（环境工程专业论文）给水管网水质及管壁生物膜细菌学研究.pdf

摘要 给水管网输送人们赖以生存的饮用水，在整个供水体系中占有重要的地位， 在保证水质安全方面起着重要作用。本文通过对给水管网水质监测及对管壁生物 膜的研究，对能够危害给水管网水质的潜在因素进行了分析，为保障饮用水的安 全输配提供技术支持。 首先，本文选定对实验室小型模拟给水管网与某校园实际管网进行定期取样 监测，并对配水管网常规水质指标的变化规律、影响细菌总数( h p c ) 的相关指 标及水质生物稳定性进行研究与分析。分析表明常规指标与配水管网中的细菌的 生长关系密切，因此对管网浊度、余氯等方面的控制对保证管网水质方面有重要 意义。对a o c 、b d o c 等反映管网水有机物水平的指标进行分析表明，管网水 中有机物含量较高，水质处于生物不稳定状态，对管网水质安全有潜在的危害。 其次，本文运用分子生物学技术对模拟给水管网的管壁生物膜进行了深入研 究，选定大肠菌群和铜绿假单胞菌种属作为研究对象，对两种群细菌基因组中 1 6 s r d n a 进行特异性扩增。在生物膜样品和管网水样品中均可检出大肠菌群， 与水质监测结果对比，说明运用p c r 扩增检验技术更加准确、可靠。而对管网 水和生物膜样品进行p c r 扩增，均未检出铜绿假单胞菌属存在，说明管网水质 较为安全。 本文还创新性的运用实时荧光定量p c r 技术对大肠菌群进行定量研究，建 立了基于s y b rg r e e ni 的实时荧光定量p c r 技术的研究大肠菌群的方法，形成 了一整套对给水管网微生物进行定性、定量研究的方法，并确定了生物膜及管网 水中大肠菌群在总细菌中的比例。 最后，本文对影响管网微生物在生长的因素进行了探讨，并在此基础上，提 出了抑制管网细菌生长，提高给水管网水质，降低水质微生物风险的有效措施。 关键词：给水管网生物稳定性生物膜大肠菌群实时荧光定量p c r a b s t r a c t t h ew a t e rs u p p l yn e t w o r kw a sa ni m p o r t a n tp a r ti nt h ew h o l ew a t e rs u p p l y s y s t e m s ，a n dc a r r i e sd r i n k i n gw a t e rt h a th u m a n sd e p e n d e do n i tp l a y e dak e yr o l ei n p r o t e c t i n gs e c u r i t yo fw a t e rs u p p l y t h r o u g ht h em o n i t o r i n go fw a t e rq u a l i t yi nt h e n e t w o r ka n dt h er e s e a r c ho nt h ep i p e l i n eb i o f i l n = l ，t h ep a p e rg a v et h ea n a l y s i so f f a c t o r st h a te n d a n g e r e dt h ew a t e rq u a l i t yi nd r i n k i n gw a t e rs y s t e m , w h i c hp r o v i d e d t e c h n i c a ls u p p o r tf o rg u a r a n t e et h es e c u r i t yo fw a t e rs u p p l y f i r s t l y , t h es i m u l a t i v ed i s t r i b u t i o nn e t w o r ki nt h el a ba n dt h ep i p e l i n en e t w o r k w e r ec h o s e nf o rt h es a m p l i n ga n dt h em o n i t o r i n g r e s e a r c ha n da n a l y s i sw e r ea l s o c a r r i e do nt h er e g u l a r i t yf o rt h ec h a n g eo ft h ec o n v e n t i o n a li n d i c a t o r s ，t h ei n d i c a t o r s t h a ta f f e c t e dt h eh e t e r o t r o p h i cp l a t ec o u n t s ( h p c ) a n dt h eb i o l o g i c a ls t a b i l i z a t i o ni n d r i n k i n gw a t e r i tc a m et ot h ec o n c l u s i o nb yt h ea n a l y s i so ft h ee x p e r i m e n t a ld a t at h a t c o n v e n t i o n a li n d i c a t o r sh a dc l o s er