（生药学专业论文）两株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究.pdf

摘要 两株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究 摘要 海绵的体表及体内积聚了大量的微生物，这些微生物的次级代谢产物化学结 构新颖、种类繁多，是新药先导化合物的重要来源。为了寻找新的活性先导化合 物，本论文采用了活性筛选和现代化学筛选相结合的方法，选取了2 株海绵来源 具有抗肿瘤和抗炎活性真菌的次级代谢产物进行系统研究。 从海南琼海及三亚附近海域的2 7 个海绵样品中分离得到了2 0 8 株微生物。 采用s r b 法，以小鼠白血病p 3 8 8 肿瘤细胞为筛选模型进行体外抗肿瘤活性的一 级、二级筛选，并结合h p l c 指纹图谱及薄层色谱进行化学筛选，得到具有较强 细胞毒活性的菌株1 5 株。对1 5 株活性菌株同时进行抗炎活性筛选，其中2 株具 有强抗炎活性的海绵真菌，经i t s 序列进行测序比对后，鉴定为附球菌属 e p i c o c c u ms p j 兀4 0 和链格孢属a l 绍r n a r ms p j y y - 3 2 ，因此本文选择这2 株活性 菌株作为研究目标。 在考察了2 株目标菌株的培养条件后，对目标活性菌进行了大量发酵。对发 酵产物运用萃取，薄层色谱，正相、反相硅胶柱色谱，l h 2 0 凝胶柱色谱，反相 高压液相等化学的分离纯化手段，从附球菌属e p i c o c c u ms p j j y 4 0 的次级代谢 产物中分离得到18 个单体化合物( 1 1 5 ，2 9 ，3 0 ，3 1 ) ；从链格孢属a i t e r n a r i as p j j y - 3 2 的次级代谢产物中分离得到1 6 个单体化合物( 1 6 - 2 8 ，3 2 ，3 3 ，3 4 ) ，共 3 4 个化合物。 继而，利用理化性质和波谱学方法( i r ，u v ，m s ，n m r ，x r a y ) 结合化 学反应的方法( 乙酰化反应等) 阐述了其中2 8 个化合物( 1 - 2 8 ) 的化学结构( 化 合物结构及名称参见t a b l e1 ) ，其中新化合物1 2 个。新化合物结构类型包括： 萜类衍生物( 1 8 2 5 ，2 7 ，2 8 ) ，a u c u b i n i n eb 的羟基化衍生物( 8 ) 以及吡喃衍 生物( 1 5 ) 。其中，新化合物1 8 2 5 为系列具有新颖侧链的萜类衍生物，此类结 构以前未曾报道，新化合物2 8 为一罕见的杂螺环萜类衍生物。其它已知化合物 分别为4 个苯的衍生物( 1 - 4 ) 、4 个二酮哌嗪( 6 ，9 1 1 ) 、1 个糖苷( 1 2 ) 、1 个 核苷( 1 3 ) 、3 个生物碱( 5 ，7 ，1 4 ) 、1 个甾醇类化合物( 1 6 ) 以及2 个 t r i c y c l o a l t e m a r e n e 类萜类衍生物( 1 7 ，2 6 ) 。 摘要 先天性免疫是机体抗感染的第一防线，而巨噬细胞在其中发挥了关键性的作 用，r a w 2 6 4 7 细胞可以很好的模拟体内的巨噬细胞系统，l p s 可以通过刺激细 胞因子的分泌而激活巨噬细胞，从而诱导炎症反应，因此实验利用l p s 刺激下 的r a w 2 6 4 7 细胞作为细胞模型，采用e l i s a ，r t - p c r ，w e s t e r nb l o t 和免疫 荧光染色的筛选方法，对部分单体化合物的体外免疫调节活性进行了初步评价， 发现化合物1 5 和1 7 可以明显的抑制l p s 诱导的t n f q 和n o 的分泌以及m r n a 基因的表达，同时这些化合物亦可以明显的抑制l p s 诱导的i n o s 以及c o x 2 的表达，说明化合物1 5 和1 7 具有很强的免疫炎症抑制作用。此为化合物1 5 和 1 7 抗炎活性的首次报道。剩余新化合物的构型和抗炎、抗肿瘤活性正在评价过 程中。 综上，本文从海绵样品中共分离筛选出1 5 株细胞毒活性菌株，2 株强抗炎 活性菌株；阐明2 株真菌中2 8 个次级代谢产物的结构，其中1 2 个新化合物，发 现1 个罕见的杂螺环萜类衍生物；首次发现化合物1 5 和1 7 具有显著的抗炎活性。 上述研究为天然产物化学提供了新的结构类型，为抗炎药物的研究提供了活性模 板化合物，并为从海绵来源真菌中活性次级代谢产物的研究提供了基础资料。 关键词：海绵真菌，活性次级代谢产物，组合筛选，细胞毒活性，抗炎活性 s t u d i e so nt h eb i o a c t i v ec o n s t i t u e n t so fs e c o n d a r y m e t a b o l i t e so ft w o s p o n g e a s s o c i a t e df u n g i a b s t r a c t s p o n g e a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s mi sar i c hs o u l c eo fs e c o l l 衄m e t a b o l i t e s 、丽廿l d i v e r s es t r u c t u r e sa n db i o l o g i c a la c t i v i t i e s as t u d yi sc a r r i e do u tt oi n v e s t i g a t et h e b i o a c t i v el e a dc o m p o u n d sd e r i v e df r o ms p o n g e - a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s m t l l i st h e s