（微生物学专业论文）苏云金芽孢杆菌菌株的分离和cry基因的鉴定.pdf

摘要 本研究从海南、云南的热带和亚热带原始森林及周边地区采集土壤6 8 3 份， 分离出苏云金芽孢杆菌野生菌株9 2 株，伴孢晶体类型有菱形、方形、球形、椭 球形、无定形等，充分体现了我国菌株资源的多样性。在4 l 份出土b t 的土壤 中，3 2 份( 7 8 ) 采自原始森林，1 4 6 土壤取自森林草地，7 4 属于大f f l 土壤。 通过对土壤资源、气候、海拔等地理特征分析，总结出了b t 资源的分布规律： 热带、亚热带b t 分离率高，温带其次，寒带分布数量有限；植被覆盖率高的地 区，生态条件优越，b t 分离率高；昆虫种类和数量丰富的地区，b t 的种类和数 量丰富：高山地区( 海拔高于3 0 0 0 米，尤为高山草甸) ，b t 含量极少。土壤表面 腐质层越厚，土壤所含腐殖质越丰富，b t 含量越多：b t 在山坡阳面比阴面分布 广。同时用2 6 对可鉴定3 1 种c r y 基因型引物对以上9 2 株菌和我国东北地区的 3 4 株菌进行了p c r r f l p 分析鉴定：含有c r y l 型基因的菌株5 8 株，含有c r y 2 型基因的菌株3 2 株，含有c r y 8 型基因的菌株1 2 株，含有c r y 9 型基因的菌株3 株，含有c r y l l 型基因的菌株1 2 株含有c r y 3 0 型基因的菌株1 4 株，含有c r y 4 0 型基因的菌株l 株。有4 2 株菌未鉴定出基因型。1 2 6 株野生菌株的伴孢晶体 s d s p a g e 分析结表明：3 2 株同时含有c r y l 型基因和c r y 2 型基因的菌株表达 1 3 0k d a 和6 0k d a 的蛋白，其伴孢晶体为菱形；在3 6 株表达1 3 0k d a 蛋白的菌 株中，2 4 株仅含有c r y l 型基因，伴孢晶体为菱形：1 2 株含有c r y 8 e a 基因，伴孢 晶体为球形。 菌株y 4 1 同时含有一个新型c r y 3 0 基因和一个新型c r y 4 0 基因，这种基因组 合在国内外系首次发现。两个基因的部分序列分别被克隆、测序( c r y 3 0 型基因 得到1 4 2 2b p 长度的序列，c r y 4 0 型基因得到1 3 8 2b p 长度的序列1 。其中，c r y 3 0 型基因与模式基因c r y 3 0 a a 和c r y 3 0 b a 的同源性分别为7 2 和7 3 ，c r y 4 0 型基 因与模式基因c r y 4 0 a a 和c r y 4 0 b b 分别保持9 3 和3 6 的同源性。在菌株z 2 3 4 中一个新c r y 3 0 基因被同时发现，得到的1 4 1 9b p 的序列与模式基因c r y 3 0 a a 和 c r y 3 0 b a 的网源性分别为8 9 和7 6 。而菌株y 4 l 和菌株z 2 3 4 中的两个新c r y 3 0 基因的同源性为7 3 。以上三个基因的部分序列已在g e n b a n k 登记注册 ( a c c e s s i o nn u m b e r s 分别为a y 8 1 7 1 4 7 、a y 8 1 7 1 4 8 、a y 9 1 6 0 4 6 ) 。 生物活性测定结果表明菌株y 4 l 和菌株z 2 3 4 对伊蚊有毒效，l c 5 0 分别是 1 0 8 4 3 3 9 9m l “和7 2 3 1 7 9 9m l 。菌株z 3 4 ，2 8 含有一个c r y l l b b 基因和 c r y 3 0 a a 基因，对伊蚊的l c 5 0 是2 7 3 7 8 7 i _ t gm l 一。4 2 株没有鉴定出基因型的菌 株对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟、粘虫、拟谷盗、黄粉虫均 无毒力。 关键词：苏云会芽孢杆菌，分布，分离，鉴定，p c r r f l p ，c r y 基因 i s o l a t i o no f 且t h u r i n g i e n s i ss t r a i n sa n d i d e n t i f i c a t i o no ft h e i rc r yg e n e s x u d o n gs u ，m i c r o b i o l o g y s u p e r v i s e db yp r o f j i a n x i nt a n ，p r o f f u p i n gs o n g ，p r o f w c iz h a n g a b s t r a c t i nt h i ss t u d y n i n e t y t w o 且t h u r i n g i e n s i si s o l a t e sw e r es c r e e n e df r o m6 8 3s o i l s a m p l e sc o l l e c t e df r o mt r o p i c a la n ds e m i t r o p i c a lp r i m e v a lf o r e s t si nt h ey u n n