e l a t i o n s h i pw i t ht h er e g r o w t ho fb a c t e r i a f o rt h a t r e a s o n , i tw a si m p o r t a n tt oc o n t r o lt h et u r b i d i t y , t h er e s i d u a lc h l o r i n ea n do t h e rf a c t o r s t h ei n d i c a t o rt h a ti n d i c a t e dt h ec o n t e n to ft h eo r g a n i cm a t t e r si nd r i n k i n gw a t e rw e r e a l s os t u d i e d i ts h o w e df r o mt h es t u d i e so fa o c ，b d o ct h a tt h ec o n t e n to fo r g a n i c m a t t e r sw a sh i g h e rt h a nt h es t a n d a r d ，a n dt h ew a t e rw a sb i o l o g i c a lu n s t a b l e ，w h i c h h a dp o t e n t i a l l yd a n g e ro nt h es e c u r i t yo fw a t e rs u p p l y s e c o n d l y , t h ep a p e rd i s c u s s e dt h er e s e a r c ho np i p e l i n eb i o f i l mi nt h es i m u l a t i v e d i s t r i b u t i o nn e t w o r ku s i n gm o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n o l o g i e s t h e16 s r d n as e q u e n c e o fe c o l ia n dt h ep s e u d o m o n a sw e r ec h o s e nt ob ea m p l i f i e d t h er e s u l ts h o w e dt h e e x i s t e n c eo fe c o l ib o t hi ns a m p l e so ft h eb i o f i l ma n ds a m p l e so ft h ed r i n k i n gw a t e r c o m p a r e dt ot h em o n i t o r i n go f t h eb a c t e r i au s i n gt h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d s , t h et e s t b a s e do np c ra m p l i f i c a t i o nw e r em o r es e n s i t i v ea n dr e l i a b l e b e s i d e s ，t h e r ew e r en o s i g n a l ss h o w i n gt h ee x i s t e n c ei nb o t hs a m p l e s ，w h i c hm e a nt h ed r i n k i n gw a t e rw a s r e g u l a r l ys a f e ar e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c rm e t h o dw a si n n o v a t i o n a lu s e di nt h es t u d yo f b a c t e r i ai nd r i n k i n gw a t e r t h em e t h o dw a su s e dt os t u d yt h ee c o l ii np i p e l i n e b i o f i l m a n dar e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c rm e t h o db a s e do ns y b rg r e e nit os t u d y t h ee c o l iw a se s t a b l i s h e d ，w h i c hr e p r e s e n t st h ew h o l en e ww a yo nt h er e s e a r c ho f b a c t e r i ai nw a t e rd i s t r i b u t i o ns y s t e mw a sf o u n d t h ec o n t e n to fe c o l ii nt o t a lb a c t e r i a w a