09 重金属检查法检验操作规程.doc

GMP质量管理（9） 文件编号：ZL/SOP/TZ/00901重金属检查法检验操作规程文件名：重金属检查法检验操作规程文件编号：ZL/SOP/TZ/00901制定人：日期： 年 月 日文件类型：工作标准审核人：日期： 年 月 日版次：第二版批准人：日期： 年 月 日印 数：共 2份生效日期： 年 月 日颁发部门：GMP办公室分发至：质量保证部、化验室1. 目 的：规范重金属测定检验操作，保证检验的质量。2. 适用范围：适于本公司原辅料、成品的重金属测定检验。3. 责 任 者：质量保证部经理、化验室主任、化验员。4. 检验依据：中国兽药典2010年版一部附录。5. 内 容：5.1原理中国兽药典（2010年版）中对于药物所含的重金属的定义是指在实验条件下，能与硫代乙酰胺或硫化钠作用显色的金属杂质。所谓“在实验条件下”是因供试品液的酸度对金属离子与硫化氢的呈色有显著的影响。中国兽药典（2010年版）规定25ml供试液中含醋酸盐缓冲液2ml，再加硫代乙酰胺试液2ml，其pH值应为3.5；在此弱酸性条件下能与硫代乙酰胺呈色的金属离子有银、铅、汞、铜、镉、铋、砷、锑、锡、锌、钴、镍等均能生成不溶性硫化物；在碱性溶液中，如铋、镉、铜、钴、铁、汞、铅、锌等金属离子均能生成不溶性硫化物。由于在药品生产中遇到铅的机会较多，而且铅易积蓄中毒，故检查以铅为代表，反应式如下：Pb2+S2 PbS 黑色5.2 仪器与用具5.2.1 纳氏比色管 应注意选择各管之间的平行性，玻璃色泽一致，内径、刻度标线高度一致。比色管洗涤时避免划伤内壁。5.2.2 过滤器 见中国兽药典2000年版一部附录重金属检查法第四法附图，而且有纹丝扣并能密封的上、下二部分以及垫圈、滤膜和辅助滤板组成。5.2.2.1 过滤器上盖部分A的入口处应能与50ml注射器紧密联接，过滤器下部F的出口处能套上一合适橡皮管。A与F能通过螺纹密封。5.2.2.2 垫圈应内径光滑，大小相同，以使斑点边缘圆整、清楚、大小一致。在滤器上加上橡皮垫圈，既可使滤膜与滤板紧密结合，又可避免在旋紧滤器接头时扭曲或损坏滤膜。5.2.2.3 滤膜的直径为10mm，孔径为3.0m，使用前在水中浸泡24小时以上，可使色斑均匀。5.2.2.4 50ml注射器，应能与滤器上盖入口处紧密联接。5.3 试药和试液5.3.1 标准铅溶液 称取硝酸铅0.160g，置1000ml量瓶中，加硝酸5ml与水50ml溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前，精密量取贮备液10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml相当于10g的Pb）。配制和贮存用的玻璃容器均不得含铅。5.3.2 硫代乙酰胺试液、硫化钠试液、醋酸盐缓冲（pH3.5）与抗坏血酸等均按药典规定。5.3.3 稀焦糖溶液 取蔗糖或葡萄糖约5g，置磁坩埚中，在玻璃棒不断搅拌下，加热至呈棕色糊状，放冷，用水溶解成约25ml，滤过，贮于滴瓶中备用。临用时，根据供试液色泽深浅，取适当量调节使用。5.4 操作方法5.4.1 第一法5.4.1.1 取25ml纳氏比色管两支，编号为甲、乙。5.4.1.2 甲管中加标准铅溶液一定量与醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml，加水或该药品正文项下规定的溶剂稀释成25ml。5.4.1.3 乙管中加入按药品项下规定的方法制成的供试液25ml。5.4.1.4 如供试液带颜色，可在甲管中滴加少量稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液，使其色泽与乙管一致。5.4.1.5 在甲、乙两管中分别加硫代乙酰胺试液2ml，摇匀，放置2分钟，同置白色衬板上，自上向下透视，乙管中显出的颜色与甲管比较，不得更深。