u g 活菌含量，益生作用不明显：添加果胶后制得的双歧杆菌微 胶囊两小时后的活菌存活率高达2 2 5 ，活菌数达到3 2 6 x 1 0 8c f u g ，远高于海藻酸钠 单层包埋制得的微胶囊。经过3 小时后，活菌数仍超过了1 0 7c 矗垤，证明了果胶的添 加使微胶囊的耐酸能力得到显著加强，这对于双歧制品来说具有重要意义。 3 1 3 肠溶性试验 微胶囊化双歧杆菌的肠溶性是其重要的性状之一。理想的肠溶性制剂在十二指 肠就开始崩解，壁材的性质决定了微胶囊化产品对环境的耐受性。因此，有必要研究 壁材的肠溶性本实验参照日本药物局对肠溶胶囊剂崩解时限的规定【7 9 】，在模拟人工 肠液3 7 ( 2 保温1 2 h ，对钟微胶囊进行肠溶性试验，观察胶囊溶出时状态，并定时 检测人工肠液中的活菌数，结果见图l ： 1 0 奄b 堇6 三 赫 橱 裙2 o o24 6 8 1 0 1 2 时阐 t b ) 田l 徽胶囊在人工肠液中的活菌歌变化曲线 f 嘻la h n 弘删口v ca b o u t t h e v i a b i l i t y o f b bl n i c m 印芦i l l 删佃 a i m u l a t i v ci n 倒n m j u i 由图1 可以看出，在前六个小时，胶囊崩解随时间呈上升趋势，2 h 时，甜微胶 囊在人工肠液中就已经迅速崩解释放出双歧杆菌，活菌数为5 6 5 x l o s c f u g ，在6 h 时， 活菌数在人工肠液中达到最高值，为7 0 4 x 1 0 8 c f u g ，6 h 8 h ，胶囊在人工肠液中的活 菌数呈逐渐下降的趋势，1 0 h 后，活菌数变化随时问呈平稳趋势。由此推断，在2 h 时大部分微胶囊在模拟人工肠液中已崩解溶出，释放出双歧杆菌，6 h 时基本全部崩 解。而图中活菌数在6 h 后出现下降趋势，并逐渐趋于稳定，其原因可能是双歧杆菌 对外界环境敏感所致，需进一步研究。 双歧杆菌微胶囊制备工艺及功能特性的研究 3 1 4 耐胆盐试验 食物在小肠消化的第一小时内，胆盐浓度可达2 ，进入第二个小时，其浓度下 降到o 5 。因此，选择这两个临界的胆盐浓度作为考察的胆盐浓度。胆盐作用的时 间一般不超过1 2 h ，因为大多数食品在1 2 h 能足以通过小肠 8 0 l ，所以选择1 2 h 作为实 验观察时间。 在模拟人工肠液中分别添加o 5 、2 的牛胆酸钠，模拟人体的胆汁酸环境，并 设对照，每隔3 小时，检测胶囊中和对照中活菌数。处理1 2 h 后的结果如表8 ： 衰8 胆盐对徽胶囊存活的影响 t a b l e 8 e f f e c t o f b i l es a l t s m v i v a b i l 时o f m i c r o e n c a p s a l a t i o n 由表3 5 可以看出，未加微囊化的菌粉在0 5 ，2 浓度的胆盐存活1 2 h 后，活 菌数分别从最初的1 2 1 x 1 0 1 0e f u g 和1 3 3 x 1 0 1 0c f u g 下降到8 6 2 x 1 0 9 c f u g 和 8 8 4 x 1 0 9 c f u g ，活菌存活率分别为7 1 2 和6 6 5 。错微胶囊在0 5 ，2 浓度的胆 盐存活1 2 h 后，活菌数分别从最初的3 4 6 x 1 0 9e f u g 和3 2 7 x i 0 9c f u g 下降到 2 9 4 1 0 9 c f e g 和2 5 6 x 1 0 9 c f i l g ，活菌存活率分别为8 5 和7 8 3 。结果表明，双歧杆 菌微胶囊在胆盐中的存活随胆盐浓度的增加而略有下降，与非微胶囊化相比，其存活 率相应获得提高，但提高的幅度不是很大，说明非微囊化的b b 具备较强的耐胆盐能 力。 根据微胶囊的贮藏稳定性、耐胃酸性、肠溶性及耐胆盐试验。我们选定辅胶囊 做为b b 的最佳囊材配方。由于b l 和b b 的生物学特性比较相似，所以此配方也可应 用于b l 微胶囊化。 3 1 5 微胶囊质量的评价 按材料和方法中2 6 2 5 的测定方法对微胶囊的质量进行评价 包囊效率的测定： 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 包囊效率= ( b 2 b 1 ) l 盹x1 0 0 其中：b i - 微胶囊表面的活菌数 b 2 一产品中的活菌数( 微胶囊表面与其内部活菌数之和) 包囊产率的测定： 取1 9 胶液与菌液的混合液进行活菌计数，计为b 3 ，则： 包囊产率- - 0 3 2 - b 0 屉3 x1 0 0 将l g 微胶囊置于人工肠液中，在3 7 c 水浴中搅拌4 5 分钟，待完全崩解后测活 菌数为4 0 1 x 1 0 9c f u g ，即为产品中的活菌数，它包括了被包覆在微胶囊内部的活菌 和附着在微胶囊表面的活菌。