（分析化学专业论文）基于磁球技术的dna单分子的体积放大以及电化学检测.pdf

山东大学硕士学位论文 中文摘要 本论文分为二章，第一章是基于体积放大技术的d n a 单分子目视检测； 第二章是基于纳米磁球介导酶联d n a 单分子电化学检测。 在第一章中我们提出了一种简单的基于体积放大技术的d n a 单分子检测方 法。该方法分为三步：首先利用生物素与链霉亲和素的特异性反应将生物素化的 d n a 捕捉探针固定在链霉亲和素修饰的聚乙烯板上，然后滴加目标d n a 溶液， 使其与捕捉探针杂交。第二步，取一定量链霉亲和素修饰的5 9 1i n n 的磁球与过 量的生物素化的检测探针反应，利用磁分离除去过量的检测探针。最后，将第一、 第二两步反应的产物按一定比例混合，进行第二次杂交反应，通过目标d n a 与 检测探针的杂交，使形成捕捉探针一目标一检测探针一磁球的结构，进而将磁球 固定在聚乙烯板上。用倒置显微镜以x 2 5 倍或x 4 0 倍物镜用c c d 照像或x 2 5 0 或 x 4 0 0 倍用眼观察。如果在上面的第一步中，使固定在微孔板上的目标d n a 足够 稀，通过杂交反应最终一个磁球上只结合一个目标d n a 分子，这样，通过对磁 球的计数检测，就等于实现对单个d n a 分子的计数检测。该方法的最大优点是 不需用复杂而昂贵的仪器，只用普通的显微镜配合常用的c c d ( 也可用目视) 就可 进行单个目标d n a 分子的检测。本章就杂交缓冲溶液的浓度、杂交方式、清洗 次数和反应时间进行了讨论，得到了最佳的杂交实验条件。使用m e t a m o r p h 软件 对磁球进行计数，实现了对目标d n a 单分子计数检测，线性范围5 x 1 0 - 1 6 - 1 1 0 。1 4 m o l i ，。 在第二章中，建立了一种电化学检测单个d n a 分子的新方法。该方法基于 核酸功能化的纳米磁球实现d n a 的初步放大，然后利用磁球表面的碱性磷酸酶 的催化反应实现第二次信号放大，最后利用毛细管作为单分子取样通道并于柱端 进行电化学检测。该方法具有以下几个优点：( 1 ) 灵敏度高。在本实验中，不是 通过检测目标d n a 而是碱性磷酸酶催化底物得到的产物苯酚，苯酚通过磁球技 术的d n a 放大以及酶放大两步放大反应得到，使检测信号大大增强。( 2 ) 重现 性好。在电化学检测中电极表面的电化学活性的不稳定常会导致电信号的重现性 山东大学硕士学位论文 变差，而本方法不是根据信号的强度，而是根据峰的个数来检测目标d n a ，所 以信号强度的重现性对实验不是很重要。这一特点使方法的重现性优于常规的电 化学检测。( 3 ) 该实验不需要昂贵的仪器设备，磁球与链霉亲和素修饰的聚苯乙 烯板都己经商品化。通过磁球技术与酶催化两步放大相结合实现了用电化学手段 对单个d n a 分子的定性及定量检测，检测线性范围5 x 1 0 - 1 6 _ l x l 0 。1 3m o l l 。 关键词：磁球；d n a ；单分子检测 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nc h a p t e ro n eo ft h i st h e s i s ，w ep r o v i d e dan o v e lm e t h o dt od e t e c ts i n g l ed n a m o l e c u l e s as a n d w i c h t y p eh y b r i d i z a t i o na s s a yi sp e r f o r m e do nas t r e p t a v i d i n c o a t e d s u b s t r a t e al a r g en u m b e ro fb i o t i n y l a t e dc a p t u r ed n a s ( c d n a s ) a r ef i r s tc o v a l e n t l y b o u n dt ot h es u b s t r a t et h r o u g ht h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns t r e p t a v i d i na n db i o t i n t h e n , t h ec o m p l e m e n t a r yt a r g e td n a s ( t - d n a s ) a leh y b r i d i z e dw i t ht h ec - d n a sa t t a c h e d t ot h es u b s t r a t e ，f o l l o w e db yh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nt - d n a sa n db i o t i n y l a t e df i r s t p r o b ed n a s ( p - d n a s ) c o n j u g a t e dt os t r e p t a v i d i n - c o a t e dm a g n e t i cm i c r o p a r t i c l e s ( m m p s ) 。