（环境科学专业论文）坛紫菜转鲎素基因研究.pdf

坛紫菜转鲎紊基凶研究 a b s t r a c t t h et h r e ec o n t e n t si n v o v e di n p o r p h y r ah a i t a n e n s j st r a n s g e n i c b r e e d i n gw e r es t u d i e ds y s t e m i c a l l y ：ph a l t a n e n s j st r a n s g e n i cr e c e p t o r s y s t e m ：6 u sg e n et r a n s i e n te x p r e s s i o nw i t h i nt h eph a 2 t a n e n s i st h a i l u s s o m a t i cc e l l s ：t h er e s e a r c ho ft a c h y p l e s i n ，t r a n s f e ri n t o 户h a l t a n e n s i s c e l s r e s u t so ft h es t u d ya sb e l o w ( 1 ) s t u d yo nph a i t a n e n s i st r a n s g e n i cr e c e p t o rs y s t e m f i r s t l y ， s p e c i a la c t i v i t i e s o ft h r e ee n z y m e so f c e l lw a l il y t i ce n z y m e sf o r s e a w e e df r o mt h r e es p e c i e so fg a s t r o p o d aw e r ec o m p a r e d ，t h er e s u l t i n d i c a t e st h a tc h l o r o s t o m aa r g y r o s t o m aa n dl u n e l l ac o r o n a t ac o r e e n s i sa r e m o r es u i t a b l ea ss o u r c e so fc e l lw a l ll y t i ce n z y m e sf o rs e a w e e df o rr e d a l g a ea s 尸h a i t a n e n s i st h a nt t a l i o t i sd j v e r s i c o o r ；s e c o n d l y ，r e s u l t s h o w st h a te e l ld e n s i t y ，i l l u m i n a t i o ni n t e n s i t ya n ds p e c i f i cg r a y i t yh a v e as i g n i f i c a n te f f e c to nt h ed e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n t i a t i o no fp 加j t a n e n s j st h a i l u s s o m a t i cc e l l s ：t h i r d l y ，r e s u l ts h o w st h a tp h a i t a n e n s i st h a l l u ss o m a t i cc e l l sa r es e n s i t i r et oc h l o r o m y c e t i n ，t h i s i n d i c a t e st h a tc h l o r o m y e e t i ni sae f f e c t i v es e l t i v ep r e s s u r ef o r t r a n s g e n i cph a i t a n e n s i s ( 2 ) s t u d yo ng u st r a n s i e n te x p r e s s i o nw i t h i nph a i t a n e n s i st h a i l u s s o m a t i cc e l l s p l a s m i dp b l 2 2 1w a st r a n s f o r m e di n t ot h a l l u ss o m a t i ce e l l s w i t ht h em e t h o do fe l e c t r o p o r a t i o n ，r e s u l to fh i s t o c h e m i c a la s s a ys h o w s t h a tg u se x p r e s s e dt r a n s i e n t l yw i t h i nt h ee e l l sc u l t u r e df o r7 2ha n d6 d e x