（环境工程专业论文）甾体雌激素废水中优势菌的选育及其降解特性研究.pdf

摘要 摘要 从某避孕药生产企业污水处理站好氧池活性污泥中通过富集驯化，分离到一 株降解甾体雌激素即3 一甲氧基- 1 7 b 羟基。l ，3 ，50 0 ) ，8 ( 9 ) 雌甾- 4 一烯( 简称m h e ) 的细菌z y 3 菌株。经形态、生理生化特性及1 6 sr d n a 序列分析初步鉴定该菌 株属于r a o u l t e l l a 属( r a o u h e l l a 印) 。 经过对z y 3 菌株以m h e 为唯一碳源生长和降解特性的分析表明，z y 3 菌 株利用m i i e 生长的最适温度和p h 值分别为3 5 。c 和1 0 o ，7 2h 时间内的最适降 解浓度为1 0m g l ，7 2 小时内降解效率最高。加入营养物质麦芽糖和蛋白胨能促 进菌株对底物的降解，在7 2h 内降解率达到了8 7 和8 5 。 碳、氮源也是影响z y 3 菌株生长和降解水平的重要因子，当有较易于利用 的其它有机碳源或有机氮源存在时，菌体的生长可以得到促进。金属离子n a 上、 m 9 2 + 、f e 3 + 、c a 2 + 、对菌株z y 3 生长和降解m h e 的影响不大，而重金属s n 2 + 、 z n 2 + 、a 1 3 + 、m n 2 + 、c d 2 + 、c u 2 + 对菌株z y 3 生长和降解m h e 有较大的抑制 作用，其中以s n 2 + 、z n 2 + 、c d 2 + 、c u 2 + 抑制作用最为明显。 目前，r a o u l t e l l as p z y 3 菌株是国内首次分离出的一株以m h e 为唯一碳源、 能源的高效降解菌，通过本实验，阐明微生物降解甾体雌激素的特性，在应用上 提供优良菌种，希望能对我国的甾体雌激素废水治理有所裨益。 关键词：甾体雌激素；生物降解；m h e ：z y 3 菌株 垒! 竺! ! a b s t r a c t ab a c t e r i a ls t r a i n ，z y 3 ，g r o w i n gw i t hs e xs t e r 6 i dh o r m o n e sa ss o l es o u r c eo fc a r b o n a n de n e r g y , w a si s o l a t e df r o mas e w a g et r e a t m e n tp l a n ti nap r o p h y l a c t i cp r o d u c t i o n f a c t o r y a n dc o u l dd e g r a d e3 - m e t h o x y 一1 7 1 b h y d r o x y 一1 ，3 ，5 ( 1 0 ) ，8 ( 9 ) - a 4 一e s t r e n ，n a m e d m h e ，t h r o u g hb e i n ge n r i c h e da n dd o m e s t i c a t e d t h i ss t r a i nw a sp r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e d a sr a o u l t e l l as p z y 3a c c o r d i n gt oi t sm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e sa n dt h e a n a l y s i so f i t s16 sr d n a s e q u e n c e ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，p h ，t i m ea n dc o n c e n t r a t i o n f o rt h ed e g r a d a t i o no fm h eb ys t r a i nz y 3w e r e3 5 。c ，1 0 0 ，7 2 ha n d1 0 m g l ， r e s p e c t i v e l y t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fs e xs t e r o i dh o r m o n e sw a sp r o m o t e dt o8 7 a n d 8 5 a f t e rt h ea d d i t i o no fm a l t o s ea n dp e p t o n e t h es e xs t e r o i dh o r m o n e sd e g r a d a t i o nw i l lb ei m p r e s s e dw h e nt h e r ei so t h e rc a r b o n s u p p l ye a s i l yt ob eu s e d ，a n ds t r a i nz y 3c a nu