i nt h i sc a s e ，o n et - d n ab i n d so n em m p w h i c hc o u l db eo b s e r v e du n d e ra n o p t i c a lm i c r o s c o p e t oq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n et - d n a s ，t h ei m a g e so fa 1 1 v i v i p s w e r et a k e nb yd p 7 0 ，t h e nt h en u m b e ro fm m p so nt h ei m a g e sw e r eo b t a i n e db yu s i n g am a t e m o r p hs o f t w a r e t h en u m b e ro ft h e i v p si sl i n e a r l yp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no ft - d n ai nar a n g eo f5 1 0 1 6 _ 1x l o 1 4m o l l 。a d d i t i o n a l l y w e d i s s c u s st h ei n f l u e n c eo fh y b r i d i z a t i o nt i m e ，h y b r i d i z a t i o nf o r m ，h y b r i d i z a t i o nb u f f e r e d s o l u t i o na n dt h et i m e so ft h ec l e a n i n gt oh y b r i d i z a t i o ne f f e c t 。t h i ss i z ea m p l i f ic a t i o n m e t h o dw a ss i m p l ea n dc o u l db ea p p l i e dt oo t h e rb i o m o l e c u l e s i n c h a p t e rt w o ，w ed e s c r i b e am a g n e t i cn a n o b e a d - b a s e ds i n g l e - m o l e c u l e e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nm e t h o do fd n ab yc o m b i n i n gd n aa m p l i f i c a t i o na n d e n z y m e - c a t a l y s i sa m p l i f i c a t i o n as a n d w i c h - t y p eh y b r i d i z a t i o na s s a yi sp e r f o r m e do n as t r e p t a v i d i n - c o a t e ds u b s t r a t e al a r g en u m b e ro fb i o t i n y l a t e dc a p t u r ed n a s ( c - d n a s ) a r ef i r s tc o v a l e n f l yb o u n d t ot h es u b s t r a t et h r o u g ht h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n s t r e p t a v i d i n a n db i o t i n t h e n ，t h ec o m p l e m e n t a r yt a r g e td n a s ( t - d n a s ) a r e h y b r i d i z e dw i t ht h ec - d n a sa t t a c h e dt ot h es u b s t r a t e ，f o l l o w e db yh y b r i d i z a t i o n b e t w e e nt - d n a sa n db i o t i n y l a t e df i r s tp r o b ed n a s0 一d n a1s ) c o n j u g a t e dt o s t r e p t a v i d i n - c o a t e dm a g n e t i cn a n o b e a d s ( 啪s ) i nt h i sc a s e ，o n et - d n a b i n d so n e