sd e t e c t e db ya n a l y z i n gt h eb i o f d ms a m p l ea n dt h ew a t e rs a m p l e l a s t 堍t h ep a p e rd i s c u s s e dt h ef a c t o r st h a ta f f e c tt h eg r o w t ho fb a c t e r i ai nw a t e r s u p p l y n e t w o r k o nt h i s b a s i s ，e f f e c t i v e m e a s u r e sa b o u th o wt or e d u c et h e m i c r o b i o l o g yr i s ka n di m p r o v et h ew a t e rq u a l i t yo ft h ed i s t r i b u t i o nn e t w o r kw e r e b r o u g h tf o r w a r d k e yw o r d s ：w a t e rs u p p l yn e t w o r k , b i o l o g i c a ls t a b i l i z a t i o n , b i o f i l m , c o l i f o r m , r e a l - t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘望或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：才千若葑 签字日期：l 硼彦年月易勾日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解：墨鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 导师签名： 掺弛绎 i 签字日期：) 铀8 年f 月勺日签字日期；：加辟月乃9 日 第一章绪论 1 1 课题的提出及研究意义 第一章绪论 1 1 1 饮用水消毒及细菌在生长现象 水，孕育生命，是人类生命之源，是人们生产生活所必不可少的资源。而 被称为“城市生命线”之一的给水管网，其输送的是人们赖以生存的饮用水，更是 关系到人民生命财产安全的大事。世界卫生组织的调查表明：在发展中国家，各 类疾病有8 是因为饮用了不安全、不卫生的水而传播的，每年大约有2 0 0 0 万人 死于饮用不卫生的水，饮水安全问题严重地威胁着人类生命 i 】。因此，自来水的 水质安全历来是水质研究工作者所最为关注的。 最初人们认为通过投加消毒剂( 氯) 杀灭病原菌，同时保持管网末端一定的消 毒剂余量来控制细菌在管网中的生长( 例如我国国标中规定末梢余氯量不得低于 0 0 5 m g l ) 就可有效实现对微生物生长繁殖的控制。这是因为过去水源很少受到 污染，少有有机物，因此，出厂水少量的细菌，或被消毒剂灭活的细菌，即使恢 复了活力也没有营养可供细菌自身繁殖需要。但是如今的水源普遍遭受到污染， 水源水经水厂常规工艺处理后仍有有机物存在，这就为细菌在管网中的再生长提 供了有利环境。 而随着管网细菌再生长现象的发现，越来越多的研究者认为管网中细菌不 单单是大量投加消毒剂所能够解决的。目前大多数自来水厂出厂水都符合饮用水 卫生标准，但是出厂水在管网输送和水池( 箱) 储蓄过程中，管网与其输送的水体 构成一个庞大复杂的“反应器”，在其中会发生一系列的物化、生物反应，从而导 致消毒剂衰减，细菌滋生，水质变差。所以合格的出厂水在经过配水管网的转输 过程到达用户时，就会出现水质不合格现象。 因此，要保证人水安全就需要在保证水厂消毒效果的同时，采取更加安全 的措施对源水处理工艺进行改进，并保证配水管网的卫生安全。 1 1 2 影响给水管网水质的因素 影响给水管网水质的因素可以主要归纳为以下两个方面：水厂出水水质和 配水管道中水流的流量、流速等水利条件情况。因此对于管道水质控制就要从两 方面下手：一方面对水处理工艺进行完善，是水厂出水达到最优，另一方面对管 第一章绪论 网水的流量、流速条件进行改善，减少细菌在管道中的滋生，使出厂水经过管网 配水后水质能够维持一个较高的水平。 从水厂处理工艺上来说，由于现今我国主要水域饮用水水源均遭到了不同 程度的污染，致使水厂处理工艺并不能将原水中所有有利于细菌生长因素控制在 较低的水平。根据2 0 0 2 年水质监测资料显示七大水系7 4 1 个重点监测断面中， 2 9 1 的断面满足i 类水质要求，3 0 的断面属、v 类水质，4 0 9 的断面 属劣v 类水质。由于8 0 以上的污水未经处理就直接排入水域，已造成9 0 以 上的城市水域严重污梨2 1 。一方面水源方面的污染问题较过去更严重，而另一方 面传统净水工艺对水的处理方面，主要关注的还是消毒及净化方面，出厂水达标 情况较好，但是对于去除水中有机物质，抑制细菌在管网中再生长方面还有所不 足。从我国日益增长的经济生活，及人民生活的安全性考虑，我们亟需对净水工 艺作进一步改进，使出厂水的水质达到更为安全的水平。 在出厂水达到标准的同时，供水管网的安全性问题是另一个同样重要的问 题。