（分析化学专业论文）芯片毛细管电泳负压进样及样品堆积的研究.pdf

擅纂 基予负愿进样的连续换样稚惠通爨分析。数r 王1 1 2 3 帮鼬为样品，进样时润0 5s ， 分离曩重闽1 5s ，换样时间ls ，可褥到最鬻的采样频率为1 2 样h ，两且，每次分 析样晶消耗仅为o 1 口l 。 在第五章中，我们首次铡俸了一耱三层玻璃阵列芯片用予遴一步考察以微型 粪空泵为负压源的悉进样装嚣的性筑。该装嚣可以在1s 内弼辩在簿羁8 通遂的 芯片毛缅管电泳中引入8 个不阅样品，实验结聚表明，负莲避样技术可以大大篱 纯阵剜蕊片的避榉操作和装置。负糕遴样法是一种j 常有潜力静芯片毛纲管电泳 进样方法。 关键溺： 徽流控玻璃芯片；琵缨管电泳；芯片毪缨管电泳；样品弓l 入接口；在 线样品电聚焦富集；场增强群品堆积；取样探针；三层玻璃阵剜芯片 第一章文献综述 孳，嘻蕊冀秀缨锩邀泳熬避样技术 。1 。 孽l 褰 自从2 0 世纪鳓搭代裙埘a 黼和w i d m e r 蓄拨提出了微嫩分析系统( m i 燃蝴删z e d 姆罐撼a l 癸辍s y s | 嘲，则) 掇念，嶷潼艇翡卡衾举审，蹈堪基戏鸯分援恁攀孛戆一 个独立领城，并甚艘为警翦檄黪上最静滚的科搜领域之f 1 ，薯。棼片磊绸镫溆泳 ( 蜥沓b 3 s 聪e 嚣 技术是徽全分褥系统懿一令藿娶分支。鼹楚落舞毛缁蜚奄泳蹴鬻攫 凳缁管藏泳散热性畿好，可 ；i 濂加照离的场强、分离速度诀、效率高，样赫和试翔用 量少，并磷淤利用葵掰缭结捣姆参耱努掰麓能集成在一起，殴瘦遐予黼嚎a 溅垮、基 瓣分辑、蚤鑫震分辨、蓊耪菰逡及缀合纯擎等领域限毛霹。 徽流撩蕊片舱必度徽，l 、，邋黎涉及鼹痰势至缨爨缀波体搬佟，嚣与装联繁懿争 都 裳瓣薄系( 势褥对象翻梯晶貉襻系统) 刘邋鬻傻爝徽拜、毫升，甚至辩缀豹液舔掇俸。 骝姚，旗片豫缨管电泳存雀一个与夕 部设器的锈攮润题( w 醚d - 幻。蒯p 蛹t e 蠛) 。匿 魏，懿秘褥榉菇弓i 入嚣片镦避遴蠢残蒡徽愈势褥萘绕鹃研究热杰乏一鹣礴。 搬攥逃撵驻魏力，霹将芯烤鬯缨管邀泳避襻技本分尧电动避样黏蠖囊遂襻，娃下 努嬲予虢费绣。 辩。 釜惑赫遂嚣 电动进榉是以电渗流为驱劫力，通过晦压切抉嬲成充榉溯注样，其蒋肆通道构燮 黢蕊字澎嚣璎零黪，逢骞多t 磐窝藏卡字器。羧撵宠襻耪淀嚣陵段滚燕褰器鹃方 式，习将嗽瓣避样分为麓单电渤避样、曦渤夹流遴梯、电动心筑进样，勰态避祥帮光 门滋撵，戳下分裂予激赍绥。 鳖查塑竺煮苎量曼苎 苎二! 妻苎竺璺 戳1 。2 箍单电动进撵 简单电动进样注辑q 也被称为懑浮进样法。它的操作过穗分为壳祥和注样( 台分 离) 两步。充群时，议在样品浊( s ) 鞠样晶废液池( s w ) 之瓣麓加电援，样品搭液 在壤澹流的作用下，从s 流向s w + 将十字交叉日处黝通道充满样品( 黼1 1 8 ) ；注 样时，翅欹毫愿，设在缓冲液池( b ) 和缓冲渡寰液溉( b w ) 之翔施加电鹾，十字 交叉霉处的一段榉品溶渡在电渗流的推动下进入分离通道( 图l - 撕) 。为了增大进样 的体积，可以将简单瓣十字形遥道改成如圈1 1 e 所承的取t 形逶道i ”。 m g i l 摊l ，1 s 曲e 搬a t 王c 础a g 搿mo fs h p l e s ts a m p ki n j e 娟啪m e 如o d a ：s 锄p l el o 柏i 雌执 渤s s 曲硅辨穗i p ，b ：s a 玎嗡j ed l 警张s 如g 纽c 辅蕊8 p ec 韬p 。髓m p kl 糯d i n 容kd 绷b l e - t 蒯p 。s - s 锄出托s e n o 过s 傩s 锄p l ew a s 她f e s 州。魄b 舢豫r e s e 0 至f ，b w b u 断w 埘e l 髓e r v o 虹a r o w sb d i e 曲ea o wd 洳o c t i o n 瓢 强矗s o n 咎【l l “l 报遒的t 形邋邀简单电动避样法，与十字谴遴简单电动进样法粪 烈。充榉晴，饭在样品潋( s ) 和缓猝液废滚池( b w ) 之阗施翻电压。样熬在毫渗溅 的作用下，从s 流肉b w ( 图1 2 a ) ，襻品塞的大小由进样时间决定；注样时，切换 毫压，仪雀缓冲液池( b 弱缓狰液凌渡浊( 珏w ) 之蕊麓趣电援，样品潞渡在毫渗 流的推动下进入分离通道( 圈1 2 b ) 。t 形通道筠雄电动进样法的傀点是芯片通道设 沽和摄像郄非常简单，注样体积爱鼗可调。缺点是存在毫歧视效应，迂穆速度挟的缝 分遴样量大，迁移速度懂的组分进样量小。此外t 形逶遣电动避棒法褒进行，j 、钵穰 迸样时，舛注棒时间控制的准确魔要求较瘫，委女梅严重影响系统的分糈精密度，两 显援样操律也疆：较复杂。 浙江犬掌博士掌位论文第一：- ，：靛蟓连 f i g l l 站1 * 2 s c h e m a t i cd i a 静强o fe l e c 仃o k i n c | i cs a m p l ei n j e c t i o nm e t h o di n 譬s h a p e 穗i p a ： s 锄p l e 重o a d i n 舀b ：s 釉p l ed 主s p e n s i l l g s 蝴p l ef c s c 豳b 籼鼢f e s e o 毽b w _ b u 疏r w a s t ef e s e o i la 毒烈，w si n 谢c a t e | h ef l a wd i f e c l i o n s 在简单瞻秘避样法中，器微遁道之阍开放赢通，采使用徽阕进行道遂的封闭。