m n b s u b s e q u e n t l y , t h em n b sa r er e l e a s e df r o mt h es u b s t r a t ea n dt r a n s f e r r e dt o a n o t h e rv e s s e l t h e n ，b i o t i n y l a t e ds e c o n dp r o b ed n a s ( p d n a 2 s ) a r eh y b r i d i z e dt o i l i 山东大学硕士学位论文 t h ep - d n a lso nt h es u r f a c eo ft h em n b s a f t e rm a g n e t i cs e p a r a t i o nf r o mt h e r e a c t i o nm e d i a , t h eb i o t i n y l a t e dp - d n a 2o nt h em n b sa r el a b e l e dw i t ha l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( a p ) c o n j u g a t e db ys t r e p t a v i d i nt h r o u g ht h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n s t r e p t a v i d i na n db i o t i n t h em n b sw i t hd n ah y b r i dl a b e l e db ya p ( a p - d n a - m n b s ) w i t he n z y m es u b s t r a t ed i s o d i u mp h e n y lp h o s p h a t e ( d p p ) a r ec o n t i n u o u s l yi n t r o d u c e d b yp r e s s u r et h r o u g hac a p i l l a r ya st h em i c r o s a m p l e ra n dm i c r o r e a c t o rb ym e a n so fa m i c r o s y r i n g ep u m p a po nt h ea p d n a m n b sc o n v e r t sah u g en u m b e ro fd p pi n t o i t sp r o d u c tp h e n o la r o u n de a c ha p - - d n a m n bd u r i n ga p - d n a - m n bm o v e m e n ti n t h ec a p i l l a r y t h ep h e n o lz o n e sw i t ht h em o v i n ga p - d n a - m n b sa r ec o n t i n u o u s l y d e l i v e r e dt ot h ec a p i l l a r yo u t l e ta n dd e t e c t e db ye l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n o n e p h e n o lz o n ec o r r e s p o n d i n gt oo n et - d n ap r o d u c e so n ep e a ko ne l u t i o nc u r v e t h e n u m b e ro ft h ep e a k si sl i n e a r l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no ft d n ai nar a n g e o f5 0 1 0 d 6 _ 1 0 1 0 d 3 t h eh i g hs e n s i t i v i t yi sb e c a u s et h a ti nt i l i sm 劬o d ，p h e n o li s d e t e c t e dr a t h e rt h a nt - d n a t h ep h e n o li sg e n e r a t e dt h r o u g hd o u b l ea m p l i f i c a t i o n ， o n et - d n am o l e c u l e p r o d u c e s 7 0 0 0a pm o l e c u l e so nt h es u r f a c eo fo n e a p - d n a m n b ( d n aa m p l i f i c a t i o n ) a n do n ea pm o l e c u l ep r o d u c e s5 x10 。