供水管网直接与用户用水点连接，从这个方面讲供水管网的安全性会直接影 响用户用水的安全性。 目前我国常用的输配水管道有：灰口铸铁管、钢管、球墨管、给水塑料管 ( u p v c 管、p e 管等) 、压力水泥管、玻璃钢管等，目前在国内城市地下已铺设的 管道中，传统工艺铸铁管仍占相当大的比例。当出厂水带有腐蚀性或管道使用 年限过长时，铸铁管内壁就会腐蚀、结垢、沉积，锈蚀物中含有大量的铁、锰、 铅、锌和各种细菌，当管道内水流速度、方向或水压发生突变时，就会造成短时 间的水质恶化【4 】。而其他管材也会或多或少存在腐蚀、结垢、沉积等现象，这也 很大程度上对供水安全构成潜在威胁。因此及时更新改造老化陈旧管网，采用对 腐蚀、结垢有更强抑制作用管材等措施对保证水质安全方面有重大作用。 1 1 3 研究意义 本研究从微生物学角度出发，对给水管网水质及管壁生物膜中微生物进行分 析。饮用水的安全卫生归根到底就是如何抑制细菌微生物生长的问题，从微生物 学的角度对管网水质进行研究可以揭示影响水质的本质因素，更有助于从根本上 提高管网的安全性。 对给水管网中微生物种群的类型和数量进行及时和准确的分析测定可为饮 用水的安全卫生提供保障，但是检测水中所有的病原微生物是不切合实际的。实 用和可行的方法是检测既能指示粪便污染又能反映水处理和消毒效果的微生物。 常用的指示微生物是总大肠杆菌和粪大肠杆菌。但越来越多的国内外的研究成果 表明：总大肠菌群数并不足以反映病毒、原生动物和寄生虫的存在，许多微生物 第一章绪论 对氯的敏感性较肠道细菌迟钝的多。因此，以总大肠菌群数和粪大肠菌群数作为 卫生安全控制指标的科学性受到了挑战。而且，传统的微生物分析测定方法，包 括显微镜微生物形态观察、选择性培养基计数、纯种分离和生理生化鉴定等，在 环境样品研究中都存在一定的缺陷【3 】。因此，不少研究者开始寻找可替代的指示 微生物或可直接检测病原微生物的方法。分子生物学的发展使得免疫学法和分子 生物法在环境微生物学中的应用增加了在自然界中( 如土壤和水) 病原体微生物 含量较低的时候被检出的可能性。 同时由于饮用水水源的微污染问题，给水管网中不可避免的会出现微生物的 再生长问题。当生物不稳定水通入管网，就会形成了细菌的再生长现象，也就形 成了附着在管壁的生物膜。管网中构成生物膜的菌种里存在条件致病菌，即使常 规管网水取样中未检出细菌和大肠杆菌，实际上管网水仍然存在一定的微生物学 风险：水体通过生物膜的作用再度产生细菌的同时，为致病菌提供生存环境，致 使生物膜中病原微生物对饮用者的健康造成直接的威胁。因此，深入研究给水管 网管壁生物膜细菌情况对保证给水生物稳定性有重要的意义。 本课题采用先进的分子生物学方法针对给水管网水细菌的再生长规律、影 响因素、变化规律进行研究，同时对管网管壁生物膜进行深入研究，确定生物膜 中的优势菌和条件致病菌，分析其分布规律和变化情况，为采取有效措施抑制或 减缓饮用水中细菌再生长提供理论基础，降低管网水中的微生物风险，保证供水 水质。 1 2 国内外研究现状与发展 1 2 1 饮用水水质方面研究现状 人类历史上最早的关于水质优劣的标准是由罗马建筑师和工程师v i t r u r i u s 于公元前一世纪提出来的。他根据水在煮沸以后的反应，蔬菜在水中煮熟以后的 滋味以及人们饮用水后对健康的影响来确定水质的好坏【2 】。 在2 0 世纪中期以前，饮水领域的研究主要集中在保证饮水的卫生安全性方 面，饮水中病源性微生物的存在和传播所导致的流行病的爆发使得消毒剂在公共 饮水处理系统中得到了广泛的应用。到2 0 世纪中期以后，由于天然水体中污染 成分的数量和浓度迅速增长，使得饮用水卫生安全问题有了新的研究方向【4 1 。 目前国内外对管网水质研究主要有以下几方面 5 】：管网水的水质稳定性；有 关消毒剂和消毒副产物的研究：给水管网材质对管网水质的影响；建立管网水质 监控数学模型及仿真系统的研究。 第一章绪论 1 2 2 管网水的水质稳定性 管网水的水质稳定性主要包括两方面：化学稳定性和生物稳定性。 水质的化学稳定性是指水在管道输送过程中既不结垢又不腐蚀管道，水质 化学稳定性主要表现在腐蚀性和结垢性两方面【6 】。水质的化学稳定性判别指数分 为两大类，一类主要是基于碳酸钙溶解平衡的指数，如l a n g e l i e r 饱和指数、r y z n a r 稳定指数；另一类则是基于其他水质参数的指数，如l a r s o n 比率等。供水系统 中水质的化学稳定性问题普遍存在，又以腐蚀问题更为严重。出厂水的化学稳定 性差，必然导致给水管道内壁的腐蚀和结垢，当腐蚀产物被释放到水中后会降低 水质而结垢则降低了管道的输送能力，严重时甚至可使管道不能通水【_ 7 1 。 管网水生物稳定性【8 】是指水中可生物降解有机物支持异养细菌生长的潜力， 即当有机物成为异养细菌生长的限制因素时，水中有机营养基质支持细菌生长的 最大可能性。饮用水生物稳定性高，则表明水中细菌生长所需的有机营养物含量 低，细菌不易生长：反之，饮用水生物稳定性低，则表明水中细菌生长所需的有 机营养物含量高，细菌容易生长【9 】。 水源水经过净水厂的各道工序处理后，出厂时水质无论从化学方面指标还 是生物方面指标来说都基本能够到达人类安全饮用的标准，但是由于现代社会对 水源的污染，致使水中的有机物经过即使经过混凝、沉淀、过滤等传统处理方法 也不能够完全去除，从而使出厂水中含有微生物生长所需要的微量有机物和其他 营养物质，即形成了生物不稳定水。 