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低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建 及其色素发酵条件的优化 专业：微生物学 申请人：梁志洲 指导导师0 周世宁教授 摘要 红曲霉( m o n a s c u s ) 是我国重要的微生物资源，是生产红曲米、红曲红及其他 功能性红曲的主要菌种，被广泛运用于现代工业中。但自从具有肾毒性的桔霉素 被发现后，红曲产品的安全性引起了人们的关注，其应用范围也受到了一定的限 制。因此，获得不产或低产桔霉素的红曲菌株，对于红曲工业的发展意义重大。 本研究提供了一种构建低桔霉素红曲霉工程菌的方法。在生物信息学指导 下，应用重叠延伸p c r ( g e n es p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o np c r ，s o ep c r ) 技 术制备桔霉素合成酶相关基因凼刀的转录激活因子c t n r 的无效等位基因片段， 通过限制性内切酶介导( r e m i ) 的方法转化红曲霉原生质体，借助同源重组方 式置换c t n r 基因，实现了对该转录激活因子的敲除。利用桔霉素对枯草芽孢杆 菌的抑制特征对转化子进行初步筛选，并对获取的低产桔霉素菌株运用分子生物 学方法( p c r ) 及高效液相色谱分析进行了验证。与出发菌株相比，转化子桔霉 素产量降低了5 8 ，而色素产量提高了3 0 。 对获得的转化子进行了生物学特性分析，并采用添加酵母破碎的方法对其红 曲色素的液态发酵生产进行了优化。通过在不同的时间往接种了红曲霉并开始培 养的摇瓶中加入不同量的酵母破碎液，研究在酵母破碎液作用下，菌体生长及醇 溶性及水溶性色素产量的变化，发现在5 0 0m l 的三角瓶装液1 5 0m l 情况下，接 中山大学硕士学位论文 种红曲霉培养4 8h 后加入1 5m l 酵母破碎液( 5 0m lo d 啪为1 8 的发酵液碎离 心后菌体用1 5i i l l 缓冲液重悬、破碎、过滤所得) 可以明显提高醇溶性及水溶性 色素产量，增幅分别达到1 2 0 和1 9 0 。 此外，分别对醇溶性及水溶性色素的稳定性进行了研究，发现红曲色素对光 敏感，易受盐浓度的影响，但对热有一定的稳定性，受f e 2 + 、v d + 、c u 2 + 以外的 大部分金属离子影响较小，且上述因素中，醇溶性色素稳定性比水溶性色素稳定 性好。p h 对醇溶性和水溶性色素的影响不同，醇溶性色素在中性偏酸性环境稳 定性较好，而水溶性色素在碱性偏中性较稳定。 关键词：桔霉素，基因敲除，酵母破碎液，红曲色素，稳定性 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 、 c o n s t r u c t i o no fam o n a s c u s p u r p u r e u s s t r a i ns h o w i n gl o w e r c i t r i n i np r o d u c t i o na n dp t i m i z a t i q 。f e r m e n t a t i o n c i t n nnp r o o u c t i o na no p t i1 1 0 no lt e r mn t a t l o n a f i r e1 l c o n d l t i o n o rr e np i g m e n tp r o a u c t i o n s p e c i a l i t y ：m i c r o b i o l o g y s u b m i t t e db y l i a n gz h i z h o u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h o us h i n i n g a b s t r a c t m o n a s c u s ，t h ei m p o r t a n tf i l a m e n t o u sf u n g u s ，h a sb e e nw i d e l yu s e di no u rc o u n t r y t o p r o d u c em o n a s c u s - f e r m e n t e dr i c e ，m o n a s c u sp i g m e n t a n do t h e rf u n c t i o n a l m o n a s c u sp r o d u c t s s i n c et h ec i t r i n i n ，ah e p a t o t o x i ca n dn e p h r o t o x i ci n g r e d i e n t ，c a n b ea l s op r o d u c e da l o n gw i t ht h em o n a s c u ss e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，t h ec o n c e r nf o r