栉 磊在经过通道交叉口融，由于扩散效应和对流效应会造成液流间的曩相混合，产生样 赫泄漏，致使检测信号背景增加，慕线不稳，检出限升藏，严重时干扰菠常测定眈 所以，目前这种进样方法在芯片琵缨管电泳中缀少使用。 1 。1 。2 。2 电动夹流迸样 为了解决样品泄漏闯题，j a c o s o n 等悯提出了电动夹流进样法( 豳l o ) 。灸样对， 除样赫废波池( s w ) 接地外，群品漶( s ) 、缓冲滚池( b ) 和缓冲液废滚漶( s w ) 均施加正电压，羚使s 、b 和b w 处静电压、k 、岛、v b w 大予十字交叉翻处豹毫簇v ，蝴， s w 处的电压v s w 小于v j ，使备通道中的电渗流方良如图1 3 a 巾的箭头所汞。在电渗流 的驱动下，b 、b w 中的缓冲液均经过十字交叉日，流入s w ，与样晶液流汇合形成夹 流。由子层流间扩散效应缀小，疆魏，液流闯可保持清晰的界面，降低或消除了样品 泄漏效应，同时消除了样品塞的扩展。注样时，储液泡s 、s w 、b 和b w 处的电压同 时切羧，使v b 大于，v s 、v s w ，v 】州小于。在这种情况下，电渗流的方向如图1 0 b 所示，缓冲溶液液流将十字交叉口处的样品寨摊入分离通道，阚辩，从分离逶道液滚 中分出郝分液流流淘s 翻s w ，将仍残整在上下两侧样品逶遵中的样品分别接囱s ；f 珏 s w ，避免了样舔溶液与流经卡字交叉目的缓、砖液接舷，从1 珂避免了注祥和分离对样 黯的泄潺。 不同淌度的离子在电场中迁移速度不同，为了使样晶塞中各缀分浓度与样品池相 同，在样晶溶液到达十字交叉翻愿，还要延长进样时间，一般需要1 0 1 5 0 秒。尽篱如 甜嚣三式掌搏j _ 辨垃诺二定 书一，t 文期潦避 此，r a 擞s e v 研究缀在讨论了逛压对夹流样品塞形状的影响嚣l 授，以三种氨蒸酸为样 晶，证明了邀动夹流进群在延长进撵孵阍螽，仍然存在一定的电歧视效应1 1 6 1 。他们还 采用计算枫模拟了十字芯片上的夹滚遴样博犹1 1 t 搬，以罗丹明b 为样黯，分剐采霜三 缀进样魄压幂葑三缀分离电鹾进行电泳分离，潋罗丹翳b 黪峰离和半高峰宽豹魄值作为 评价标准，确定了最佳电动夹流避榉和分离电压 9 j 。 电动夹流进样的优点是可以控制样晶塞宽度，获得更离的分离效率，容易获得熏 现的分析结果，肖稳定的基线。嚣前，电动夹流遴样法在芯片毛维管电泳分柝中得到 了广泛应用【缸捌。 辩鼙辩1 3 s 穗凇a t i ed i a 黼m 蠛e l e c 胁甄矬e t i ep i n c h e ds 黜p l e 蠲蝴i o n 毪l e 也o d 。a ： s a 玎峰l e 王o a d i l l g 纽c s s s h a p ec 嫩p ，b ：s 锄p l ed i s p e n s 纽g 呈nc r o s s - s h a p ec h 玲，c ：s a m p l e l o a d i n g i l ld o u b l e tc h 旗s s 蝴p l e 托s e f v o 打，s w s 踟p l ew a s l ef e s e r v o 溉b - b u f f e r r e s e r v o 沁b w _ b 珏程e rw a s t c 孢s e r v o i r a n d w si n d i c a 主e 也ef l o w 出f c c l i o n s 掰g t l r e1 4 s a l n 辩d 迤拄i 堍t o n sp l 。to f 妇d o n b l e - 铷d s s 鲫蝴i o 藏s y s 恕m a ：s a m p l e l o 菇i n 舀b ：s a m p kd i s p e n s i n g 传统的十字形芯片在夹流避样对，注入分离通道的样品塞被扭曲成魏胬l - 3 a 掰 示豹锥形，这显然不利予芯片毛细管电泳的分离效率和分离度。轴等m3 1 】提出了一 讳 辽大掌博士掌位论文 种双十字芯片，用来改变这种状况。如图1 4 a 所示，在双十字芯片的充释阶段，样 品溶液在电场作用下从通道1 流向陵液通道2 ，同时在分离通道5 、6 秽聚焦遥道3 、 4 上施鸯釜合适豹电压，防止撵晶泄漏，邋遂3 、4 是主要聚焦通道，5 、6 为辕助聚焦 逶道；当样晶充满两个十字交叉区时，电压切换到注群分离模式，经过两次夹流的梯 晶塞被接入分离逶道6 。尽篱这芹中迸样方式与传统十字芯片电动夹滤进样十分楣徵， 但注入分离遂道的样品塞形状接近矩形( 圈1 4 b ) ，宽度变窄，从丽提高了奄泳分离 度。 在电动夹流避样的注样淤段，进样邋道中泌样晶溶液在泡渗流 乍耀下从+ 字交叉 疆两样菇池稻样菇废液滚流动，如果分离辩阀足够长，缓冲液会进入样赫漶政变样晶 溶液缀成，面在下一次遴样辩样品需要熏新圆到十字交叉日；在充样阶段，缓冲液泡 秘缓冲液废液涟中浆溶液流向样豁废液洮，这会使以前注入的样晶凰流，并蠢到达十 字交叉目的可能。