s eo r g a n i cn i t r o g e nb e t t e rt h a ni n o r b a n i c n i t r o g e ns u p p l y h e a v ym e t a li o n ss n 2 + 、z n ”、a 1 3 + 、m n 2 + 、c d 抖、c u 2 + e s p e c i a l l y s n 2 十、z n 2 + 、c d 2 + 、c u 2 + c a l lg r e a t l yr e s t r a i nt h eg r o w t ha n ds e xs t e r o i dh o r m o n e s d e g r a d a t i o nb yz y 3 b yt h i st i m e ，r a o u l t e l l as p z y 3w a st h ef i r s tb a c t e r i a ls t r a i nt o o km h e a ss o l e c a r b o na n de n e r g yr e s o u r c e si nc h i n a i tw a se x p l a i n e df o rt h ec h a r a c t e r i s t i c so fs t r a i n z y 3d e g r a d a t i n gm h ei nt h e o r y i naw o r d ，t h i ss t u d yw a se x p e c t e dt ob eb e s t e a df o r t r e a t i n gw i mt h ep o l l u t i o no fs e xs t e r o i dh o r m o n e so fc h i n a k e yw o r d s ：s e xs t e r o i dh o r m o n e s ；m h e ；b i o d e g r a d a t i o n ；z y 3s t r a i n i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：童= 1 左：豳绉日期：星丛：受： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：刻苤，鹏导师签名：互丛至竺至兰日期：之堡：! ： 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 甾体化合物的发展概况 甾体化合物属生物学上的活性物质，由胆固醇合成，在化学结构上均有一个 共同的环状化合物，称环戌烷多氢菲核，结构通式如图1 1 虚线框中所示，由三 个六元环和一个五元环组成，分别称为a 、b 、c 、d 环。甾体化合物包括雌激 素、雄激素、孕激素、皮质素四大类。一般天然及合成甾体雌激素在核的c 一1 0 和c 一1 3 上常有甲基；在c 一3 、c 1 l 和c 1 7 上可能有羟基或酮基；a 环或b 环可 能有双键；c 1 7 上有长短不一的侧链，如图1 2 ： 2 l1 12 图卜1 甾体化台物的基本结构 f i g l 一1t h eb a s i cs t r u c t u r eo fs e xs t e r o i dh o r m o n e s c h 3 o h e e 2m h e 图卜2 天然及合成甾体雌激素结构 f i g l 一2t h es t r u c t u r eo fn a t u r a la n ds y n t h e t i cs e xs t e r o i dh o r m o n e s 甾体化合物能影响人类或野生动物内分泌系统并导致非正常效应，这种物质 称为内分泌干扰物( e n d o c r i n ed i s r u p t o rc h e m i c a l s ，e d c s ) 【1 】主要应用于医药生 北京工业大学工学硕士学位论文 产。自1 9 5 0 年发现肾上腺皮质激素可的松等对风湿关节炎有显著疗效以来，甾 体激素药物因具有多种生理活性和医疗用途而得到迅速发展。目前常用的已有 5 0 多种药物，成为医药工业的一大门类。近年来还对其他医疗领域不断扩大应 用范围，如用于心血管、抗肿瘤、利尿、麻醉、肌松以及和内分泌有关的老年性 疾病等新药不断涌现。此外，甾体激素亦开拓应用子促进家蓄繁殖生长及植物生 长。我国自1 9 5 8 年以来，在科研单位与生产厂密切协作下，甾体药物逐步发展， 已形成工业生产体系。目前国际上有的重点品种包括性激素、皮质激索、避孕药 物、蛋白同化激素等，国内已生产，不仅满足国内需要，很多已经出口1 2 1 o 天然甾体化合物e 1 、e 2 和e 3 的溶解度大约为1 3m g l ，合成甾体雌激素 的溶解度还要低，e e 2 为4 8m g l 一，m e e e 2 为n 3m g l 一。 甾体激素结构复杂，最初从生物组织中提取获得，但其量甚微，不能满足医 疗需要。