p r e s s i o ne f f i c i e n c yw e r e1 1x1 0 “a n d1 3 x1 0 1r e s p e c t i v e l y ：r e s u l t o fq u a n t i t a t i v ee n z y m ea s s a ys h o w st h a ts p e c i a la c t i v i t i e so fg u s e x t r a c t e df r o mt r a n s f o r m e dc e l l sc u l t u r e df o r2d - 5d w e r ea l lh i g h e r t h a nt h o s eo fc o n t r o l ss i g n i f i c a n t l y ，t h i si n d i c a t e st h a tg u se x p r e s s e d t r a n s i e n t l y t h er e s u l t s a b o v ei n d i c a t et h a t e x o g e n o u sg e n e t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f 尸h a l t a n e n s i st h a l l u s s o m a t i c c e l l si s e f f e c t i v e 厦门大学理学博，i 学位论文 ( 3 ) s t u d yo nt a c h y p e s i nit r a n s f e ri n t o 尸h a l t a n e n s i sc e l l s r e c o m b i n a t i o nv e c t o r p s v 4 0 一h r m a r t a c h y p l e s i n 1w a sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e di n t oph a l t a n e n s i sc e l l sw i t ht h em e t h o do fe l e c t r o p o r a t i o n i n t e g r a t i o no ft a c h y p e s i n ，w a sc o n f i r m e dw i t ht h em o l e c u l a ra n a l y s i s m e t h o d so fp c r ，p c r s o u t h e r nb l o t t i n ga n ds o u t h e r nb l o t t i n g t a c h y p l e s i n 1w a st r a n s f o r m e ds u c c e s s f u l l yi n t o p h a it a n e n s i sc e l l sf o r t h ef i r s t t i m ea n di n t e g r a t e d ，r e s u l to fn o r t h e r nd o tb l o t t i n gs h o w st h a t t a c h y p l e s i n ，e x p r s s e da tt h el e v e lo fr n a t h u s ，s t u d yo nt r a n s g e n i c p o r p h y r aw i t hd i s e a s er e s i s t a n c ei sb o o s t e d ，a n dt h ed a t aa r eu s e f u lf o r t h er e s e a r c ho ft r a n s g e n i cp o r p h y r ab i o r e a c t o r f u r t h e r m o r e ，t h er e s u l t s a b o v ei n d i c a t et h a t t h es t r a t e g yi su s e f u lf o rt r a n s f o r m a t i o n i n t e g r a t i o na n de x p r e s s i o no ft a c h y p l e s i n1 w i t h i nph a l t a n e n s i sc e l l s ， s e q u e n c e so f4 6 0 b p ，1 2 0 0 b po fph a i t a n e n s i s1 8 sr d n aa r ea d o p t e d r e s p e c t i v e l ya s3 a n d5 e n ds e q u e n c e so fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，a t t h es a m et i m e ，m a r so fs i l k