t h e s a f e t yo fm o n a s c u sp r o d u c t sb e c a m et h ec r u xo fc o n t r o v e r s ya n dt h i sl i m i t si t s a p p l i c a t i o n t h u s ，s t r a i n sw i t hn oc i t r i n i no rl o wc i t r i n i np r o d u c t i o nw i l lb ei m p o r t a n t f o rt h em o n a s c u sr e l a t e di n d u s t r t y i nt h i ss t u d y , am o n a s c u sm u t a n ts t r a i nw a sc o n s t r u c t e db yu s i n gt h em e t h o do f g e n es p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o np c r ( s o ep c r ) t h ei n v a l i da l l e l ef r a g m e n to f t h ea c t i v a t o rg e n ec t n r ，w h i c hi sr e l e v a n tt ot h et r a n s c r i p t i o no fg e n ep k s c t , w a s p r e p a r e da n dt h e nt r a n s f o r m e di n t ot h ep r o t o p l a s to fm o n a s c u sb yr e m i t h eg e n e c t n rw a sr e p l a c e db yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n t h e n , t h et r a n s f o r m a n t sw h i c hl o s t c t n rg e n ea n dr e d u c e dc i t r i n i np r o d u c t i o nw e r ep r e l i m i n a r ys c r e e n e db yo b s e r v i n g t h el o s so ft h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s tb a c i l l u ss u b t i l i s f i n a l l y , t h es e l e c t e d m u t a n t sw e r ef u r t h e rc o n f i r m e db yp c ra sw e l la st h ec i t r i n i nd e t e c t i o nw h i c hw a s i i i 中山大学硕士学位论文 m e a s u r e db ym e a n so fh p l c r e s u l t ss h o wt h a tt h ec i t r i n i np r o d u c tw a sr e d u c e db y 5 8 ，a n dt h ep i g m e n t si n e a s e db y3 0 ，c o m p a r i n gw i t ht h ew i l dt y p es t r a i n s t h eb i o l o g i c a lp r o p e r t yo ft h es e l e c t e dt r a n s f o r m a n tw a sa n a l y z e d ，a n dt h e c o n d r i o nf o rr e dp i g m e n tf e r m e n t a t i o nw a so p t i m i z e d t h ee f f e c to fy e a s t ( s a c c h a r o m y c e sc e m v i s 妇e ) l y s a t eo nt h er e dp i g m e n tp r o d u c t i o no fm o n a s c u sw a s i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o wt h a t4 8h o u r sa f t e ri n o c u l a t i n gw i t hm o n a s c u si st h e m o s ts u i t a b l et i m ep o i n tt oa d dy e 嬲tl y s a t ea n d1 5m li st h em o s ts u i t a b l ea m o u n to f y e a s tl y s a t ef o r15 0m lc u