1 9 4 6 年美国m e s c k 公司的s a r e t t 等曾用二年多时间，通过3 0 多步化学反 应，由1 2 7 0 磅牛胆汁中的脱氧胆酸合成了9 3 8 毫克可的松，总收率仅0 1 5 ，无 法应用于生产。在合成过程中最大的困难是向团体骨架的1 l 位碳原子引入一个氧 原予( 即羟基) 。与此同时，德国生化学家h e c k e s 等用智上腺素的组织均浆研究成 功便脱氧皮质酮转化成可的松，证明生物的酶可以将氧原子直接引入到团体的 c l l 位上。在这一启发下，1 9 5 2 年美 雪d p j o h n 药厂的p e t e r s o n 和m a r r a g 习等成功地 用黑根霉使黄体酮一步转化成l la 羟基黄体酮，解决了皮质激素合成中的关键问 题，并且转化率高达9 0 以上，专一性也强，是化学方法所无法相比的。从而开 辟了甾体微生物合成的新途径，产量扩大，成本降低，促使甾体药物工业迅速发 展。 目前微生物工程在甾体药物生产中已成为一个极其重要的组成部份，利用微 生物酶转化代替化学合成的反应也日益增多，如1 1a 羟化、1 1b 羟化、a 环芳构 化、定向还原、甾醇降解及不对称合成等均可用微生物发酵进行工业生产。我国 在发展甾体药物生产中，微生物合成也已广泛应用，形成了一定规模，在皮质激 素、高效皮质激素、雌激素以及避孕药等药物生产中发挥作用，取得良好经济效 益。 1 ln 羟化 用黑根霉使1 6q1 7n 环氧孕甾4 烯3 。2 0 - - 酮氧化引入1 la 羟基，从而研究成 2 第l 章绪论 功自薯强皂素台成可的松七步法合成路线，这是我国第一个用于甾体药物生产的 微生物合成。 c h 3 c h 3 乒 ，- - o 图i - 3 l ia 羟化 f i g l 一3h y d r o x y l a l i o na t11 o 1 1 1 3 羟化 采用梨头霉( a b s i d i ao r c h i d i s ) 从醋酸化台物s 一步引入1 10 羟基合成了 氢化可的松。 c h 2 0 a c e h 2 0 h o h 一o h 图卜4 1 1b 羟化 f i g l 一4h y d r o x y l a t i o na t11b 环芳构化反应 用简单节杆菌使1 9 羟甲雄甾4 烯3 ，1 7 二酮一步发酵转化成雌酚酮，已成 为较经济的生产方法：反应过程是先使a 4 烯变成l ，4 二烯，然后芳构化，合 成挥酚酮后，可用合乙炔雌二醇，雌二醇，雌三酵及其衍生物。 o 定向还原反应 o 图卜5 环芳构化反应 北京工业大学工学硕士学位论文 在全合成1 8 甲基炔溶酮中，用啤洒酵母2 3 4 6 茵株使bb 乙基3 甲氧基ce ， 1 4 开链1 ，3 ，5 ( 1 0 ) ，9 ( 1 1 ) 雌甾四烯1 4 1 7 - - 酮定向还原为光学活性相应的1 7 羟 基化物，收率8 3 1 4 1 。 c h 3 _ c h 图1 6 定向还原反应 f i g l 一6o r i e n t a t i o nr e d u c i n gr e a c t i o n 甾醇降解 利用诺卡氏突变菌株使胆固醇或谷甾醇等醇原料的边链降解成为雄甾1 4 - - 烯3 ，1 7 - - 酮( a d d ) 或雄甾4 烯3 ，1 7 - - 酮。这是国际上用微生物开发的甾体新资源。 1 2 甾体雌激素在环境中的分布 甾体化合物在动物的排泄物、土壤、地表水、以及地下水中都有分布。s h e m e s h 在动物的粪便以及尿液中检测到了甾体激素0 5 1 ；t a b a t a 等报道了地表水中甾体激 素的含量，在1 0 9 条日本河流中的2 5 6 个水样中检测到有2 2 2 个水样含有e 2 ，平均 浓度为2 1 n g l 6 1 ，在一些饮用水中也检测到了甾体激素 7 1 ，在不同国家的污水处 理厂的进出水中都检测到了甾体激素8 4 1 。近来一些研究表明，动物粪便排放到 农业耕地上作为肥料会导致甾体激素转移到地表水和地下水中”】。 人体每天都要向自然界排泄一定量的甾体化合物( 表l 一1 ) 。这些甾体化合 物挥发性差，可通过食物链富集，生物半减期较长，可在集体内长期蓄积，难生 物降解。 表卜1 人体向自然界排泄的甾体化合物( ug 人天) t a b l e l ls e xs t e r o i dh o r m o n e se j e c t e db yh u m a nt on a t u r ee v e r y d a y ( “g p - d ) 种类 e le 2e 3e e 2 男性 1 63 91 5 月经期女性 2 584 8 闭经女性 2 3 4 1 怀孕女性 2 5 96 0 06 0 0 0 女性 3 5 4 第l 章绪论 1 3 甾体雌激素对环境的污染和危害 甾体雌激素在科学界归为内分泌干扰物，此类物质能够影响人类或野生动物 内分泌系统并导致非正常效应，对人体和野生动物的生存都造成极大的威胁! p u r d o m 最早报道了城市污水处理厂( s e w a g et r e a t m e n tp l a n t ，s t p ) 出水中 鱼类受到雌激素影响1 1 6 。