a na n d h a i n a np r o v i n c e so fc h i n a a m o n gt h e41t o t a ls o i ls a m p l e sc o n t a i n i n gb t h u r i n g i e n s i s ，t h e r ew e r e3 2s o i ls a m p l e s ( 7 8 ) c o l l e c t e df r o mp r i m e v a lf o r e s t s ， i4 6 o fs a m p l e so b t a i n e df r o mg r a s s l a n d s ，a n do n l y7 4 f r o ma g r i c u l t u r a l s o i l s r e g u l a r so fd i s t r i b u t i o no fb tw e r es u m m a r i z e d s e v e r a ls h a p e so fc r y s t a l s i n c l u d i n gb i p y r a m i d a i ，s q u a r e ，o v o i d ，s p h e r i c a l ，a n da m o r p h o u ss h a p e ，w e r e o b s e r v e di nt h ebt h u r i n g i e n s i si s o l a t e s t w e n t y - s i xp a i r so fp r i m e r sw e r eu s e dt o i d e n t i f y31h o l o t y p ec r yg e n e sa tp r i m a r yr a n k o ft h eb t h u r i n g i e n s i sc r yg e n e n o m e n c l a t u r es y s t e m t h ec r yg e n e - t y p e so f9 2b t h u r i n g i e n s i si s o l a t e sa n d3 4b t h u r i n g i e n s i si s o l a t e ss c r e e n e df r o mt h en o r t h e a s tr e g i o no fc h i n aw e r ei d e n t i f i e db y u s eo fp c r r f l p f i f t y e i g h ti s o l a t e sh a r b o r e dc r y lg e n e s ，3 2i s o l a t e sh a r b o r e d c r y 2 g e n e s 。12i s o l a t e sh a r b o r e dc r y 8g e n e s ，3i s o l a t e s h a r b o r e dc r y 9g e n e s ，12 i s o l a t e sh a r b o r e dc r y l lg e n e s ，14i s o l a t e sh a r b o r e dc r y 3 0 g e n e sa n d1 i s o l a t e h a r b o r e dc r y 4 0g e n e s d s p a o ea s s a yi n d i c a t e dt h ee x p r e s s i o no f12 6i s o l a t e s t h i r t y t w oi s o l a t e sc o n t a i n i n gb o t hc r y lg e n e sa n dc r y 2g e n e sp r o d u c e d 13 0k d a a n d6 0k d ap r o t e i nb a n d s ，a n df o r m e db i p y r a m i d a lc r y s t a l s a m o n gt h e3 6i s o l a t e s w i t h13 0k d ap r o t e i n s ，2 4i s o l a t e sh a r b o r i n go n l y c r y lg e n e sf o r m e db i p y r a m i d a l c r y s t a l s ，12i s o l a t e sc o n t a i n e dt h ec r y s e ag e n ea n dp r o d u c e ds p h e r i c a lc r y s t a l s a n o v e lg e n ep r o f i l eo fc r y 3 0a n dc r y 4 0w a sd e t e c t e di no n ei s o l a t e ( y 41 ) w a snever r e p o r t e di nt h ew o r l