目前，国际上普遍以可同化有机碳( a o c ) 和生物可降解溶解性有机碳 ( b d o c ) 作为饮用水生物稳定性的评价指标。a o c 是可生物降解有机物中可被细 菌转化成细胞体的部分；b d o c 是水中有机物中能被异养菌利用( 无机化和合成 细胞体) 的部分【9 】。它们的含量越低，细菌越不易生长繁殖。 1 2 3 消毒剂和消毒副产物的研究 消毒剂对微生物的抑制作用一直是水质研究者所最为关注的问题。国内外 学者研究的重点最初主要研究投氯量、余氯在水中的存在形式及消毒机理、影响 余氯消耗的各种因素、消毒效果等。当前的研究重点逐渐集中在管网中余氯变化 的动力学机制和衰减规律等方面。研究初期，所建立的模型大部分都是直接用数 学方法推导而来，并未从化学角度研究余氯在管网中衰减的动力学机制，因此不 能完全反映出余氯在管网中消耗的本质。随着对氯衰减激机理的深入研究，研究 者们更加注重在研究余氯衰减动力学模型中考虑了影响余氯消耗的管长、管径、 管材、流速、管道的敷设年代、管壁粗糙度、温度、反应活化能等因素，所以较 第一章绪论 全面地反映了余氯在配水管网中的衰减过程。现在对氯消毒剂的研究已经达到了 相当的深度，提出了多种确定余氯衰减系数的方法和余氯衰减模型，但模型的实 用性还有待进一步提高1 1 0 1 。 氯作为消毒剂对管网中的细菌生长有着很强的抑制作用，但是同时氯也是 较不稳定的物质，具有强氧化性，极易与水中含有的许多天然有机物反应。因此， 在加氯过程中会产生对人体有害的消毒副产物，这些消毒副产物主要有三卤甲烷 ( t r i m s ) 、卤乙酸( h a a s ) 、卤代氰( c y a n o g e nh a l i d e s ) 等十几种。目前对消毒副产 物的研究是管网水质研究的热点之一，主要研究的消毒副产物是三卤甲烷和卤乙 酸。国内外对于三卤甲烷的研究绝大多数集中在卤仿形成机理、卤仿形成的预测 模式及分析检出方法等研究方面。 1 2 4 给水管网材质对管网水质的影响 管网材质对水质的影响主要有两方面：管材与管网水发生的腐蚀反应( 电化 学反应) 和管材对水中微生物的影响( 生物反应) 。水在管内流动的过程中由于腐蚀 等原因，往往形成管内腐蚀、沉淀及结垢的情况，由于腐蚀等作用生成的各类沉 积物形成结垢层。它们的厚度和管道使用的年数有关，随着时间的延续不断增加， 管道有效截面积不断缩小。这不仅极大的影响管道的通水能力，同时由于腐蚀和 结垢的存在，为细菌的滋生提供了良好的场所。 从生物反应的角度讲管材内壁的光滑程度，腐蚀程度对生物膜的影响是非 常显著的。p a t r i c dn i q u e t t e 等研究了配水管网中不同管材对生物膜的影响，认为 铸铁管对管壁生物膜的影响最大，塑料管对管壁生物膜的影响最小】。目前， 国内外在管材方面的研究主要从化学和电化学角度进行的，从微生物学方面和毒 理学方面对管材和水质关系的深入探讨还较少。因此对管网管材的合理选择和抗 腐蚀技术的研究会对抑制管网中微生物的生长，提高供水安全有着重要的积极意 义。 1 2 5 给水管网仿真系统的研究 美国环境保护署( e p a ) 为了满足供水水质标准和人们的用水要求，研究开发 了e p a n e t 计算机模拟软件。这个软件描述了配水系统中的水力变化和水质变 化情况。在水质模拟方面主要可以研究不同水源的混合情况、整个管网的水龄、 余氯的衰减变化、消毒副产物的增长、污染物的传输路径等若干问题。国外海斯 德公司推出的w a t e r c a d 给水管网模拟程序也具有强大的水质模拟能力。 第一章绪论 1 3 给水管网微生物方面研究的热点问题 微生物是水传播疾病的重要原因。水中的微生物安全，是确保水质安全的 基础。因此对于供水管网微生物方面的研究一直是水质研究和水质监测的重点。 国内外对水质的研究主要集中在以下几个方面：微生物学水质模型的建立，管网 水的生物稳定性，管网内壁生物膜研究，供水管网细菌多样性研究。 1 3 1 微生物学水质模型的建立 管网水质模型是模拟水中物质( 包括余氯及污染物) 随时间在管网中的变化。 管网水质模型是在水力分析的基础上，利用计算机模拟水质参数或某种污染物在 管网中随时间和空间的分布。按照模拟系统的水力状态，配水系统水质模型可分 为稳态水质模型和动态水质模型；按照研究所涉及的水质参数，可分为余氯衰减 模型、消毒副产物模型和微生物模型。 在众多的饮用水水质指标中已有学者进行了研究的只有寥寥数种，而相对成 熟的就更少了。确定型模型中，余氯及其消毒副产物( d b p s ) 中的总三卤甲烷 ( t t h m s ) 的机理模型比较成熟，最近在部分细菌学指标方面的研究也取得了 一定进展；统计模型的建立需要大量的相关水质数据，目前已被提出的包括余氯、 t t h m s 、h a a s ( 卤乙酸) 等 1 2 , 1 3 。 在细菌学指标方面，今年来也有了长足的发展。对多元线性回归、神经网络 等方法的运用，已经对管网水中细菌总数等细菌学指标有了深入研究，并建立了 一系列统计预测模型。通过预测模型能及时的了解水中微生物的状况，这在一定 程度上改善了传统方法的滞后性，在细菌大量繁殖等突发事件发生时，能及时的 指示工作人员采取相应的措施，避免饮水事故的发生，从而起到水质预报、预警 的作用。