p h e n o l m o l e c u l e s ( e n z y m ea m p l i f i c a t i o n ) t h e r e f o r e ，a l la m p l i f i c a t i o nf a c t o ro f 10 8i s o b t a i n e di nt h em e t h o d w h i c hl e a d st ot h a te l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u ec a nd e t e c t s i n g l ed n a m o l e c u l e s t h eq u a n t i t a t i v em e t h o dr e l i e so nc o u n t i n gt h en u m b e ro ft h e p e a k sc o r r e s p o n d i n gt os i n g l et - d n am o l e c u l e sr a t h e rt h a ns i g n a li n t e n s i t yo ft h e p e a k s t h u s ，t h ed e t e c t e ds i g n a li n t e n s i t yi sn o ti m p o r t a n t t h i sf e a t u r eg u a r a n t e e st h e r e l i a b i l i t yo ft h ee l e c t r o c h e m i c a l l yq u a n t i t a t i v ea s s a yf o rd n a a d d i t i o n a l l y ，t h e s e l e c t i v i t yo ft h em e t h o di sh i g h k e y w o r d s ：m a g n e t i cs p h e r ed n a ；s i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o n 山东大学硕士学位论文 s e c m s t d s t m a f m s e m 心 d p p p b s c c d s c e a p d f i t c p c r 刀灭 r s d 符号与缩写 扫描电化学显微镜 单分子检测 扫描隧道显微镜 原子力显微镜 扫描电子显微镜 碱性磷酸酶 磷酸苯二钠 生理盐水 电荷偶合器 饱和甘汞电极 双光子计数雪崩二极管 异硫氰酸荧光素 聚合酶链式反应 全内反射 相对标准偏差 v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：查盐拯e l 期：塑墨：堕呈f 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：查盐丛导师签名 山东大学硕士学位论文 第一章基于体积放大技术的单个d n a 分子的检测 1 1 引言 过去的十年中，在分析化学领域水溶液中的单分子检测( s i n g l em o l e c u l e d e t e c t i o n ，s 加) 技术已经有了显著的发展 1 - 6 。建立了各种基于单分子技术的 定量方法 7 1 2 。具有单光子和双光子计数雪崩二极管( a p d ) 的s m d 共聚焦 显微镜已经被用来检测微流控电泳通道中单个荧光分子 7 以及单个荧光染料标 记的生物分子，如抗体蛋白复合物 1 0 】和d n a 分子 9 。使用荧光显微镜和普 通电荷耦合器( c c d ) ，单分子计数荧光成像已经被应用到检测毛细管中d n a 的电迁移 1 1 。而建立在两种不同折射介质的界面上产生的全内反射( t 瓜) 光 基础上的隐逝波也可以作为有效的s m d 计数技术 1 2 。电化学方法也己用于 s m d 1 3 1 。s m d 近几年在分析领域得到快速的发展。归纳这些方法可以看出， 都采用了信号放大技术。在荧光s m d 分析中，人们是利用在光的激发下，分子 在基态及激发态之间反复转换产生的光子爆发进行信号放大的。在电化学s m d 中，利用了分子的氧似还原特性让单个分子在相距1 0a m 的两电极间反复进行 氧化还原反应以放大电信号。这些方法需要昂贵的仪器( 如荧光s m d 分析) 及 高难度的技术( 如电化学s m d 分析) 。 炭疽( a n t h r a x ) 是由炭疽杆菌引起的一种急性、烈性人畜共患和自然疫源性 的传染病，由于这种疾病的症状类型之一是引起皮肤等组织发生黑炭状坏死，故 称为“炭疽” 1 4 。炭疽芽孢杆菌( b a c i l l u sa n t h r a c i s ) 是炭疽病的病原体，是人类 历史上第一个被发现的病原菌 1 5 。炭疽芽孢杆菌革兰氏染色呈阳性，能以芽孢 形态在土壤中长期存活，是食草动物的一种重要致病菌，并通过呼吸道、消化道 和皮肤接触感染人类，以皮肤型炭疽最常见。