（环境工程专业论文）壳聚糖固定化过氧化氢酶在清除卷烟烟气自由基等有害物质中的应用.pdf

摘要 过氧化氢酶是一种重要的抗氧化酶，对羟基自由基、超氧阴离子等自由基具有较好的 清除能力。本论文以壳聚糖固定化过氧化氢酶提高过氧化氢酶的稳定性及其在卷烟滤嘴生 产中添加的可操作性，从而达到以过氧化氢酶清除卷烟烟气中自由基的目的。 主要的研究内容与结果如下： 1 确定了壳聚糖固定化过氧化氢酶的固定化方案，对固定化过程进行了优化。固定化的 最优条件为：酶液( 过氧化氢酶酶活2 1 0 4 c i u m 1 ) ：3 壳聚糖溶液：交联剂= 6 ：2 0 ：1 0 0 ( v ： v ：v ) ，乙二醛浓度6 ( w v ) ，吸附时间0 5 h ，交联时间2 5 h 。 2 对固定化过氧化氢酶的性质进行了初步的研究：红外分析结果说明过氧化氢酶完成了 交联反应；固定化过氧化氢酶的米氏常数k m 从游离酶的3 0 3 m m o l ，l 增加到 6 1 7 衄o l 几，固定化酶对过氧化氢的亲和性明显下降；最适p h 值为7 o ，且在5 9 范 围均保持较高的酶活；其热稳定性和贮藏稳定性均得到了提高。 3 以紫外光一t i 0 2 催化自由基产生体系初步考察了过氧化氢酶清除自由基的能力。活性 过氧化氢酶对紫外光一t i 0 2 催化体系产生的自由基几乎能完全清除，而热灭活的过氧 化氢酶对此体系的自由基几乎不能清除。说明只有具有活性的过氧化氢酶具有清除自 由基的能力。 4 固定化过氧化氢酶对邻苯三酚体系产生的自由基同样有清除作用，9 m lo 2 m m o l l 邻苯 三酚溶液中，当加入固定化过氧化氢酶o 0 8 9 时，对其自氧化达到5 0 抑制。 5 以壳聚糖固定化过氧化氢酶为一种卷烟滤嘴添加剂，研究其去除主流烟气中自由基的 效果。当滤嘴中固定化过氧化氢酶添加量分别是1 0 、3 0 、5 0 m g 支时，气相自由基分别 减少了6 5 、9 9 和1 5 1 ：固相自由基分别减少2 3 、2 1 9 和4 0 8 。 6 采用机械干法添加的方式可以提高固定化过氧化氢酶对自由基的清除效率。1 0 m g 支的 机械干法添加的清除自由基效果为：气相自由基下降3 5 ，固相自由基下降2 2 4 。 7 考察了壳聚糖固定化过氧化氢酶对卷烟中其他有害物质的去除效果，包括烟碱、烟气 总粒相物( t p m ) 、焦油和烟草特有亚硝胺。壳聚糖固定化过氧化氢酶能明显的减少烟 气中总粒相物的量，在添加4 0 m 支时，t p m 的量小于1 0 m 支，降幅超过6 0 ；焦 油3 5 m g 支，下降7 7 8 ：添加量为3 0 m g 支时，烟碱从o 9 4 m g 支下降到0 6 8 m 支， 下降了2 8 ；t s n a 由0 3 7 “g ，支下降为0 2 7 “g 支，下降超过2 5 。 关键词：过氧化氢酶；壳聚糖；固定化；卷烟烟气：自由基；电子自旋共振光谱仪( e s r ) 江南大学学位论文壳聚糖固定化过氧化氢酶在清除卷烟烟气自由基等有害物质中的应用 a b s t r a c t t h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fc a t a l a s ep o w d e ri m m o b i l i z e db yc h i t o s a nu s e da sak i n do f c i g 盯e n ef i l t e ra d d i t i v cw a si n v e s t i g a t e di nt h ep r e s e n tp 印e l t h er e s u i t ss h o w e dt h a t ： 1 c a t a l a s ew a si m m o b i l i z e do nc h i t o s a nw i t hg l y o x a lb yc r o s s l i n k i n gr e a c t i o n 1 1 1 ec o n d i t i o n s f o ri m m o b i l i z a t i o nw e r eo p t i m i z e da sf o l l o w s ：3 c h i t o s 肌2 0 m l ，c r o s s 一“1 1 k i n gr e a g e n t l 0 0 m l ， e n z y m e6 m l ，t h ec o n c e m r a t i o no fg l y o x a l6 ，a d s o r p t i o nt i m e2 5 h ，c m s s l i n k i n gr e a c t i o nt i m e 0 5 h t h ea c t i v i t yy i e l do f t h ci m m o b i i i z c dc a t a l a s ew a s4 2 9 u ri h eo r i g i n a l 2 