他发现，s t p 出水口附近的鱼类体内血浆卵黄蛋白原浓 度高于正常水平。此后的许多研究也表明有许多化学物质能够干扰人类及野生动 物的内分泌系统，导致男性精子数量减少，野生生物生殖机能和生殖器官发育出 现异常现象。大量研究表明，在这类物质中，天然以及人工合成的甾体类雌激素 是一类被重点嫌疑的化学物质。 很低浓度的甾体雌激素就可以导致性腺的形态学改变或性别比例的变化，同 时也存在血液学毒性、肝脏毒性、。肾脏毒性、脾脏毒性以及其它器官或组织毒性 由于环境雌激素不容易被生物降解，因此极易通过食物链在生态系统内进行生物 富集，雌激素经过3 4 个营养级的富集即可达到惊人的浓度。 内分泌干扰物己成为全球环境研究热点问题之一，美国、欧洲、日本分别提 出了自己的内分泌干扰嫌疑物质名单。近年来，许多发达国家和地区都已经开始 对城市s t p 中的e d c s 展开分析调查工作。国内目前类似研究鲜有报道。 ：我国是当今世界上避孕药生产和销售量最大的国家之一，而合成雌激素是避 孕药的主要成分。由于我国的城市污水处理率普遍较低，因此，从污染水平上看， 我国存在来自人类、家畜所排泄的天然激素和人工合成激素的污染较其他发达国 家高的污染特征。由于雌激素类物质在极低的浓度条件下显示出强的内分泌干扰 作用，而且有可能与水体中残留的其他类雌激素物质发生协同作用，因此这类物 质对生态环境和人类健康潜在的危害性是不可忽视的。 1 ，4 多环芳烃化合物的分布及危害 甾体雌激素属于多环芳烃化合物( p n l s ) ，多环芳烃化合物( p a h s ) 一般是 指在结构类型上含三个或更多并合芳香环的分子，是个庞大、多样的有机化合 物类群，常见的如葸、菲、芘( p y r e n e ) 、荧蒽( f l u o r a n t h e n e ) 、苯并葸 ( b e n z a 】a n t h r a c e n e ) 、屈、苯并芘( b e n z o a p y r e n e ) 等，见图卜7 。这类化合物分 布广泛，对人类具有很高的遗传毒性、致癌性、诱导突变性和致畸性 2 0 1 。该类 化合物在环境中普遍存在，如大气、地球表面的水体和土壤沉积物中，这些环境 北京工业大学工学硕士学位论文 中的p a h s 主要源于有机物的燃烧。除此以外，p a h s 也是原油和煤矿中的一些物 质如杂酚油和煤焦油的组成成分，在生产、运输以及这些物质使用过程中，由于 意外的泄露和不合适的倾倒都会形成一些严重危害健康、对环境有破坏作用的污 染点。 葸( a n t h r a c e n e ) ( p h e n a n t h r e n e ) 芘( p y r e n e ) 苯昔7 煎, ( b e n z a a n t h r a c e n e ) 屈( e h r y s e n e ) 苯并芘( b e n z o a p y r e n e ) 双苯蒽( d i b e n z a , h a n t h r a c e n e )荧蒽( f l u o r a t h r e n e ) 图1 7 ：常见多环芳烃化合物的结构 f i g l 一7t h ec o i i l o ns t r u c t u r eo fo fp a i _ s 生物的分解能力主要取决于p a h 化学结构的复杂性以及微生物本身的性质。 2 3 环芳烃化合物如萘的降解途径、代谢过程中的酶以及代谢的遗传调控已有了 较多的研究和阐述f 2 l 】，4 环及4 环以上的芳烃化合物，研究工作在1 9 8 8 年才开 始出现一些进展1 2 2 1 。含四环的p a h s 的代表化合物是芘和萤蒽，常作为模式化合 物进行研究。 1 5 国内外研究现状 1 5 1 关于甾体类雌激素的降解菌 从目前的研究报道来看，甾体雌激素的降解以生物降解和光解为主，目前对 于雌激素在环境中降解行为的研究还很少。t a n a k a 等研究了酶对5 种内分泌干 扰物的降解，发现e e 2 能在漆酶作用下降解2 3 】；v a d e r 等在硝化活性污泥中对 5 0 m g l 的e e 2 进行降解，发现e e 2 被氧化生成亲水性、雌激素活性较低的产物 6 第1 苹绪论 1 2 4 1 ；s e g m u l l e r 等从药物变质角度，利用h p l c n m r 和h p l c m s 技术鉴定了 4 3 9 l e e 2 在乙腈溶液中的氧化和光降解，证实主要的降解产物是e e 2 的过氧化 物1 2 5 】；c o l e m a n 等则证实在t i 0 2 存在下，紫外光可使e 2 发生降解 2 6 】。 k a z u t a k a 等研究了白腐真菌中的1 i g n i n o l y t i c 酶对e e 2 干h e 2 活性的去除 1 2 7 1 ：f u j i i 等从s t p 分离得到一株革兰氏阴性好氧菌，暂鉴定为n o v o s p h i n g o b i u m s p 能将e 2 降解【2 8 】。