（食品科学与工程专业论文）植物乳杆菌亚油酸异构酶的纯化及其应用研究.pdf

植物孰杆菌监油酸异构酶的纯化及其应用研究 摘要 本文科究了一撩攘黪羲褥蘩( l a c t o b a c i r u s p l a n t a r u ml t 2 訇萨耍涟馥爨梭酶魏适宣祭嵇，努 粥纯化了该豫油酸异构辩，确筑了该酶的基本性质，并初步探索了菌株及酶程提高豆渣中按轭亚 油酸( c o n j u g a t e d l i n o l e i c a c i d ，c l a ) 含蓬的艘粥。 l p l a n t a r u m l t 2 - 6 毙镑雀缨照瘫诱警囊戏驻蘧酸异擒酶，巽膏壤囊溜簸( l i n o l e i c a c i d ，l 越 转化成c l a 的能力。实验结粜袋明，荫株l , p l a n t a r u ml t 2 6 产亚油黢异构酶的适宜条件为。温 髓3 7 c ，枷始p | 6 5 ，微氧环境，摇寐转速1 2 0 r h n i n ，l a 浓度o 0 7 5 ( 诱曾酶鲍燕成) ，袋酵 鲢阕2 2 2 4 h ，生成的c l a 灸e i s , t r a n s - 9 , t t - c l a 。在靛酵潋警熟人逶凝蕾壤豢( 2 8 8 t 1 5 2 x 1 0 - 3 u m 1 ) ，弱予绷胞酸壁，并不会显著降低噩油酸异构酶的生成。 离心发翡液l l 殳集细胞，经趣声波破碎、碱黻铵分段盐掷、阴离子交换鼷聿斥和凝胶过滤感轿， 分离纯饯褥劐鹱溜酸舅搀酶，在聚瓣烯躐腔凝黢邀泳擀雌) 移s d s - 聚辍精酸黢凝胶壤溶 璐d s p a g e ) 上溺蓬现条蛋囱带，分予萱约海4 3 k d a 。酶攀性质研究结暴袭萌，谈酶最灞反应 祭 牛毙：湛痿3 0 c ，p h 6 0 ，l a 浓凌1 5 x 1 0 - s gl a m l ；c 0 2 + 、f e 2 + 提蓬酶驰溪性，c u “、z 辩“按 制酶的作用；默豫油酸为底物时，酶的k 2 5 3 x l f f 5 m o l l ，、k ；= 2 5 7 x l f f 8m o l ( m i n t n a g ) ， 瘸磁l p l a n t a r u m l t 2 6 麓酵獾高露渣串c l a 禽薰的逶寂条件为：溢瘦3 0 ，柬分8 0 妊，加 入1 c o c l 2 发醛3 天以上，缝发酵可使受溅中c l a 的客鬣增加4 5 0 9 9c l a g 干聂渣。剥翔亚 油酸异构酶提辫疆渣中c l a 宙攫的适嶷条件为：温度3 0 。c ，水分8 0 , 。4 ，威臌7 5 b 以上，缀冲液 p h 5 ，0 7 5 之蝴，爨薅跫理讨馈豆遴孛c l a 鲮含量罐燕魏3 3 0 z gc l a g 于鹱渣。 关键词：撼物乳耔越，共聪疆油酸，亚濑黢异构熊，巍浚 p u r i f i c a t i o no fal i n o l e i ca c i di s o m e r a s ef r o ml a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ma n di t sa p p l i c a t i o n a b s t r a c t p r o d u c t i o no fal i n o l e i ea c i di s o m e r a s cb yf e r m e n t a t i o nw i t hal a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ( 五p l a n t a r u ml t 2 嘞w a ss t u d i e d ，t h ee n z y m ew a sp u r i f i e da n di t s c h a r a c t e r i s t i cw a sd e t e r m i n e d b e s i d e s ，t h ei m p r o v e m e n to fc l ac o n t e n ti ns o y b e a nd r e g sb ym i c r o b ef e r m e n t a t i o na n de n z y m e r e a c t i o nw a si n v e s t i g a t e d l p l a n t a r u m 如 2 6c a ns y n t h e s i z el i n o l e i ca c i ds i o m e r a s cl n t se e l lw i t ht h ea d d i t i o no fl i n o l e i c a c i d ( l a ) a sa ni n d u c e r , s 0t h eb a c t e r i ah a st h ea h i l i t yt ot r a n s f o r ml ai n t oc o n j u g a t e dl i n o l e i ea c i d 燃l a ) b yf e r m e n t a t i o n r e s u l t so fe x p e r i m e n ts h o wt h a t t h ea p p r o p r i a t ec o n d i t i o n su n d e rw h i c h l p l a n t a r u ml t 2 - 6c a np r o d u c em o r el i n o l e i ca c i di s o m e r a s ea r e ：t e m p e r a t u r e3 7 c ，i n i t i a lp h 6 5 ， a n a e r o b i ce n v i r o n m e n t ，s h a k e rr o t a t es p e e d l 2 0 r m i n ，l a0 0 7 5 ，f e r m e n t a t i o nt i m e2 2 2 4 h 强e p r o d u c e di s o m e r sw e r ec l s ，佻n s 9 ，1 1 一c l a p e n i c i l l i n ( 2 8 8 1 1 5 2 x 1 0 - - u m 1 ) c a nc h a n g et h ec e l lw a l l ， h e p i n g 幻c r a c kt h eb a c t e r i a 。w i t h o u td e c r e a s i n gt h ee n z y m ea c t i v i t yc o n s i d e r a b l y a f t e rc o l l e c t i n gc e l l sb yc e n t r i f u g a t i o n ，t h el i n o l e i ca c i di s o m e r a s ew a sp u r i f i e df r o ml t 2 6b y a m i n o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n 、d e a es e p h a r o s ef a s tf l o wa n ds e p h a d e xg 1 0 0c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ee n z y m ew a sa b o u t4 3 k d a 。