l t u r em i xt oi n c r e a s et h ep 远m e my i e l d u n d e rt h em o s t s u i t a b l ec o n d i t i o nm e n t i o n e da b o v e ，t h er a t e so fi n e a s ei l ly i e l do fh y d r o p h o b i c p i g m e n ta n dh y d r o p h i l i cp i g m e mw e r e12 0 a n d19 0 ，r e s p e c t i v e l y , a sc o m p a r e d w i t hc o n t r 0 1 e f f e c to fl i g h t ，t e m p e r a t u r e ，a c i d b a s e ，s a l tc o n c e n t r a t i o na n dm e t a li o n so nt h e s t a b i l i t yo fh y d r o p h o b i cp i g m e n ta n dh y d r o p h i l i cp i g m e n tw a ss t u d i e d r e s u l t ss h o w t h a tb o mh y d r o p h o b i cp i g m e n ta n dh y d r o p h i l i cp i g m e n ta r es e n s i t i v et o 岵h t ，a n d t h e i rs t a b i l i t yi si n c l i n e dt or e d u c ea st h es a l tc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e s h o w e v e r , t h e y c a l lw i t h s t a n dh e a tt os o m ee x t e n t ，a n dc a nr e t a i ns t a b l eu n d e rt h ep r e s e n c eo fm o s t m e t a li r o n se x c e p tf d + 、f e 3 + 、c u 2 + h y d r o p h o b i cp i g m e n ti sm o r es t a b l et h a n h y d r o p h i l i cp i g m e mu n d e rt h ei n f l u e n c eo ft h ef a c t o r sm e n t i o n e da b o v e a c i d - b a s e h a sd i f f e r e me f f e c to n h y d r o p h o b i cp i g m e n t a n d h y d r o p h i l i cp i g m e n t t h e h y d r o p h o b i cp i g m e n to rh y d r o p h i l i cp i g m e n ti ss t a b l ew h e np hr a n g e sf r o m4t o7o r 8t o10 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：c i t r i n i n , g e n ek n o c k - o u t ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a el y s a t e ， m o n a s c u sp i g m e n t ，s t a b i l i t y i v 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 缩略词 e l i s a e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫分析 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制片段长度多态性 r e m i r e s t r i c t i o ne n z y m e - m e d i a t e di n t e g r a t i o n 限制酶介导整合 c t a b h e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三甲基溴化铵 t l c t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 薄层层析 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e 开放阅读框架 d t t d l - d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 