但是由于细菌学指标的特殊性，使得水质模型只能反应有限的几个可以 测定的水质指标的影响作用，因此对于细菌学指标的模型研究还基本处于理论研 究阶段，其实用性还有待进一步研究。 1 3 2 管网水的生物稳定性 管网水的生物稳定性是水质稳定性的一方面，它表征了自来水在出厂后， 经过管网输送到用户的过程中，水中能够提供给微生物在生长所需的物质的一个 指标。当管网中通入生物稳定性高的水，管网中的细菌就不宜生长，管网的安全 系数就较高。因此对管网水的生物稳定性研究，对提高供水安全有着很重要的意 义。 第一章绪论 对于管网中微污染水的处理已经成为水处理工业的研究重点，对水中a o c 和b d o c 的去除方法归结起来主要有3 个方向：( 1 ) 是常规强化水处理工艺；( 2 ) 是深度处理技术；( 3 ) 为源水预处理技术。目前，已有一些行之有效的微污染水 处理技术，但仍有许多问题亟待解决。开发新技术、解决现有技术存在的问题以 及提高微污染水处理技术的经济性，进行多单元组合，将是微污染水处理技术重 点发展方向。 1 3 3 管网内壁生物膜研究 配水管网中微生物在生长现象是极为普遍的，因此生物膜是普遍存在的。“生 物膜”通常用来形容水环境中在聚合载体上连接在一起的一层微生物膜，聚合载 体通常附着于像管道、小的块状物或者沉淀淤积等基质上，成功的依附以及随后 微生物在表面上的生长导致了生物膜的形成【l 4 1 。 给水管网为贫营养环境，其中生长的细菌大多数是以有机物为营养基质的异 养菌。异养细菌所具有的独特的饥饿生存适应方式，以及几种异养菌可共同利用 大多数基质的特性，使得细菌在含有微量有机物的管网中生存成为可能。此外与 高营养基质相比，贫营养基质下生长的细菌对消毒剂具有更高的抗性，生物膜、 颗粒物质、管壁表面的保护作用也成为细菌能在管网中生长的重要原因 1 习。 在生物膜生长过程中，首先是微生物和营养物质运输到界面并发生积累，随 着微生物的增殖和细胞外化合物的分泌，生物膜逐渐形成。进入衰老期后，生物 膜不断从附生表面脱落 i6 1 。当给水系统的条件适合细菌生长时，在水处理过程 中存活下来的细菌或已经存在于给水系统中的细菌就成为了细菌繁殖的母体。给 水系统中的生物膜通常很薄，所能达到的最大厚度大概只有几百微米【l4 1 。 研究表明，生物膜的形成速率与管材的表面理化性质、表面粗糙度、发生粘 附的微生物的生理特征等密切相关。水力冲刷作用等则是使生物膜从附生表面脱 落的重要因素。 1 3 4 供水管网细菌多样性研究 用细菌群落的多样性指示环境污染，探索污染与细菌群落动态变化的关系等 离不开对细菌群落结构的描述。对环境中微生物种群的类型和数量进行及时和准 确的分析测定，在微生物生态研究中十分重要。由于自然界中大部分的微生物类 群的不可培养性，使得利用传统的依赖于微生物培养和纯种分离的技术来定量描 述微生物群落结构和多样性的重要参数( 如种的丰富度和平均度) 时受到严重制 约。另一个问题是，所有这些传统技术在培养过程中都不可避免地将微生物置于 或多或少偏离它们原来的小环境的、新的人为操纵的条件下，从而会改变有关微 第一章绪论 生物群落原来的结构【l7 1 ，准确地说是形成了与之并不完全相同的新的群落结构。 我国原生活饮用水卫生标准中的微生物指标只有总大肠菌群和菌落总数两 项指标，新标准中增加的耐热大肠菌群( 粪大肠菌群) 和大肠埃希氏菌两项指标， 均属于对总大肠菌群指标的细化。水质标准中的微生物指标仅能够从基本的卫生 安全角度对水质进行衡量，对于其他条件致病的分离分析并没有明确的方法。因 此近年来利用分子生物学技术对管网中细菌进行分析成为管网细菌学研究的主 要方法。目前，鉴定微生物种群中的单个微生物体主要是采用p c r 技术，直接 克隆测序【l8 】和微生物基因组中特定靶标基因的测序【l9 】。 1 4 分子生物技术在水质研究中的应用 随着分子生物学的迅猛发展，许多分子生物实验技术已运用于环境中微生物 的分类、鉴定和微生物种群动态分析中。而以p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， 聚合酶链反应) 技术为主的一些分子生物学技术因具有快速、灵活的特点，正在 被越来越多的研究者所采用。目前这些分子生物学技术已经能在r d n a 测序和有 关结构基因分析的基础上鉴定复杂的混合微生物群落中的一些特殊微生物，而且 其中许多技术都是在p c r 扩增的基础上来鉴定混合微生物群落中原本含量很低 的d n a 序列。近年来以2 3 sr r n a 的基因及1 6 2 3 sr d n a 间区( t s r ) 的序列分 析正在成为细菌分类和鉴定中的热点。总之，以d n a 基因分析方法为代表的核 酸技术将微生物多样性及微生物生态学研究带入了新的时代，极大地推动了微生 物多样性的研究。 1 4 1p c r 技术应用 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 由美国c e t u s 公司的m u l l i s 等于1 9 8 5 年提出，是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术。 此技术能快速、特异地在体外扩增所希望的目的基因或d n a 片段。