w o r mi sa d o p t e da se x p r e s s i o ne n h a n c e m e n t s q u e n c e f i n a l l y ，r e c o m b i n a t i o nv e c t o ro ft a c h y p l e s i n ，c a nb ea p p l i e d i nt h ei n t e r r e l a t e dr e s e a r c ho f k e yw o r d s ：p o r p f l y r ah a it a n e n s i s t r a n s g e n i cl a r g es e a w e e d t a c h y p l e s i n ：t r a n s g e n e 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编a 有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 4 ) ( 请在以上相应括号内打“4 ”) 作者签名：么杪日期：2 0 。5 年1 2 月9 日 导师签名：荔矿i 彩丢，日期：2 0 0 5 年1 2 月9 曰 r 惶坦 坛紫菜转黉素基同研究 第一章前言 大型海藻种类很多，主要包括褐藻门的海带( l a m i n a r i aj a p o n i c a ) 、鹿角 菜( p e l v e t i as i l i g u o s a ) 、马尾藻( s a r g a s s u ms p p ) 和裙带菜( u n d a z l i a p i n n a t i f i d a ) ，红藻门的紫菜( p n z p h y r as p , p ) 、石花菜( g e l i d i u ma m a n s i i ) 以及绿藻门的石莼( 坍v al a c t u c a ) 等。大型海藻的用途主要包括食用、动物饲 料、提取生物活性物质( 药用、保健、化妆) 、化工原料( 琼胶、卡拉胶、褐藻 胶，碘、甘露醇等) 等；此外，包括大型海藻在内的海洋藻类在全球气候调控及 环境修复方面也发挥着重要作用。迄今，人工栽培的经济海藻主要包括1 0 多属 2 0 多种，海藻栽培业、加工业、制药业全球总产值达3 0 亿美元以上。我国海藻 栽培已有几百年的历史，目前，海藻年产量达到1 2 2 x1 0 6t ( 干重) ，占世界海 藻年产量的7 0 。迄今，我国商品化海藻栽培种类有1 0 属1 2 种，产量名列前 茅的有紫菜属、海带属、裙带菜属、江蓠属4 属6 种( 纪明侯，1 9 9 7 ；曾呈奎， 1 9 9 9 ；张学成等，2 0 0 5 ) 。 紫菜营养丰富，干品蛋白质含量达4 0 以上，富含维生素( 尤其是维生素b 、 & 、b 1 2 ) ，微量元素含量也很丰富，此外，干品粗纤维含量为2 9 3 5 。我国沿 海人民食用紫菜已有上千年的历史，紫菜的栽培生产始于3 0 0 年之前，虽然真正 意义上的紫菜人工育苗栽培只有几十年的时间，但如今我国紫菜年产量居世界首 位，我国紫菜年产量( 按国际标准换算) 2 0 0 3 年达到1 8 2 亿张( 。3g 张) ，其 中，条斑紫菜( py e z o e n s i su e d a ) 2 2 亿张，坛紫菜( ph a i t a n e n s i sc h a n g e tz h e n g ) 折合干重为4 8 1 0 4 t 。紫菜已成为世界上人工海藻栽培业中年产值 最大的经济海藻，中国、日本、韩国的紫菜初级加工品年产值超过2 0 亿美元( 曾 呈奎，1 9 9 9 ；张学成等，2 0 0 5 ) 。 目前，紫菜栽培面临的主要问题是尚未实现良种化和育苗不稳定( 曾呈奎， 1 9 9 9 ) 。为克服传统育种、育苗技术的缺陷，体细胞工程和基因工程技术已被用 于紫菜相关研究中。其中，转基因育种因为具有常规育种技术所无法比拟的一些 优点而成为研究热点之一，并已取得一些进展。源自紫菜叶状体的原生质体与单 离体细胞为单倍体，其表现型与基因型相同，因而成为紫菜基因工程育种最常用 的转基因受体( 姜红霞，汤晓荣，2 0 0 3 ) ，原生质体与单离体细胞的常用分离方 法为海藻解壁酶法；g u s 报告基因是转基因植物研究中常用的报告基凶；而多肽 j 题门人学理学博l 学位论文 抗生素基因为转基因抗病植物研究中常用的目的外源基因。下面对紫菜转基因育 种涉及的海藻解壁酶研究、叶状体体细胞发育分化及其应用研究、g u s 报告基因 在转基因植物研究中的应用、多肽抗生素研究等几个方面进行综述。 1 1 海藻解壁酶的研究 1 1 1 大型海藻原生质体、单离体细胞制备方法 紫菜属红藻门( r h o d o p h y t a ) 红毛菜科( b a n g i a c e a ) 紫菜属( p o r p t 春、夏季；年龄对纤维素酶 活力无显著影响；季节和年龄相互作用显著影响纤维素酶活力( 张永普等，2 0 0 3 ) 。 针对海藻解壁酶的上述特点，具体使用时，常采用不同来源的复合酶的混合 物。