t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ei m m o b i l i z e dc a t a l a s es u c ha st h eo p t i m a lp h ，t h e m a ls t a b i l i t y ，a n d s t o r a g es t a b i l i t yw e r ea s s e s s e d t h ek m ，a ni m p o n a n tk i n e t i cp a m m e t e ro fe n z y m e ，w a so b t a i n e d a s6 1 7m m o i l 、v i t hl i n e w e a v e 卜b u i km e t h o d i m m o b i l i z e dc a t a l a s eh a st h es a m eo p t i m u mp h ( 7 o ) a st h ef r e ee n z y m e ，a n dt h ep hp r o f i i eo f “w a sb r o a d e rw i t hr e s p e c tt ot h e 舶ee n z y m e 3 t h es t i l d ys h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yc a t a l a s ec a i ls c a v e n g ef k er a d i c a li nw a t e 卜u v - t i 0 2 s y s t e m ，w h i l et h ec a t a l a s ed e n a t u r a l i z e db yh e a tn e a r l yc a n t ，w h i c hm e a n st h a to n l ya c t i v i t y c a t a l a s ec a ns c a v e n g e 行e er a d i c a l s 4 m o r e o v e r ，m ei m m o b i l i z e dc a t a l a s ew a sf o u n dt ob ea b l et or e m o v es u p e r o x i d ea n i o n 丹e e r a d i c “( s a f r ) p r o d u c e di np y r o g a l l i ca c i ds y s t e m 5 i tw a sf o u n dt h a ti m m o b i l i z e dc a t a l s ea d d e di nc i g a r e t t ef i l t e rc l e a r e da w a yf r e em d i c a l si n m a i n s t r e a ms m o k e t h ef r e er a d i c a l si ng a sp h a s ew e r ed e c r e a s e d6 5 ，9 9 a n d1 5 1 ，a n d t h a ti nt a rd e c r e a s e d2 3 ，2 1 9 a n d4 0 8 a st h eq u a n t i t yo fi m m o b i l i z e dc a l a l a s ea p p e n d e d w a slo ，3 0a n d5 0 m g c i g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn e er a d i c a l si nm a i n s t r e 锄s m o k ew e r e r e d u c e ds i g n i f i c a n t l yw i mt h ei n c r e a s eo fi m m o b i l i z c dc a t a l a s ea d d e d 6 i tw a so b s e n ，e dt h a ti m m o b i l i z e dc a t a l s ea d d e di nc i g a r e t t ef i l t e rc a nr e d u c eo t h e rt o x j c a n t s i nm a i n s t r e a ms m o k e t p m ，t a r n i c o t i n ea n dt s n a ，、v a sr e d u c e d6 0 ，5 0 ，2 8 a i l d2 5 ， r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ： c a t a l a s e ， c h i t o s a n ，i m m o b i l i z e ， c i g a r e t t es m o k e ， f r e e r a d i c a l ， e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e ( e s r ) i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： i 当：塾日期：厶以年6 月z 2 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 目前，世界上一些主要发达国家相继对市售卷烟的焦油、烟碱及c o 量做出了具体的 含量限制。