革兰氏阴性菌c o m a m o n a s t e s t o s t e r o n i 在缺乏合适的碳源的情 况下能够以甾体雌激素的c 1 9 - c 2 7 位为唯一碳源和能源1 2 9 1 。广明雄等报道，在人体 及土壤中存在c m a m a o n a st e s t o s t e r o n i 菌，能够以芳香化合物和甾体类化合物为唯 一碳源和能源，并认为该菌对这些化合物的生物降解具有重要作用3 0 】。 由文献报道可知，城市s t p 在某种程度上能够去除甾体雌激素，尽管经常达 不到低于对鱼类产生雌性化作用的浓度 3 1 , 3 2 1 。国内刘彬等研究了雌酮在水溶液 中的光降解情况以及三价铁离子对雌酮光降解的促进作用。研究结果表明，雌酮 在光降解时破坏了其苯环结构，生成了含有羰基的氧化物( 3 3 】。最近一些研究者对 e 2 、e e 2 等在汞灯或紫外光照射下的光解进行了研究，结果表明，这些雌激素均 有不同程度的降解。 一些报道认为，e 2 的减少主要是活性污泥的吸附或其它与微生物有关的因素 3 5 】。目前，降解木质素的白腐真菌及其酶系引起了人们广泛的关注，这是因 为白腐真菌被认为对环境污染物具有降解或解毒的作用。由木质素降解菌产生的 锰过氧化酶( m n p ) 已经被证明能够降解木质素以及像氯酚、多环芳烃以及染料 这些化合物。 目前，对胆甾醇降解的研究较多，车成彬等人口6 1 研究了1 8 8 种菌对胆甾醇降 解能力的比较，能把胆甾醇完全降解成二氧化碳和水的菌种有：节细菌属、芽孢 杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属，分枝杆菌属、诺卡氏菌属。在降解过程中如果 加入一定的亚硝酸盐和吡啶可以使胆甾醇分解酶受到抑制作用。 研究表明，诺卡氏菌、节杆菌和分支杆菌等微生物可切除甾醇的饱和侧链， 得到a d d ，然而，微生物对甾体化合物的降解可以使甾类物质直接转化为二氧化 碳和水，反应方程式如图所示： 北京工业大学工学硕士学位论文 oo o o 舻+ 明班一三嘞+ 哟 h o o c 图卜8 ：甾体化合物降解途径示意图 f i g l 一8t h es k e t c hm a po fd e g r a d a t i o na p p r o a c ho fs e xs t e r o i dh o r m o n e s 甾体雌激素在环境中的分布及存在形式由它们的物理化学特性以及它们所 处的环境状况决定。许多学者认为吸附和生物降解是甾类雌激素两种可能的去除 途径眇3 8 1 。 关于甾体雌激素可能在污泥上进行吸附的文献较少，只有一些粗略预测。e 2 和e 3 的疏水性较差 3 9 1 ，因此吸附在生物污泥上可能不是它们主要的存在形式。 e e 2 的疏水性强于e 2 和e 3 ，因此，对于e e 2 ，通过吸附到污泥中而达到从水相 中的去除是其主要的去处方式。l a y t o n 等用浓度为2 5 9 l _ 1 的接种污泥作降解试 验，在没有发生降解的第1 h 取样，发现水相中只剩下2 0 9 6 的作了标 己的e e 2 ，说 明有8 0 的e e 2 被吸附到了污泥中，l a y t o n 还指出，天然甾体雌激素的降解速度 越快，吸附就越困难。 最近，越来越广泛的关注集中在s t p 在阻止甾体物质排放方面所扮演的角色。 t e r n e s 等通过微观试验观察到只有少量e e 2 进行了转化h ”，因此可以预测e e 2 通过s t p 的去除率比较低。l a y t o n 早期用碳1 4 标记e e 2 的实验则表明有8 0 的 e e 2 吸附到污泥上【4 2 1 。因此，对e e 2 去除率比较稳定的解释是它不受不同的s t p 中生物污泥性能影响。而其他一些用不同的方法进行研究的学者，并没有得出 e e 2 具有稳定去除率的结论。一些意大利的s t p 对e e 2 的去除率在3 0 9 6 至49 0 9 6 之 间；里约热内卢s t p 对e e 2 的去除率为8 0 【4 3 】：而瑞典的一个s t p 4 4 ； i 德国的一 个s t p 3 8 j 对e e 2 没有去除效果。 除了e e 2 外，b a r o n t i 等人的研究发现，在不同的s t p 或者在同一s t p 的不 同采样点，e 2 和e 3 都有稳定的去除率。e 3 被认为是可生物降解性最好的甾类雌 激素，平均去除率可达到9 5 9 6 。严格来讲，没有人能够给出e l 的降解去除率的 第1 覃绪论 准确值，因为很明显它还是e 2 不断分解的产物。 丽臭氧氧化、紫外照射、膜分离以及活性炭吸附都是可以改善s t p 中雌激素 去除效果的可能处理方法1 4 5 1 ，但这些技术的实施会大大增加处理成本，目前的应 用实例还比较少。 1 5 2 关于甾体类雌激素的检测 目前，对废水中甾类雌激素的测定方法文献报道多为气相色谱一质谱法 ( g c m s ) 和液相色谱一质谱法( l c m s ) 法。国内外科学家正在积极探索切实有效的 新方法，例如，有人认为，对于甾体类化合物，酶一免疫吸收剂化验法 ( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 是比较强大的分析方法，并能 够与g c m s 联机法相媲美1 4 6 1 。 