d f r a g m e n t so ft w og e n e sw e r es e q u e n c e d ( a1 4 2 2b pf r a g m e n t o f t h ec r y 3 0 g e n ea n da1 3 8 2b pf r a g m e n to f t h ec r y 4 0g e n e ) t h ep a r t i a ls e q u e n c eo f an o v e lc r y 3 0g e n es h a r e d7 2 a n d7 3 h o m o l o g yw i t ht h ee r y 3 0 a aa n dc r y 3 0 b a g e n e s ，r e s p e c t i v e l y t h ef r a g m e n to ft h en o v e lc r y 4 0 g e n eh a d9 3 a n d3 6 s e q u e n c eh o m o l o g yw i t ht h ec r y 4 0 a aa n dc r y 4 0 b bg e n e s ，r e s p e c t i v e l y af r a g m e n t ( 1 4 1 9b p ) o fan o v e lc r y 3 0g e n ei ns t r a i nz 2 3 4w a sa l s oc l o n e da n dh a ds e q u e n c e h o m o l o g yo f8 9 a n d7 6 t oh o l o t y p eg e n e sc r y 3 0 a aa n dc r y 3 0 b a , r e s p e c t i v e l y t h e r ew a s7 3 s e q u e n c eh o m o l o g yb e t w e e nt h ef r a g m e n t so ft h ep o t e n t i a ln o v e l c r y 3 0g e n e si ni s o l a t e sy 4 1a n dz 2 3 4 t h ea b o v et h r e es e q u e n c e sw e r es u b m i t t e dt o t h eg e n b a n k ( a c c e s s i o nn u m b e r sw e r ea y 8 1 7 1 4 7 ，a y 8 1 7 1 4 8a n da y 9 1 6 0 4 6 ) s t r a i ny 41e x p r e s s e dp r o t e i n sw i t ht o x i c i t yt oa e d e sa l b o p i c t u s ，t h el c 5 0w a s 1 0 8 4 3 3 1 - t gm l s t r a i nz 3 4 2 8 ，c o n t a i n i n gc r y l l b ba n dc r y 3 0 a ag e n e s ，a n dz 2 - 3 4 ， c o n t a i n i n ga n o v e lc r y 3 0g e n e ，h a dt o x i c i t yt o w a r d sa e d e sa l b o p i c t u sw i t ha nl c s o o f2 7 3 7 8 7 t a gm l “a n d7 2 317 肛gm l ，r e s p e c t i v e l y f o r t y - t w oi s o l a t e sd i dn o t r e a c tw i t ha n yp c r p r i m e r , n o rd i dt h e ye x h i b i tt o x i c i t yt o w a r d sp l u t e l l ax y l o s t e l l a ， c h i l os u p p e r s s a l 括，o s t r i n i af u r n a c a l i s ，l a p h y g m ae x i g u a ，h e l i o t h i s a 1 t n i g e r a m y t h i m n as e p a r a t e ，t r i b o l i u mc a s t a n e u m ，t e n e b r i o m o l i t o r k e y w o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，d i s t r i b u t i o n ，i s o l a t e ，i d e n t i f i c a t i o n p c r r f l p ，c r yg e n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑垦垒些盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：舅侈焉， 