例如欧盟从2 0 0 4 年1 月1 日起，焦油含量最多不得超过1 0 毫克，尼古丁含量 不得超过1 毫克，一氧化碳含量不得超过1 0 毫克。有关资料显示，早在1 9 8 0 年，美国卷 烟的平均焦汕台量就已降到了1 4 毫克，支，1 9 9 u 年美国卷烟的平均焦油含量则降剑，1 2 5 毫克支。在日本市场上，2 0 0 4 年卷烟的焦油含量更是降到了8 毫克支。同时，消费者自 身的健康和环保意识也有所增强。在此背景下，世界烟草业为了降低烟草制品对人类健康 的危害，更好地保护消费者的健康，已在包括烟叶生产、加工和卷烟降焦减害技术等领域 加大了研究力度；同时，国际卷烟市场也出现了加速向更低焦油、烟碱和低有害成分卷烟 发展的趋势。其主要的研究方向为选择性的去除卷烟中的有害物质，主要有一氧化碳、亚 硝胺、稠环芳香烃、自由基、挥发性醛类等。 生物技术、生物材料是世界烟草界的研究热点之一，在利用生物技术和生物材料降低 卷烟焦油和其它有成分方面已进行了一定的研究，并取得了一些实质性进展。 1 2 烟气中主要的有害物质 1 9 9 0 年，d h o f h n a n 和s s h e c h t 在烟草致癌物和致突变物研究进展一书中对烟 气主要有害成分作了归纳，列出了1 2 类共计4 4 种有害物质成分，通称h o 仃n l a l l 名单( 表 卜1 ) 。表1 2 列出了美国某一卷烟品牌主流烟气中主要有害物质的含量。 1 2 1 烟碱 烟碱又称尼古丁，学名l 一甲基一2 2 ( 3 吡啶) 吡啶烷，是一种存在于烟草中的天然的生 物碱，是烟草中特有的生物碱。烟碱在室温下为无色油状液体，无臭，味辛辣，见光或遇 空气会很快变成棕色的粘性物质，并带有特殊的臭味。 尼古丁对心血管和呼吸系统有直接的毒害作用，可引起呼吸加快、血压升高、心跳加 快、甚至心律不齐并诱发心脏病；破坏体内吸收的维生素c ，减弱人体的免疫能力：尼古 丁是吸烟成瘾的主要依赖物质。 1 2 2 焦油 焦油中含有的主要有害物质是多环芳烃，其中至少有1 7 种致癌物，如苯并【a 】芘、苯 并 a 】葸、二苯并 a 】蒽、苯并【b 】荧葸、苯并d 荧蒽、苯并 a 】菲等。燃烧一支卷烟可产生1 5 2 5 m g 江南大学学位论文壳聚糖同定化过氧化氢酶在清除卷烟烟气自由基等有害物质中的应用 焦油。实验证明，将焦油涂在兔子耳朵上，1 0 0 产生肿瘤。人体皮肤经常接触或者吸食 容易引起皮肤癌，肺癌等；而且焦油在人体中不易排出。 1 2 3 一氧化碳 一氧化碳是无色、无味的有毒气体。他随卷烟烟雾进入人体，能与血液中携带0 2 的血 红蛋白( h b ) 结合成稳定的碳合血红蛋白( c o h b ) 。由于c o 与h b 的结合力是0 2 的2 3 0 2 7 0 倍，因此，导致血液携0 2 的能力降低，组织和器官缺氧，引起头痛、恶心等症状。不吸烟 的正常人体内碳合血红蛋白的含量约为o 5 ，而吸烟者严重者可达1 5 - 2 0 ，使人体正 常的血液循环受阻，导致思维及判断力受到影响；增加心脏的负担，增加中风和心脏病等 的发病机会。 1 2 4 烟草特有亚硝胺 烟草特有亚硝胺t s n a ( t o b a c c os p e c m cn i t m s 锄i n e s ) 的研究最早始于2 0 世纪6 0 年代初，目前已鉴定出了8 种烟草特有的亚硝胺。其中的4 种：n7 亚硝基降烟碱( 1 叮n n ) ， n 亚硝基新烟碱( n a t ) ，n7 亚硝基假木贼碱( n a b ) 和4 ( n 甲基亚硝胺基) 1 一( 3 吡啶基) 一1 丁酮d n k ) 研究得最为深入。在4 种t s n a 中，n n n 是发现最早的一个。烟草中的t s n a 含量极微，一般浓度均在0 0 0 1 1 0 m 非g ，在这几种烟草特有的亚硝胺中，n a b 的含量最 小，约为n a t 含量的1 0 。卷烟烟气中的亚硝胺是导致癌症的重要原因；而且亚硝胺的 沸点较低，比多环芳烃类无之更容易挥发，污染环境，伤害人体；亚硝胺几乎在动物所有 的脏器和组织都可诱发恶性肿瘤。 1 2 5 自由基 卷烟烟气中的自由基可分为两种。一类是圃相自由基，其颗粒直径一般大于o 3 微米， 可以通过剑桥滤片收集：主要的自由基类别为：醌半醌类自由基、多环芳烃自由基、石墨 碳自由基和磷自由基；其中醌半醌类自由基约占8 5 ，此类自由基比较稳定，可以直接用 e s r 测定。