d d h 2 0 d o u b l yd i s t i l l e dw a t e r r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e o d r t k b o p t i c a l d e n s i t y r o o mt e m p e r a t u r e k i l o b a s e b a s ep a i r 6 7 双蒸水 辕| 禽 光密度 室温 千碱基对 碱基对 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容夕b 本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：器去z _ 日期：砌年多月j 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：冯尘卅 日期：嘶月f 日 导师躲) 孵 日期：矽d 年6 月l 曰 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 第1 章绪论 1 1 概述 红曲，亦称作丹曲，是红曲霉以大米等淀粉基质为原料进行发酵的产物，在 我国有着悠久的应用历史。早在汉代诗赋( - e 释中就已有“瓜州红曲，参揉相 拌，软滑膏润，入口流散”的食用记载，而医用记载则最早见于元代日用本草 一书：“红曲酿酒，破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤损 。明代的两部巨著本 草纲目和天工开物对红曲的记载更为详细，不但阐明了其在饮食及医药方 面的价值，而且涉及到了红曲生产的细节，如控温、控湿、通风等等。 虽然人们应用红曲的时间久远，但对其的认识也还只是限于应用层面。直到 1 8 8 4 年法国学者v a nt i e g h e m 从中分离到两种红曲霉以后，红曲的本质才得以 揭示，红曲霉的现代研究也才由此开始。一百多年来，世界各国学者对红曲霉进 行了广泛的研究，分离得到的红曲霉菌株种类越来越多，且随着研究的深入，其 代谢生产的多种生物活性物质也逐步被发现。如今，红曲霉因其巨大的潜在价值， 已经被广泛应用于现代工业生产中。 1 2 红曲霉的分类地位及生物学特性 1 2 1 红曲霉的分类地位 1 2 1 1 红曲霉“属”的分类 红曲霉属( e o n a s c u sv a nt i e g h ) 是v a nt i e g h e m 于1 8 8 4 年建立的。经过 观察鉴定，他认为他所分离到的菌株是单子囊结构的，故命名为e o n a s c u s ，取 单子囊( m o n o - a s c u s ) 之意。但是其实他所观察到的是成熟的闭囊壳，散落其中 的多个子囊的子囊壁已解体，只留下子囊孢子，故使得他误认为只含有1 个子囊。 尽管名字并不确切，原名还是沿袭了下来( 傅金泉，1 9 9 7 ) 。 有关红曲霉属的分类学术界存在着较大的争议，存在着不同的分类方法。按 照目前多数真菌学者趋向参照的a i n s w o r t h 分类系统，红曲霉属被归于真菌界 ( t h ef u n g i ) 、真菌门( e u m y c o t a ) 、子囊菌亚门( h s c o m y c o t i n a ) 、不整子囊菌纲 ( p l e c t o m y h c e t e s ) 、散囊菌目( e u r t o t i a l e s ) 、红曲科( m o n a s c a c e a e ) 。在此分类 中山大学硕士学位论文 、 系统中，于散囊菌目下建立了红曲科，从而与散囊菌科分开，红曲科下仅一属，即 红曲霉属( m o n a s c u sv a nt i e g h ) ( 俞大绂李季纶，1 9 8 5 ；张纪忠，1 9 9 0 ) 。 1 2 1 2 红曲霉“种 的分类 红曲霉属以下的分类及命名也比较混乱，自红曲霉属建立以来，文献记载的 种名多达数十种，其中并不乏同种异名的情况。h a w s k w o r t h 和p i t t 根据菌落生 长状况、菌丝生长速度、闭囊壳颜色、子囊孢子形态大小等生物特性将红曲霉归 为3 个种，即红色红曲霉( 彪t u b e r ) 、紫色红曲霉似p u r p u r e u s ) 、丛毛红曲 霉似p i l o s u s ) ( h a w s k w o r t h p i t t ，1 9 8 3 ) ，且进一步用生化测定的方法进行 了验证( b r i d g e h a w s w o r t h ，1 9 8 5 ) 。 