i s d e s c r i b e st h es t u d yo ft h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sp r o d u c e db yt w os e l e c t e d s p o n g e a s s o c i a t e df u n g i 、衍t ha n t i - t u m o ra n da n t i - i n f l a m m a t o r ya c t i v i t i e s t w oh u n d r e da n de i g h tf u n g a ls t r a i n sw e l t ：i s o l a t e df r o mt w e n t ys e v e i ls p o n g e s a m p l e sw h i c hw e r ec o l l e c t e df r o mt h es e a s h o r eo fq i o n gh a ia n ds a n y ai nh a i n a n p r o v i n c e f i f t e e na c t i v es t r a i n sw e 托p i c k e do u tb a s e do nt h ec y t o t o x i ca s s a y u s i n gt h e p 3 8 8c e l ll i n eb yt h es r bm e t h o da n do nt h e 唧l ca n dt l cc h e m i c a ls c r e e n i n g a m o n gt h e m , t w os t r a i n sw h i c hw e l ei d e n t i f i e d 鹤e p i c o c c u ms p j j y 4 0a n d a l t e r n a r i as p j j y - 3 2b yi t ss e q u e n c i n ga l s oe x h i b i t e dh i ：g h a n t i - i n f l a m m a t o r y a c t i v i t i e s s ot h e yw e r es e l e c t e df o rf u r t h e rs t u d yo ft h e i rs e c o n d a r ym e t a b o l i t e s l a r g e - s c a l ef e r m e n t a t i o n so f t h et w ob i o a c t i v es t r a i n sw e r ep c r f o r r n e dt oo b t a i n t h ea c t i v e e x t r a c t s b ym e a n so fc h r o m a t o g r a p h yo v e rs i l i c ag e lc o l u m n ，s e p h a d e x l h 2 0 ，p r e p a r a t i v et l c a n ds e m i p r e p a r a t i v eh p l c ，e i g h t e e n ( 1 1 5 ，2 9 ，3 0 ，3 1 ) a n d s i x t e e nc o m p o u n d s ( 1 6 2 8 ，3 2 ，3 3 ，3 4 ) w e r ei s o l a t e df r o mt h es p o n g e a s s o c i a t e df u n g i j j y 4 0a n d j j y - 3 2 ，r e s p e c t i v e l y b a s i n go nt h e i rp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n ds p e c t r a ld a t a ( i wm s ， n m r , e t c ) ，t w e n t ye i g h ts t r u c t u r e sw e r ee l u c i d a t e da s5 - m e t h y l b e n z e n e 一1 ，3 一d i o l ( 1 ) ， 1 ，3 - d i h y d r o x y - 4 ，5 - d i m e t h y l b e n z e n e ( 2 ) ，2 , 4 一d i h y d r o x y l 一5 ，6 一d i m e t h y l - b e n z o i ca c i d ( 3 ) ，2 ，4 一d i h y d r o x y l 一6 一m e t h y l - b e n z o i ca c i d ( 4 ) ，3 - i n d o l y l a c e t i ca c i dm e t h y le s t e r ( 5 ) ， c y c l o 一( t y r - p r o ) ( 6 ) ，n a c e t y l t y r a m i n e ( 7 ) ，3 一h y d r o x y 一7 一m e t h y l - 6 ，7 - d i h y d r o c y c l o p e n t a 【c p y r i d i n e 一5 - o n e ( 8 ) ，c y c l o - ( p r o l e u ) ( 9 ) ，c y c l o 一( p r o - i l e ) ( 1 0 ) ，c y c l o 一( 1 v a l - p r o ) ( 1 1 ) ， i s o m a l t o l g l u c o s i d e ( 1 2 ) ，i