m i z u k a m ie ta j ( 1 9 9 2 ) 研究了不同来源( 假单胞菌，角蝾螺( t u r b o c o r n u t u s ) ，黑斑海兔( a p l y s i ak u r o 幽j ) ，紫海胆( a n t h o c i d a r i sc r a s s i s p i n e ) ， 皱纹盘鲍( 且d i s c u s ) ) 的海藻解壁酶的混合物对条斑紫菜原生质体电融合的影 响，发现不同海藻解壁酶的组合之间存在显著差异。p a c k e r ( 1 9 9 4 ) 利用三种来 源( 假单胞菌( pe l o n g a t a ) 、构巢曲霉( a s p e r g i l l u s n i d u l a n s ) 、虹鲍( hi r i s ) ) 的海藻解壁酶混合物制备了紫菜叶状体原生质体，获得了很好的效果。 综上所述，动物来源的海藻解壁酶活力与动物种类、季节、食物都有密切的 关系，酶源动物一般都生物量小、分布不集中，大量生产时易受到天然资源的限 制，所以进行酶源动物人工养殖及拓展酶源动物的相关研究具有理论及现实意义 ( 陈菊琦，1 9 9 1 ) 。本研究以厦门潮间带常见的朝鲜花冠小月螺、银口凹螺 ( c h l o r o s t o m aa r g y r o s t o m ag m e l i n ) 及人工养殖种类杂色鲍为酶源动物，提取 海藻解壁酶，并针对紫菜的胞壁构成，利用3 ，5 - 二硝基水杨酸( d n s ) 法测定不 同来源海藻解壁酶中琼胶酶、木聚糖酶及纤维素酶的比活力，初步筛选出适宜的 酶源动物，为海藻解壁酶的应用和本论文的后续研究工作奠定基础。 1 2 紫菜叶状体体细胞发育分化及其应用研究 1 2 1 紫菜叶状体体细胞发育分化研究进展 紫菜叶状体原生质体与单离体细胞为单倍体，其表现型与基因型相同，目前 厦门大学理学博士学位论文 已成为紫菜基因工程育种最常用的转基因受体( 姜红霞，汤晓荣，2 0 0 3 ) 。因而， 紫菜叶状体体细胞发育分化研究已成为紫菜转基因育种研究的基础及热点。 一般认为，紫菜形态学简单，仅由1 或2 层细胞构成，叶片分化程度低。 p o l n e f u i l e r g i b o r ( 1 9 8 4 ) 研究表明，孔紫菜( 尸p e r f o r a t a ) 的叶片由 4 个细胞形态学不同的区域组成，其中包括5 种细胞类型：具有长突起的锥形细 胞，大而具液泡的细胞，分裂中的营养细胞，生殖细胞( 雄性、雌性) 。孔紫菜 叶状体单离细胞、原生质体的再生率取决于各自所属的形态学类型，在再生体中 观察到4 种不同的发育模式。进一步研究表明，紫菜叶状体原生质体的分离效率 及原生质体的发育模式一方面取决于它们所属的组织类型，另一方面，培养条件 在细胞和个体水平上极大地影响着发育模式。相关研究结果表明，紫菜叶状体不 同区域化学组分、细胞形态、细胞间质的形态及性质的分化是明显的 ( p o l n e - f u l l e ra n dg i b o r ，1 9 9 0 ) 。 国内学者对紫菜叶状体体细胞的发育分化也进行了大量研究。严兴洪和王素 娟( 1 9 8 9 ) 对坛紫菜单离体细胞的研究首先表明，根据体细胞再生体的形状、有 无假根、颜色、色素体形状、细胞大小和排列方式及最终分化趋势等，坛紫菜体 细胞分为8 种发育类型，其最终分化趋势包括叶状体、细胞团、丝状体三种类型； 其次，坛紫菜叶状体体细胞的发育分化与原藻体大小、日龄及部位有关，体细胞 不同发育类型是由它们所处发育时期不同导致的，根据体细胞的上述8 种发育类 型，营养细胞发育成为果孢子的过程大致可分为7 个不同发育时期。体细胞连续 克隆培养研究及不同生长日龄( 相同体长) 和不同体长( 相同生长日龄) 藻体单 离体细胞再生实验的结果都表明，坛紫菜叶状体体细胞从原始的营养细胞向性原 细胞( 精子囊母细胞和果孢母细胞) 的分化，存在一个逐步分化的过程；处于不 同分化阶段的体细胞及其后代在离体培养中具有不同的发育趋势( 严兴洪等， 1 9 9 0 ) 。戴继勋等( 1 9 8 8 ) 、刘必谦等( 2 0 0 4 ) 、曾庆国等( 2 0 0 4 ) 研究了坛紫菜 叶状体体细胞、原生质体的发育分化，研究结果与严兴洪等( 1 9 8 9 ，1 9 9 0 ) 的相 一致。 类单孢子的发现是坛紫菜叶状体体细胞发育分化研究的一个重要结果。一般 认为，坛紫菜不会产生及放散单孢子( 张德瑞，郑宝福，1 9 6 0 ：王素娟等，1 9 8 6 ) 。 但室内及海上栽培网帘观察结果表明，坛紫菜叶状体也能形成、放散类单孢子， 坛紫菜转鲎素基因研究 并能长成正常叶状体( 李世英，1 9 8 8 ) 。坛紫菜叶状体单离体细胞的再生研究结 果最终确认了坛紫菜叶状体体细胞在人工培养的条件下，可以产生类单孢子；类 单孢子形成的数量与种藻的大小、部位有关( 王素娟、严兴洪，1 9 9 0 ) 。但关于 类单孢子的性质还有待于深入研究( 王素娟，马凌波，1 9 9 4 ) 。 除坛紫菜外，发育分化研究较系统的紫菜种类还有条斑紫菜( - 培民、王素 娟，1 9 9 2 a ；严兴洪等，2 0 0 4 ) 。