取微胶囊样品l g 置于9 矗1 l 的缓冲液( p h 4 o ) 中，恒温 水浴振荡，处理4 5 m i n ，此时微胶囊囊膜并未崩解，所测菌数为附着在微胶囊表面的 活菌，为7 1 7 x 1 0 7c f u g ，由公式得出包囊效率为9 8 2 ，包囊产率为7 6 0 3 。 3 1 6 恒温加速保藏试验 温度对双歧杆菌徽胶囊的影响主要涉及两个方面：其一是微胶囊内菌体的存活率 下降i 其二是囊衣特性结构发生改变，而囊衣特性结构的改变往往会加速微胶囊内活 菌的下降，长时间处于较高温度环境下，囊衣高分子材料易发生裂解，膜的通透性发 生改变，此时，囊衣对微胶囊内的双歧杆菌的保护作用就会减弱，双歧杆菌容易受到 外界环境因素( 氧气、光照、水分等) 的影响，从而引起微胶囊内双歧杆菌活茵数的下 降【盯1 。 将双歧杆菌胶囊分别装瓶密封，3 7 ( 2 的恒温培养箱中放置2 个月，每隔1 0 天取 出测量活菌数，同时以密封的菌粉做对比实验，表9 是恒温加速保存性实验结果 裹9 恒沮加速保存性实验结果 t a b l e 9t kr m u l 也o n s t a b i l 睁o f m i f m e n c a p s u l a f i o n d t u 曲g s t o r a g e a t 3 7 菌粉1 1 5 x 1 0 1 0i , 0 7 x 1 0 9 5 6 4 x 1 0 76 6 6 x 1 0 64 3 5 x l o s0 , 0 0 4 错微囊3 4 2 x1 0 92 3 3 x 1 0 91 0 6 x 1 0 9 7 4 2 l o l4 9 9 x 1 0 |1 4 6 由表9 得出，经过恒温加速试验，6 0 天后菌粉的存活率很低，仅为0 0 0 4 ，活 菌数不足1 0 6c f u g ，下降很明显，而删微囊的活菌存活率能达到1 4 6 ，活菌数仍超 过1 0 8c f u g ，可见经过微囊化的双歧杆菌能够抵御加速试验时的恶劣条件，延长了双 歧制品的保藏期。经两个月贮存后，微囊仍保持颗粒状，无粘连，崩解性符合肠溶要 求。 双歧杆菌微胶囊制备工艺及功能特性的研究 3 1 74 c 冰箱保存性试验 将群微胶囊分别装瓶密封，4 c 冰箱中放置2 个月，每间隔1 0 天取出测量双歧 杆菌活菌数，同时以密封的菌粉做对照实验。试验结果见图2 1 0 5 耄嚣 量 9 盏b s 】i g l z 5 + 徽囊化 - l t - - 靠m 囊化 01 02 03 0柏5 06 0 时同( 田 圈2 徽胶重和菲徽胶囊4 保叠活菌数变化 f i g 2c u m g eo u a v ca b o u t 出cv i a b i l i t yo f b b m i o r o e a c a l n u l a 倒d i n - l a g e t o r a g e m 4 c 由图2 可以看出，4 c 保藏温度下保藏6 0 天，未微囊化的双歧杆菌活菌存活率下 降较快，由1 1 1 1 0 1 0 c f u g 下降到4 7 5 x 1 0 8 c f u g ，活菌存活率只为4 2 8 ，经过微囊 化的双歧杆菌在前3 0 天活菌数下降并不明显，只从3 2 3 x 1 0 9 c f u g 下降到 2 7 8 x 1 0 9 c f u g ，下降不到1 4 ，在后3 0 天，活菌数下降速度虽然较上一阶段要略快， 但活菌数仍能达到1 4 5 x 1 0 9 c f u g ，活菌存活率高达4 4 9 ，较未微囊化的菌粉有显著 提高。 3 2 喷雾干燥法制备双歧杆菌微胶囊 3 2 1 喷雾干燥过程中不同因素对微胶囊产率和菌体存活率的影响 在喷雾干燥过程中，固形物浓度、进样流量、进风温度、出风温度对微胶囊的产 率和菌体存活率的影响是很显著的，本试验选择上述四种因素进行考察，以微胶囊的 产率和菌体存活率为指标对喷雾干燥过程中的参数进行优化。 3 2 1 1 固形物浓度对微胶囊产率的影响 以明胶为壁材，分别配成浓度为l ，2 ，3 ，4 ，5 的明胶溶液，不加入菌 体进行喷雾干燥，考察固形物浓度对微胶囊产率的影响，实验结果见表1 0 。