这使得电动夹流进样具有以下缺点：第一，每次遴样霈要重新充样， 特剩是为了消除歧视效应需要延长充样时间，使进样时闽大大越过样品分离时间；第 二，上次注入的样晶在分离通道中圈流，有可能导致基线不稳。 f i g u r e1 5 w 撕t el i g h t 诚a g eo f ( a ) t h el e p e t i t i v ep i n c h e di n j e c t i o nv 越v ea n dn u o r e s c e n c e i m a g e so f ( b ) s a m p kl o a d 至n ga n d ( c ，d ) d i s p 髓s n g ，至n ( b ) t h ea r l o w si n d 主c a t et h ed i r e c 圭i o n o ft h ee l e c t r o o s m o 虹c 曩o wi na l lc h a n n e l sd u 国礤s a m p l e 王。越捷舀a n d 主n ( c ，d ) 攮ea 玎a w s i n d i c a t e 搬ec h a l l g ei nt h ed i r e c t i o n0 ft h ee l e c t f o o s m o t i c 熊o wi nc h a l l n e l sc 1a l l dc 2d u r i n 嚣 d i s p e n s i n g 最近，弧o m a s 等【3 2 l 设计了一； 申改进的电动哭流进样法，该法克服了以上缺点， 可以快速完戒究样过程，并能保持注入分离通道的滚液始终单向流动。他们奁翔瞄 第一章文献嫁避 1 5 a 所示的微流控芯片上嬲工了一个十字形通遂和两个离十字交叉口爿# 常近的t 形 通道。充样对，在s a m p l e ，b u f f c f l ，b u f f e r 2 ，w a s t e l ，w a s t e 2 和a n a l y s i s 储液池分别 施嬲呶压9 ，4 0 0 ，l l ，3 0 0 ，0 ，o v ，样品在电渗漉的驱动下，从样品通道进入 废液通道l 和废液通道2 ，缓冲溶波1 和缓冲溶液2 在十字交叉阴与样晶溶液形成夹 流，荧光照片如图1 5 b 艇示。淀样时，切换各储液池毫压，在s a m p i e ，b u f f c r l ，b u 踟r 2 ， w a s t e l ，w a s t e 2 和a n 甜v s i s 储液洮分别施加电睚8 0 0 ，1 0 0 0 ，6 5 0 ，o ，o ，o v ，通道 c 2 和缓冲溶液2 通道中的电渗濂反扁，样燕塞在缓j 中液的撼动下逶逑交叉口t 2 ，进 入分离通道，荧光照片如圈1 5 c ，d 所示。由于通道c l 的长度仪为8 0 脚，在下一次 充样时，样品溶液可以迅速到达+ 字交叉口，完成充群过程，所以，该进样方法阿以 快速、熏复进样，焉嚣遂样霾现蚀蓬好，但是需要使用一个具有六个独立电压输出的 裔压电源。 在有些检测中需要更大体积的样晶塞进入分离通道，使用十字形通道电动夹流避 样不熊满足要求，这时霹戳使用如鬻1 3 c 所示的双t 形通道泡动夹流进样1 3 3 】，改变双 t 形通道的阀距，可以改交进样的体积。但是，对于一个采用电动夹流进样的双t 形通 道芯片来说，只能提供一种固定体积豹样晶塞进入分离通道，进样体积不熊改变。针 对这一问题，翔等【3 4 】提出了一种纂予多t 通遴芯片的电动夹流遴样方法，与十字芯片 电动夹流进梯法类似，控制各个通道上静媳场强度，多t 通道芯片能够完成十字、双t 和多t 形芯片的进样功能。 在以上工 乍的基勰土，h 等【3 5 】通过实验帮数值模拟，研究了l n ( 一个样晶入 口和n 个样品出口) 和m n ( m 令样晶入嗣和n 个趣口) 两萃中结构芯片的电动夹 流避样。圈1 6 a 怒微加工的l 5 奄动夹流进样的通道结构，它包括一个样晶入口和 a 、b 、c 、d 、e5 个出口( 摇当于样品废液韶，下间) ，图l 。6 b 是微加工的2 7 电 动夹流送样的通道结构，它包括两个样晶入口和a 、b 、c 、d 、嚣、f 、g7 个出豳， 圈1 6 中的f l 、张均为夹流通道，相当于十字芯片夹流遴样的分离遁逶。在图1 6 a 所示结构的芯片上，通过改变施加在样品入强和各出臼的电压，可以控铡样品流向任 意一个擐定的出团。农圈1 6 b 所示的芯片通道上，通过施加合适的电压，诳以控制 两个样品弼辩流向不固或相同的出口。所以，该进样通道构型可以变换多种进样体积， 以满足不嗣分拆对样品爨大小的需要。 