n o s i n e ( 1 3 ) ，f l a z i n ( 1 4 ) ，d 8 6 4 6 2 6 o s ) ，e r g o s t e r o l ( 1 6 ) ， a c t g t o x i n s h ( 1 7 ) ，d i c y c l o a l t e m a r e n ei b 0 8 ) ，d i c y c l o a l t e m a r e n e2 b ( 1 9 ) ， d i c y c l o a l t e m a r e n e3 a ( 2 0 ) ，d i c y c l o a l t e m a r e n e3 b ( 2 1 ) ，d i c y c l o a l t e m a r e n e4 b ( 2 2 ) ， v i i d i c y c l o a l t e r n a l e n e4 a ( 2 3 ) ，p h e n c y c l o a l t e m a l e n e1 ( 2 4 ) ，p h e n c y c l o a l t e m a l e n e2 ( 2 5 ) ， t r i c y c l o a l t e r n a l e n e6 a ( 2 6 ) ，t r i c y c l o a l t e r n a l e n e 12 a ( 2 7 ) a n dt r i c y c l o a l t e m a l e n e 13 a ( 2 8 ) a m o n gt h et w e l v en e wc o m p o u n d s ，t h e r e w e r e t e n t e r p e n o i d d e r i v a t i v e s ( 1 8 2 5 ，2 7 ，2 8 ) ，ah y d r o x yd e r i v a t i v eo fa u c u b i n i n eb ( 8 ) a n dap y r a n d e r i v a t i v e ( 1 5 ) n e wc o m p o u n d s1 8 2 5a l eas e r i e so ft e r p e n o i dd e r i v a t i v e s 、i 也 n o v e ls i d e c h a i nw h i c hh a v en o tb e e nr e p o r t e dp r e v i o u s l y n e wc o m p o u n d2 8i sa r a l es p i r o - o x i n d o l et e r p e n o i dd e r i v a t i v e t h ek n o w nc o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e d 罄 f o u rb e n z o ld e r i v a t i v e s ( 1 - 4 ) ，f o u rc y c l i cd i p e p t i d e s ( 6 ，9 - 1 1 ) ，ag l u c o s i d e ( 1 2 ) ，a n u c l e o s i d e( 1 3 ) ，t h r e ea l k a l o i d s( 5 ， 7 ， 1 4 ) ， as t e r o l ( 1 6 ) a n dt w o i r i c y c l o a l t e r n a l e n e t y p et e r p e n o i dd e r i v a t i v e s ( 1 7 ，2 6 ) ，r e s p e c t i v e l y m a c r o p h a g e sp l a yac r u c i a lr o l ei ni n n a t ei m m u n i t yw h i c hi st h eb o d y 。sf i r s tl i n e o fd e f e n s e a g a i n s t i n f e c t i o na n dl p sc a na c t i v a t em a e r o p h a g e st oi n d u c e i n f l a m m a t o r yr e s p o n s eb ys t i m u l a t i n gt h es e c r e t i o no fc y t o k i n e s s ow eu s e dl p s s t i m u l a t e dr a w 2 6 4 7c e l l sw h i c hc a l ls i m u l a t em a c r o p h a g es y s t e mi nv i v op e r f e c t l y a sc e l lm o d e lt oe v a l u a t ei m m u n o m o d u l a t o r ya c t i v i t yo fs o m ec o m p o u n d si nv i t r ob y e l i s a ，r t - p c r , w e s t e r nb l o ta n di m m u n o f l u o r e s e e n ts t a i n i n gs c r e e n i n gm e t h o d s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc o m p o u n d s1 5a n d1 7c o u l di n h i b i ts e c r e t i o na n dm r n a e x p r e s s i o no fl p s i n d u c e dt n f qa n dn o