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 毫1 0 不同固形物浓度对徽胶囊产率的影响 t s b i e l oe f f e c t o f d f f e r e me m u i s i o n c o n c e n t r a t i o n 衙耐唧枷舯d l i c d 眦 固形物浓度喷雾干燥后产率 1 2 3 钔晦 5 在收集瓶中几乎无产品获得 在收集瓶中有少量产品出现，占初始固形物加入量的1 5 在收集瓶中出现大量胶囊粉粒，占初始固形物加入量的2 3 产品获得量较上一浓度有所减少，占初始加入量的1 4 产品获得量进一步减少，只占初始加入量的1 7 由表l o 可以看出，喷雾干燥后微胶囊的产率随明胶浓度的升高表现出先上升后 下降的趋势。可见，在适当的范围内增加固形物浓度，可以提高微胶囊化产率，当料 液浓度小于3 时，微胶囊化产率明显随浓度增加而提高，这是因为固形物含量的提 高，有利于喷雾干燥过程中囊壁的形成和致密性的提高，同时由于体系粘度的增加， 减少了芯材向壁材表面的迁移，能更好地包埋芯材。但当料液浓度大于3 时，由于 进料液的粘度增大，会给料液的雾化造成困难，料液在干燥器内的粘壁现象很严重， 收集瓶内得到的微胶囊产品逐渐减少。因此控制进料的固形物浓度选择在3 为宜 3 2 1 2 进样流量对微胶囊产率的影响 选择3 固形物浓度，在1 2 0 c 进风温度下进样，考察不同的进样流量对微胶囊 产率及出口温度变化的影响，实验结果见图3 、表1 1 2 7 03 6 04 5 05 4 06 3 0 花量( 吐h ) 田3 不同进样流量的产辜变化曲线 f i 3c h s u g ec l t r v eo f 山cp r o d u c t i v emo fd i f l c r e mh i h f l o w n 越矗b 廿n f l o w i 出 双歧杆菌微胶囊制备工艺及功能特性的研究 寰1 l 不同进样流量的出口量度变化 t a b i e l lo u t l e tt e m p e n m no f d i f f e r e n ti n l e tf l o wr a t e 流量( m l h )出口温度( ) 2 7 0 3 6 0 4 5 0 5 4 0 6 3 0 7 5 7 8 7 0 7 3 6 8 7 0 6 3 6 6 5 5 5 8 由图3 可见，随着进样流量的增大，微胶囊产率呈下降趋势，但下降的幅度在不 同的温度变化范围表现出明显差异，由2 7 0 m l h 上升到3 6 0 m i 2 h 时，产率下降幅度 较小，由7 1 5 下降到6 6 8 ；而从3 6 0 m l h 上升到6 3 0 m l h 产率下降幅度较大，由 6 6 8 下降到1 0 7 。由表l l 可见，出口温度随进样流量的增加呈现递减趋势。进样 太快，会导致蒸发能力不足，不能形成良好的致密性与一定强度的壁，所以产品的效 率和产率都下降；进样太慢，蒸发过度，会导致出口温度过高，造成菌体较快死亡， 还会影响生产率。此外，进料流量对产品颗粒和水分含量影响较大，进料流量大，则 产品颗粒大，水分分散性，溶解性好，但过于偏大，微胶囊干燥效果和产品流动性不 佳，同样也不利于双歧杆菌较长时间的保存。 3 2 1 3 不同进风温度对微胶囊产率和菌体存活率的影响 选择3 的固形物浓度，在2 7 0 m l h 的进样流量下进样，考察不同进风温度对微 胶囊产率，菌体存活率和出口温度变化的影响，实验结果见图4 ，图5 ，表1 2 。 程度( ) 围4 不同进风温度产牢变化曲线 f i r 4c 陆g c i v c o f t h ep r o d u c d v c r a m o f d i f f e m a ti s l e ta ：m s , ：r m 印 ，、5 0 笔4 0 嬖3 0 鐾2 0 - 1 0 0 1 0 5i i o1 1 51 2 0 进风温度( ) 田5 不同进风温度盲体存活翠变化 曲线 l i g 5 c h a n g ec l n v c o f s e r v i v a b i 研o f 功o f d i f f t m ：a t i n l e t 嵋日加e n 由目t 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 表1 2 不同进风温度下的出口噩度变化 t a b l c l 2o