每支卷烟烟气中可检测的固相自由基大约在1 o 8 o l o “个自由基自旋之间。 另一类是气相自由基，可随卷烟烟气穿过剑桥滤片，其主要的组成是烷基自由基和烷氧自 由基，每支卷烟烟气中可检测的气相自由基含量一般在1 0 ，2 0 1 0 1 4 个自由基自旋之间。卷 烟烟气自由基的反应性很强，可以直接对旺i - 抗蛋白酶作用，使其失活，造成肺部的损伤： 烟气中的自由基同样具有很强的氧化性，可以直接引起细胞膜质脂过氧化，使细胞膜的动 力学性质和蛋白质的构象发生变化。 笙二童竺丝一 表1 1 卷烟烟气有害成分h o 胁a n 名单 1 _ a b l el _ 1t h eh o 疗- m a nl i s t 序号类别 名称 氨 4 种芳香胺 苯并 a 芘 8 种醛酮类化合物 氢氰酸 7 种重金属 氮氧化物 c o 焦油 7 种酚类物质 氨 1 胺基萘、2 一胺基萘、3 胺基联苯、4 胺基联苯 苯并【a 芘 甲醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、甲基乙基酮、巴豆醛、 丁醛等 氢氰酸 n i 、p b 、c d 、c r 、a s 、s e 、h g n o 、n o x c 0 焦油 苯酚、儿茶酚、间苯二酚、对苯二酚、o ，m ，p 一甲基苯 酚等 1 14 种亚硝胺n n n 、n n k 、n a b 、n a t 1 2 8 种挥发性有机成分 吡啶、喹啉、1 3 j 二警戊二骶丙烯腻苯乙 表1 2 美国某一品牌卷烟的有害物质的含量( 2 0 0 4 年) 1 a b l e1 - 2t h e 叫u r a n tc o n t e n ti nm a i n s t r e a ms m o k eo f o n eb r a n dc i g a r e n ei nu s a ，2 3 4 5 6 7 8 9 m 望堕查兰兰堡堡苎 塞壅塑里塞些苎墨些墨堕垄塑堕堂塑塑皇! 鱼苎箜塑宣塑堡塑壁旦 续表1 2 丁二烯( 腿c i g ) 4 0 o4 6 4 8 93 1 o 2 2 异戊二烯( 腿c i g ) 3 5 93 8 4 3 32 8 5 2 1 苯乙烯( 雌c i g ) 7 10 5 8 o6 21 3 甲苯( c i g ) 6 3 95 57 4 8 5 3 01 7 氢氰酸( c i g ) 1 2 2 98 61 3 9 91 0 6 o 1 4 硝酸盐类( 地c i g ) 2 9 5 1 43 2 3 2 6 79 氮氧化物( c i g ) 3 0 81 6 3 4 02 7 7 1 0 甲醛( p g c i g ) 2 0 83 7 2 8 o1 3 73 4 氨( c i g ) 1 3 4o 61 4 6 1 2 19 苯 a 并吡 6 9 5o 3 37 6 6 2 99 ( n g c i g ) 苯 a 并蒽 ( n g c i g ) 儿茶酚( c i g ) 3 7 6 3 04 3 43 1 8 1 5 m ，p 一甲酚( 唁c i g ) 7 8o 7 9 26 4 1 8 q 一甲酚( 腿c i g ) 3 2 0o 3 43 8 7 2 5 3 2 1 对苯二酚( 盹c i g ) 4 0 3 2 94 5 9 3 4 71 4 苯酚( c i g ) l o 41 6 1 3 57 3 3 0 间二苯酚( c i g ) o 7 2o 2 0 1 1 1o 3 25 5 嘧啶( 垤c i g ) 7 6 o 89 1 6 12 0 喹啉( 糖c i g ) o 3 00 0 2 0 3 40 2 5 1 5 n n n ( n g c i g ) 1 1 5 41 4 9 1 4 4 78 6 22 5 n n k ( n g c i g ) 9 1 71 2 6 6 1 2 4 2 5 9 13 5 n a t ( n g c i g ) 1 3 2 41 6 2 1 6 4 11 0 0 6 2 4 n a b ( n g c i g ) 2 5 7 6 73 8 9 8 1 2 65 1 镉( n g c i g ) 6 4 42 9 7 0 05 8 8 9 铅( n g c i g ) 3 6 7 1 53 9 6 3 3 78 水银( n g c i g ) 5 5 0 56 5 4 51 9 砷( n g c i g ) 4 7 o 86 23 1 3 3 1 3 卷烟添加剂的研究进展 1 3 1 活性炭 活性炭是国内外烟草行业研究应用最早的滤嘴添加剂之一，在2 0 世纪5 0 年代美国烟 4 兰二兰笙堡 的份额约为7 。1 2 1 目前活性炭滤嘴卷烟的主要市场有日本、韩国、匈牙利、俄罗斯和委内 瑞拉，活性炭滤嘴已经成为特殊滤嘴市场中增长最快的。 活性炭可以选择性的滤除2 0 多种烟气有害物质，包括甲醛、乙醛、重金属元素和放 射性元素。国外对活性炭探究较早，其中f i t t o n a 公司m j 通过多年研究，该公司先后推出 了多种活性炭滤嘴如二元复合同芯活性炭滤嘴和多功能活性炭滤片滤嘴等。