人类感染炭疽后很少相互传播，因 而以散发病例和小暴发为主。人间炭疽病例以皮肤炭疽最为常见，肺炭疽及肠炭 疽病死率高 1 6 。由于炭疽芽孢在环境中的抵抗力极强，易生产，在军事上一直 被列为头号生物战剂 1 7 。自美国9 1 1 恐怖事件发生以后，炭疽更加受到了社 会的关注，更引起广大科学工作者研究的兴趣 1 8 ，1 9 。g e n b a n k 中已登录炭疽 芽孢杆菌a 2 0 1 2 株的基因序列 2 0 3 。其中炭疽致命因素序列( 5 g g a t t a t g t t aa a ta t t g a t a a g g a t3 ) 更是研究的热点 2 0 一2 4 。从1 9 8 5 年p c r ( 聚 合酶链式反应) 技术出现以来，p c r 技术已经对生物和医学领域产生了巨大的影 山东大学硕士学位论文 响 2 5 2 8 。然而，由于p c r 反应条件苛刻、价格昂贵并且耗时长，其它没有酶 标记的d n a 分析方法也得到了发展，如：放射性标记法，分子染料法，化学发 光法，电化学标记法，尤其是最近又提出了纳米粒子标记的方法 2 9 3 7 。在上 述方法中为了达到高灵敏度或者单分子水平也需要采用高档的仪器设备或繁琐 的检测步骤。 本文提出了一种基于体积放大技术的，新的，简单的对炭疽热单分子的检测 方法。在这个方法中我们采用修饰有检测探针的磁球、单个目标d n a 分子和固 定在聚乙烯微孔板上的捕捉探针进行夹心反应，进而使磁球连接到微孔板上。在 普通的光学显微镜下，通过检测磁球数目来检测目标d n a 分子。实验过程分四 步进行： 第一步，磁球与检测探针的结合：取一定量链霉亲和素修饰的的磁球( 磁球 直径5 9 1g m ) 加过量的生物素化的检测探针溶液，反应完毕后，利用磁分离除 去过量的检测探针，得到结合了检测探针的磁球。如图1 1 a 所示。 第二步，捕捉探针的固定及与目标d n a 的结合：链霉亲和素修饰的聚乙烯 板上滴加生物素化的捕捉探针，反应完毕，用p b s 缓冲液洗去未反应的捕捉探 针。然后滴加目标d n a 溶液，使其与捕捉探针杂交，最后洗净固定好目标d n a 的聚乙烯板。如图1 1 b 所示。 第三步，检测探针与目标d n a 的杂交：将第一、第二两步反应的产物按一 定比例混合，进行第二次杂交反应，通过目标d n a 与检测探针的杂交，使形成 捕捉探针一目标一检测探针一磁球的结构。如图1 1 c 所示。 第四步，显微镜观察检测：用倒置显微镜以1 0 或2 0 倍物镜用d p 7 0 照相 机照像或1 0 0 或x 2 0 0 倍用眼观察。由于结合在板子上的磁球为5 9 1l a i n ，在显 微镜下很容易观察到。 如果在上面的第一步中，使固定在微孔板上的目标d n a 足够稀，通过杂交 反应最终一个磁球上只结合一个目标d n a 分子。这样，通过对磁球的计数检测， 就等于实现对单个d n a 分子的计数检测。 2 【j 东大学硕士学位论文 a b c 篱墨渗 糍魏 i i ll l i i i i i i i s t r e p t a 、7 i d i n c o a t e ds u b s t r a t e 舻 w a s h i n g 图1 1 检测原理示意图 一b i o t i n y l a t e dc d n a wb i o t i n y l a t e dp - d n a t - d n a s t r e p t m i d i n c o a t e dm n b 鎏 山东大学硕士学位论文 1 2 实验部分 1 2 1 实验仪器 i x 8 1 倒置荧光显微镜( o l y m p u s ，j a p a n ) ；d p 7 0 照相机( o l y m p u s ，j a p a n ) ； 卤素灯( l g - p s 2 ，o l y m p u s ，j a p a n ) ；超声清洗机( b r a n s o n2 0 0 型，中美合资必 能信超有限公司，上海) ；5 1 0 型超级恒温器( 上海市实验仪器总厂，上海) ：磁 珠分离架( p r o m e g a 公司，w i ，u s a ) ；蒸汽消毒器r c y x q 6 0 2 型，山东新华器械 厂，山东) 。 1 2 2 材料与试剂 链霉亲和素修饰的磁性微球( 简称磁球，lm l 包装，密度为8 5 7 x 1 0 7 个m l ， 直径为5 9 1 1 a m ，b a n g sl a b o r a t o r i e s ，c a r m e l ，i n ，u s a ) ；生物素化捕捉探针( 分 子量为9 6 8 1 1 7 ，碱基序列为：5 n 蛆c a a t a at c c t t t t r 丌t t r r r t r r r t t t t t t t b i o t i n3 ，) ；生物素化检测探针( 分子量为1 0 5 8 4 7 2 ， 碱基序列为：5 b i o t i n t t t t t r r r t t t t t t t t t t r t ta t cc t ta t ca a ta t t 3 ) ；目标d n a ( 分子量为8 3 6 5 4 ，碱基序列为：5 - g g at t at t g t t aa a ta t t g a ta a gg a t 3 ) 均购自北京赛百盛公司；氢氧化钠( n a o h ，a r ，天津市博 迪化工有限公司，天津) ；三羟甲基氨基甲烷( t r i s ，纯度 9 9 8 ，a m e r s c o 分装，s o l o n ，o h ，u s a ) ；t w e e n - 2 0 ( s i g m a ，s t l o u i s ，m o ，u s a ) ；浓盐酸 ( 分析纯，淄博化学试剂厂，淄博) ；无水乙醇，丙酮( 分析纯，天津市富宇精 细化工有限公司，天津) ；环氧树脂胶( j c 3 1 1 型，江西省宜春市化工二厂，宜 春) 。修饰有链霉亲和素的聚乙烯9 6 孔板( $ 6 9 4 0 ，s i g m a ，s t l o u i s ，m o ，u s a ) 。 t t l 缓冲溶液：1 0 0m m o l lt r i s - h c l ，0 1 t w e e n 2 0 ，1m o l ll i c l ，p h8 0 。 t t 缓冲溶液：2 5 0m m o l l i r i s h c l ，o 1 t w e e n 2 0 ，p h8 0 。 t t e 缓冲溶液：2 5 0m m o l lt f i s - h c i ，o 1 t w e e n 2 0 ，2 0m m o l ln a 2 e d t a , p h8 0 。 t e 缓冲液：1 0m m o l lt r i s - h c l ，lm m o l ln a 2 e d t a ，p h 8 0 。 杂交缓冲液：1 0m o l l n a c i 溶液。 生理盐水( p h y s i o l 晒c a lb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ，0 1m o l l n a c i ，7 6 1 0 am o l l n a 2 h p 0 4 ，2 4 x 1 0 一m o l l n a h z p 0 4 ，p h7 4 ) ：称取n a c i1 1 7 9 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 0 5 1 6g ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 0o 0 8 7g 溶于水中，然后定容至2 0 0m l 容量瓶中，现用现 4 山东大学硕士学位论文 酉已。 lm l 链霉亲和素修饰的磁性微球，每5 0 止一份分装，4 。c 保存。 1 0 0i _ u n o l l 捕捉探针溶液：将装有7 9n m o l 固体粉末状的捕捉探针的1 5m l 离心管置于离心机中，1 0 0 0r p m 离心1m i n ，加入7 8 9 止灭过菌的t e 缓冲液， 振荡使其充分溶解后，一份分装3 9g l ，其余的平均分装成1 5 份，每份5 止， 2 0 0 c 存放。溶解与分装操作在超净工作台中进行。低浓度捕捉探针由此用灭过 菌的t e 缓冲液稀释而得。 1 0 0g r n o l l 检测探针溶液：将装有3 4 4n m o l 固体粉末状的检测探针的1 5m l 离心管置于离心机中，1 0 0 0r p m 离心lm i n ，加入3 4 4 止灭过菌的t e 缓冲液， 振荡使其充分溶解后，一份分装2 4 皿，其余的平均分装成1 6 份，每份2 0 止， - 2 0 0 c 存放。溶解与分装操作在超净工作台中进行。低浓度检测探针由此用灭过 菌的t e 缓冲液稀释而得。 1 0 0l a m o l l 目标d n a 溶液：将装有7 9n m o l 固体粉末状的目标d n a 的1 5 m l 离心管置于离心机中，1 0 0 0r p m 离心lm i n ，加入7 8 9 p j _ , 灭过菌的t e 缓冲 液，振荡使其充分溶解后，一份分装3 9 止，其余的平均分装成1 5 份，每份5 止， - 2 0 * ( 2 存放。溶解与分装操作在超净工作台中进行。低浓度检测探针由此用灭过 菌的t e 缓冲液稀释而得。反应前置于9 0 0 c 左右的水浴中加热5m i n ，然后迅速 置于冰浴中冷却1 0m i n 。 溶解与分装操作在超净工作台中进行。低浓度检测探针由此用灭过菌的t e 缓冲液稀释而得。 除注明外，所用其他试剂均为分析纯，溶液用二次蒸馏水配制。实验中所用 液体均需消毒使用。另外，所用溶液均用孔径为0 2 2g r n 的混合纤维素酯微孔滤 膜过滤。 1 2 3 实验方法 1 2 3 1 高压灭菌 生物素化d n a 和链霉亲和素的微球等生物产品，保存或使用不当就会变质 或失活，同时也要防止外源性的污染，因此在实验过程中，需进行必要的灭菌操 作，以将微生物的污染程度降至最小。首先需要对溶解分装生物产品所需的离心 管及次性吸头用电热压力蒸汽消毒器进行高压灭菌。