中国科学院微生物研究所的李钟庆长期从事红曲霉分类学方面的研究，他认 为红曲霉至少应分为1 3 个种( 李钟庆郭芳，2 0 0 3 ) ，分类如下： 发白红曲霉a l b i d u ss a t o ) 红色红曲霉纰t u b e rv a nt i e h g e m ) 紫色红曲霉p u r p u r e u sw e n t ) 橙色红曲霉a u r a n t i a c u sl i ) 巴克红曲霉b a r k e r id a n g e a r d ) 烟灰色红曲霉b m i g i n i o s u ss a t o ) 苍白红曲霉p a l l e n sc a n o n ，a b d u l l a h a b b s ) 丛毛红曲霉( 彪p i l o s u ss a t oe xh w a k s w o t h p i t t ) 血红红曲霉s a n g u i n e u sc a n o n ，h b d u ll a h a b b s ) 红曲红曲霉( 彪a n k an a k a s a w a s a t o ) 佛罗里达红曲霉f l o r i d a n u sc a n n o n b a m a r d ) 新月红曲霉( 彪l u n i s p o r a su d a g a w a b a b a ) 旱生红曲霉( 彪e r e m o p h i u sh o c k i n g p i t t ) 由于培养条件对菌落形态及其生理生化特征有较大的影响，根据生物学特性 进行分类有时仍旧难以区分。目前已有运用分子生物学方法，通过基因组分析手 段进行分类的报道。泰国学者通过对收集到的2 0 几株红曲霉菌株进行 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 分析，将其归为5 类，其中膨 2 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 p u r p u r e u s 占大多数( l a k r o de t8 l ，2 0 0 0 ) 。美国典型菌种保藏中心的研究者 根据r r n a 上l s u ( 1 a r g es u b u n i t ) 基因的d 1 d 2 序列区序列同源性对保藏的红 曲霉菌株进行了分类鉴定( p a r k j o n g ，2 0 0 3 ) 。由此可见，从基因水平对红曲 霉进行种的分类，将是一个值得研究的方法。 1 2 2 红曲霉的生物学特性 1 2 2 1 红曲霉的形态 红曲霉是一种丝状真菌，菌丝分支众多且不规则，为多细胞构造，具横隔， 多核。细胞幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴。红曲霉无性繁殖产生分生孢子， 着生于菌丝及其分枝的顶端，单生或基式生长，2 6 个成链状排列。分生孢子 梨形或球形，初为白色，后呈红色，可萌发成为菌丝。有性繁殖时形成闭囊壳， 呈球形，有柄。壳内散生多个子囊，每个子囊内含有8 个子囊孢子。子囊成熟后 子囊壁解体，其内所含子囊孢子则留在薄壁的闭囊壳内。当闭囊壳破裂后，子囊 孢子散出，经萌发形成多核的菌丝( 戴芳澜，1 9 7 8 ) 。 1 2 2 2 红曲霉的培养特征 红曲霉可在多种培养基上生长，大多能在麦芽汁琼脂培养基上生长良好。菌 落初为白色，后逐渐变为橙红色、淡红色、紫红色等，因种而异。菌落平坦或隆 起，呈绒毡状或呈皮膜状，呈皮膜状的菌落稍有褶皱或具有辐射纹。菌体生长过 程中会产生红色素，分泌于培养基中使培养基背景着色( 李钟庆郭芳，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 3 红曲霉的生理生化特征 红曲霉是腐生真菌，嗜酸，尤嗜乳酸，耐高温，耐乙醇。生长温度范围很广， 一般为1 5 一4 2 。c ，最适温度为3 0 3 5 ；最适p h3 5 5 0 ，可耐p h2 5 ；能 耐1 0 的乙醇。能以糖类、有机酸、醇类为碳源，可利用硝态氮、氨基氮、有机 氮，能在无维生素的合成培养基中生长。生长过程中能产生多种具有重要应用价 值的代谢产物( 李钟庆郭芳，2 0 0 3 ) 。 中山大学硕士学位论文 1 3 红曲霉的代谢产物 红曲霉作为一种重要的工业真菌，首先以其能产生大量色素而闻名。此外， 红曲霉还能产生多种具有生物活性的代谢物，如m o n a c o l i nk ，y 一氨基丁酸，麦 角固醇等等。 1 3 1 红曲色素 1 3 1 1 红曲色素的种类 红曲色素是红曲霉在生长过程中所产生的色素的总称，具有多种成分，主要 分为红色、橙色、黄色三系。目前已探明的结构有1 0 种，包括红斑胺、红曲红 胺、红斑素、红曲红素、红曲素、红曲黄素、n 一葡糖基红斑胺、n 一葡糖基红曲红 胺、n 一戊二酰基红斑胺和n 一戊二酰基红曲红胺。按溶解性可以分为醇溶性色素 和水溶性色素( b l a n ce ta l ，1 9 9 4 ；h a j j a je ta l ，1 9 9 7 ；k y o k oe ta ，1 9 9 7 ； t e n g f e l d h e i m ，1 9 9 8 ；l i a nxj ，2 0 0 7 ) 。其结构、分子式及分子量分别见表 1 - 1 和表1 - 2 。 