2 0 0 2 年布朗- 威廉姆森公司【7 】在美国推出的“a d v a n c el i g h t s ”牌卷烟接装的新型活性炭滤嘴“t r i o n i c f i l t e r ”三元复合滤嘴。该滤嘴的各段均为二醋酸纤维滤嘴，但其第l 段( 靠近烟丝段) 和第2 段( 中间段) 中分别含有离子交换树脂和特制的活性炭颗粒。吸烟过程中，当烟气流过第 1 段滤嘴时，烟气中的一部分粒相物被二醋酸纤维机械过滤，同时眷烟滤嘴中的离子交 换树脂与烟气中的半挥发性成分如甲醛、乙醛和氰化氢发生反应，使这些烟气成分在通过 第l 段滤嘴后均被截留了一定的比例。烟气流过中间段滤嘴时，滤嘴中的活性炭继续吸附 烟气中的醛类和其它成分如丙烯醛、苯和甲苯，同时又有一部分粒相物被这段醋纤滤嘴截 留。烟气在流过第3 段滤嘴时，烟气中的粒相物再次被醋酸纤维所截留。因此，烟气在流 过“t r i o n i c 滤嘴后，烟气中的有害物质就被有选择性地大幅度降低。报道声称，“a d v a l l c e l i g h t s ”卷烟的氰化氢、甲醛、苯和丙烯醛分别降低6 2 6 5 、3 3 4 0 、3 6 5 0 和 3 6 5 2 。 国内对活性炭国内对活性炭滤嘴的研究起步较晚，研究人员如娄性义嘲等用活性炭粉、 刘颖涛等9 1 采用进口的活性炭纤维素、胡群等1 m 1 1 1 采用进口滤棒和浦跃朴等采用国产卷 烟从不同的角度研究了活性炭滤嘴的作用，并取得了一定的进展。 1 3 2 硅铝酸盐等无机类添加剂 无机类添加剂中硅铝酸盐是研究比较多的一类以吸附卷烟烟气中有害物质为主的添 加剂，一般包括经过改性的天然材料如海泡石、膨润土、麦饭石、沸石和凹凸棒石等和合 成材料如分子筛等。 1 3 2 1 天然材料 董有等【l3 】研制的以海泡石为添加剂的醋纤二元复合滤嘴卷烟的焦油和烟碱比单段醋 纤滤嘴卷烟分别降低1 9 和2 8 ，且其香味、杂气、刺激性和余味均与普通醋纤滤嘴卷烟 接近。惠博然等1 1 4 j 的实验结果显示，蒙脱石对强极性有毒卷烟烟气物质的吸附量较大，而 对非极性的香味物质吸附很少。高文全等【”】用麦饭石和茶多酚作添加剂，在不影响卷烟吸 味和常规指标的情况下，可使卷烟主流烟气中的自由基由对照的( 2 2 士o 1 0 个，支降低至 ( 1 钍o 1 ) 1 0 个支，并使焦油降低2 4 6 。一项欧洲专利【1 6 】提出，在滤嘴棒中添加特制的疏 水性沸石或沸石分子筛，可以降低烟气中t s n a s 的含量。于建军等【1 的研究结果表明，麦 饭石对卷烟烟气t p m 的过滤效率 5 0 麦饭石+ 3 0 提纯膨润土+ 2 0 膨化蛭石 提纯膨润土 活性炭，且麦饭石与活性炭的差异达到了显著水平。李东亮等【1 8 】报道，含凹凸棒石的滤 嘴( 1 5 m g 支，9 0 0 目) 可使卷烟焦油降低1 4 m 支，c o 降低1 1 m g 支，而且烟碱比变化不大， 卷烟原有的吸味风格并未受到影响。 1 3 2 2 人工材料 e 竖堕盔兰兰壁兰茎 查鍪壁塑塞些苎墨些壑堕垄堕坠堂塑塑墨鱼虫茔竺宣宣塑堕! 竺生旦 赵素琴等【9 1 以水玻璃、氢氧化钠和氢氧化铝为原料在一定温度和压力下制备的添加 剂，作为吸附剂，可使卷烟烟气中的乙醛、丙烯醛、苯、甲苯和二甲苯降低4 0 5 0 以 上焦油和烟碱分别降低3 0 4 6 和2 8 4 8 。刘立全等【驯用自制的硅酸铝制备的三元 复合滤嘴的试验结果表明，在卷烟吸阻接近的情况下，自制硅酸铝滤嘴的过滤效率不仅高于 同样长度的醋纤、活性炭和麦饭石滤嘴，而且日本j f t 本社和郑州烟草研究院专家的评吸 结果也均表明，“就整体平衡而言，自制硅酸铝三复合滤嘴优于活性炭和麦饭石滤嘴”。李绍 民【2 1 1 称，将用铜离子改性的n a y - 1 型沸石分子筛加入滤嘴( 4 0 m g 伎) 中，卷烟焦油降低3 6 。 而后，吉林大方经贸有限公司和郑州烟草研究院合作1 2 2 。】对李绍民的n a y 分子筛进行了应 用实验，结果显示，与对照相比，含改性n a y 分子筛的二复合滤嘴不仅使卷烟焦油和烟碱 各降低2 3 2 3 1 7 和2 3 2 3 4 0 ，同时还使烟气中的苯系物、b a p 、3 种p a h s ( b a p 、 苯并 a 】蒽) 、酚类和t s n a s 总量分别降低3 4 8 4 6 3 、2 5 0 2 8 o 、2 4 3 2 7 7 、 2 1 7 2 8 5 和2 8 6 7 2 o 。 1 3 2 3 无机催化剂类 s t a n f o r d 研究所【2 4 1 提出以某些金属催化剂为滤嘴添加剂，降低卷烟烟气中的c o 。 s e e h o f e r 等f 2 5 j 称，以m 2 m r u 0 6 ( m 是二价金属离子，m 是三价稀土金属，r u 是五价离子) 为 催化剂，利用烟气中n 0 和c o 自身的反应，可使烟气中c 0 和n o 的含量各降低1 5 4 3 和 3 6 7 3 。