5.4.1.6 如在甲管中滴加稀焦糖溶液仍不能使颜色一致时，可取该药品项下规定的2倍量的供试品和试液，加水或该药品项下规定的溶剂稀释成30ml；将溶液分成甲乙二等份，甲管中加入硫代乙酰胺试液2ml，摇匀，放置2分钟，经滤膜（孔径3m）滤过，然后甲管中加入标准铅溶液一定量，加水或该药品项下规定的溶剂使成25ml，再在乙管中加硫代乙酰胺试液2ml，甲管中加水2ml，照上述方法检查，即得；5.4.1.7 供试品如含铁盐影响重金属检查时，可取该药品项下方法制成的供试液，加抗坏血酸0.51.0g，并在对照液中加入相同量的抗坏血酸，再照上方法检查，即得；5.4.1.8 配制供试品溶液时，如使用的盐酸超过1.0ml（或与盐酸1.0ml相当的稀盐酸），氨试液超过2ml，或加入其他试剂进行处理者，除另有规定外，对照液中应取同样同量的试剂置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml与水15ml溶解后，移置甲管中，加标准铅溶液一定量，再加水稀释成25ml。5.4.2 第二法5.4.2.1 除另有规定外 取在500600灼烧的炽灼残渣项下遗留的残渣，加硝酸0.5ml蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml，微热溶解后，移至乙管中，加水稀释成25ml。5.4.2.2 如不取炽灼残渣项下遗留的残渣，则可取供试品一定量，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.51.0ml, 使恰湿润，用低温加热至硫酸除尽后，加硝酸0.5ml，蒸干，使恰湿润，用低温加热至硫酸除尽,加硝酸0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在500600炽灼使完全灰化，再按（4.2.1）“放冷，加盐酸2ml”起，至加水稀释成25ml。5.4.2.3 取配制供试溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml与水15ml微热溶解后，移至甲管中，加标准铅溶液一定量，加水稀释成25ml。5.4.2.4 按（4.1.5）方法检查5.4.3 第三法5.4.3.1 取25ml纳氏比色管两支，编号为甲、乙。5.4.3.2 除另有规定外，取供试品适量，加氢氧化钠试液5ml与水20ml溶解后，置乙比色管中。5.4.3.3 取一定量的标准铅溶液，与（4.3.2）同样处理，置甲管中。5.4.3.4 于甲、乙两管中各加硫化钠试液5滴，摇匀。5.4.3.5 甲、乙管同置白色衬板上，自上向下透视，乙管中所显的颜色与甲管比较，不得更深。5.4.4 第四法5.4.4.1 标准铅斑的制备 精密量取标准铅溶液一定量，置小烧杯中，加水或该药品项下的溶剂稀释成10ml，加入醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml与硫代乙酰胺试液1.0ml，摇匀，放置10分钟用50ml注射器转移至过滤器中进行压滤（滤速约为每分钟1ml），滤毕，取下滤膜，放在滤纸上干燥，即得。5.4.4.2 检查法 照该药品项下规定制成的供试液10ml，照例（4.4.1）标准铅斑的制备，自“加入醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml”起，依法操作，将生成的色斑与标准铅斑比较，不得更深。5.4.4.3 若供试溶液有颜色或浑浊，应对换辅助滤板与滤膜的位置，进行预滤，如滤膜有污染，应换滤膜再滤，直至滤膜不再染色；反转辅助滤膜的位置，然后取滤液10ml，照4.4.1）标准铅斑制备，“加入醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml”起，依法操作，所得供试液的铅斑与标准铅斑比较，不得更深。5.5 注意事项5.5.1 在弱酸条件下测定时，应严格控制溶液的酸碱度，因为pH值3.03.5，硫化物沉淀比较完全，酸度太大或太小都使颜色显色浅，从而结果不正确。5.5.2 本法以10g20gPb35ml所产生的浑浊度为最佳目视比色范围。5.5.3 在酸性溶液中检查重金属，以硫代乙酰胺试液作为显色剂，如用硫化钠试液，容易分解析出硫，引起浑浊而影响比色。在碱性溶液中，则用硫化钠试剂作为显色剂。5.5.4 检查新产品重金属时，除有标准管和供试管外，宜应配有一个监测管（加适量的标准溶液及供试品）。三管依法同样操作，供试管显色不得深于标准管，则可能供试品经有机破坏后再依法检查。