t h e ya l s oi n h i b i t e dl p s i n d u c e di n o s a n dc o x 2e x p r e s s i o no b v i o u s l y t h eh i 曲a n t i i n f l a m m a t o r ya c t i v i t i e so fs u c h c o m p o u n d sh a v en o t b e e nr e p o r t e dy e t t h ea n t i - i n f l a m m a t o r ya n da n t i - t u m o r a c t i v i t i e so ft h er e s tn e wc o m p o u n d sa l eb e i n ge v a l u a t e d i naw o r d , f i r e e na c t i v es p o n g e - a s s o c i a t e df u n g a ls t r a i n s 、析t hc y t o t o x i c a c t i v i t i e sw e r eo b t a i n e db yc o m b i n a t o r i a ls c r e e n i n g a m o n gt h e mt w os t r a i n s a l s o e x h i b i t e dh i g ha n t i i n f l a m m a t o r ya c t i v i t i e s t w e n t ye i g h tc o m p o u n d sw e r eo b t a i n e d f r o mt h et w oa i m e df u n g i a m o n gt h e mt w e l v ec o m p o u n d sw e r en e wi n c l u d i n gar a r e s p i r o o x i n d o l et e r p e n o i dd e r i v a t i v e c o m p o u n d s1 5a n d1 7w e r ef i r s tf o u n dt os h o w l l i g ha n t i i n f l a m m a t o r ya c t i v i t i e s t h i ss t u d yp r o v i d e sn o v e l s t r u c t u r et y p e sf o rn a t u r a l p r o d u c tc h e m i s t r y a n db i o a c t i v e t e m p l a t ec o m p o u n d s f o r e x p l o r i n g n e w a n t i i n f l a m m a t o r yd r u g s i ta l s op r o v e st h a tt h em e t h o dw eu s e di se f f e c t i v ei nl o o k i n g f o rn e wb i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o l i t e s 舶ms p o n g e a s s o c i a t e df u n g i v i i i a b s t r a c t k e yw o r d s ：s p o n g e - a s s o c i a t e df u n g i ，b i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o f i t e s ， c o m b i n a t o r i a ls c r e e n i n g ，c y t o t o x i ca c t i v i t y ，a n t i - i n f l a m m a t o r ya c t i v i t y i ) ( 缩略词语 一一_ 一 a p o c h c h c o s y 2 d n i d m s o e s i - m s e t o a c e t o h f c m g 0 g t g y m m 嘬c m q c h _ p l c r - t o f - m s i c s o i r m e c n m e o h c m p m 呼f m 叮t n e e n m r n o e s y p b s h p g f n m r r c e r y s s r b t l c t o f m s u v v l c a b b r e v i a t i o n a p o p t o s i s c h l o r o f o n n s h i f tc o r r e l a t i o ns p e c t r o s o c o p y t w o d i m e n s i o n a ln m r d e m e t h y l s u l f o x i d e e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r a e t h y la c e t a t e e t h a n o l f l o wc y t o m e t r y g a p o g a p l g a p 2 | m i t o s i s 1 h - d e t e c t e dh e t e r o n u c l e a rm u l t i p l eb o n dc o n n e c t i v i t y 1 h - d e t e c t e dh e t e r o n u