g a l l a l l e r 公司【2 6 l 发明了一种可在低温下将c 0 催化氧化为c 0 2 的滤嘴添加剂，该 添加剂是将c r 、s n 等贵金属、过渡金属以及、族金属以微晶( 多晶颗粒) 的形式高 度分散在载体( 分子筛、硅藻土等) 体系中制成的。项美国专利【27 】称，含负载v 2 0 5 、m 0 2 0 3 或r h 2 0 的活性炭或其他过滤材料的滤嘴，也可使烟气中的c 0 ，氧化为c 0 2 。崔文艳等 提出，用一种无机单质氧化物( 某种空气净化剂) 作为滤嘴添加剂，可使卷烟焦油和c o 分别降低2 0 3 0 和1 5 2 0 ，同时还使卷烟烟气中的苯、甲苯和二甲苯含量明显降低。 聂聪等l 及长沙卷烟厂【3 0 1 研究发现，加入中等粒度的含有助剂纳米a u 催化剂( 3 5 m 支) 二 元复合滤嘴，可使卷烟烟气中的c 0 量降低4 4 6 ，同时还使卷烟烟气焦油和烟碱各降低 3 9 8 和5 8 并基本上保持了卷烟原有的风格和吸味。2 0 0 2 年c v e t k o v i cn 等报道，将 粒径为1 5 岬的c u z s m 5 沸石粉末与丙二醇和9 5 乙醇制成悬浮液，然后分别加入卷烟烟 丝和滤嘴中。结果表明，加入烟丝中，烟气中的n o 和n 0 x 分别降低3 7 1 和1 6 0 ，加入 滤嘴中则各降低了5 6 2 和1 2 9 。 1 3 2 4 其它 h s uc h i h s u e h 等1 3 2 j 在滤嘴中添加k a l ( s 0 4 ) 2 ( 1 0 2 0 0 m g 支) ，可以去除烟草烟气中的烟 碱和其它有害物质。德国的一家公司【3 3 j 和e a s t m a l lk o d a k 公司【3 4 l 称，含二元或三元羧酸或 其酸酐的滤嘴或负载柠檬酸的二醋酸纤维卷制的滤嘴均可降低烟气中的烟碱和其它碱性 有害物质。d a i m i n gk u o 口5 j 提出，在卷烟滤嘴中加入水合氯化铁氯化亚铁的复盐，可以降 低烟碱对吸烟者呼吸道内粘膜的毒害。b r o 、v p ecl 等【3 6 】宣称，将硫酸、硝酸和乙酸的铁、 铜、钴、锌、镉、镍、镁和汞盐单独或混合加入滤嘴中，也可以选择性地除去烟草烟气中 的烟碱。b a t 【3 q 介绍，在卷烟滤嘴中加入某种碱性材料，添加量是卷烟滤嘴重量的1 2 可以提高卷烟烟气的劲头。“g g e t t l 38 】发现，在滤棒中添加不溶于水的碱土金属硫酸赫( 如镁 6 兰二童堕丝 盐、钙盐、锶盐或钡盐) 和某些过渡金属的碳酸盐( 如钴盐、镍盐、铜盐、锌盐) 可有效除去 烟气中的氰化氢。d e n n i s 等口9 】将高锰酸钾、二氧化锰加入滤嘴中，用氧化方法除去卷烟烟气 中的n o 。l e l a h 等【4 0 】以聚乙二醇衍生物为分散剂，将氧化锌( 或醋酸锌) 加入到滤嘴中，可 以选择性地除去卷烟烟气中的n o 及其它氮氧化物。最近，菲莫公司1 4 lj 发明一种可高效选 择性地降低目标烟气有害成分的新型滤嘴，该滤嘴所用的纤维具有开口或半开口的微小空 腔，空腔中嵌有粒径为l 5 0 “m 的固体颗粒吸附剂如活性炭和硅胶等。 1 3 3 生物类添加剂 所谓生物类添加剂，足指具有生物活性的动植物提取物。2 0 世纪8 0 年代仞，日本学 者市川清司【4 2 j 发明了一种含有浸渍螯合亚铁离子的原卟啉类化合物溶液的多孔性物质( 如 活性炭) 的滤嘴，可有效去除烟气中的c 0 、苯并 a 】芘( b a p ) 及其衍生物等。张爱华1 4 3 】的试 验结果表明，添加血红素的滤嘴( 血红素浓度为1 ，0 m m l 、剂量5 0 此支和温度3 0 ) 可使 卷烟焦油降低1 7 0 0 。希腊的约安尼斯斯塔夫里迪斯等】通过对生物滤嘴的详细研究发 现：1 丝束或活性炭浸渍血红蛋白的滤嘴可使卷烟烟气中的有害物包括n o 、n o x 、亚硝基 化合物、自由基、c 0 、醛类和痕量元素各降低9 0 以上；2 转铁蛋白、过氧化氢酶、原卟 啉和细胞色素c 也是一类有效降低卷烟有害烟气成分的生物材料。我国的科技人员同样进 行一些研究，现在一些卷烟厂已把生物滤嘴应用于卷烟上。如郑其岚【4 司将叶绿素类物质、 丙酮和无水乙醇与三醋酸甘油酯一起加入滤棒中，能有效滤除卷烟烟气中的致突变物致癌 物如b a p ，减少吸烟对人体健康的危害。戴亚等【4 6 】发现，将由鸡血提取的血红蛋白加到卷 烟滤嘴中，可使卷烟烟气中的n 亚硝胺降低5 0 左右。云南烟草科学研究院等【47 j 的实验 结果表明，通过用某种有机高分子聚合物的溶液浸渍活性炭，提高了活性炭的表面活性及 其对焦油和c 0 的吸附作用。深圳卷烟厂”州利用进口三元复合生物滤嘴研制出“金尊好日 予”牌卷烟。该滤嘴的近嘴段为普通醋纤滤嘴，近烟丝段是加入活性炭的醋纤滤嘴，二者中 间的空腔中装满浸溃血红蛋白的活性炭。其烟气分析结果表明：与对照相比：1 焦油和烟 碱的降低并不十分明显：2 b a p 、亚硝胺、甲醛、乙醛、丙烯醛和其他苯类有害成分大幅度 降低，降幅平均在3 0 左右，远远高于焦油的降幅：3 c o 几乎没有降低，与约安尼斯斯 塔夫里迪斯等的测定结果不一致。