灭菌的基本操作步骤如 山东大学硕士学位论文 下：1 打开锅盖，向锅内加入适量水，使水面与桶底的三角支架持平，并把内 桶放在三角支架上；2 将所要灭菌的离心管及一次性吸头包在塑料袋内，连同 需要灭菌的溶液一齐放入内桶，并保持一定距离，以免影响蒸汽流通和灭菌效果； 3 加盖，旋紧螺旋，打开放气阀，接通电源加热，冒蒸汽约1 0m i n 后关闭放气 阀；4 待压力升至0 1 4 a 时，切断电源，当压力降至0 1 0 a 时再打开电源， 将压力保持在该范围内约2 0m i n ，切断电源，停止加热；5 压力降至0 a 时， 打开锅盖，取出灭菌物品，置于超净工作台中至室温。用蒸汽消毒器高压灭菌的 同时，把移液器( o 5 - 1 0 止可调、5 0 此、1 0 0 止，e p p e n d o r f ，h a m b u r g ，德国) 放入超净工作台中，打开紫外灯进行消毒。由于购买的生物素化d n a 粉末状的， 所以在使用之前需要将其溶解，为了避免重复取样带来的污染，溶解后还需对其 进行分装。 1 2 3 2 磁球的清洗 由于磁球中含有大量的表面活性剂，使用前需清洗。向1 0 止的磁球( 密度 为8 5 7 1 07 个m l ) 中加入4 0 0 止t t l 缓冲溶液，混合均匀。将离心管置于磁球 分离架上，3m i n 后用移液器轻轻将溶液吸出，弃去。重复上述操作1 0 次，最后 得到1 0u l 的磁球( 密度为8 5 7 107 个m l ) 待用。 图1 2 磁球分离架 1 2 3 3d n a 的单分子显微观测 1 2 3 3 1 检测探针在磁球表面的化学键合 取清洗后的磁球1 0 止加入到5 0 此t t l 溶液中。把一定量的检测探针置于 9 0 。c 左右的水浴中加热5m i n ，然后迅速置于冰浴中冷却1 0m i n 。将冷却后的检 测探针( 5 0v - l ，1 1 0 6 m o l l ) 加到含磁球的t t l 溶液中，使检测探针摩尔数： 磁球上可接物质摩尔数约为2 0 ：l 。室温反应3 0m i n 后，按照磁球说明书，用0 15 6 山东大学硕士学位论文 m o l ln a o h 溶液清洗2 遍，以除去非特异性结合的探针，再用t t 溶液清洗2 遍，再加入t t e 溶液清洗2 遍，最后置于8 0o c 的水浴中1 0m i n ，4o c 保存备用。 1 2 3 3 2 捕捉探针及目标d n a 在聚乙烯微子l 板上的固定 把底部铺有链霉亲和素的聚乙烯微孔板用p b s 冲洗干净，取5 0g m o l l 的1 0 止的捕捉探针置于9 0o c 左右的水浴中加热5m i n ，然后迅速置于冰浴中冷却1 0 m i n 。将冷却后的捕捉探针以及5 0 止p b s 溶液滴加到微孔池内，2 5o c 下反应2h ， 反应完成后，将溶液弃去，用p b s 冲洗板子5 次，然后加入1 0m o l l n a c i 洗3 遍后，加入适当浓度的目标d n a1 0 止，5 0 此1 0m o l l n a c i 溶液，2 5o c 下在 保湿盒内反应6 也如图1 3 。反应完成后，用p b s 溶液将板上的未反应的目标 d n a 洗净。 保湿盒 水位线 图l - 3 反应装置示意图 1 2 3 3 3 键合上探针的磁球与微孔板内里的目标d n a 的结合 将结合了检测探针的磁球3 0 止( 密度为8 5 7 x 1 0 4 个止) 用移液器打匀迅速 加入到结合了目标d n a 的微孔池内，加入5 0 止的1 0m o l ln a c l 溶液，室温 下在保湿盒内反应6h 。反应完成后，将溶液弃去，用p b s 溶液冲洗微孔板八次 ( 注意：冲洗时轻轻沿板壁吸取溶液) 。 1 2 3 3 4 显微镜观测 目标d n a 分子通过与检测探针的杂交反应后，就把磁球连接到目标d n a 上了，由于使用的磁球直径5 9 1l a i n ，可在显微镜下观察到。故将杂交后带有磁 球的聚乙烯板放置在倒置显微镜下，以1 0 或x 2 5 倍物镜用d p 7 0 照相机照像或 1 0 0 或2 5 0 倍用眼睛观察，就可得到磁球数量，由于控制每个磁球只连接一个 7 山东大学硕士学位论文 目标d n a 分子，故计数得到的磁球数目，就是目标d n a 的数目。 1 3 结果与讨论 1 3 1 目标d n a 、捕捉探针和检测探针的选择与确定 实验选取目标d n a 的标准品由北京赛百胜生物技术有限公司设计引物并 p c r 扩增得到。目标d n a 分子，捕捉探针与检测探针序列的选择应遵循下列原 则 3 8 ： l - 探针长度一般要求在1 8 - 5 0 个碱基之间，过长的探针不仅合成困难， 而且杂交时间也长，过短则特异性降低； 2 g 和c 的组成在4 0 - 6 0 之间，超出此范围会增加非特异性杂交； 3 探针内部应无互补区域存在，即不应含有大于4 个碱基的反向互补区域， 否则探针内部会形成“发夹结构； 4 避免同一碱基重复出现，一般不能超过4 个，如伽一或- c c c c 一； 5 一旦确定了一种符合上述原则的序列，应将探针序列与其来源序列区域 或基因组基因，以及该区域的反相互补成分进行比较。若与非目标分子区域的同 源性大于7 0 或超过8 个连续碱基，该探针序列就不应该使用。 