f i g u r e1 6 p h o t o g f a p ho f ( a ) l 5a 拄d ( b ) 2 7 n t i 菲u o u ss 蝴p l ei 垮e c t i 雠s y s t 黜o na c h i p 托g h 辩1 - 7 s c h e m a t i ci a y o u t so fac h i p m p o s e do fe i 醵tc es y s t 嘲sw i t hd i f f c r e m i 巧e c t i o nd e s i g n s 0 嚏l h el e f t 甜e 氆ee x p a n d e dv j e w so f 搬r e et y p i c a li 撕e c t o r s ： c o n v e n t i o n a lc r o s s ，n s cc r o s sa n dn s cti n j e c t o r s 除电动夹流外，改变微逶道构毅是消除或降低样晶泄潺效应曲另一耪慧路， 熬a n g 秘m a 矬zp 锶报邀了一转窄遥道避样法，其进横通道宽l o 陋，只宥分离通遴宽 度盼五分之一( 如图1 ，7 所示) 。德钔采用窄通道十字芯片，在不麓搬夹流电压的情 况下，以简单电动迸样法充祥o 5 。3 秒，撞效超过了常规十字通道电动夹流进榉2 0 4 0 秒时所达到的桂效。该文l 乍者认为，这是由于窄通道十字芯片在十字交叉口处产生的 样品寨扩璇小掰致。值德注意的是该芯片为p d 醅s 一渡璃复合芯片，篡电渗流不及玻璃芯 第一j t 文献蠊琏 片稳定。面且l om 宽的窄通道需要采用价格昂贵的s u 培光胶制作阳膜，加工难度 大，所以这种芯片没有被广泛使用。 鄞1 - 2 3 电动门式进祥 i 9 9 4 年，j a c o s 。n 等f 瑚提出了电动门式进撵法( g a t c dl 琊e c l o n ) ，该法分三步完 成进样。如图1 - 8 a 所示，充样前，缓冲液池( b ) 的电压v b 大子样品池( s ) 的电压 v s ，样品废液池( s w ) 车缓冲液废液池( b w ) 的电压为零。此时，缓冲滚以较大的 流量从b 出发，流疑十字交叉口时，大部分向下流入b w ，小部分向右流入s w ：样 晶溶液从s 出发，流经。p 字交叉墨时，由于电场的导向及缓冲液流的挤压作用翔在流 入s w ，从而确傈在此阶段无样品溶液濮漏雾1 分离逶道。如图1 _ 8 b 所示，充样时，在 b 不施加电压，样品溶液在电场作用下，经十字交叉口一部分仍流向s w ，男一都分 向下流入分离通道。如图1 8 c 所示，充样结束后，器储液池所施加电压恢复到充样 前的状况，样品塞在电渗流的推动下进入分离通道，完成进样。 f i g u r e1 培s c h e m a t i cd i 鸭r a mo fg a t e ds a l i l p l ei n j e c l i o nm e l h o di nc f o s s s h a p ec 址p ，a ： b e f o r es a m p l e o a d i n 岛b ：s a n l p l 。l o a d i n 岛c ：s a h l p l ed i s p e n s i “g s - s a h 警l er e s e o 址 s w s a m p l ew a s t er c s c r v o i r ，b 也u f f c rf c s e r v o 饥b w - h 瑜rw a s t e 糌s e f v o i la r r o w si n d i c a t e l h en o wd i r c c 石o n s 这 进样方式的进样量可以通过调节充群时黼来控制，样品可以始终保持在十字 交叉目处，在不闽断分离的条释下可以连续进棒。电动门式进样法也是芯片毛细管电 溶中常用的一萃中避样方法f 3 “”。 在电动门式进样法中，样品塞的前沿被推入分离通遴，不同组分闰的歧视效应不 能忽略。s l e n l z 等i “增察了电动门式进样法在十字通道交叉口处的进样歧视效斑， ，s ， 第一掌采啾述 研究结暴表明，在电动门式避样法中，除存在所有电动遂榉均有的电动选择歧援外， 还有一耪来盘予转囱半径电动选择( t r a n s f a d i a le l e c t l ( i n e t i es o l e 瞳o n ，h 逆k s ) 的进 样歧视效波。当样器滤经通遂交叉口处辩，霜右转9 0 0 流向样品废液漶，电动迁移速 率不同的粒子有不同的转向半径，迁移速率俊的粒子眈迂移遥率慢的粒予要经过更大 的转向半径，在十字交叉霸处形成不同的区带。充样时，进入分离通道中迁移速率快 的缝分就会多于迁移速率慢的缀分，予是产生了耶t e x s 歧视效应。样品在逶道交叉 阴处经过的路径和转向半径与电泳迁移率密切相关，施着充样时闻的增加，样品塞变 宽，h 蠛k s 产生的歧视将变小。因此，在电动门式选样法中，总的选样竣裰等于以 上两种歧视效皮之和。对于电迁移率相差比较大豹复杂样品来说，这种进样方法显然 楚不可靠的。 为了简化电动门式避样的电源系统，j a c o b s o n 等泓j 报道了只用一个赢压电源鞠 个继电器就可以实现电动f 1 式进梯的方法。如图l ，9 a 所示，继电器断开，樗晶池 施加高莲，菠液漶2 接地，缓冲液池悬空，芯片处予究榉状态，宠样时间越长，样品 塞越大，充样状态豹荧光照片如图l ，1 4 b 所示；当继电器接遽，样品池鞠缓冲液池均 施加薅联，废液洮2 接缝，芯泞处予注榉状态，样品塞被缓渖液推入分离通道，注榉 状态的荧光照片如黧1 1 4c 所示。 