宝鸡卷烟厂f 4 9 】研制出对t 生物滤棒，可选择性地吸附焦 油、c 0 和重金属等有害物质，且不会使烟碱同步降低。孟仟祥【5 0 】称，以s i 0 2 + a 1 2 0 3 为载 体、山梨醇苷或木糖醇苷为稳定剂、d 环糊精或纤维素共同组成的具有生物活性的滤嘴添 加剂，可有效地消除烟气中的苯核类化合物，尤其是p a h s ，并可降低焦油。美国t h i o n e 公司( t h i o n ei n t e m a t i o n a li n c ) 川宣称，当卷烟、雪茄、斗烟或无烟烟草、卷烟滤嘴( 复合滤 嘴的近烟支段或近嘴段) 和卷烟纸中加入包括谷胱甘肽( 最好是l 一谷胱甘肽) 和抗氧剂催 化酶与过氧化物歧化酶源在内的抗氧化剂时，能清除和中和烟气中的自由基，同时也能减 轻自由基对吸烟者口腔、咽腔、呼吸道和肺的损伤。e m a m ia k b a r 等【s 2 】介绍，在卷烟滤嘴 中加入多酚类及其衍生物，可以清除卷烟烟气中的自由基，这些清除剂可以通过化学方法、 生物技术或从植物提取物中得到。最近，l e s s e r 等【5 3 】发明一种含多孔性载体的滤嘴，这种 翌堕查兰兰堡堕苎塞塞塑旦窒垡塾墨些塾堕垄塑堕堂塑塑墨! 虫董箜塑童望堕! 竺壁旦 多孑l 性载体一种卟啉，也可包含微胶囊或焦谷氨酸钠，微胶囊中可包含一种或多种选自于 叶绿酸、甲基纤维素、焦谷氨酸钠和植物油的物质。 1 4 本论文的研究思路和主要的研究内容 本课题属于国家烟草专卖局科技计划项目生物技术改进烟用醋纤丝束的技术研究与 应用( 合同号：1 1 0 2 0 0 3 0 2 0 3 1 ) 的一部分。过氧化氢酶是一种重要的抗氧化酶，对羟基自 由基、超氧阴离子等自由基具有较好的清除能力。本论文以壳聚糖固定化过氧化氢酶提高 过氧化氢酶的稳定性及其在卷烟滤嘴生产中添加的可操作性，从而达到以过氧化氢酶清除 卷烟烟气中自由基的目的。 本论文的具体研究内容： 1 确定壳聚糖固定化过氧化氢酶的工艺路线，确定固定化的最佳条件。 2 验证过氧化氢酶的清除自由基的能力和机制。 3 确定卷烟烟气自由基的测定方法，研究固定化过氧化氢酶对卷烟烟气中自由基的 清除情况。 4 研究固定化过氧化氢酶对卷烟烟气中其他有害物质的吸附去除效果。 第二章壳聚糖固定化过氧化氢酶的研究 2 1 引言 第二章壳聚糖固定化过氧化氢酶的研究 过氧化氢酶( c a t a l a s e ，简称c a t ) ，又称触酶，是一种高效，安全，无毒的生物催化 剂，是一种含有四个铁原子的铁卟呤酶，通过其中的血红素功能基团，能够快速催化双氧 水分解为水和氧气，是目前了解的抗活性氧生物活性物质之一。 过氧化氢酶的固定化研究国内外已自不少的报道，主要的崮定化材料包括无机金属化 合物【5 4 5 5 1 ( 氢氧化铝、氧化铁等) 和改性生物材料【5 6 5 8 1 等，形成的固定化产物有微胶囊化 和膜化过氧化氢酶等。s i l g i a 【5 9 。删以氢氧化铝为载体固定化过氧化氢酶，提高了酶对热和酸 碱的稳定性；刘持标1 6 l j 利用乙基纤维素作为膜材，加入一定量的明胶后，制备了较稳定的 微胶囊化过氧化氢酶。从目前研究结果看，固定化有利于提高过氧化氢酶的稳定性，并提 高其实际应用价值。但是目前研究所用的固定化材料多为金属类物质和化学合成材料，限 制了其在食品行业中的应用。 壳聚糖是从虾、蟹等甲壳类动物的外壳提取的一种胺基多糖，分布极其广泛，每年的 产量仅次于纤维素，其学名是b ( 1 ，4 ) 2 一乙酰氨基2 脱氧一d 壳聚糖【6 ”。壳聚糖具有如下特 性：生物相容性、生物可降解性、无毒性、无生理活性、亲水性、对蛋白质高度的亲和性、 化学性质稳定、制备简单、耐热【6 3 j 等。因此它是一种非常好的固定化酶的载体。 本文选择壳聚糖为固定化载体，通过吸附、乙二醛交联的方法固定化过氧化氢酶。对 固定化条件和固定化过氧化氢酶的性质进行了研究，目的是得到稳定性较好的固定化过氧 化氢酶，以期成为一种可行的卷烟滤嘴添加剂。 2 2 材料和方法 2 2 1 材料与仪器 过氧化氢酶 3 0 过氧化氢 2 5 乙二醛 焦磷酸钠 壳聚糖 r e 5 2 c s 旋转蒸发仪 j b 5 0 d 增力电动搅拌器 u v - 7 5 0 0 紫外分光光度计 n e x u s 富立叶变换红外光谱仪 a r a r a r 2 1 0 5 c i u m l 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 食品级 上海本波仪器有限公司 上海标本模型厂 上海天美科学仪器有限公司 t h e r m on j c o l e tc o 9 江南大学学位论文壳聚糖同定化过氧化氢酶在清除卷烟烟气自由基等有害物质中的应用 p l 2 0 0 2 电子天平m e t t l e r 2 2 2 过氧化氢酶酶活的测定 2 2 2 1 游离过氧化氢酶：采用n o v e n z y m e 公司的测定方法。 计算公式为： a m g = 蔫斋 其中： k h 2 0 2 的分解量3 4 5 u m o l v _ 一样品稀释的容量m l d 一稀释因子 r 一时间( m i n ) v 。