p c r 可以看 成一项酶促合成d n a 技术，类似于细胞内的d n a 复制过程，但p c r 的反应体 系要简单的多，主要包括d n a 靶序列、引物、4 种单核苷酸d n t p 、耐热d n a 聚合酶以及合适的缓冲液体系。 p c r 扩增过程包括 2 0 】： ( 1 ) d n a 变性，采用高温使双链d n a 解链形成单链； ( 2 ) 退火，降低温度，在特定的杂交温度下，引物与单链d n a 互补结合， 形成杂交复合物； 第一章绪论 ( 3 ) 延伸，将温度调至d n a 聚合酶的最适温度，在此温度下，该酶以4 种 d n t p 为原料，根据碱基互补的原则，按照模板d n a 的序列，从引物的3 端开始， 逐一将d n t p 聚合上去。 p c r 扩增d n a 片段只是一个实验手段，真正的目的是对扩增产物进行分析。 根据研究对象和目的的不同可采用不同的检测方法。目前常用的有琼脂糖凝胶电 泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子杂交技术和p c r 扩增产物的直接测序等等。 1 4 2 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 技术 1 9 7 9 年f i s c h e r 和l e r m a n 首先提出了变形梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n t g e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 分析技术，并将其用于医学上基因点突变的检测。 与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，这项技术可以分辨只有一 个碱基差异的基因序列。p c r - - d g g e 技术自1 9 9 3 年被引入微生物生态学领域以 来，在研究微生物多样性和种群差异上已成为一种重要工具，避免了传统微生物 研究方法的局限性1 2 。 d g g e 是根据序列的不同，将片段大小相同的d n a 序列分开。双链d n a 分 子中，八t 碱基之间有2 个氢键，而g ，c 碱基之间有3 个氢键连接，因此，a ，t 碱 基对对变性剂的耐受性要低于g ，c 碱基对。由于这四种碱基的组成和排列差异， 使不同序列的双链d n a 分子具有不同的解链温度。 从环境样品中直接提取总d n a ，经p c r 扩增到含有某一高变区的目的d n a 序列产物，通过d g g e 得到图谱。因为每个条带很可能就代表一个微生物物种， 所以d g g e 带谱中条带的数量，即反映出该环境微生物群落中的优势类群的数 量。为了得到更详细的信息，往往采用种或类群专一性探针与得到的条带进行杂 交或将条带切下，重新p c r 扩增后测序，进而得到部分系统发育信息。 1 4 3 以1 6 s r r n a d n a 为基础的分子生物学技术简介 细菌核糖体的核糖核酸( r i b o s o m er i b o s en u c l e i ca c i d ，r r n a ) 序列分析方法， 即r r n aa p p r o a c h 尤其是1 6 sr r n a 序列分析已成为一个分子指标，被应用于各 种微生物的遗传特征和分子差异的研究【2 2 】。 r r n a 是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量大( 约占细菌r n a 总 量的8 0 ) ，并存在于所有细菌中。r r n a 基因由保守区和可变区组成，在细菌 中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的 分子钟。原核生物的r r n a 分为3 种，分别为1 6 sr r n a , 2 3 5r r n a 和5 sr r n a 。 其中，1 6 sr r n a 基因已经成为研究细菌种属鉴定和分类的最重要的靶基因，现 在已经利用1 6 sr d n a 建立起套完善的在菌株、种、属、门等分类级别进行鉴 第一章绪论 定的标准方法【2 3 。 因此，对1 6 s r r n a 基因进行克隆和序列分析成为探索自然环境样品中微生 物多样性的有利方法 2 4 1 。以1 6 s r r n a d n a 为基础的分子生物学技术已成为普遍 接受的方法【2 5 1 ，该技术主要利用不同微生物在1 6 s 核糖体r n a ( r r n a ) 及其基 因( r d n a ) 序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分析。使用该方法使 人们了解到用传统方法不足以得到的更加丰富的微生物多样性。其主要研究路线 可用图1 1 表示。 环境样品 id n a 提取及纯化 上 总d n a 。 i 里堡 山山 远距离引物对近距离引物对 16 s r r n a 基因序列扩增产物混合物 16 s r r n a 全长序列16 s r r n a 部分序列 克隆 上筛选克隆 测序及序列比较分析 图1 1 以1 6 s r r n a 为基础的微生物分子生态技术的研究路线 1 4 4 实时p c r ( r e a l t i m ep c r ) 技术 近年来，r e a l - t i m ep c r 技术作为一种敏感、快速、简便、重复性好的检测技 术已广泛出现在生物学研究领域。