圆紫菜( 唐延林，1 9 8 2 ) 、铁钉紫菜( pi s h g e o c o l a ) ( 王素娟等，1 9 8 6 ) 、孔紫菜( p o l n e f u l l e ra n dg i b o r ，1 9 8 4 ) 、朱红紫菜( p m i n i a t a ) ( c h e n 1 9 8 6 ) 、尸 a n c e o a t a 、pn e r e o c y s t i s 、户s c h i z o p h y l l a ( p o i n e f u l l e ra n dg i b o r ，1 9 9 0 ) 等也开展了发育分化的研究。上述紫菜种类 的研究结果基本上相一致。 紫菜叶状体单离体细胞的发育分化首先受其所处发育分化阶段的影响，另一 方面也受外界培养条件的显著影响。研究表明，条斑紫菜壳孢予在单一藻种条件 下发育分化形成叶状体，而在无菌条件下，萌发形成细胞团。y a m a z a k ie ta j ( 1 9 9 8 ) 认为，在无菌培养条件下，条斑紫菜配子体时期( 叶状体时期) 丧失了 典型的形态建成，这可能与缺乏紫菜共生菌的作用有关。此外，光照、比重等生 态因子对大型海藻的生长、发育及病害等存在显著影响，相关研究不仅具有理论 意义，而且对大型海藻栽培生产也具有现实指导意义。迄今，国内外的研究主要 集中于不同生态因子对大型海藻生长、发育分化、光合作用、呼吸作用等方面的 影响( l u n i n g ，1 9 9 2 ；王永川等，1 9 9 4 ；f o n ge ta 1 ，1 9 9 6 ；刘静雯等，2 0 0 1 ； 杨迎霞等，2 0 0 2 ) 。 细胞密度、光照强度、比重等是紫菜单离体细胞培养的重要参数，迄今，已 见报道的研究多集中于上述培养条件对紫菜壳孢子附着、叶状体生长、单孢子形 成放散等的影响( y a m a u c h i ，1 9 7 3 ；李世英等，1 9 7 9 ；李世英，崔广法，1 9 8 0 ； d a vp ta ，2 0 0 2 ；崔广法等，1 9 8 2 a ，1 9 8 2 b ：汤晓荣，费修绠，1 9 9 8 ) 。而关 于上述培养条件对紫菜叶状体单离体细胞发育分化影响的研究报道极少( 何培 民，王素娟，1 9 9 1 ，1 9 9 2 b ；z h ie ta 1 ，1 9 9 6 ；h e e ta ，1 9 9 6 ) ，并存在不 相一致之处，本研究试图系统研究细胞密度、光照强度、比重对坛紫菜叶状体体 细胞发育分化多个方面( 成活率、分裂速度、叶片率等) 的影响，从而进一步完 善坛紫菜叶状体体细胞发育分化的研究，并为坛紫菜转基因育种提供可资借鉴的 厦门大学理学博士学位论文 基础资料。 1 2 2 紫菜育种、育苗简介 紫菜生活史属异型世代交替，包括配子体世代和孢子体世代。紫菜配子体是 宏观的叶片状组织叶状体，大多由单层细胞( 少数由两层细胞) 构成。紫菜 的孢子体则是穿钙生长的微观的丝状体，曾被称为壳斑藻( c o n c h o c e l i s ) 。紫菜 具有3 种孢子：果孢子、壳孢子、单孢子。叶状体细胞经过雌雄分化、受精，分 裂形成果孢子，果孢子萌发生长成为丝状体，丝状体经过近半年的生长发育而产 生壳孢子，壳孢子萌发生长成为幼叶状体，即栽培生产上的苗种。单孢子是叶状 体在一定条件下产生的，单孢予萌发生长成为叶状体，它也是一种苗源( 何培民， 王素娟，1 9 9 2 a ；曾呈奎，1 9 9 9 ) 。 就总体而言，藻类的育种、育苗还处于初级阶段，使用的是技术水平较低的 仍不够成熟的传统技术。早期的紫菜育种是从自然种群，以后发展到由栽培种群 中挑选性状优良的藻体进行留种栽培，如日本的奈良轮条斑紫菜、大叶甘紫菜( 只 t e n e r a ) 。后来，1 9 本学者利用杂交方法从两个条斑紫菜的色素突变体得到子一 代叶状体，从重组的野生型细胞组织中培育出晓光号新品系( 曾呈奎，1 9 9 9 ) 。 紫菜生活史、核相转换规律、色彩突变体诱变的系列研究表明，条斑紫菜的 减数分裂发生在由壳孢子萌发产生4 细胞幼叶状体时期，因而由4 细胞幼叶状体 长成的紫菜苗是嵌合体植株，具有遗传上的多样性( 孙爱淑，曾呈奎，1 9 8 7 ；王 索娟等，1 9 9 9 ；严兴洪等，2 0 0 0 ；许璞等，2 0 0 2 ；姜红霞，汤晓荣，2 0 0 3 ) 。因 此，利用叶状体得到果孢子接种贝壳的传统育苗技术是不能得到纯系的，即使用 良种原藻接种贝壳育苗，原有的优良性状也会很快退化消失，这增加了紫菜育种 的复杂性和难度( 曾呈奎，1 9 9 9 ) 。紫菜体细胞工程育种、育苗研究正是在上述 背景下产生的，并于近年来取得较大进展，它主要包括紫菜丝状体细胞( 2 n ) 工 程、叶状体细胞( n ) 工程两个方面，下面综述了叶状体体细胞工程的研究进展。 1 2 3 叶状体体细胞工程育苗 我国学者在这方面进行了许多开拓性的工作。赵焕登、张学成( 1 9 8 1 ，1 9 8 4 ) 首先开展了条斑紫菜叶状体体细胞育苗的研究。唐延林( 1 9 8 2 ) 首次用海螺酶成 功解离圆紫菜叶状体体细胞并培养成株，从而大大促进了紫菜叶状体体细胞工程 育苗的研究。方宗熙等( 1 9 8 6 ) 、戴继勋等( 1 9 8 8 ) 、马凌波等( 1 9 9 8 ) 报道了条 斑紫菜叶状体体细胞室内育苗、直接附网育苗及其下海养殖的研究结果。