国内张宏报道了尿及河底泥中环境雌激素( 壬基酚、双酚a 、已烯雌酚、1 7 d2 乙炔基雌二醇) 和内源性雌激素( 1 7n 一雌二醇、1 7b 一雌二醇、雌三醇、雌酮) 的气相色谱一质谱( g c m s ) 测定法h 。 下表列出了目前国外一些著名学者在净化、富集、鉴定污水中的甾体类激素所采 用的分析方法。 表1 2 甾体类雌激素的检测方法 t 曲l e l 一2d e r e c t i o nm e i so f s e xs t e r o i dh o r m o n e s 作者年份 萃取净化 分离 回收率 j o h n s o n 2 0 0 0 o 5 9 c a r b o g r a p h4甲醇甲酸 l c 翟s8 8 9 7 萃取柱 b e l r o i d 1 9 9 9s b d x cc 1 8 n h 2 柱，g c 叫s 一惦8 8 9 8 p o l y s t y r e n e d i v eh p l c 分离 n y l b e n z e n e t e r n e s 1 9 9 9 ac 1 8 柱硅胶柱 g c 叫s _ m s7 4 8 6 l a s s o n 1 9 9 9 p o l y s t y r e n e d i v e b i o b e a d ss x 一3g c m s n y l b e n z e n e 柱 d e s b r o w 1 9 9 8c 1 8 柱甲醇水，c 1 8g c 埘s 7 9 8 5 柱 c h i a r a 2 0 0 0 0 5 9 c a r b o g r a p h4 甲醇水l c e s i - m s - m s 萃取柱 j o h n s o n 认为，定性、定量测定s t p 进、出水中的甾体激素是困难并且昂贵的 过程，要形成一套常规分析方法，还需一段时间【3 8 】。 北京工业大学工学碗士学位论文 1 5 3 降解多环芳烃化合物的微生物 多环芳烃化合物在环境中有很大的危害作用，国内外学者对若干菌株的降解 能力进行了研究。1 9 8 9 年，m u e l l e r 等人以萤蒽作为唯一碳源和能源从杂酚油污 染的石油中分离到一个能够利用萤葸的细菌群落，该群落由7 个成员组成。同时， 该群落用萤葸进行培养时，还能对其它高分子量的芳烃化合物进行生物转化，转 化浓度范围在o 3 2 3 m g 1 【4 8 】。2 0 0 2 年s a m s w a t h y 和h a l l b e r g 首次报道了真菌以 芘作为唯一碳源和能源的利用情况。他们从一个前煤气厂分离得到了5 株能够降 解芘的真菌，其中p e n i c i l l i u m 属有4 株。降解能力最强的菌株在培养2 8 天时， 对浓度为5 0 m g l 和l o o m g 1 的芘的最大降解率分别为7 5 和6 7 ，而降解能力 最差的菌株的降解率也分别为5 7 和3 1 5 【4 9 1 。 表1 3 降解多环芳烃化合物的菌种 t a b l e l 一3t h ed e g r a d a t i v ep a l l sb a c t e r i u m 降解微生物文献 化合物 细菌真菌 萘p s e u d o m o n a s ， 5 0 ，5 1 ，5 2 ，5 3 ，5 4 ， r h o d o c o c c u s ，5 5 c y c l o c l a s t i c u s 蒽p s e u d o m o n a s ，p i e h f o t u s ， 5 6 ，5 7 ，5 8 ，5 9 ，6 0 ， m y c o b a c t e r i u m ， p k n e r o c h a e t e ，6 1 c o r i o l o p s i sb j e r k a n d e r a 菲 p s e u d o m o n a s ，p h a n e r o c h a e t e ，5 2 ，5 3 ，5 4 ，6 2 ， n o c a r d i o i d e s ， p l e u r o t u s ，a s p e r g i l l u s 6 3 ， 6 4 ，6 5 ， m y c o b a c t e r i u m ，6 6 ，6 7 ，6 8 c o r i o l o p s i s ，c y c l o c l a s t i c u s 莹蒽m y c o b a c t e r i u m ，5 4 ，6 6 ，6 9 p s e u d o m o n a s 芘 m y c o b a c t e r i u m ，a s p e r g i h u s , p l e u r o t u s 7 0 ，7 1 ，7 2 ，7 3 ，7 4 ， c o r i o l o p s i s ，p s e u d o m o n a s , 7 5 s p h i n g o m o n a s , c r i n 