r 酶稀释液的体积，取o 1 m l w 一称量样品酶的重量( 曲 2 2 2 2 固定化过氧化氢酶 0 1 9 固定化过氧化氢酶加入到0 0 5 m 的过氧化氢0 1 m o l lp h = 7 o 磷酸缓冲溶液中， 反应l m i n ，过滤去除固定化过氧化氢酶。在过氧化氢特征吸收波长2 4 0 n r n 处测定吸光度 值变化，求得酶活。 2 2 3 过氧化氢酶的固定化 2 2 3 1 交联剂的制备 乙二醛溶液在8 0 恒温水浴内活化1 0 m i n ，冷却至室温后，与等体积的3 焦磷酸钠 混合。 2 2 3 2 壳聚糖溶液的制备 取9 0 0 9 壳聚糖加入蒸馏水3 0 0 m l ，搅拌1 0 m i n ，充分浸润后，加入冰醋酸3 m l ，持续 搅拌3 h 。 2 2 3 3 过氧化氢酶的固定化过程 将过氧化氢酶液( 酶活2 1 0 4 c i u m 1 ) 加入到壳聚糖溶液中，搅拌均匀，放于4 冰箱 中，进行吸附反应。然后将此溶液缓慢地加入到交联剂中，在冰浴、搅拌条件下，进行交 联固定化反应。然后抽滤，用等体积0 1 m o l 几磷酸缓冲液洗涤三次以去除残余的乙二醛， 得到固定化过氧化氢酶样品。 0 第二章壳聚糖固定化过氧化氢酶的研究 2 3 结果与讨论 2 3 1 过氧化氢酶固定化条件的优化 2 - 3 1 1 吸附时间的确定 分别取6 份2 0 m l3 壳聚糖溶液，各加过氧化氢酶液6 m l 。在4 条件下，分别吸附 o 5 、1 o 、1 5 、2 o 、2 5 h ，其他固定化条件为：乙二醛浓度6 ( w v ) ，交联剂用量1 0 0 m l ， 交联时间2 5 h 。测定固定化过氧化氢酶酶活，结果如图2 一l 所示。 6 0 0 0 儡4 5 0 0 邑4 0 0 0 辩 匿2 5 0 0 o 5ll522 53 吸附时间( h ) 图2 1 吸附时间对固定化的影响 f i g u r e2 一l t h ej n 门u e n c eo fa d s o r p t i o n t i m eo ni m m o b i l i z e de n 2 y m ea c t i v i t y 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 o 511 5 2 2 53 交联时间( h ) 图2 2 交联时间对固定化的影响 f i g u r e2 2t h ei n n u e n c eo f a d s o r p t i o n t i m eo ni m m o b i l i z e de n 珂m e 由图2 1 可知，固定化过氧化氢酶酶活随吸附固定化时间增加而增加，当达到2 h 时， 酶活达到最大值，这可以认为2 h 后壳聚糖对过氧化氢酶吸附作用达到平衡。当吸附时间 再增加时，由于壳聚糖溶液( p h4 6 ) 对过氧化氢酶( 最适p h 为7 o ) 有一定的影响，在 较长时间低p h 条件的作用下，过氧化氢酶可能发生了变性失活作用而使总酶活、吸附固 定在壳聚糖上的酶活下降。因此，确定适宜的吸附时间为2 h 。 2 3 1 2 交联时间的确定 固定化反应中选择的交联时间分别为0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 h ，其他固定化条件为： 3 壳聚糖2 0 m l ，过氧化氢酶液6 m l ，吸附时间2 o h ，乙二醛浓度6 ，交联剂用量1 0 0 m l 。 结果如图2 2 所示。 结果表明，随着交联时间的增加，固定化过氧化氢酶活降低较快，说明交联反应体系 对过氧化氢酶有较强的变性作用，因此采用的交联时间应较短。由于本固定化过程采用的 交联剂中含有焦磷酸钠，其主要的作用是使壳聚糖凝胶化，形成凝胶固体，从而可以制备 得到颗粒状的固定化过氧化氢酶，此反应过程大约需要o 5 h ，因此确定最佳交联时间为 o 5 h 。 2 3 1 3 乙二醛浓度的选择 交联剂中乙二醛的考察浓度分别为2 、4 、6 、8 、l o ，1 2 。其他固定化条件 为：壳聚糖2 0 m i 过氧化氢酶酶液6 m l ，吸附时间2 0 h 交联时间0 5 h ，交联剂用量1 0 0 m i 。 f1d妪萋匦 坚堕盔兰兰堡垒奎 塞塞堡里塞些婪墨些蔓堕垄堕堕堂塑塑皇鱼虫茎量塑宣望堕主堕壁旦 结果如图2 3 所示。 裔 昌 8 烬 避 基 删 匦 图2 3 乙二醛浓度对固定化的影响 f i g u r e3t h ei n 门u e n c eo f g l y o x a l c o n c e n a t j o no ni m m o b i l i z e dc a i a l a s ea c t i v i t y 4 06 08 01 0 0 1 2 0 1 4 01 6 0 交联剂用量( m 1 ) 图2 4 交联剂用量对固定化的影响 f j g u r e2 - 4t h ei n n u e n c