签字日期：洲年月 f 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些垒些盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑些壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：荔欢蜩 导师签名 学位论文作者签名：彩欢购 导师签名 签字r 期：如口睥占月垆日签字r 期： 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 檀建裁 劫西年f 月2 严日 电话： 邮编： 苏云金芽孢杆菌曲株的分离和c r y 基冈的鉴定 1 引言 1 1 苏云金芽孢杆菌的研究历史 1 9 0 1 年日本学者s 1 s h i w a t a 报道了从猝倒死亡的家蚕体内分离山种杆状细菌，即b t 猝倒弧种( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss u b s p s c o l t o ) ，从而揭开了人类对苏云金芽孢杆菌的研究史 川。 1 9 11 年b e r l i n e r 报道了从德国苏云金省染病的地中海粉螟中分离出一种杆菌并定名为 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 1 2j 。1 9 2 7 年m a r t s 雨次从地中海粉螟中分离出类似 的杆菌并沿刚了苏云金芽孢杆菌的名称。这就是现在的模式种苏云金弧种m a l t s 戏 “b e r l i n e r ”菌株( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss u b s p t h u r i n g i e n s i sm a r t s o rb c r l i n e r ) ”。 1 9 3 8 年，第一个苏云金芽孢杆菌商品制剂问世。埘丁舫治地中海粉螟。刘1 9 5 3 年 h a n n a y 第一次发现苏云金芽孢杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，井与f i t z j a m e s 一起证实 了伴孢晶体是一种蛋白质”。d u l m a g e ( 1 9 7 0 ) 筛选出对夜蛾科毒力较高的菌株h d 1 ， 并以此建立了标准晶的生物洲定程序，实现了苏云金芽孢杆曲制剂的标准化1 6 j 。 1 9 6 2 年，b a r j a c 等首先根据生理生化反戍和鞭毛抗原( h ) 血清反廊的不同把苏云 金芽孢杆菌划分为6 个弧群。1 9 6 7 年、1 9 6 8 年h e i m p e l 把形态特征、生化反应、h 型和酯 酶型结合在一起。提出了产伴孢晶体的细菌分类表【7 i 。 1 9 7 6 年z a k h a r y o n 最先提出：质粒可能对伴孢品体的编码起作h j ，接着d e b a b i o v 等 ( 1 9 7 7 ) i i r 实苏云金芽孢杆菌确实含有质粒伴孢晶体的形成和质粒有犬弭”。同时g o l d b e r g 和m a n g a l i t ( 1 9 7 7 ) 分离出对双翅目幼虫有特异活性的o n r 菌株( s u b s p i s r a e l e n s i s ) 。成 为苏云金芽孢杆菌开拓性研究的起点p j 。 随着基因工程技术的发展1 9 8 1 年s c h n e p f 和w h i t e l e y 克隆出苏云金芽孢杆菌的第一 个c r y 基因，并于1 9 8 5 年发表了它的核酸序列，标志着b t 研究跨入了分子生物学时代i i 。 1 9 9 5 年c r i c k m o f e 等提出了新的c r y 基风分类系统截d - 2 0 0 5 年1 月确定并公布的 杀虫基因已达3 2 5 种i l l j 。 2 0 0 4 年9 月1 1 日，美国能源挪的b r e t t i n 等在n c b i 上公布了b t9 7 2 7 的基冈组全序 列，标志着对b t 的研究进入了基冈组时代。 1 2 苏云金芽孢杆菌的生物学特性及分布 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 是芽孢杆菌属的一个种，革兰氏 染色呈阳性营养体为杆状，两端钝圆，大小为1 2 一i 8 p m x 3 0 5 o p m ，周生鞭毛或无鞭 毛。在芽孢形成的过程中，菌体内一端或两端产生一个或多个伴孢晶体( p a r a s p o r a l c r y s t a l ) ，孢子囊在后期破裂，释放出芽孢和伴孢晶体。芽孢人小为0 8 - - 4 ) 9 p m x 2 p m ，日圆 形，有光泽，有很强的抗逆性；伴胞晶体形状多样，有长菱形、短菱形、立方形、球形、 椭球形、无定形【1 2 “1 及三角形i “悚l 镶嵌形i ”，其主要成份是具有杀虫活性的蛋白质又 河北农业大学硕十学位论文 称杀虫晶体蛋向( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，i c p s ) 或6 一内毒素( g - e n d o t o x i n ) 。