驴i l l i s ，b a s i d i o m y c e t e s 苯蒽7 6 ，7 7 ，7 8 ，7 9 t y c o b a c t e r h mp l e u r o t u s 芴 p e u r o t u s ， 5 9 ，7 7 ，7 8 ，7 9 4 月z h r 0 刚c 撇 p h a n e r o c h a e t e ， c u n n i n g h a m e l l a 1 0 第l 章绪论 微生物降解是消除有机污染物的重要手段，已分离得到不少针对各种污染物 的菌株，但这些菌株基本都是分离自高浓度污染源，菌株为富营养细菌，在寡营 养条件下难以正常生长和繁殖，因此现有降解工艺和菌株无法满足微污染物的降 解需要。 1 6 课题研究内容和意义 本课题主要研究内容包括以下几部分： 1 在某避孕药生产企业污水处理站的活性污泥中，用微生物分离技术筛选出对 甾体雌激素m h e 具有降解活性的菌株，并对菌株酶活进行了的初步测定。 2 研究纯菌株的生理生化特性和对m h e 降解特性，并且考察该菌株以其他多苯环 芳香烃为唯一碳源的生长情况。 3 菌株鉴定和保藏。 甾体雌激素具有非常特殊的生物活性，当这些物质流失到环境中时，就具有 潜在的威胁。e e 2 就是一个重要的例子，本意是作为避孕药，但是当人类的大量 生殖功能都由药物来调控，那么，e e 2 也便成了水体中鱼类的避孕药，水生生物 的雌性化现象也就不足为奇了。 我国在甾体雌激素对人体以及野生生物的负面影响方面重视还不够。国外学 者已经开始了有关甾体雌激素污染的研究，但目前对甾体雌激素这类重点嫌疑的 e d c s 在环境中存在方式与消失途径的研究比较有限，有必要进行详细的调查研 究以了解甾体雌激素在环境中的分布情况以及消失和降解途径，包括对甾体雌激 素的降解微生物进行培养和研究，考察降解历程以及中间产物的雌激素活性等。 城市污水是甾体雌激素的来源之一。因此，城市污水处理厂应用先进、有效 的处理技术以防止这些物质迸入到给水水体中。正如j o h n s o n 所认为的那样，城 市污水处理厂对甾体雌激素的去除潜能将成为世界范围内废水处理出水水质的 主要问题之一【3 8 1 。 北京工业大学工学硕士学位论文 第2 章实验材料及方法 2 1 甾体雌激素的测定一高效液相色谱法 2 1 1 测定原理 用乙酸乙酯将液体培养基中的m h e 按1 ：2 的比例萃取出来，通过高效液相色 谱仪( h p l c ) 测定菌体降解前后培养液内m 既的峰面积，判断菌体对m h e 的降 解率，选出优势菌种和最佳降解条件。 降解率分析结果表述： s ：生! 二生! l o o ( 2 1 ) 4 l s 甾体雌激素降解率( ) ： a l 降解前的峰面积； a 2 降解后的峰面积； 2 1 2 测定步骤 ( 1 ) 吸收波长的确定 在一系列干燥洁净的地反应管中，分别加入m | e 溶液2 0 m l ，浓度分别是l m g l ， 5 m g ，1 0 m g 1 ，2 0 m g 1 。2 5 m g 1 。通过紫外分光光度计扫描绘制出标准曲线， 从而确定m h e 的吸收波长为2 7 9 纳米。 ( 2 ) 标准曲线的绘制 配置不同浓度的删e 溶液，通过高效液相色谱仪( h p l c ) 获得m h e 浓度和峰面 积关系的标准曲线，进而来测定菌体降解前后培养液内的m h e 。 首先制作流动相。取一定量的蒸馏水通入超纯水仪，超纯水仪电阻控制在 1 8 3 m o ，准备完毕后，按下开关s t a r t ，将流出的超纯水接入烧杯中，制备完 毕，按下s t o p ，关闭仪器。以乙腈( f i s h e rc h e m i c a ll j s a ) 和超纯水以6 8 ：3 2 的比例混合水接入烧杯中，流动相制作完毕。 然后用高效液相色谱仪( h p l c ) 来测定溶液中m i e 的峰面积。色谱柱为z o r b a x e x t e n d c 1 8 ( 安捷伦科技有限公司，5pm ) ，内径4 6 r a m 2 5 0m m 不锈钢管。柱压 控制在8 5b a r ，控制流速t m l m i n 。首先用甲醇清洗色谱柱3 0 分钟，然后用配置好 2 第2 章实验材料及方法 的流动相清洗色谱柱6 0 分钟，清洗完毕后，按下l o a d 和b a l a n c e ，待屏幕显示 r e a d y 时，用进样器快速注入1 0 “1 待测液，按下i n j e c t 。等待计算机屏幕上显示 出峰，按下f 8 ，得出峰面积。检测完毕。将删e 浓度与峰面积制成标准曲线，如图 2 - 1 所示。 图2 - 1 蛐e 浓度和峰面积曲线图 f i 9 2 1t h eg r a p ho f 姗ec o n c e n t r a t i o na n da p e xa r e a 2 2 菌种选育 2 2 1 菌种富集、分离纯化 将活性污泥样品按l o o m l 液体培养基的1 0 的接入量接种于液体培养基中， 加入l o o m l 液体培养基的2 0 的实际废水驯化，在3 0 。