表1 - 1 醇溶性色素主要成分的分子结构 t a b l el lm o l e c u l a rf o r m u l a so f t h em a i nm o n a s c u sn g m c n mo f e n t h a n o l - s o l u b i l i t y 4 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 表卜2 水溶性红曲色素主要成分的分子结构 t a b l ei - 2m o l e c u l a rf o r m u l a so f t h em a i nm o n a s c u sp i g m e n t so f w a t e r - s o l u b i l i t y 名称结构分子式分子量颜色 中山大学硕士学位论文 1 3 1 2 红曲色素的合成途径 红曲色素是一种聚酮化合物，其合成途径见图卜1 。在聚酮合酶的作用下， 1 分子乙酰c o a 和3 分子的丙二酰c o a 反应生成1 分子的四酮化合物，四酮化合 物再与1 分子丙二酰c o a 生成五酮化合物，如此循环使酮基化合物碳链不断加长， 最后形成胞内色素( h a j j a je ta l ，1 9 9 7 ) 。一般认为，通过此途径合成的色素 是橙色系的红斑素和红曲红素，其他色素都是由橙色素转化而来的( k u r o n oe t a l ，1 9 6 3 ；c a r e l s s h e p h e r d ，1 9 7 7 ) 。从结构式上可以看出，橙色素经氨基化 作用后生成红色素，而黄色素则是橙色素加氢氧化而产生。胞内的醇溶性色素可 与蛋白质、氨基酸、核酸、以及氨基糖的氨基发生反应，形成水溶性色素分泌于 胞夕 ( l i n d e m a i n ，1 9 9 4 ；h a j j a je ta ，1 9 9 7 ；w o n g k o e h l e r ，1 9 9 8 ) 。 乙酰c o a + 3 丙二酰c o a _ | 聚酮体合酶 土 c n 。- 酰c 。a 五四化宝物 丙二酰c 。a 土 c 晚川川扎驯。 六酮化合物 上 i 图卜1 红曲色素合成途径 f i g 1 - 1s y n t h e t i ca p p r o a c ho f m o n a s c u sp i g m e n t s 1 3 1 3 红曲色素的性质 1 3 1 3 1 色价与色调 色价用于定义单位质量或单位体积内某种色素的含量，单位为1 3 g 或u m l 。 6 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 色调用于表征色素表观颜色。可见光谱下扫描检测到红曲色素在4 1 0n i i i 和5 1 0n m 附近有两个最大吸收波峰，分别对应化学合成色素柠檬黄和胭脂红主波峰。通过 测定这两个波长下的吸光度( o d 值) ，可以分别计算黄色素和红色素的色价。黄 色素色价与红色素色价的比值即为色调，若色调大于1 ，说明黄色素多于红色素， 视觉感官会觉得红曲色素呈现橙红或橙黄色；反之若红色素多余黄色素，即色调 小于l ，视觉感官则会觉得红曲色素颜色显得深红( 张永权p 芒“，1 9 8 5 ) 。 1 3 1 3 2 溶解性 根据溶解性的不同，红曲色素分为醇溶性色素和水溶性色素。醇溶性色素能 溶于有机溶剂，如乙醇、氯仿、甲醇等，工业上提取一般采用7 0 乙醇进行提取。 水溶性色素的溶解度与水的p h 值有关，在中性或偏碱性条件下溶解性好，过酸 或过碱水质中，其溶解性呈减弱倾向( 周建钟e 芒a l ，2 0 0 3 ) 。 1 3 1 3 3 稳定性 不同菌株产生的红曲色素、不同性质的色素组分，其稳定性也会有差异。红 曲色素的光稳定性因光源而异，受室内自然光和紫外光的影响较小，而在室外日 光直射下褪色较为严重( 宋水山p 芒a - ，1 9 9 5 ) ；热稳定性较好，有研究表明色 素经1 0 0 。c 处理4h ，保存率仍能达到7 0 ( 赖建平罗军，1 9 9 9 ) ；在p h3 - - 一1 1 范围内较稳定，极酸、极碱条件下色调会发生变化( h e n d r i c k s o n d a v i d ，1 9 9 9 ) ； 对大部分金属离子稳定，但在c u 2 + 、f e 3 + 溶液中出现沉淀( 赖建平罗军，1 9 9 9 ) ； 对盐浓度比较敏感，在5 以上浓度的n a c l 溶液中，溶解度减弱，色价降低( 李 严巍e fa j ，1 9 9 6 ) 。 1 3 1 4 4 红曲色素的生产工艺 红曲色素产品主要有红曲米( 粉) 和红曲红( 液态或粉状) ，其相对应的生 产方式分别为固态发酵与液态发酵，工艺流程见图l 一2 ，1 3 。 固态发酵是我国红曲产品生产的传统方式。但是传统的盒曲法因其占地面积 大，操作繁琐、劳动强度大等缺点，并不适宜大规模工业化生产，目前多数红曲 生产厂家固态发酵更多的是采用现代厚层机械通风法。该工艺是在纯种制曲工艺 7 中山大学硕士学位论文 基础上，采用以池代窑，改人工翻曲为机械通风、自动控温的办法，使红曲的生 产达到机械化、纯种化，不受季节限制，常年均可生产( 朱文锦，1 9 8 5 ) 。 红曲色素的液态深层发酵是近1 0 年内发展起来的，与固态发酵相比，因其 具有原料来源广、生产周期短、有助于自动化生产等优点，目前也已被多数厂家 采用，且有由固态发酵向液态发酵的趋势。但是液态发酵的单位产量相对于固态 发酵较低，一定程度上影响了其更大规模地应用于工业化生产。目前研究者通过 选育高产菌株、优化培养条件、改善提取工艺等方式提高液态发酵色素产量，取 得了很大的进展( 衣珊珊e fa l ，2 0 0 5 ) 。 