e l e a rm u l t i p l eq u a n t u mc o n n e c t i v i t y h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m o t o g r a p h y h i g hr e s o l u t i o n - t i m eo ff l y i n gm a s ss p e c t r a h a l fi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n i n f r a r e as p e c t r a a e e t o n i l r i l e m e t h a n o l m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n l r a t i o n m e l t i n gp o 硫 m a t u r a t i o n m - p h a s ep r o m o t i n gf a c t o r 3 ( 4 ，s d i m e t l l y l - 2 - t h i a z o y l ) - 2 ，5 - d i p h e n y l - t e t r a z o l i u mb r o m i d e n e e r o s i s n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e n u c l e a ro v e r h a u s e re f f e c ts p e c t r o s c o p y p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p r o d i u mi o d i d e p u l s e - f i e l dg r a d i e n tn u c l e a rm a g n e t i cr e s o r l a n c e r e c r y s t a l l i z e s u l f o r h o d a m i n eb t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y t i m eo ff i y i n gm a s ss p e c t r a u l t r a v i o l e ts p e c 缸- a v a c u u ml i q u i dc h r o m m o g r a p h y x 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；如浚直墓丝盂要持别直明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：幺嗽签字日期：。7 年月? 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名： 一期印年名肿 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 一字：仍惩辑 签字日期：o 忙夕月，萝日 l 电话： 邮编 t a b l e1s t r u c t u r eo fc o m p o u n d s o h 1 j 5 - m e t h y l b e n z e n e 一1 ，3 - d i o l a o i - i o h 2 f 1 , 3 - d i h y d r o x y - 4 ，5 一d i m e t h y l b e n z e n e 众o h 3o h 2 , 4 - d i h y d r o x y l - 5 ，6 - d i m e t h y l - b e n z o i ca c i d i 众 | o h h o 冬o 4o h 2 , 4 - d i h y d r o x y l - 6 - m e t h y l b e n z o i ca c i d i 糸h 冷o i - i o 5 广p 3 - i n d o l y l a e e t i ca c i dm e t h y le s t e r r 、弋 6 、 h 6 e y c l o - ( t y r - p r o ) h o i l 7 h n - a c e t y l t y r a m i n e 囝a o h o 8 o 3 - h y d r o x y 7 一m e t h y l 一6 ，7 一d i h y d r o c y c l o p e n t a c 】 n e w 磷 p y r i d i n e - 5 - o n e i i i 曼塑! 型! ! 12 1 竺婴p 2 竺翌坐 9o c y c l o 一( p r o - l e u ) 堙 o 1 0 o c y c l o - ( p r o i l e ) u 吖v 弋 n 丫u o 1 1 1 0 c y c l o 一( v a l p r o ) v 叩弋 洲 o 1 2 0 i s o m a l t o l g l u c o s i d e h 。扒h o 1 3 i n o s i n e h 礅酞h 、 h o o h 1 4 匝二礤c 。h f l a z i n 目 d8 6 4 6 2 6 1 5 九一职。d x 觚 n e w i v 1 6e r 9 s t e r o l e r g o s t e r o l h 。盥 1 7 。h c 一。h a c t g t o x i n sh 1 8 矿柳o h d i c y c l o a l t e m a r e n e l b 1 1 e w 1 9 芦翔洲 d i c y e l o a l t e m a r e n e2 b 1 1 c w 2 0 d i e y e l o a l t e m a r e n e3 a n e w 一 o h o 飞 2 1 h 。