c 、1 2 0r r a i n 的摇床上振荡 培养5 d ，培养液变浑浊后，再按l o o m l 液体培养基的1 0 的接入量转接到新的培 养液中，同时加入l o o m l 液体培养基的2 0 的实际废水，培养5 d ，如此重复5 8 次，完成对降解微生物的富集培养。随后在加1 0m g lm h e 的琼脂培养基平板上 划线分离，选择不同形态特征的菌落，分别转接至m h e 浓度为1 0 m g l 的液体培 养基中于3 0 c 、1 2 0r r a i n 的摇床上振荡培养7 2h ，菌种生长以6 0 0i i l l 1 处的浊度 o d 6 0 0 表示，选择o d 6 0 0 值最大的菌株为优势菌，即z y 3 。细菌生长以波长x6 0 0n l t i 处的浊度o d 6 0 0 表示。 2 2 2 革兰氏染色法 试剂：a 液染色：结晶紫2 0g ，9 5 ( v v ) 乙醇2 0m l ；b 液染色：草酸铵o 8 g ，蒸馏水3 0 0m l 。混合a 和b 得到结晶紫染色液。在使用前贮存2 4h ，并用 滤纸过滤。媒染液：碘1 0g ，碘化钾2 0g ，蒸馏水3 0 0m l ；在研钵中研磨碘 和碘化钾，边研磨边缓慢地加入水，直至碘溶解为止。在棕色瓶内储存。脱色液： 北京工业大学工学硕士学位论文 9 5 ( v v ) 醇；复染液：番红o 【2 5 ( w v ) ，在9 5 ( v v ) z , 醇中】1 0m l ：蒸馏水1 0 0 m l 步骤： ( 1 ) 涂片：无菌操作条件下，用接种环沾取已培养2 4 小时的菌体，在载玻片 上的2 0 “l 灭菌蒸馏水中划几下，酒精灯灼烧接种环( 以防菌体太多影响染色) ， 再用冷却的接种环在水滴中划l m i n ，使菌体分布均匀，自然晾干； ( 2 ) 初染：将载玻片在火焰中来回过2 3 s ，热固定涂片，结晶紫染色l m i n ， 自来水轻洗涂片，自然晾干； ( 3 ) 媒染：碘液lm i n ，自来水轻洗涂片，自然晾干： ( 4 ) 脱色：9 5 ( v v ) z , 醇轻洗涂片3 0 s ( 时间严格控制) ，自来水轻洗涂片，自 然晾干； ( 5 ) 复染：番红染色l m i n ，自来水轻洗涂片，自然晾干； ( 6 ) 油镜观察 以革兰氏阴性菌e c o l i 为对照。革兰氏阳性菌表现为蓝色或紫色，而革兰氏 阴性菌表现为红色。同时可用k o h 实验验证革兰氏染色的结果。 k o h 实验步骤：在玻片上滴一滴3 k o h 溶液，用接种环挑取过夜培养的 新鲜菌落涂于液滴处，1 分钟后轻轻抬起接种环，观察是否可拉出丝。革兰氏阴 性菌可以在k o h 中破壁，有丝拉出。 分别取培养1 2 h 、1 8 h 、2 4 h 、3 6h 的菌落，用2 的醋酸稀释固定，在喷碳 的铜网上点5 l 稀释为不同浓度的菌液，用透射、扫描电子显微镜观察菌体的形 态和鞭毛。 ( 2 ) 菌落形态：接种l b 培养基平板，3 0 。c 培养2 天，观察菌落颜色及形态。 2 3 样品与培养基 试验样品取自某避孕药生产企业制药厂污水处理车间好氧池活性污泥。 甾体雌激素：m h ec 1 9 h 2 4 0 r 3 甲氧基1 7b 羟基一1 ，3 ，5 ( 1 0 ) ，8 ( 9 ) 雌甾4 烯( 一种重要的甾体雌激素) ，其结构式如图1 所示。 第2 章实验材料及方法 o h 图2 - 23 - 甲氧基1 76 羟基1 ，3 ，5 ( 1 0 ) ， 8 ( 9 ) 一雌甾4 烯 f i g 2 23 - m e t h o x y - 1 71 3h y d r o x y 一1 ，3 ，5 ( 1 0 ) ，8 ( 9 ) - 土4 - e s t r e n e e 2 购自s i g m a 化学试剂公司 无机盐培养基( m s b ) 组成：n a e h p 0 4 1 2h 2 0 ，2 0g ；k h 2 p 0 4 ，0 5 9 ； m g s 0 4 h 2 0 ，0 2 9 ：( n - h ) 2 s 0 4 ，1 o g ：酵母膏，o 1 9 ；微量元素，5m l ；h 2 0 ， 1 0 0 0m l ；p h ，7 0 + 每升微量元素包括：e d t a ，0 5 0 0 9 ；z n s 0 4 h 2 0 ，2 0 0 9 ；c a c l 2 ，0 0 5 5 0 9 ； m n c l 2 h 2 0 ，2 o o g ；f e s 0 4 + h 2 0 ，0 0 4 9 9 9 ；( n i - h ) 6 m 0 0 2 4 h 2 0 ，1 o o g ：c u s 0 4 5 h 2 0 ， o 0 1 5 1 9 ；c u c l 2 ，o 0 1 6 1 9 ；h 2 0 ，1 0 0 0m l ；p h 6 0 。 固体培养基中加入1 5g l 的琼脂粉，m s b 在1 5 磅压力下灭菌3 0 分钟后， 再直接加入1 0m g 几的m h e ，用于菌株的富集培养和特性试验。 l b 培养基：蛋白胨l ，酵母粉0 5 ，n a c ll ，琼脂1 5 2 ，p h7 0 ，蒸馏水 1 0 0m l ，1 5 磅压力下