该杀虫 晶体蛋白由c r y 基冈或纠f 基闭编码，对鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、烈翅目( d i p t e r a ) 、鞘翅 目( c o l e o p t e r a ) 、膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 、同翅目( h o m o p t e r a ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) 、 食毛目( m a l l o p h a g a ) 等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀灭恬 性”“1 。苏云金芽孢杆菌在不同培养基上的菌落形态有所著异。在营养琼脂上节圆盘 状，乳白色，表面干燥，平坦，边缘不齄齐，略带放射状向外散开，当芽孢释放后，菌 落表面有光泽。枯稠。 苏云金芽孢杆菌广泛分布在十壤、虫尸、污水、淤泥、尘埃、叶面等介质中口”】。 十壤作为微生物定殖的人本营，是苏云金芽孢杆菌生存的最佳介质。a n w a r 等发现苏云 金芽孢杆菌的分布与十壤p h 值有关，其晟适p h 值为7 5 8 2 ，而p h 值小丁5 0 或人丁。8 5 的十壤中鲜有分布：沙壤所含营养物质较少，b t 分布有限：十壤含铜离子，可提高抗逆境 能力，有利rb t 的生艮，而含有铁、锌离子，不利丁b t 的分布1 2 s l ；腐质层厚的地区，b t 分离率高l e c k i e 等曾经报道在腐质层厚的十壤中腐殖质含城高，革兰氏刚性茵的数鼙多 1 2 ”。植被覆蔬率高的地区，b t 分布。，森林生态条件稳定，直射阡l 光少，昆虫种群丰富： 气候对b t 分布也有影响。热带、砸热带1 ：壤b t 分离率最高，温带次之，寒带及高山( 人 约3 5 0 0 m ) 地隧b t 数衬极少，其原冈为寒带址虫的种类数蜮较少p 。 1 3 苏云金芽孢杆菌的分离 目前，许多国家已对本国的b t 资源进行了调奄从十壤及其它介质中分离出大批有研 究价值的菌株如墨艇哥、美国、巴曲、哥伦比砸、埃及、印度、孟加拉国、及欧洲部分 国家1 3 1 、3 7 1 。根据苏云金芽孢杆菌的生理生化特性j “泛采_ j 的分离方法主要有： 温度筛选：苏云金芽孢杆菌的芽孢由外向内依次为芽孢外罐、芽孢农、皮层、芽孢内 壁，原生质膜和原生质体。其中皮层的主要成分是肽聚糖，不含营养细胞的多聚糖磷肇酸， 它保持着芽孢的脱水状态和耐热性，另一方面，芽孢形成过程中，会产生大量d p a c a 鳌 合物使得芽孢中的生物人分子形成耐热凝胶在8 0 下热处理2 0 分钟，苏云金芽孢杆 菌芽孢也不会死亡p ”， = 且休眠的芽孢在7 5 的砭致死温度卜i 处理1 5 分钟活化效果最 好，不但促其快速萌发还可提高芽孢的成活率| 7 i 。依据这一特性，可实施温度筛选1 3 9 4 0 。 温度筛选分离范同，“，不易漏筛，但1 ：作苗人，而且b t 要达到一定浓度方能筛出。 醋酸钠选择性筛选：苏云金芽孢杆菌芽孢的萌发，直接受p h 值影响。当p h 值为7 0 时芽孢萌发率达8 5 以上：当p h 低丁6 5 或高y - 8 5 时，芽孢萌发率极低。因此，加八 适量醋酸盐的培养基可选择性地抑制b t 芽孢的萌发。经热处理而不被杀死：而其它种类的 芽孢杆菌芽孢因不被抑制萌发经热处理而被杀死从而消除干扰菌咀达到高效分离筛选 的目的1 4 “4 ”。该方法筛选b t ，可有效抑制蜡状芽孢卡f 菌、地农芽孢杆菌的生长。使得类似 b t 菌落的干扰菌人为减少。 抗生素选择性筛选”j ：抗生素能钝化酶的活性，阻止微生物新陈代谢的某些环诮从 而对微生物产生选择性作川。芽孢杆菌中，由于芽孢农、皮层致密通透性羞，抗生素不 能进入芽孢内部而不能抑制其萌发、生长作_ i 。不同种、属的芽孢对抗生素有着不同的抗 2 苏云金芽孢杆菌苗株的分离和c r y 基冈的鉴定 性。苏云金芽孢杆菌同地农芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌抗性类似外，较 其他常见芽孢杆菌抗性显著。实验中，采州般抗平板( 如青霉素、硫酸庆人霉索筲。终浓 度可保持在4 0 0 2 0 0 n gm l o ) 4 4 i 筛选可增大抗菌谱，最大限度的淘汰干扰菌。抗生素筛选 检出率高。效果显著，但由于苏云金芽孢杆酱各弧种之间对抗生素的敏感性不同个别弧 种会困抗生素相对过高而不能形成芽孢和件孢晶体因此。抗生紊9 i f 选会造成个别弧种的 漏筛 将醋酸钠、抗生素分离法合二二为一，使得十壤悬液的可操作浓度较单一使用醋酸钠或 抗生素法耍高出2 0 3 0 倍i “，可人人提高b t 的分离效率。 1 4 苏云金芽孢杆菌和其c r y 基因的分类与鉴定 苏云金芽孢杆菌在伯杰氏细菌鉴定手册第9 版中门属为第_ 二类第十八群芽孢杆菌 属的一个种i “，种f 分不同的弧种，说明其分类地位的特殊性。