菌种嘲面活化t 级菌种璩泡1 浆t 级曲种浆 大米嘲泡珈干嘲熟飞饭叫种搬酵_ 烘干飞验嘲级飞装飞品 图1 - 2 红曲米的生产工艺流程 f i g 1 - 2t e c l m o l o g i d a lp r o c e s so f p r o d u c t i o n o fr e dr i c e 甲大毒、辅料大葛、辅料大米了辅料 斜彳、活化甲甲甲吾圹旦1 = 1 1 - 1 i ￥ 一级嘉子摇瓶一驽种子罐二驽种子罐发弩罐咖 二级妻子摇瓶学妒 妒每 二级种子摇瓶 。r 上甲甲宁擎 压缩空气飞却 成品+ 包装卜冷冻干燥 图卜3 液体发酵法生产红曲红工艺流程 f i g 1 - 3t e c h n o l o g i c a lp r o c e s so fp r o d u c t i o no fr e dp i g m e n t si ns u b m e r g e d c u l t u r e 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 1 - 3 1 5 红曲色素的应用及前景 红曲色素是红曲霉生长代谢过程中产生的天然色素，也是目前世界上唯一被 允许用于食品工业的由微生物代谢产生的色素( 马美荣p 舌a l ，1 9 9 9 ) 。我国食 品添加剂使用卫生标准中明确规定：红曲色素按生产需要可适量用于各种肉制 品、奶制品、水产品、果品、配制酒、冰棍、饼干、果冻、膨化食品、调味类罐 头和植物蛋白( 温辉梁p 芒a ，2 0 0 2 ) 。目前，红曲色素作为着色剂已被广泛用 于食品工业中，尤其是用于替代发酵香肠中具有潜在危害的化学发色剂亚硝酸盐 ( 赵燕p 芒a j ，2 0 0 4 ) 。此外，红曲色素在化妆品行业也将有很大的发展空间。 随着化学合成色素及一些传统化学发色剂的安全问题的出现，作为天然产品 的红曲色素更显示出了它优越性，越来越受到人们的青睐，市场需求前景巨大。 1 3 2m o n a c o l i nk m o n a c o l i n s 是一类物质的统称，包括活性及结构相类似的m o n a c o l i nk ， m o n a c o l i nl ，m o n a c o l i nx 等等，是日本学者远藤章先后于红色红曲菌( 彪t u b e r ) 发酵液中发现的( e n d o ，1 9 7 9 ，1 9 8 5 ) 。m o n a c o l i n 类物质具有降低胆固醇的药效， 其中m o n a c l i nk 的活性最高，在血液中浓度只要达到0 0 0 1 - - - 0 0 0 5 肛g m l ，就 可以影响胆固醇的合成( e n d oa ，1 9 7 9 ) 。其作用机理是此类物质与胆固醇合成途 径的限速酶i g - c o a ( 3 - 羟基- 3 - 甲基戊二酰c o a ) 还原酶的底物h m g - c o a 结构相 似，并且它们与i i m g - c o a 还原酶的亲和力远远大于h m g c o a 与该酶的亲和力，因 此能够通过竞争性抑制h m g - c o a 还原酶的活性，从而有效减少或阻断内源性胆固 醇的合成。 目前，富含m o n a c o l i n s 物质的红曲己经被开发为降血脂的药物投放市场， 如北大维信的“血脂康 、成都地奥的“脂必妥”等，在临床发挥着重要作用。 1 3 3y 一氨基丁酸 y 一氨基丁酸( y - a m i n o b u t y r i ca ci d ，g a b a ) 是目前研究较为深入的一种抑 制性神经递质，具有调节心血管活动、调节心律失常、营养神经细胞等生理功能。 红曲中的g a b a 首次于日本被发现( k o h a m ae ta l ，1 9 8 7 ) 。日本国立健康研究所 通过往饲料中添加红曲培养物，发现可使患有高血压症老鼠的血压从超过2 0 0 9 中山大学硕士学位论文 m m h g 降至1 8 0m m h g 以下，并证实了其有效成分为g a b a ( 迁启介，1 9 9 2 ) 。现在， 已有不少研究者在对y 一氨基丁酸深入研究，以期研制出可治疗人类高血压的药 物，而红曲霉因其具有生产y 一氨基丁酸的特性，更是成为了研究的热点。 1 3 4 麦角固醇 麦角固醇又称麦角甾醇，是维生素d 2 的前体，经紫外照射可以转变为维生 素d ：，有助于防治婴幼儿佝偻病及促进孕妇、老年人对钙和磷的吸收。此外，麦 角固醇还可用于生产“考的松”和黄体酮，是一种重要的医药化工原料。目前国 内外麦角固醇的生产一般来源于酵母菌。现在已有研究发现红曲霉属中的很多菌 株都能不同程度地产生麦角固醇，其中有些菌株的产量甚至接近目前工业生产中 所用酵母的发酵水平( 陈松生p 芒a - ，1 9 9 5 ) 。 1 3 5 红曲霉的其他代谢产物 红曲霉除能产生上述生理活性物质外，还能产生多种酶类、脂肪酸、有机酸、 抗菌活性物质等多种生理活性物质。 1 4 桔霉素与红曲产品的安全性 1 4 1 红曲中桔霉素的发现 1 9 8 1 年，香港中文大学的w o n g 等人从具有抗菌活性的红曲色素中提取出一 种抑菌因子，命名为m o n a s c i d i na ( w o n g k o e h l e r ，1 9 8 1 ) 。