f i 弘r e1 9 。a ：s c h e m 8 l i co f m i 艘o c 赫pu s e df o rg a e dv a l v i n g 甜l ed o n b l el i n e sr e p 托s e n t m i c r o f a b r i c a t e dc h a n n e l s ，a n dt h es i n 9 1 el i n e sf e p f e s e 髓te l e c t r i c a lc o n n e c t o n s 。t h e h i 曲一v o l t a g er c l a yi si n 搬ed i s p e l l s e ( o p e n ) p o s i t i o n b ：辩u o r e s c c n i m a g e so fs a m p 王e d i s p e n s 纽g ，c ：f u o f e s c e n c ei m a g e so fa n a l y s i sm o d e s 。恕t o w sd e p i c td i r e 艘i o no ff l o w 。 1 。1 2 4 动态进样 d a v i ds i n t o n 等【4 6 j 在十字芯片电动夹流避样的基础上，增加了注样前样晶扩散过 程，在十字芯片上实现了进样量可调的大体积迸榉，从砸提高了检测灵敏度。该方法 分三步完成，曾先在十字通道上施加夹流电压形成如图1 1 0 a 所示的稳定夹流，然愿 施加动态避榉电压，使样品塞在十字交叉口处向两边扩散，形成如豳1 1 0 b 魇示的大 体积样暴塞，样晶塞的长度囱藏加动态进样魄压鼹瓣问决定，最后旄加分离电鼷进行 毫泳分离，如图1 1 0 c ，d j 辫示，大体积徉晶寨被注入分离逶遴，进样道邀中的样品分 羽流向样品波帮样赫凌液池，避免了样品渣漏。在诧基础上d a v i ds i n t o n 等将j 鹾：进祥 方法耀于芯片上在线样晶难积磷究【4 。 f i g u r e1 1 0 1 飘e 协r e e s t 。pi 珥e e i o np r o c e s si l l l l s t f a t e dw i t ha i li m a g es e q u e n c e 毪ll 硪a 聪 as c h e m a l i co ft h ef l o wd 主r e c t i o n sa tf i g h t 1 。1 。2 5 光门进梯 光门进样法燕一种比较特殊的电动迸样法。m o o n i n g 和j o 喵e n s o n 程2 0 世纪9 0 年代初提出了光门避样法，用于传统亳纲管电泳快速分离【矧。该方法将一束激光分成 豫寒，能蹩低的一束为检 烫9 光束( p r o b eb e a m ) ，聚焦在毛纲管下游的稔测寮口，用 于激光诱导荧光稔测；能爨离舱一柬为门控光浆( g a t i n gb e a m ) ，聚焦在亳缨管上游 的进樽窑口，通过光漂自样品完成样黠豹弓l 入。在电场作爝下，荧光标记豹样晶溶液 在毛纲餐中不断撼流动，f 1 控光束述续不断地漂自焚光标记雏持测物，需要送祥瓣将 门控光柬遮住一定的时间，一段没有被漂囱的样品经过进样窃翻，即完成一次遴祥。 。1 0 。 浙江太撩博士掌位沧支 脚i n g 等f 4 9 j 将这种进样方法应用于芯片毛细管电泳迸样和检测，之嚣又将它应髑于多 通遵阵列芯片的进样秘检测【5 0 ，5 。p i t 慨a n 等【5 2 】采用光门避群方法分奄蓐了f 耀c 标记 的氨慕簸，保留对闯秘峰嵩的重现憋良好。僮得注意懿是，光门进样豹样品必须具菇 荧光，并且能够被激光漂自，从某释程度上说，光门遴样法静应用对象受到了很大跟 剩，而且其光路系统龟非常复杂。 。1 。3 压力进梯 电动进梯虽然使趱方便、灵活，但怒其缺点也不察忽视。第一，电动进样法存在 歧视效皮，对于彀泳遥移率粳差较大酌样品或不躲来源豹复杂样箍，不邋合使耀电动 进样法；第二，为了降低或消除歧视效应，必须延长充襻时闼，影响采样频率；第三， 电动进样的羹现性依赖予电渗流的稳定性，徽遴遵表面电荷状况易受多种因索影晌， 特别是生物样品中所含蛋自质易在微通道表箍嗷附丽改变电渗流的大小，使其进榉的 重现性难以傈证；第四，经过多次电动避样盾，样晶溶液中各组分的浓度会发生变化； 第五，电动避样的电源系统复杂，通常需强计算机控制，电腰切换遴过高压继电器完 成，无形中增加了系统的设计难度和硬件成本。 压力驱动的液流对电泳迁移率不闲懿样品没有皱视效应，而且压力流与微逶遁表 面电旖状况无关，为了避兔电动遴样豹缺点，燕研究鬻提融了压力进样法，该方法 一般以气压或液压为驱动力，结合电渗滚，快速完成宠样和注样。根据形成群品塞的 方式，可将压力进样法分为压力定时进祥和压力定容进样。涯力定时进样法可以遂过 调节施加滕力的时间控制样品塞的大小，压力定容避样的梯晶塞体积由芯片构型决 定，对于一块芯片来说是溅定不变的，尽管匿力定容进样法不能方便圭| 熟调节进样量， 但是其重现憔优予压力定时遴样法。强下分别予以介绍。 1 。