苏云金芽孢杆茁t - 1 9 5 7 年被划分为独立种以来，其分类地何一直存在争论主要原冈住丁该菌与近缘种一蜡状芽 孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 在形态学及生理生化特征上没有斧别，区别仅在于苏云金芽孢杆 曲能产生伟孢晶体。随着苏云金芽孢杆菌新汹株的不断发现全 廿：界收藏的苏云金芽孢杆 菌已达4 0 0 0 0 株卜6 i ，箨种分类方法也被相继提出：将苏云金芽孢杆菌分为不同的弧种、变 种、血清弛、生物刑、致病猬和c r y 基闪型等”。鉴定方法土要包括生理生化试验、酯酶 法、晶体抗原法、鞭毛抗原法。以及染色体杂交等现代分子生物学方法1 4 ”。 1 4 1 苏云金芽孢杆菌血清型及其亚种 在苏云金芽孢杆菌的鉴定中，h 血清型是一项重要的鉴定指标，这项指标特异性强， 稳定可靠，被普遍接受和采用1 4 9 , ”1 。1 9 6 2 年，b a r j a c 对2 4 个产晶体的品系进行生理生化 和血清学研究，将b t 分为6 个血清型下的8 个弧种p 。i ：1 9 9 4 年为4 0 个血清型，5 4 个血 清型弧种近年来，从世界各地分离山人譬菌株，血清型弧种数鼙迅速增加，到1 9 9 9 年已 知人约有6 9 个血清型，8 2 个血清型娃种。到2 0 0 4 年7 月，b t 血清型达7 1 个，血清型弧 种已达到9 4 个i “。”。 血清型鉴定：苏云金芽孢杆菌的鞭毛主要由鞭毛蛋向组成，它具有抗原的特性。一株 菌的鞭毛往往有一个或多个抗原，称为鞭毛抗原或h 抗原h 为德语h a u c h ( 扩散) 的缩写1 7 1 5 7 , ”】。当用苏云金杆菌制备的鞭毛抗原免疫动物时动物体内可以产生抗体。通过抗原、 抗体凝集反应，可对菌株进行分类。 生理生化鉴定：苏云金芽孢杆菌各血清型弧种的生理生化特性存在着正与负、强与弱 的不同。弧种特征的划分根据一系列指标测定来进行，生化项目共1 4 项j 。不同亚种对以 上反应会产生不同的阴性或m 性特征，将各指标综合起来，就构成种特征的划分标准。 河北农业大学硕士学位论文 1 4 2 苏云金芽孢杆菌的c r y 基因分类及其鉴定 苏云金芽孢杆菌苗所释放的伴孢晶体( 编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白即6 - 内毒素的基 因称作c r y 基因) 类型同杀虫括性存在搬人的相关性。通过鉴定菌株的c r y 基冈类型可以 预测其杀虫活性，同时对于发现新基冈、新杀虫谱也具有重要意义；血清弛及其程种分类 指标不能反映出c r y 蛋白的类璎，菌株命名与杀虫活性之问也就，大去了联系的纽带基丁 形态和生化特征的鉴定分类方法不适台b t 菌株在杀虫防病方面的廊用。冈此针对c r y 基闻 类型豹分类方式逐渐被普遍接受，f ：得到，“泛应用。 1 9 8 1 年美国的s c h n e p f 和w h i t e l e y 克隆了苏云金芽孢杆菌的第一个c r y 基冈( 编码苏 云金芽孢杆菌蛋白晶体的基冈称作c r y 基因) ，f = 于1 9 8 5 年发表了它的核酸序列。1 9 8 9 年 该基冈被命名为c r yi a a ，标志着b t 的研究进入了分子时代i l 。1 9 8 9 年h o f t e 平w h i t e l e y 提出了c r y 基因分类方法胯”，根据杀虫谐和蛋白氨基酸序列的同源性将已发表的4 2 种晶体 蛋白分为5 群1 4 弧类。随着c r y 基冈序列的不断发现人们对这些基因序列的分类也经过 了一个发展认识过程，直到1 9 9 5 年c r i c k m o r e 等入在第2 8 祸国际无脊椎动物病理学会年 会( s i p ) 上提山了新的分类系统1 ”1 ( h t t p ：h w w w b i o l s s u s x a c u k h o n l e n e l lc r i c k m o r e b t ，t o x i n s 2 h t m l ) ，只根据氨基酸序列的同源性而非内毒素的生物活性来确定其不同的分类 笛级。由丁这一分类方法形成了一个趋向完善的、开放式分类系统冈此目前已得到公认。 根据c r i c k m o r e 等建立的新分类规则，6 内毒素基冈编码蛋白质氨基酸序列的同源性 低r4 5 定为第一分类等级，州5 口拉伯数字表示：同源性在4 5 一7 8 之间定为第二分类 等级，用人弓英文字母表示；同源性枉7 8 - - - 9 5 之间定为第二分类等级，翊小写英文字 母表示：同源性在9 5 以上定为第四分类等级，用阿拉伯数字表示妒，如图1 所示。同时 还提出了对新基因命名的要求： 1 ) 基因必须来自苏云金芽孢杆菌。 2 ) 编码的蛋白质具有杀虫活性。 3 ) 表达的毒素蛋白必须存在于伴胞晶体中。 4 ) 基因的核苷酸序列或蛋白质序列必须在一个主要的国际数据库( 如e m b l g e n b a n k 或p i r ) 中登记。 随着生物化学、遗传学、分子生物学等学科的发展，基丁基因型分类的分子生物学的 鉴定方法得到迅猛发展主要有： p c r - r f l p 鉴定：1 9 9 3 年日本学者浅野真一郎根据c r y l l 基因的保守区设计了寡聚核 苷酸引物，然_ i 亓用限制性内切酶消化扩增产物。