而王素 坛紫菜转雀素基因研究 娟等( 1 9 8 7 ) 系统研究了坛紫菜叶状体体细胞育苗，研究结果表明，由冷藏1 年 的2 5c m 的幼苗制备的单离体细胞可以在生产条件下长成正常紫菜，揭示了坛 紫菜叶状体体细胞用作新苗源的前景。为解决紫菜叶状体体细胞育苗中的一些难 题，王素娟、何培民( 1 9 9 2 ) 还研究了条斑紫菜固定化细胞育苗技术，研究结果 表明，固定化细胞育苗能保证苗的密度，从而保证了紫菜的产量。 上述研究所进行的小型生产实验表明，海藻解壁酶法解离的叶状体体细胞可 以直接成苗，长出符合商品要求的紫菜产品，并且形成了一套操作工艺，但叶状 体体细胞育苗技术仍处于小型试验阶段，在规模、效率和成本方面尚不能达到生 产性栽培实用化的需求( 王素娟，1 9 9 4 ) 。 1 2 4 叶状体体细胞工程育种 。 主要包括原生质体融合育种、体细胞诱变育种两方面。 1 2 4 1 原生质体融合育种 原生质体融合育种技术已被成功用于跨越显花植物种间有性繁殖不亲合性 及引入抗性性状。紫菜属种类间因为性不亲合而难于应用常规育种技术克服种间 屏障以进行遗传改良( u p p a l a p a t ia n df u j i t a ，2 0 0 0 ) 。 为探索一种有效的育种新手段，1 9 6 0 年代就开始了藻类原生质体的研究工 作，而近1 0 余年的海藻细胞杂交研究，主要以紫菜为材料，迄今，已有1 0 余个 紫菜物种被研究过( 曾呈奎，1 9 9 9 ) 。来自紫菜叶状体体细胞的原生质体是单倍 体，其表现型与基因型相同，这是原生质体成为紫菜杂交育种和基因工程育种重 要材料的原因( 姜红霞，汤晓荣，2 0 0 3 ) 。戴继勋等( 1 9 9 0 ) 用p e g 法研究了坛 紫菜、条斑紫菜异种原生质体融合，但杂种细胞仅形成细胞团，未能分化产生叶 状体。严兴洪( 2 0 0 1 ) 采用p e g 法研究坛紫菜、条斑紫菜种内原生质体融合，但 坛紫菜原生质体融合体的再生体及其无性繁殖体的研究结果表明，坛紫菜的种内 原生质体融合体可能只发生了细胞质融合；此外，条斑紫菜原生质体融合体培养 1 5 2 0d 后，再生形成细胞团，然后放散出许多孢子并萌发成正常野生型叶状 体。c h e ne t 臼利用电融合法获得了p7 _ i n e a r i s 和朱红紫菜的融合细胞，培 养4 周后，发育形成多细胞的小植物体( 姜红霞，汤晓荣，2 0 0 3 ) 。紫菜原生质 体融合研究常用的方法为p e g 法，而相关研究表明，电融合法的融合率大于p e g 法的( p a t w a r ya n dv a nd e rm e e r ，1 9 9 2 ) ，电融合效率受到海藻解壁酶等因素 的影响( m i z u k a m ie a 7 ，1 9 9 2 ) 。 厦门大学理学博士学位论文 目前，已有研究获得对紫菜病原菌具有部分抗性的原生质体融合体后代( 简 称为f p p ) 。紫菜种质资源研究表明，尽管条斑紫菜栽培品系对病原菌p y t h i u m p o r p h y r a et a k a h a s h ie ts a s a k i 导致的赤腐病高度敏感，仍有两种非栽培紫菜 pt e n u i p e d a l i sm i r u a 和圆紫菜具有部分抗性。其中，因为细胞壁较薄、生长 快速，pt o n o i p e d a l i s 更适于作为导出抗性性状的育种材料。u p p a l a p a t ie t a l ( 2 0 0 0 ) 获得了两个源于条斑紫菜和pt e n u i p e d a l i s 的种间f p p ，它们对赤腐 病病原菌的抗性介于两亲本之间，并较接近pt e n u i p e d a l i s 的。紫菜原生质体 融合育种目前尚处于基础研究和探索试验阶段，尚未获得有栽培价值的紫菜品 系。 1 2 4 2 物理诱变育种 。 物理诱变育种已被证明是高等植物的一种有效的诱变手段，但在紫菜方面的 研究开展较少。戴继勋等( 1 9 9 0 ) 研究表明，较高剂量的紫外线照射对条斑紫菜 的营养细胞可能具有诱变作用。匡梅等( 1 9 9 7 ) 用y 射线处理条斑紫菜、坛紫菜 体细胞苗，结果显示，1 0 0 4 0 0g y 的辐照剂量对两种紫菜细胞的生长都有促进 作用，并获得了多种形态与色素变异体。上述研究结果显示了射线处理潜在的应 用前景。 1 2 4 3 化学诱变育种 相对物理诱变育种而言，化学诱变育种方面的工作开展较多且较系统。秋水 仙素作为植物多倍体的有效诱发剂，早在1 9 4 0 年代就被广泛用于高等植物研究， 并取得了巨大成就。研究表明，秋水仙素首先具有抑制条斑紫菜、坛紫菜叶状体 体细胞分裂以及毒害的作用，导致出现细胞及叶状体形态变异( 戴继勋等，1 9 9 0 ； 严兴洪、王素娟，1 9 9 0 ) ；其次，秋水仙素对坛紫菜叶状体体细胞发育分化具有 明显影响：促进幼苗生长，促进假根发生和生长，并能促进细胞团释放类单孢子， 从而增加正常苗数量( 严兴洪、王素娟，1 9 9 0 ) ：此外，还有研究表明，秋水仙 素可延缓坛紫菜再生叶状体发育成熟与衰亡( 王志勇、黄世玉，1 9 9 8 ) 。e m s 是 另一种常用的化学诱变剂，具有促进坛紫菜叶状体单离体细胞再生体假根生长的 作用，但对细胞分裂的抑制作用阻及致畸变或致突变的作用都不明显( 王志勇、 黄世玉，1 9 9 8 ) 。