1 3 1 压力定时遴样 蕊e n 等f 5 3 1 设计了一耪如阉1 1 l 所零的芯片燕缁管恕泳流邋式样晶弓| 入系统，样 翥溶液在控寨泵的推动下从芯片进口( a ，i n l e t ) 进入微逶遂，遥过施加在各储液、泡 咆压的切换，实现样品连续弓l 入和嚣力定对邀样。箕避样过程与电动门式进样类似， 充样前，在储液洮e 施加正离舔，这个高压称为门控电魔，d 、f 接遗，在这种电压 1 1 第一j 簟舞：戢捌述 模式下，来自蕊片迸口的压力流在第一个通道交叉口分流，然后经过第二个交叉日流 囱储液池d ( 图1 1 l a ) 。究样辩，d 、e 、f 悬空，样品在压力作用下淹d 、e 、f 流 动，通过控制充样时间，可形成不闽体积的样暴塞( 图1 1 l b ) 。注样时，d 、f 接遗， e 麓加亚高压，此耩尊嵩莲称为分离电压，群品塞被注入分离通遵进行电泳分离( 图 王1 l c ) 。 f i 静r e1 - 1 1 v 0 1 1 8 9 es w i t 馥i n gs c l l 嘲ef o rs 籼p l ei n 的d u c t i o n 。a ：b e f o 她s 撼p l el o a d i n g ，b s a m p l el o a d i n g ，c ：s 甜n p l ed i s p e n s i n g 。a ：s 啦群ei n l e t ，b ：s 躺p l eo u t l e t ，c - f ：b u 蜘r r c s e r v o i r s ，s p ：s y r i n g ep u m p c h e n 等【s 4 】在此工作基礁上，建立了流通式样品引入系统的操作模型，推导出的 模型表明憔界门控电压( v o ) ，朝应瘸予苍片进样的最小门控电惩由柱寨泵的流速、 芯片微通道构型和缓i 孛溶液的魄渗流性质决定。计算彳舄出黪理论v o 值，与从遴样邋 道尺寸不网豹薅个芯片获得的实验穰楣毙，误差范翻在l 2 0 。 由于压力流和电泳迁移率无关，这种芯片罨缨管电泳进样法的优点怒不存在避样 歧视效应，其缺点是需要柱塞泵等附宓厝设备，增加了系统成本，需要优化v 。傻，并 且需要精确控制避样时间以确僳送样的重现髋，使得分享斤过程复杂化。 b a c k o f c l l 等【5 5 l 撬出了一葶孛芯片芬缁管电泳的液愿力避样法。在摇圈1 ，1 2 a 所示豹 双t 形通道芯片中，样品漶s 中的液夏魄其它滚池中的液蘅略离，恩距双t 处的邋 道较短，这样藏熊产生足够的液压力，撼动样品溶液滤向其它储液池。该系统使用了 两个麓压电源，在分离时，一个电源用于样品池( s ) 和样品废洮 s w ) ，样晶溶液 在电渗流的作用下，从s 流向s w ，另个电源用于缓冲液池( b ) 和缓冲液疲液浊 ( b w ) ，掇供分离电雁，使缓冲溶液从b 滚翔b w ；如圈1 1 2 b 掰示，此时两个滚滚 在9 0 0 拐角处有明摄的分界线，双t 通道之闻充满了缓i 率溶液。当两个赢鹰电源关溺 对，样品在液位麓产生的液鍪力作用下，流向s w 、8 、b w 。峦于分离通遂的背压更 浙辽太攀博士学位论文 第一章裒献练述 离，流向s w 的榉品要比漉向分离通道的多一些( 图1 1 2 c ) 。当豫个商腥电源重新打 开时，样晶塞被注入分离通道，网时样晶邀中的样品溶液在电渗浚的 乍用下，从s 流 向s w ，避免了样品泄漏( 图1 1 勰) 。该进样方法没有电歧视效应，可适用予阳离予、 阴离予霉爨中性亿合物样晶。需要注意的是，为了以防止样品涟漏至6 分离逶道，分离通 道帮进样通遵上的毫压毙例需要仔细优化。 f i 辨辩1 1 2 ，a ：s 。h e m a t i cl a v o u to ft h ec 嚣m i c f o c h i p 趟lc h a n n e l sh a v ea 毡n l f o 鞋硅d c p 攮 a i l dw i d t l lt h t l 鳓o u tt h ec h i po f1 2a n d3 0 “m ，f e s p e c t i v e l y ：b w ；n l i lb u 溉rw a s l e r c s e r v o i f ：b ，n j nb u f e rf e s e n r o i r ；s ，s a m p l er e s e r v o i r ；s w ；s a m p l ew a s t er e s e r v o i r ；h v l a n d 鞋v 2 ，h i g h v o l t a g es o u r c e s b ：f l u o f 。s c e n c em i c 静a 必so fb e f o f es a m p l el o 勰i n g c ： 张硅o f e s c e n c cm i c r o 斟婶h so fs a m p l el o a d i n g d ：f 1 u o r e s c c n c em i e r o g r 绰h so fs a m 辨e d i s p e n s i n g s o l i 建n a c 等酬以荧光素和钙黄绿索为梯晶，研究了媳极农镳滚漶中不闫位置产生 麴歧视效应，并掇懑了一种舔力脉孥迸样法，大大地减少了歧褪效应，并能控镣l 样熬 塞静大小。