根据酶切片断长度差异鉴定了c r y i i a 、 c r y l i b 基冈。1 9 9 6 年台湾学者k u o 和c h a k 创立了一种新的研究方法1 6 1 1 ：p c r r f l p ，即 根据各基因的保守区域，在5 和3 各设计一个适于一大类c r y 基冈( 如适于所有c r y l 或所 有c ，孵等级的基因扩增) 的通用引物，进行p c r 扩增产物用两种限制性内切酶( r e ) 消化，根据不同基冈d n a 碱基序列冈点突变、易付、倒位、缺失和转库等产生变化，使 得限制性内切酶( r e ) 的识别、切割位点发生变化，导致酶切片断的长度不同依照电泳 4 苏云金芽孢轩凶菌株的分离和c r y 基冈的鉴定 t h r e e d o m a i nc r yp r o t e i n s l。45 2 。 7 8 3 。 9 5 l r l l r 一 r r l 1 一 扛 广 一 r 1 l 豳1 - i苏云盎芽孢杆菌c r y 蛋白的同源性比较图 f i g i 一1h o m o l o g yo f 8 - e n d o t o x i n 分析所产生的这种芳异米判断不同凶株所禽的不同基冈的鉴定方法i o “。p c r r f l p 鉴定对 每一对d n a r e 组合来说，所产生的片断是特异的，能够作为某一d n a 的特有“指纹”， 并且克服了前人方法中存在的如：需要台成多对引物、鉴定范闱过窄、只能鉴定已知基冈 的缺点，用适丁多种基冈型的通_ l j 引物进行p c r 扩增。1 9 9 7 年中国农科院植物保护所永 福平等设计了c r y 2 ，c r y 3 ，c r y 4 1 0 的通川引物，可以鉴定剑第三等级的c r y 基冈，井进一 步将台湾学者鉴定的1 1 种c r y i 7 9 基因型扩大到2 9 种”。之后，本实验窒建立的鉴定系 统不断拓宽鉴定范用，目前可签定到包括c r y l 、c r y 2 c r y 3 、c r y 4 1 0 、c r y 5 ，c r y 6 ，c r y 7 、 河北农业人学硕十学位论文 c r y 8 、c r y 9 、c r y l l 、c r y l 3 1 4 、c r y l 6 1 7 、c r y l 8 ，c r y l 9 、c r y 2 1 c r y 2 2 、c r y 2 4 2 5 、c r y 2 6 2 8 、 c r y 2 7 2 9 、c r y 3 0 、c r y 3 2 、c r y 3 4 3 5 、c r y 4 0 ，c r y l l 基冈璎的第二等级基冈。己鉴定山的模式 基因有c r y l a h 、c r y l l e “】，c r y s e 、c r y s f 、c r y 8 g 在g e n b a n k 登陆的新基因超过3 0 种。 多重p c r 鉴定0 7 1 ：是在p c r 基础上建立的混合引物鉴定方法。其引物有通h j 引物 和高度同源的特异性引物之分，如以色列e i t a nb a n d o v 等【68 设计了一套c r y 9 型基冈的通 剧引物和四条与c r y 9 a ，c r y 9 b 、c r y 9 c 、c r y 9 d 基因高度同源的特异性引物，混合进行p c r 扩增鉴定成功鉴定出c r y 9 a 、c r y 9 b 、c r y 9 d ，并检测山一株推测府为c r y 9 e 的新菌株。这 种方法用丁鉴定已知基因是准确、特异的，但对丁i 新基冈鉴定还需借助其它研究方法，： 且特异性引物系统设计耗时，耗资金。 e x c l u s i v ep c r 鉴定：是指首先麻用每类基阗的通_ l f j 引物进行第一次p c r 扩增，再_ i j 每类中备基冈的特异性引物进行第二次扩增达到鉴定基冈的目的。此方法第一次p c r 鉴定 已知基因、第二次p c r 检测未知基口习。m a s s o n 等在1 9 9 8 年也麻州此方法在h d 1 3 3 基冈 组d n a 中检测出了人种c r y 基因，分别是c r y l a a ，c r y l a b c r y l c c r y l d ，c r y 2 c r y l l 删基冈1 6 9 】。 随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 鉴定“j ：随机扩增多态性d n ai r a p d ) 分析是 以人l i 台成的各种核苛酸序列为引物，在t a q 酶作用卜通过p c r 技术扩增d n a 片断后 根据所扩增出的d n a 多态性分析进行遗传作图或特种鉴定。b t 作为原核生物，其d n a 较 真核生物染色体简单。所以指纹图谱代表性不高：另外r a p d 鉴定要有标准茁株为对照， 仅以鉴定d n a 组上的差异。 杂交鉴定：核酸分子杂交技术在1 9 6 8 年有华盛顿矗内基学院的r o yb r i t t e n 等发明以 来，被广泛州于检测特定有机体之间是否存在亲缘关系并能准确检测出特定d n a 序列 是否存在。