5.5.5 标准铅溶液取量问题应注意重金属的含量以Pb计算为20g（即相当于标准铅溶液2ml ）时，加硫代乙酰胺试液后所显的黄褐色最适用于目视法观察，如小于10g，则显色太浅，于30g时则显色太深，均不利于观察与区别，故于检查时，如取样量标准液均未指明时，则常以2ml计算和试验。5.6 供试品在未加硫乙酰胺以前带色，可用稀焦糖液，将标准溶液调整，使两者颜色一致，而后加硫代乙酰胺；若滴加稀焦糖溶液，仍不能使颜色一致时，可加其他对测定无干扰的试液，如加常用的指示液调色。如按上述方法仍不能使供试品管与标准管颜色一致时，可取该药品上规定的二倍量的供试品试液，加水溶解后，分成两等份，在一份中加硫代乙酰胺试液，用滤膜（孔径3m）滤除金属硫化物沉淀后，加入规定量的标准铅溶液作为对照溶液，再与另一份供试溶液按药典规定方法处理比较。或者将供试品作有机破坏，除去颜色，再作重金属检查。5.7 微量高铁离子的存在，能在弱酸溶液中氧化硫化氢溶液而析出硫，产生浑浊而影响重金属的比色，因此必须除去；药典中利用加入抗坏血酸或盐酸羟胺使微量高铁还原成亚铁离子，因亚铁不干扰检查。5.8 若药物本身是重金属的盐（如铁盐、砷盐、锑盐、锌盐、铜盐等），在检查这些药物中其他重金属的含量时，必须先将药物加以处理以除去自身离子的干扰，然后再进行测定。5.9 药品本身生成不溶性硫化物，影响重金属的检查，可加入掩蔽剂以避免干扰。如检查硫酸锌或葡萄糖酸锑钠中的重金属，在碱性溶液中加入氰化钾或在中性溶液中加入酒石酸，使与锌离子或锑离子生成稳定的络合物，再依次检查铅盐。5.10 含有Pb2+的中性或弱酸性溶液，经滤纸过滤时，因滤纸能吸附Pb2+而造成Pb2+的大量损失，故一般不应过滤。必要时可加对酚酞呈微碱性的饱和醋酸铵溶液，温热后用直径较小的定量滤纸滤过。5.11 具有芳环或杂环的有机药物，如需先行炽灼破坏，则按中国药典（2010年版二部附录操作，使与有机物分子结合的重金属游离，但应注意炽灼的温度不能高于600，以免重金属损失，温度适宜。5.12 为了消除盐酸或其他试剂可能夹杂重金属，故在配制供试品溶液时，如使用盐酸超过1ml（或与盐酸1ml相当的稀盐酸）使用氨试液超过2ml，以及用硫酸与硝酸进行有机破坏，或加入其他试剂进行处理者，除另有规定外，对照溶液应取同样量试药在坩埚或瓷皿中蒸干后，依法检查。5.13 为使有机物分解破坏完全，炽灼残渣需加硝酸加热处理，故必须蒸干除去氧化氮，否则，亚硝酸可氧化硫化氢析出硫，影响比色检查。蒸干后残渣加盐酸处理，使重金属盐成为盐酸盐，置水浴上蒸干，去除残留盐酸，再加蒸馏水溶解，以氨试液调至对酚酞指示液显中性，依法检查，使供试品液的pH值仍为3.5左右，某些供试品（如安乃近、对氨基水杨酸等）在炽灼时能腐蚀瓷坩埚而带入较多的重金属，影响检查结果的准确性，应改用石英坩埚或硬质玻璃蒸发皿、铂坩埚。5.14 标准铅液应在临用前，精密量取铅贮备液新鲜配制，使用不得超过一周，以防止铅的水解而造成误差，否则贮存时间过久，显色不得超过一周，以防止铅的水解而造成误差，否则贮存时间过久，显色愈浅。但硝酸铅贮备液（内含适量硝酸，可防止水解），则可放置较长时间，并需注意制标准铅液用的玻璃仪器，均不得有铅的杂质。5.15 硫化钠试液稳定性与硫化钠的纯度的很大关系，采用分析纯硫化钠配制，贮存色瓶中可保持12个月。PH=3.55.16 硫代乙酰胺在弱酸性条件下水解，产生硫化氢，可与重金属离子生成有色硫化物的均匀混悬液。 CH3CSNH2H2O CH3CONH2 H2O本品优点是无恶臭，浓度易控制。5.17 记录与计算5.17.1计算5.17.1.1标准铅溶液度计算：1mol的硝酸铅Pb（No3）2的质量为331.2g，含铅（Pb）207.2g；称取硝酸铅0.1598g配成1000ml贮备液，含Pb量为： 207.20.15981000 331.21000 0.1mg/ml贮备液依法稀释十倍后所得标准铅溶液的浓度为每1ml含10g的Pb。5.17.1.2重金属限量计算 进行检查时，如取供试品1.0g，与标准铅溶液2.0ml制成的对照液比较，计算重金属限量。标准铅溶液体积（ml）标准铅溶液浓度（g/ml）供试品量（g）重金属限量 1002.00.000010 1.0 100% 0.0020% 百万分之二十 20ppm5.17.1.3 标准铅溶液取样量计算 根据取供试品量及限量计算，如取供试品2.0g，依法检查，规定含重金属不得过百万分之五，应取标准铅溶液（Pb10gml）多少毫升？0.000