充样辩，在如图1 1 3 a 掰示的样品池i l i 中加入一定爨的样品溶液，在其它 群箍淑中加入一定燕的缓冲溶液，如图1 1 3 b 所示，在样品池王i i 上盖一片1 1 m m 浮的 p d m s 膜，用露定予膜上豹电磁制动器使p d m s 膜发生机械形交，产生2 5 - 3k p a 的 瞬时聪力，样品池上鄙的空气可接动 o 私l 的样品遴入样品通道，通过控制脉冲压 力持续时间可以调节进样量。该方法在充样和注样过程中，施加在各德波漶上的电羼 浙主】：大掌博噎瞳豇位论文 ，秽一j 文献蟓琏 始终保持不交，可以连续进覃亍脉冲压力避样，面不影响分离，晨进样时间缩短至o 。l l 。o 秒，但是在芯片上安装彀磁利动器并非易事，丽髓覆盏了p d m s 膜嗣，换样搡l 乍更热 复杂。 秘g l l r el - 1 3 。( a ) c 匿e h 玲d e s i 鼬e df o fp r e s s 甜ei n j e c t i o 藏( b ) s c h e m a t i cv i e wo f 也e m e c h a n i c a 王a c t u a t i o no f 侥ep d m sm e m b r a n eo nt h es a m p i er e s e 辫o i ff o rp r e s 轴f ep u l s e i n j e c t i o n 1 囊r l i 璐e v 等f 5 魂设诗了在进样通道上集成了隔膜微裂瓣p d m s 玻璃复合芯片。通 过多次电动进样翻隔膜微泵嚣力进样鲍对比发现2 0 次电动进样茬嚣组分峰蠢积比值 变化2 0 ，碾压力进样的结渠表疆样品缝成糖定不变，2 0 次压力避样的峰两积比僮 的交异系数为3 6 。这种邀样方法有效地解决了避样歧视问题，为复杂样品的无歧 视快速遴样提供了可能，但是在芯片上集成微泵增舶了芯片的力硅工难度。 g a i 等侧邋过调节各锉液漶的液面赢发在各继液池阙产生液压差，驱动溶液流 动，从丽避免了援力浆戆僮建，将其与电动力结合艨翔予的字形芯片，实现了悬浮 进样张f j 式遴样，最螽成功电将缨臆等i 入微通道内。毽惑，诧法在进行荧光染料进群 避，从其发表的荧光照片上可以观察翔鞭显酌样斋泄漏。 1 。 2 。3 压力定容进样 黔8 等1 5 j 使用了一个多彼阗和三个柱塞泵，默毪细管连接芯片通道口，多藏蹰及 擅塞泵，以柱塞泵驱动液流，借勒芯片外郝的多位阙控话液流方向，在十字芯片上实 现了压力定容和定时进样。如图l 。1 4 a 所示，充样前，系统处于待闺状态；充样时， 切换阏位，台莱将样品从通道c 推入芯片，另外薅台象将缓冲溶液分别从通遂b 、 d 推入芯片，三股液流在卡字交叉口处汇合薅避入遇道a ，在十字交叉口处褥到如霪 渖抟大掌博士啦位论文 1 1 4 b 所示的锥形的样貂塞；如图1 1 4 d 浙示，当润位切换到初始位显时，通道a 、c 出口连接在一起，其内的溶液不褥滚动，从通道b 推入的缓 中波将十字交叉口处的样 晶塞推入通邀d ，即完成定容遴样过程。如图1 1 4 c 所示，通过调节三个棱塞泵的流 鬟，郎夹沆援力，可使群品在充样辩进入通遵d ，充样时阕越长，遴样鬟越大，警阐 位切换到裙始位鬣对，邸完成定时避样过程。但是，l 鞋= 法一轰使用柱塞泵驱动液流， 无法应用于芯片毛缁管电泳的进样，只能用于芯片徽色谱的样品弓| 入。 f i 瓣r e 王- 1 4 s c h e m a t i cd i a 譬r a mo fa w o w a ym i c r o 8 _ p o nv a l v ec o n n e c t e dt oa m 奴：f o - c h a n n e ln e 批o r k w 毯c hd e s c f i b e st h em o v e 格l e n to fas a m d l ea n da ne l u t i o ns o l u t i o n a saf u 珏c 连 o no ft h ep o s i t i o n 艇攮ev a l v e 髓i sf i g l l r ci l l l l s 拄a t e sh o was a m p l ec a nb e 蠲e c t e di n t oam i c r o - c h a n n e ln e 柳o r k ：a ，t h es t a n d b ys t a t eb e f o r cs a m p l el o a d i n g ；ba n dc ， c o n f i g u f a t i o no ft h ep r e s s 娃f ep i 堇l 蕊e d 蛹e c t i o n ，w h e r c 掇es a m p l es o l u t i o ni sl o a d e di n t o t h ec f o s sa n dw 圭l e f et h el o a d e dp l 驻gi sp r c s s e db yt w o u n t e r c u 科e n 耄噩o w s as y m m e 拓i c a l t r i a 狂g l e ( b ) 删an 鲰- s y m m e t r i c a l ( c ) s h 弩oo ft h e1 0 a d e dp l n ge a 堇lb eo b t a i n e du s i n g 也e s a m ep i n c hp r e s s h r e so rd i f f 。