澳_ 人利弧学者b e a r d 等在用杂交方法鉴定c r y 新基冈时，设计并使j ：f j 了8 个基冈家族( 1 0 个不同c r y 基冈) 的通_ j 探针，他们将实验分为两步，第一步州通用探针 做d o tb l o t ，鉴定出未知b t 基因所在的基因家族，然后用特异性探针做s o u t h e r nb l o t ，确定 披检测出的基因的基因犁再对比两步试验的结果找出新弛基因。但应用此方法首先要 设计并合或人量d n a 探针。并且较p c r 鉴定耗时费力。新基因确定的类型仍然未知，需 要借助其它方法做进一步鉴定。基因芯片是2 0 世纪9 0 年代发展起来的建立在杂交基础上 的一项前沿生物技术4 - ”j 。刘旭光等建立了一种不经p c r 扩增而直接虑刚寡聚核茁酸芯 片从b t 总d n a 中检测c r y 基冈类型的方法，检测结果具有很高的可信度。应用寡聚核营 酸做探针，可人规模、高通量、真实的反映基冈组中存在的功能基因，鉴定方法是适应基 因组时代的强有力的技术2 一1 7 ”。 蛋白鉴定：对c r y 蛋白进行鉴定可最直接、最准确的获得b t 基冈型、杀虫活力等相关 信息并可确定被表达基冈。l u k e 等人研究蛋白时，川胰蛋向酶消化待测蛋白，h j 高效液 相色谱对蛋白进行分析在同标样相比较时，成功的分辨山c r y l c 、c r y l d 、c r y l a b 的存 在。但此法仅适于对已知基因所表达的蛋白的鉴定【6 ”。目前，对于c r y 蛋白测序而言，虽 然真实性非其它方法所比拟，但由丁二存在许多技术性问题，如纯化、费用昂贵、步骤繁琐 等，较基因操作，还不具备应用条件，但最具科学性虽有发展前景7 7 ，”l 。 6 苏云金芽孢杆菌菌株的分离和c r y 基冈的鉴定 1 5 苏云金芽孢杆菌的c r y 基因与伴孢晶体形态及杀虫活性的关系 伴孢晶体的形态冈c r y 基冈的不同而不同例如：c r y l 型基因编码菱形晶体：c 们型 基困编码立方形晶体：c r y 3 型基囡编码方形晶体；c r y 4 弛基冈编码无定形晶体i ”1 ；c n 哂型 基因编码球形晶体；c r y l l c r y 3 0 ，c r y 4 0 型基冈编码球形晶体。冈此，根据显微形态的观 察，可以推测菌株所禽基因类帮。 不同c r y 基因编码的蛋白具有不同的杀虫活性。通常c r y l ，f 哪，c r y 9 基冈编码蛋白对 鳞翅目害虫有杀灭活性1 3 0 ；c r y l b ，e r y l l ，c r y 3 ，c r y 7 , c r y 8 c r y l 8 基冈编码蛋白对鞘翅日害 虫具有毒力 8 ”j ：c y t l c y t 2 c r y 2 c r y 4 ，c r y l o c r y l l c r y l 6 ，c r y l 7 ，c r y l 9 ，c r y 2 4 c r y 2 5 c r y 2 l c r y 2 9 , c r y 3 0 c r y 3 2 c r y 3 9 , c r y 4 0 基闪对般翅目有活性4 “；c r y 5 ，c r y 6 c r y l 2 , c r y 3 , c r y l 4 c r y 2 1 基丙编码蛋白可杀灭线虫p “。( 表1 列出模式c r y 基冈的来源、编码c r y 蛋白分子鼙 和生物活性) 鉴定出菌株所禽基冈就可推测菌株的杀虫活性，对快速发拥有价值的野生 资源具有重要意义。 杀虫晶体蛋白对人和家皆无害，义不污染环境。在农业、林业害虫的防治上得到了“ 泛的府心。随着生物技术的发展新的c r y 基冈不断被分离克隆，人们研以用基冈f ：秽的 方法将分离的c r y 基冈进行遗传改良，构建不同的i ：科微生物缄培育抗虫的植物黼种等， 显示了苏云金芽孢杆菌c r y 基冈j 。泛的麻埘前景。 表卜1c r y 模式基冈及杀虫活性 t a b l e1 1t h ei d e n t i f i c a t i o nr e s u l t so fc r y - t y p eg e n e s 名称序号来源菌株分子量 生物活性 c r y l a a m 1 1 2 5 0 s u b s p k u r s t a k ih d - l - d i p e l l3 4 l e o c r y l a b m 1 3 8 9 8 s u b s pt h u r i n g i e n s i sb e r l i n e r1 7 i5 l3 l l e o c r y l a c m l1 0 6 8 s u b s pk u r s t a k ih d - 7 3 1 3 3l e o c r y l a dm 7 3 2 5 0p s 8 1 11 3 9 l e p c r y l a e m 6 5 2 5 2 s u b s pa l e s t i 1 3 4 l e p c r y a f u 8 2 0 0 3n t 0 4 2 3 p a r t l e p d i p c r y l a g a f 0 8 1 2 4 8n o n ea v a i l a b l e1 2 9_ n o n ea v a i l a b l e c r y l a ha f 2 8l8 6 6 u n p u b l i s h e du n p u b