h d i c y c l o a l t e r n a r e n e3 b n e w 2 2 寸j 一。h d i c y c l o a l t e m a r e n e4 b n c w v 2 3 d i c y c l o a l t e m a r e n e4 a n e w 寸从。婶 p h e n c y c l o a l t e m a r e n e1 2 4 j h 、二c 。h n e w p h e n c y c l o a l t e m a r e n e2 2 5 弋人o h 湖h 火 n e w 2 6 o i - i t r i c y c l o a l t e m a r e n e6 a i h 一 o h 2 7 o t r i c y c l o a l t e m a r e n e12 a 、0 曰 n e w 妁 o i - ! 2 8 o t f i c y c l o a l t e r n a r e n e13 a 1 1 e w 一 h d o h v i 两株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究 上- j k 刖吾 海绵属于多孔动物门，是最原始的低等多细胞海洋动物，全世界约有 1 0 0 0 0 - - - 1 5 0 0 0 种，我国也有5 0 0 0 种左右。由于海绵的固着生活方式缺乏有效的 物理性防御，因此在生存竞争中，海绵积聚或分泌许多对其他生物具有威慑性、 攻击性、甚至毒害性的次级代谢产物【1 1 。这些次级代谢产物往往具有显著的生物 活性，因此海绵一直以来都是海洋天然产物物种研究最热的海洋生物。据统计， 从海绵提取的化合物约占海洋生物提取物的3 3 ，尤其是具有细胞毒性的化合物 超过1 0 ，显著高于其他海洋动物、陆生植物及微生物等，为新药研制提供了大 量高活性的先导化合物【2 捌。但一直以来，由于海绵采集困难、有效成分含量低 等因素，制约着深入开发利用。 近年，国外对海绵中次级代谢产物及其生态学作了探讨性研究，结果发现， 某些活性物质实际上可能是由与其共附生的微生物产生的。并从海绵共附生微生 物中发现许多与其宿主相同或相关的次级代谢产物。这些发现对运用海洋微生物 的发酵工程、基因工程等技术来解决天然海绵资源及活性天然化合物的药源问题 有重大意义。由于海绵来源微生物的次级代谢产物中蕴含着许多结构新颖、活性 强的抗菌、抗肿瘤等活性化合物，因此成为人们加大投入深入研究寻找活性物质 的重要资源。并且，研究开发海绵共附生微生物活性物质具有其独特的优势，即 微生物作为药物的生产者无原材料后顾之忧，而且微生物发酵工艺成熟、成本低 廉、产物质量有保证，易于大规模生产。 本文从采自海南琼海及三亚附近海域的2 7 个海绵样品中分离得到了2 0 8 株 海绵微生物。采用s r b 法，以小鼠白血病p 3 8 8 肿瘤细胞为筛选模型进行体外抗 肿瘤活性的一级、二级筛选，并结合h p l c 指纹图谱与薄层色谱进行化学筛选， 得到具有较强细胞毒活性的菌株1 5 株。针对这1 5 株活性菌株又进行了免疫调节 抗炎活性的筛选，初步发现2 株具有较强抗炎活性的真菌，进一步分析这2 株海 绵真菌附球菌属e p i c o c c u ms p 。盯y - 4 0 和链格孢属a l t e r n a r i as p j j y - 3 2 的小 样发酵产物，结果提示j j y - 4 0 次级代谢产物丰富且主产物的紫外吸收特异，而 j j y - 3 2 次级代谢产物为具有特征紫外吸收的系列同系物。 根据以上结果，本论文选定此菌株e p i c o c c u ms p j j y - 4 0 和a l t e r n a r i as p 两株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究 j j y - 3 2 作为目标菌株进行大量发酵，并应用现代分离手段对其代谢产物进行活性 追踪分离，以期阐明其生物活性的物质基础，为新结构、新活性药物的研究提供 候选化合物。 2 两株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究 1 海绵来源微生物的分离与活性筛选 海绵的体表及体内积聚了大量的微生物，这些微生物的次级代谢产物化学结 构新颖、种类繁多，是新活性先导化合物的重要来源。我们实验室以小鼠白血病 p 3 8 8 肿瘤细胞为筛选模型，采用s r b 法，对从海南琼海及三亚附近海域的2 7 个海绵样品中分离得到的2 0 8 株微生物进行体外抗肿瘤活性的一级、二级活性筛 选。并进一步结合t l c 、h p l c 等化学筛选方法手段，最终确定了1 5 株有较好 活性和深入研究价值的菌株，为实验室提供了宝贵的资源。本章归纳介绍了有关 的筛选结果。 f 1 样品来源与菌株分离 1 1 1 样品来源 样品来源：采白海南琼海龙湾港、海南临高县新盈镇临昌礁、海南三亚东瑁 岛及梅山镇梅联村西鼓岛附近海域的海绵样品。 1 1 2 样品的处理 稀释涂布法：用无菌海水清洗海绵样品的表面，将冲洗完的样品切碎挤压至 出现粘稠状液体，取适量配成浓度为1 0 4 的母液，并依次稀释梯度至1 0 之、1 0 刁、 1 0 4 、l o 、1 0 缶、1 0 刁。各取0 2 m i 不同梯度的液体均匀涂布于培养基上，并做两 组平行实验。 组织切块法：用无菌海水清洗海绵样品的表面，将冲洗完的样品切成适当大 小平铺于培养基的表面，使海绵与培养基接触的表面积尽可能大。 1 1 3 菌株的纯化及保藏 将培养基置于2 8 培养箱中，每天观察，挑出形态差异较大的单茵落，二 次纯化后接种于固体斜面培养基，长成后置于冰箱4 。c 保存。具体各种培养基的 配制见第四章第三节。 