r e n to n e sa tba n ddc o n n e c t i o n s 。d ，c o n f i 2 m r a t i o no ft h e s e p a f a t i o np o s i t i o nw h e f et h es a l n p l ep l u gi si r 巧e c t e dl l n d e fp r e s s u r ea n de v o l v e si na p a r a b 蕊i cs h a p e 第一，皇：献腺述 k a c l l 等【6 。】利用多层p d m s 加工气动阀的技术，设计了如图1 。1 5 所示的微流控 滚动注射系统，该系统将蠕动浆( a ) 、注入瓣( b ) 、混合反应邋道( c ) 和样品选择 器( d ) 均集成在芯片上，剩用予注入阏连接的微采样环，实现纳升级定容避样。 秘g u f e1 1 5 d i a g r a mo fm em 毡l t i l 矗y e rp d m sm i c 蹦驻确cn o wi 珥e c 毛i o na n a l y s i ss y s t e m 聪u i d i cc h a n n 畦sa f es h o w ni i l 舯y ，a n dc o n t r o l 西a n n e i sq 珏m p sa n dv a l v e s ) i nb l a 呔 r u i d 主cc o m p o n e n t si n d l l d e ( a ) p e r i s 攮l t i cp u h l p s ，( b ) 涸e c t i o 珏v 毪l v e ，( c ) m i x i n 驴c a c t i o n c o l u m n ，a n d ( d ) s a m p l es e l e e 沁f 。1 飞es 扳n t l i df e s e f v o i 辐c o n t a i n e d ( 1 ，2 ) t w os 糊p l e s o l u t i o n s ，( 3 ) c a r r i e r ，( 4 ) r e a c a n t ，( s ) s 嘲p l ew a s t e ，a n d ( 6 ) m i x i n gc o l u m nw 鹅t e f i g u r ei 1 6 s a m p i ei n t r o d u d i o nb yp r e s s h f e 一主n d u c e dp u s 埘套u i l 襄o wh s 坛gas w i t c hv 越v e 7 n l es o l i d 强n ec o n n e c t i o no nt h ev a l v er e p r e s e n t st h es a m p l 主n gs t a t ea n dt h ed o t | e dl i n et h e s a n d - b ys t a t e w u 等【6 1 】提出了一种压力推拉式进样方法，装置如图1 1 6 所示。该方法使用了两 台柱寨泵和一个多位阀，两台柱寨泵分别与逑样通道的进、蹬口连接，芯片的另弼个 第一j t 文献嫁述 通道口与寒压电源的两极相连。究梯时，不施加媳压，蕊台泵遇避多位阙与芯片的避 榉遗道连通，一螽泵攥动样品，另一台泵抽样品，英睹的是傈诞样晶充满进样遵道， 蔗不会 蘑处予敞日状态的分离逶遵流动。注榉时，切换多位溺，切断进样通道与柱寨 泵的连接，慈热电压，使样熊塞进入分离通道。值得注意豹是，高压可熊透过泵与芯 片的连接管泄漏，存在安全隐患。 t t e r e r 等f 6 2 】采用在分离通道上壤充了磁珠的双t 芯片( 豳l 。1 7 a ) 和计算机控铡的 气动进样姨置，实现了长片断d n a 分离。图1 1 7 b 是继液池结构示意图，储波池上方 密闭了一定体积酌空气，透过滤量控制翻控制涟内气压，为了防止样晶遇过加样篱倒 流，储滚溜上还安装了一个由计算梳控涮的拯阀( p i n c hv a l v e ) 。图l 一1 7 c 是压力控铡 单元韵实物照片，压力控涮单元由控制接圈、压力输入输出接口、比铡阀，压力传感 器和泄漏阙及连接管等组成。由于该装置需要控制每个豫液池上的气压，而照采用了 多个阙和压力传感器，系统过予复杂，不利于推广使用。 f i g u f el 1 7 ( a ) d i a 黟a mo fd b l e 嚣c h i pa n db e a dc o l u m n si nm i c r o c h a n n e l ( b ) i n j e c t i 嘲 s v s t e m ：琢i e c t i o na n dp f c s s u r ec o