1 9 9 5 年，法国的 b l a n c 通过核磁共振、质谱、荧光等多种分析方法对分离到的同种物质进行定性， 发现m o n a s c i d i na 实为桔霉素( c i t r i n i n ) ( b l a n ce ta ，1 9 9 5 ) 。随后，各国 学者通过进一步研究，肯定了红曲及其相关产品中桔霉素的存在，红曲产品的安 全性因此而引起了世界的关注。 1 4 2 桔霉素的理化性质 桔霉素最早于1 9 31 年从桔青霉( p e n i c i l l i u mc it r i n u m ) 的代谢产物中分离 得到。纯品桔霉素为黄色针状棱形晶体，无味，分子式为c 。h ，。q ，分子量为2 5 0 2 5 ； 1 0 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 熔点1 7 3 一- - 1 7 4 ，难溶于水，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂中；在9 5 乙醇中呈黄色，加过氧化氢先褪色后变浅褐色，再加0 1m o l l 硫酸变为橙黄色， 再加0 2m o l l 氢氧化钠又恢复酒红色( 李云p 芒a j ，2 0 0 0 ) 。桔霉素结构式见 图1 - 4 。 图1 - 4 桔霉素的结构式 f i g 14 s t r u c t u r eo fc i t r i m n 3 1 4 3 桔霉素的毒理性质 桔霉素在发现之初是被作为一种抗生素来使用的，但经过深入研究后，发现 其毒性不亚于黄曲霉毒素b 。，于是转而被视为真菌毒素，生产上需要严格控制。 桔霉素的作用靶点主要是肾脏( c i e g l e re ta l ，1 9 7 7 ) ，可引起动物肾脏肿 大、肾小管扩张及肾脏上皮细胞变性坏死等症状。经口服或皮下注射，小鼠的半 致死量l d 。分别为l1 0m g k g 和3 5m g k g ，毒性属中等偏剧毒( 孟昭赫p 芒a ， 1 9 7 9 ) 。 桔霉素同时还具有致畸性，研究发现给发育4 天的鸡胚胎注射桔霉素后，胚 胎中的脚发生了变形( c i e g l e re ta l ，1 9 7 7 ) 。 此外，桔霉素可以在细胞中的线粒体内积累，降低呼吸链相关酶类的磷酸化 效率，造成线粒体膜内外电位差减小，进而影响到其他生理活动，如d n a 、r n a 及蛋白质合成受阻等等( 张徐兰e 芒a l ，2 0 0 7 ) 。 1 4 4 桔霉素在红曲霉内的合成途径 桔霉素与红曲色素均是红曲霉的次级代谢产物，且均为聚酮化合物。有研究 表明，它们在合成途径上有相关性，具有共同的前体。如图1 - 5 所示，1 分子乙 酰c o a 和3 分子的丙= 酰c o a 反应生成1 分子的丁酮后分开为两条途径，一条途 中山大学硕士学位论文 径继续与丙二酰c o a 反应生成己酮，最后形成红曲色素：另一条途径则是与乙酰 c o a 反应生成桔霉素的中间体，最后产生桔霉素。红曲霉内桔霉素的合成途径不 同于青霉属和曲霉属，在后两者中，桔霉素是以戊酮为前体，再进一步生成桔霉 素( h a j j a je ta l , 1 9 9 9 ) 。 丙二酰 c 0 2 乙酰c o a + 3 丙二酰c o a l聚酮合酶 丙二 c 0 2 戊酮、 己酮 i 1 l 红曲色素 曲霉或青霉 中间体 土 a s h 、上、 桔霉素 图卜5 红曲霉桔霉素合成途径 f i g 1 - 5s y n t h e t i ca p p r o a c ho fc i t r i n i ni nm o n a s c u s 1 4 5 桔霉素的检测方法 红曲产品中的桔霉素问题引起了世界的关注，各国纷纷加强了对红曲产品的 检测力度，尤其是欧美国家，对进口到欧美等国的红曲产品，必须要进行桔霉素 含量检测，甚至生产菌株都要进过鉴定。关于红曲产品中桔霉素的安全阂值，国 际上目前尚无定论。日本厚生省1 9 9 9 年版“同本食品添加剂标准”规定：色价基 准为5 0 0u g 的红曲色素其桔霉素含量不得超过o 2 g 。 目前检测桔霉素的方法主要有抑菌圈法，薄层层析( t l c ) 、高效液相色谱 ( t t p l c ) 及酶联免疫分析( e l i s a ) 。抑菌圈方法简单直接，能根据桔霉素对枯草 芽孢杆菌的抑制作用及抑菌圈的大小初步判断桔霉素的有无及含量的多少，但是 1 2 低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化 因红曲产品中还可能有其他抑菌物质( 如橙色素) 的存在而造成假阳性；薄层层 析法是常用的定性和半定量确定红曲中的桔霉素含量的方法，可以很容易地将桔 霉素用有机溶剂分离出来，操作也较为简单，但是由于色素干扰大，灵敏度不高； 高效液相色谱精确灵敏，重复性好，能较好地将桔霉素与其他物质分离开来从而 准确定量，但是样品前处理比较麻烦，且仪器设备也比价昂贵；酶联免疫法依靠 抗体的专一性结合桔霉素并定量，不存在因通过物理化学方法提取桔霉素而出现 部分损失的情况，灵敏度精确度均为最高，可检出纳克级别的桔霉素含量，但此 方法需要专一性载体，且载体制备复杂，费用也较高( 宫慧梅p 芒a l