另外在磁球以及板上连接d n a 时，考虑到空间位阻 3 9 ，在设计捕捉探 针、检测探针的碱基序列时，分别在3 端和5 端增加了2 0 个胸腺嘧啶，确定碱 基长度为3 0 个碱基左右，目标d n a 分子为2 7 个碱基，捕捉探针为3 2 个碱基， 检测探针为3 5 个碱基。捕捉探针和检测探针由北京赛百盛有限公司合成并进行 生物素标记。 1 3 2 杂交条件的选择 1 3 2 1 杂交方式的选择 d n a 的杂交反应有两种方式，即一步杂交法和两步杂交法。在一步杂交方 式中，检测探针、捕捉探针和目标d n a 混合在一起反应，如图1 - 4a 图所示。 两步杂交方式中，目标d n a 先与捕捉探针进行第一步杂交反应，然后再与检测 探针进行第二步杂交反应，如图l _ 4b 图所示。 8 山东大学硕士学位论文 九龇+ + 饕一 图l - 4 杂交反应的示意图 a ，一步杂交反应；b ，两步杂交反应 遴 我们分别用两种杂交方式进行反应，然后对杂交后的板上的磁球进行显微镜 下观测，如图1 - 4 所示。从图片上磁球的数目可以看出，两步杂交方式显然比一 步杂交方式观测到的磁球的数量要多，说明用两步杂交方式，将捕捉探针、目标 和带磁球的检测探针三者结合在一起的效率要高。所以，以下的实验均采用两步 杂交方式进行。图片还出现了少量的双磁球和多磁球的聚积体( 图1 5 b1 ，在 后面的实验中应尽量将小球打匀，避免聚积。 一一 ab 图l 一5 拍摄的两种不同杂交方式下的杂交结果照片 杂交过程中加八捕捉探针，目标d n a 的浓度分别为1 1 0 、l 1 0 - 1 4 t o o l 几，体积分别为5 0 止，1 0i i l ；o8m o l l n a c i 溶液；结台检测探针的碰球4 止。反应温度2 5 0 ，一步杂交时 间为1 0 小时，两步杂交时间分别为6 小时、6 小时a ，b x 2 5 物镜：a ，一步杂交：b 两步 杂交 0 山东大学硕士学位论文 1 3 2 2 杂交缓冲液浓度的选择 杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，如杂交时间、探针浓度和 探针长度( 复杂度) 等。杂交缓冲液的浓度对杂交效果也有很重要的影响。为了 对比在不同的杂交液浓度下的杂交效果，在四个聚乙烯微孔板，分别用1 0 0 0 m m o l l ，5 0 0 m m o | l ，5 0 m m o l l ，5 m m o l l 的杂交缓冲液( n a c i 溶液) 的浓度， 实验了用5 0u l lx 1 0 4 m o l l 的捕捉探针，1 0u l l 1 0 1 4 m o l l 目标d n a 分子， 3 0 止己结合有检测探针的磁球，杂交反应时间为8 小时、反应温度为2 5 c ，按 两步杂交方式进行，杂交后冲洗的次数都取8 次的微孔板，在显微镜下观测板上 同一区域下磁球的照片( 图1 _ 6 ) 。由图1 - 6 的结果表明，使用浓度较大的杂交缓 冲液时，杂交的效率较高，即杂交得到的杂交物数量多。以下的实验中杂交缓冲 液浓度均选择10 m o l l 的n a c l 溶液。 a b 誓簟 cd 图卜6 不同杂交缓冲液浓度下进行杂交反应的结果照片 a ，缓冲液浓度为1 0 0 0 m m o l l ；b ，缓冲液浓度为5 0 0 m m o l l ；c ：缓冲液浓度为5 0 m m o l l ： d ：缓冲液浓度为5m m o | l ：其他反应条件同1321 中的两步杂交条件，a ，b ，c ，d x 2 5 物镜 1 0 山东大学硕士学位论文 1 3 2 。3 磁球与检测探针、目标i ) n a ，捕捉探针与目标i ) n a 的比例选择 为了保证足量的捕捉探针与磁球表面的链霉亲和素结合，我们首先估算了磁 球表面链霉亲和素的数量。从厂商提供的数据( 磁球的结合能力g 为；0 0 4 嵋 b i o t i n f i t c m g ，磁球浓度c 为：8 5 7 x 1 0 7 个m l ，b i o t i n f i t c 的分子量m 为： 8 3 1d a l t o n s ) 。 f ， 由公式 6 门= 一 m c 可算出每个磁球上可接物质的摩尔数力为5 6 2 1 0 。1 8m o l 。因为磁球浓度c 为8 5 7 x 1 0 4 个皿，所以每微升磁球上的结合能力为4 8 x 1 0 1 3m o l ，实验中根据 这个数据得出与磁球反应的检测探针的量是磁球上理论结合位点数的2 0 倍以上 与1 此磁球表面的链霉亲和素结合，检测探针的量为1 0 止，1 1 0 。6 m o l l 。 依据9 6 孔聚乙烯板的说明书显示，每个微孔板的结合生物素的能力至少为 3 0 0p m o l e s ，因此加入的生物素化的捕捉探针为5 0 皿，1 0i j m o l l 以保证加入的 分子数目能与板上的链霉亲和素反应完全。 为了保证每个磁球上只连接一个d n a 分子，我们从理论上对此进行了分析。 依据9 6 孔聚乙烯板的说明书显示，每个微孔板的底面积为3 3 2 x 1 0 巧m 2 ，直径为 5 9 1 岬的磁球的最大截面积为2