r e a l t i m ep c r 技术是k a r ym u l l i s 在p c r 的基 础上发展革新的一项新技术。其原理是利用能特异标记p c r 产物的荧光物质。 利用荧光信号积累实时监测整个p c r 进程，得到s 型的扩增曲线，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与常规p c r 相比，灵敏度更高，误差 更小，且可以达到很好的定量效果。 实时荧光定量p c r 技术的定量检测是建立在两个基础之上的【2 6 j ： 第一章绪论 1 c 。值的重现性 p c r 循环在到达c 。值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时 微小误差尚未放大，因此c 。值的重现性极好，同一模板不同时间扩增或同一时 间不同管内扩增，得到的c 。值是恒定的。 2 c t 值与起始模板的线性关系 研究表明，每个模板的c 。值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，c t 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可绘制出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表c t 值。因此，只要获得未知样 品的c t 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 目前，应用实时定量荧光p c r 方法已对水资源中的大肠杆菌，藻青菌和一 些寄生虫成功的进行了监测。 1 5 本课题的主要研究内容 给水管网中微生物利用水中的各种营养物质在水体中生长繁殖，导致水质 变差；同时管网中水流的粘滞层的存在，适于微生物的生长，使得很大一部分微 生物附着在管壁上生长，形成了给水管网中生物膜。同时形成了给水管网的内环 境两个主要的研究方向：管网水质的细菌学和管壁生物膜的细菌学研究。 本课题主要从这两个方面入手，对给水管网内环境进行深入分析。一方面 从给水管网中通入的自来水水质入手，对各项监测指标对水中微生物生长的影响 作用，另一方面提取管网内壁上的生物膜，对生物膜中生长的微生物进行深入研 究，并与水体中的微生物进行对比，从而确定生物膜对给水管网水质造成的潜在 危害及减小或消除危害所需要控制的指标。 本课题的研究内容主要包括以下几个要点： ( 1 ) 建立实验室模拟管网，确定监测指标，对模拟管网及选定的实际管网 的水质指标进行监测； ( 2 ) 对常规指标及反映水中有机物水平的指标进行分析，并对水质的生物 稳定性进行评价。 ( 3 ) 对水样细菌进行平板培养，分析其细菌生长变化规律及原因； ( 4 ) 培养给水管网中的生物膜，对细菌进行分离、纯化； ( 5 ) 应用a p i 鉴定系统确定管网水中的菌落的主要种属； ( 6 ) 选取特定的细菌种类作为研究对象，提取细菌的d n a ，应用p c r 技术， 及荧光定量p c r 技术对给水管网管壁生物膜进行深入研究； ( 7 ) 确定管壁生物膜及管网水样品中所选定的细菌d n a 占细菌总d n a 的比 第一章绪论 例； ( 8 ) 对比水中和生物膜中的细菌种类及条件致病菌比例，并提出可能的预 防或控制管网水质污染的有效措施。 1 6 技术路线 本课题的技术路线表示如图l 一2 图1 2 课题技术路线 第二章给水管网水质监测方案 第二章给水管网水质监测方案 为了研究给水管网中的各种因素对管网水中细菌生长的影响，及其对管网内 壁生物膜的影响，对所建立的模拟给水管网水质进行监测，同时对模拟管网所在 的用水区域的实际管网进行水质监测，从而能够对水质的情况有全面的了解。 2 1 实验室模拟管网系统水质监测方案 2 1 1 实验室模拟管网系统概况 为了真实的模拟实际管网，在实验室搭建了小型模拟给水管网。该模拟管网 系统水箱进水为实验室自来水，管材为p e 材质，水进入水箱后，通过水泵的提 升进入管网，最后再回到水箱中。通过调节阀门可以改变管网水循环方式、路径 及水力条件。模拟管网的管网图见附录。 2 1 2 监测取样点位置的确定 模拟管网取样点设置为两个，一个位于模拟管网提升泵出水附近，可看作模 拟管网进水点，另一个设置在模拟管网某支管末梢。这样的布置主要为了能够更 有效的对管网中的水质指标的变化情况进行分析。 2 1 3 监测指标的确定 根据国家生活饮用水卫生标准( g b 5 7 4 9 2 0 0 6 ) 所规定的水质监测指标 及对管网实际情况的考虑，选定以下指标作为监测指标：温度( t ) 、p h 、浊度、 总氯( t c h ) 、自由余氯( f c h ) 、u v 2 5 4 、n p o c ( 非挥发性有机碳) 、a o c ( 生 物可同化有机碳：a s s i m i l a b l eo r g a n i cc a r b o n ) 、b d o c ( 生物可降解溶解性有 机碳：b i o d e g r a d a b l eo r g a n