关于秋水仙素及e m s 的研究都尚未明确秋水仙素和e m 8 的上述 作用是否可遗传。 紫菜含三种主要的光合色素：叶绿素a ( c h la ) 、藻红蛋白( p e ) 、藻蓝蛋 坛紫菜转鲎素基因研究 白( p c ) 。这三种色素的含量及相互l e f f , j 决定了紫菜叶状体的色彩变化以及商业 紫菜饼的质量。所以，紫菜色素突变体研究对突变育种、栽培品种改良均具有重 要意义。相关研究显示，紫菜比江蓠( 6 r a c i l a r i a ) 等海藻更难被一般的化学诱 变剂所诱变( 严兴洪，2 0 0 0 ) 。因此，m i t t m a n v a nd e rm e e r ( 1 9 9 4 ) 使用强 烈的化学诱变剂m n n g 处理尸ip u r p e r u a ，获得了少量色彩突变体。严兴洪等( 2 0 0 0 ) 用m n n g 处理条斑紫菜叶状体原生质体，获得了少量点状色彩变异体，并利用单 色变异叶状体分离出3 个突变株：绿色( y e l ) 、浅桔黄色( c c h ) 、深桔红色( b u s ) 。 进一步遗传分析表明，条斑紫菜的人工色素形成突变体是由基因变异导致的( y a n a n da r u g a ，2 0 0 0 ) 。此外，研究表明，m n n g 还能诱导紫菜壳孢子形成色彩变异叶 状体( 许璞等，2 0 0 2 ) 。 1 3g u s 报告基因在转基因植物研究中的应用 1 3 1g u s 报告基因简介 报告基因通常编码一个在离体条件下易于检测的酶，或者最好可以在活体条 件下进行组织化学定位，这样就可以提供定量、定性的信息。g u s ( f 3 一葡糖醛酸 糖苷酶) 基因分离自大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) ( j e f f e r s o ne ta 1 ，1 9 8 7 ) 。 g u s 是一种外切水解酶，能催化多种b d - 葡糖苷酸类物质水解为d 一葡糖醛酸和 糖苷配基。重要的是，在g u s 氨基末端加上一系列的氨基酸，所产生的融合蛋白 仍具有g u s 活性。相关研究表明，低等植物( 如藻类、苔藓类、蕨类、真菌等) 中不存在内源g u s 活性；仅在部分高等植物中检测到内源g u s 或类g u s 活性。g u s 基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高、易于定量及定位分析、可以与其它 蛋白质基因融合等优点( j e f f e r s o ne ta 1 ，1 9 8 7 ) ，从而成为1 9 9 0 年代以来植 物基因工程研究中应用最为广泛的报告基因之，同时也是大型海藻转基因研究 中最常用的报告基因。目前，用不同的b d - 葡糖苷类物质作为底物，发展了不 同的g u 8 检测分析方法，主要包括组织化学定位法、分光光度法、荧光法、聚丙 烯酰胺胶原位分析法等( c l a r k ，1 9 9 8 ；王关林、方宏筠，2 0 0 2 ) 。 1 3 2g u 8 基因在外源基因载体研究中的应用 g u s 基因在启动子研究中获得了广泛应用。启动子捕获( p r o m o t e rt r a p p i n g ) 方法广泛应用在细菌、酵母、动物和植物中。该方法将不带启动子的报告基因随 机插入染色体中，由插入位点附近基因的启动子启动报告基因表达，通过检测报 厦门大学理学博士学位论文 告基因是否表达、以及报告基因在生物体中的表达部位，从而判断报告基因插入 位置附近是否有启动子存在以及宿主基因的表达是否有特异性。进而可以从报告 基因的邻近序列中分离出启动子及其相应的基因。g u s 基因首先可用于捕获新的 启动子，c h i ne ta 1 ( 1 9 9 9 ) 、j e o ne ta 1 ( 2 0 0 0 ) 将无启动子的g u s 基因构 建在t - d n a 上，通过t - d n a 的随机插入，从而分离水稻基因组的启动子。而朱英 等( 2 0 0 3 ) 进一步将无启动予的g u s 基因构建在非自律性的胍转座子上，从而 用于分离水稻基因组的启动子。其次，g u s 基因还被应用于启动子功能研究中。 谢迎秋等( 2 0 0 0 ) 将c l c u v 启动子片段分别以不同方向与g u s 报告基因和d o s 终 止子融合，构建瞬时表达载体，用以转化烟草( n i c o t i a n at a b a c u ml ) 、棉花 ( g o s s y p i u mh i y s u t u ml ) 。研究结果初步证实分离的互补链基因启动子可作为 新型强启动子应用于双子叶植物尤其是棉花的遗传转化。此外，甘蓝型油菜 ( b r a s s i c a n a p u s ) 种子贮藏蛋白基因b c n a l 的启动子能特异启动g u s 基因在种 子中的表达，而且间接证明b c n a l 基因的启动子在转基因烟草中的遗传传递方式 符合孟德尔遗传定律( 石东乔等，2 0 0 1 ) 。而g u s 基因瞬时表达系统也被用于快 速比较分析多种水稻基因启动子的效率( h w a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。