1 2 活性菌株筛选模式 i 2 1 活性筛选模型l i 细胞培养：活性筛选采用小鼠白血病p 3 8 8 肿瘤细胞系和小鼠r a w 2 6 4 7 细 两株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究 胞株。p 3 8 8 细胞用含1 0 f b s 的r p m i 1 6 4 0 培养基，在3 7 、通入5 二氧 化碳的细胞培养箱中继代培养。小鼠r a w 2 6 4 7 细胞株购自a m e r i c a nt y p e c u l t u r ec o l l e c t i o n ( a t c c ) ，以1o f e t a lb o v i n es e r u m ( f b s ) ，10 0 u m l 青霉素和 1 0 0 口g r n l 链霉素的d m e m 培养基( g i b c o ) ，在3 7 c ，5 - - 氧化碳的温湿细胞 培养箱中传代培养。 细胞镜检：取对数生长期的小鼠白血病p 3 8 8 肿瘤细胞，用含1 0 f b s 的新 鲜r p m i 1 6 4 0 培养基配制成5 x 1 0 4 个m l 的细胞悬液，接种到9 6 孔板中，每孔 2 0 0 肛l 。培养箱孵育2 4 小时后，每孔再加2 l 样品甲醇溶液，留复孔空白对照。 培养7 2h 后，首先在光学显微镜下观察细胞形态，判断有无细胞周期抑制，细 胞凋亡或细胞坏死的形态学特征。记录样品的活性结果，并对高活性的样品拍显 微照片以作记录。 s r b 法：取对数期生长的肿瘤细胞p 3 8 8 ，与不同浓度的药物共同孵育一定 时间，加入预冷的8 0 三氯醋酸5 0 比l t c a 固定，放置_ 定时间后用去离子水冲 洗，甩干。然后每孔加入1 5 0 , l 的s r b ，染色后用1 醋酸洗掉未结合的s r b 。 再加缓冲液t d s l 0 0 乒l 。酶标仪5 1 5 n m 处测定o d 值，计算抑制率，评价药物对 细胞增殖的抑制作用。 流式细胞术活性筛选：取对数生长期的p 3 8 8 细胞，用含1 0 f b s 的新鲜 r p m tm e d i u m l 6 4 0 配制成2 1 0 5 个m l 1 的细胞悬液，接种到2 4 孔板中，每 孔5 0 吮l 。各孔再加5 l 样品溶液，留复孔空白对照。在3 2 c 细胞培养箱中培 养1 7 h 后，倒置显微镜下观察细胞形态，判断有无细胞凋亡或细胞坏死的形态学 变化。然后将细胞分别转移至e p p e n d o r f 管中，离心、吸去上清液，加p b s 缓冲 液o 5m l 清洗细胞1 次，离心收集细胞，p i 染色后流式细胞术检测细胞中d n a 的含量分布，分析样品对细胞的作用。并利用计算机软件进行分析计算。分析测 试结果可以初步判断被测试样品是否有细胞周期抑制和细胞调亡诱导的活性。具 体的活性测试过程如s c h e m e1 所示。 细胞增殖分析：利用c e l l t i t e r9 6 a q 呦惦o n es o l u t i o nr e a g e n t ( p r o m e g a ) 进 行细胞增殖活性的检测。取对数生长期r a w 2 6 4 7 细胞接种于9 6 孔板中( 1 0 1 0 5 孔) ，贴壁2 4 小时以后，分别给予不同浓度的化合物和或l p s ( o 1 , g m 1 ) 刺激，3 7 。c ，含5 c 0 2 的温湿培养箱中孵育培养2 4 小时。然后每孔加入2 毗l 1 9 0 m g m lm t s ( 3 - ( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l 2 - y 1 ) 一5 一( 3 - c a r b o x y m e t h o x y p h e n y l ) 4 两株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究 2 一( 4 s u l f o p h e n y l ) - 2 h - t e t r a z o l i u m ) ，3 7 c 孵育1 小时后，振荡均匀，以测定波长 4 9 0 n m 进行吸光值测定。 酶联免疫吸附实验( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ) 免疫调 节活性筛选：t n f a 和n o 是化合物免疫活性筛选中的重要细胞因子，因此，我 们以l p s 刺激下的r a w 2 6 4 7 细胞作为模型，以t n f - 1 1 ，n o 为初筛指标，进行 了化合物的抑制效应检测。取对数生长期r a w 2 6 4 7 细胞接种于9 6 孔板中， 1 o 1 0 5 个孔，贴壁2 4 小时以后，分别给予不同浓度的化合物和或l p s ( o 1 g m 1 ) 刺激，3 7 c ，含5 c 0 2 的温湿培养箱中继续孵育培养1 6 小时，收 集上清以n o 检测试剂盒( k o r e a ) 以及t n f ae l i s ak i t 限& ds y s t e m s ，m n ， u s a ) 进行n o 和t n f a 表达的检测，观察化合物对于l p s 诱导的炎性细胞因子 表达的抑制效应。 r t - p c r 免疫调节活性检测：取对数生长期r a w 2 6 4 7 细胞( 10 6c e l l s w e l l ) 接种于六孔板过夜，分别给予不同浓度的化合物和或l p s ( 0 1 g m 1 ) 刺激，3 7 c ， 含5 c 0 2 的温湿培养箱中继续孵育培养1 6 小时，收集细胞，以e a s yb l u e k i t ( i n t r o nb i o t e c l m o l o g y , k o r e a ) 提取细胞总r n a ，继而利用t h e r m o s r i p tr t - p c r 系统(