第三，g u n 基 因也被广泛用于启动子组织特异性表达及诱导表达方面的研究。下列启动子的组 织特异性表达都是采用g u s 报告基因发现的：与乙醇脱氢酶基因高度相似的 s t g a n 基因的启动子仅在马铃薯匍匐茎顶芽表达( t r i n d a d ee ta ，2 0 0 3 ) ；m s v c p 启动子具有一定的发育调控功能，且可用于转基因水稻的组织特异性表达 ( m a z i t h u l e l ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ；t g m v 外壳蛋白基因启动子仅在棉花韧皮部特异 表达( x i ee ta ，2 0 0 0 ) ：马铃薯g t 基因启动子受u v 、低温、光照、盐类、 脱落酸等环境因素的调控( k o r o b c z a ke ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 g u s 基因在u t r 及增强子研究中也获得了广泛应用。g u s 基因瞬时表达研究 表明，t m v3 u t r 在转基因植物中不具有p o l y ( a ) 和转录终止子的作用( q i ne t a 1 ，2 0 0 0 ) 。增强子捕获( e n h a n c e rt r a p p i n g ) 被认为是全基因及调控元件功 能分析的重要工具，含有g u s 报告基因的增强子捕获系统被认为是水稻功能基因 组研究的有效策略( p e n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 m a r s 是真核生物染色质的特殊d n a 序列，主要特征为富含a 、t 碱基及数个 短的可形成d n a 结构域从而与核基质结合的特征d n a 序列。m a r s 通过与核基质 坛紫菜转黉素基心研究 结合，将染色质分割成一个个染色质环，每个染色质环是染色质的结构单位和基 因表达调控单位。环内的基因不受周围染色质成分的影响，独立地进行表达调控。 转基因研究中，常将m a r s 构建到外源基因两侧，使外源基因在转基因植物的染 色质中形成独立区域，从而避免外源基因表达中的位置效应，而且可提高外源基 因在转化细胞中的稳定性和表达水平。关于m a r s 的上述功能研究中，g u s 基因 是常用的外源基因。构建在g u s 基因两侧的豌豆( p y s u ms a t i v u ml ) m a r s 序 列可使g u s 基因在烟草转化细胞中的表达水平提高2 倍( 李旭刚等，2 0 0 1 a ) 。z h o n g e ta 1 ( 2 0 0 4 ) 则e b 较分析了烟草、酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、腰豆 ( p h a s e o j u sv u l g a r i s ) m a r s 对烟草中外源g u s 基因表达水平的影响。h r 技术 和m a r s 的应用都是近年发展起来的克服外源基因失活、提高表达效率的有效方 法。利用上述技术，可以将外源基因精确整合到宿主细胞染色体特定位点，也可 以对某一位点的基因进行准确的修饰、；b h t 和剔除，具有高效稳定的优点，在不影 响原基因结构元件的情况下，可使外源基因得以正常表达。研究表明，1 8 sr d n a 基因片断及m a r s 可提高外源g u s 基因在拟南芥根组织中的表达( 张秀海等， 2 0 0 0 ) 。 g u s 基因也是转基因沉默研究中的常用外源基因。转基因沉默是植物基因工 程研究中常见的现象，许多因子，如d n a 甲基化、位景效应、反式失活、协同抑 制等，能导致转基因沉默。研究表明，启动子区甲基化导致转基因烟草中g u s 基 因沉默( l ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。此外，转基因烟草中g u s 基因沉默还与其拷贝数有 关：s o u t h e r n 杂交结果表明，g u s 基因沉默植株的基因组中整合了多个g u s 基因 拷贝，而g u s 活性高的转基因植株多为g u s 单拷贝整合；n o r t h e r n 杂交结果显 示，多拷贝引起的基因沉默发生在r n a 水平( l i e fa 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 3 3g u s 基因在转基因体系研究中的应用 g u s 基因常被用于外源基因转化方法筛选及优化研究。植物早期原胚首次电 穿孔转化外源基因的研究就是采用g u s 基因进行的，结果表明，电穿孔法是植物 原胚的有效转化方法，早期原胚的表达率是球状原胚的7 倍( l ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 曹毅等( 2 0 0 1 ) 也用g u s 基因瞬时表达优化了电穿孔法转化玉米胚性愈伤组织的 最适参数。吴丽芳等( 2 0 0 0 ) 利用g u s 基因首次证明了离子