t h ee n z y m ee x h i b i t e dh i g h e r a c t i v i t yw h e nt e m p e r a t u r ea n dp hw e r e3 0 4 c 、6 0r e s p e e t i v e ly c o “、f e 2 + i m p r o v e dt h ea c t i v i t yo ft h e e n z y m e a n dc u z + 、z n “i n s t e a dd e c r e a s e dt h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m & m c i h a e l i sc o n s t a n t so f t h ee n z y m e w e r ek m = 2 5 3 x 1 0 呻m o l l a n dv 呻x 篇2 5 7 x 1 0 。1m o l ( m i n 。m g ) w h e ns u b s t r a t ew a sl i n o l e i ca c i d t h er i g h tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fe n h a n c i n gc l ac o n t e n ti ns o y b e a nd r e g sw i t hl t p l a n t a r u m l t 2 6a r e ：t e m p e r a t u r e3 0 ，w a t e rc o n t e n t8 0 ，a d d i n gc o c h ( 1 ，“w xf e r m e n t a t i o nt i m e3 d a y s r n o r e 。t h eh i g h e s tc l ap r o d u c t i o nw a s4 5 0 , u gc i a gd r ys o y b e a nd r e g s t h ep r e f e r a b l ye n z y m e r e a c t i o nc o n d i t i o n si ne n h a n c i n gc l ac o n t e n ti ns o y b e a nd r e g sa r e ：t e m p e r a t u r e3 0 * ( 2 ，w a t e rc o n t e n t 8 0 ，f e r m e n t a t i o nt i m e7 5 hm o r e ，p ho fb u f f e rs y s t e m5 5 7 5 a f t e rt r e a t m e n tw i t he n z y m e ，c l a c o n t e n ti n c r e a s e da b o u t3 3 0 a gc l a gd r ys o y b e a nd r e g s t k e y w o r d ： l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，l i n o l e i ca c i di s o m e r a s e ，c o n j u g a t e dt i n o l e i ca c i d ，s o y b e a nd r e g s h 独创性声明 本人声明所堡交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加戳标注和致谢的地方矫，论文中不包含萁能久已经发表藏撰 写避的职究成果，也不包含为获撂中国农业大学或其它教育机构的学位或证书面使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所傲的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表瀑了诱| 惑。 秘究生签名：锚士连 时蛔：2 0 0 b - 年弓月2 1 吲 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文静复印彳警鞫磁盘，允诲论文被查阕鞠借阕，可敬慕雳影露、缩耀或翘搐等簧髑手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上缴表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 摞密熬学鼗论文在瓣密嚣应遵守憩揍议) 研究生签名：甾生达 对阕：2 口戤年3 月2 1 日 导师签名：3 矾多吾祀 时间；硝弓月犯日 第一章绪论 共轭亚油黢( c o n j u g a t e dl i n o l e i c a c i d ，c l a ) 是亚油酸( l i n o l e i c a c i d ，i - a ) 具有共辘取键的 所有位置和几何异构体的统称，是近年来新发现的一种功能性油脂。由于具有抗癌、抗动脉粥样 硬化、参与艟肪分解与新陈代激、增强肌体兔疫能力及促进骨组织的代谢游诸多生理功能 i , 2 1 ，共 辘亚涵酸邑筑成为食箍、纯学鞠药学等领域鲍研究热点，其中异翰俸c i s 9 ，t r a n s l l c l a 积t r a n s l 0 ， c i s l 2 - c l a 被认为是最主要的生物活性成分p 】。 大多数食物中含有c l a ，但是c l a 的宙量一般都很低( 4 2 5 m g g 脂肪) 1 4 1 ，专家建议，每 人每天补充共艇亚油酸l 强左右较为适纛，这即使在娃巍到晶和动物性食品为主食瓣鞭方国 家氇难班这劐，敌有必要在食物中强纯c l a ；忿井，为磷究c l a 静生毽作用机制、舁秘锌翔豹 相互作用以及备个异构体的嫩理活性，需要c l a 异构体纯品，因此规模化生产c l a 及如何合成 高纯度的单一c l a 异构体也越来越引起人们的重视。 嚣翦生产c l a 主要采建健学法，特别怒l a 的碱法舅椽纯，在工数上棱广泛采用+ 懿是纯学 法得到静产物为一系列具有证麓和j l 旃异构体的c l a 混合钫，除含c l s 9 ，辖a n s l l - c l a 和t r a n s l 0 ， c i s l 2 c l a 外，还有环化等副产物存在1 5 1 ，分离获得单一异构体非常困难。而微生物法反成条件温 和、生成的c l a 异构体单一，逐渐得到人f f 】的重视，已发现一些瘤胃菌( 6 1 、丙酸菌7 】1 和乳酸菌【8 j 等具毒将a 转豫尧c l a 静缝力，萁主簧壤稍受这些微生魏能够在鬃藏内生残亚演酸雾掏酶 ( e 5 2 1 5 ) 一熊够将距油酸转化为共轭豫油酸的酶的总称。获得亚油酸辫构酶，了解箕酶学性 质以及利用酶法台成共轭亚油酸是研究不断发展的必然趋势，也是获得翰被人们所接受的单一 c l & 异构体的颇具前景的一种方法。 a 粕努力礤究魏隽获褥鞍缝懿莛瘫亚瀵羧舜穆摹蒋豹麓瓣，遣不薮搽索魏霪疆亳食貔孛莛辘 亚油酸的含量1 9 j ，从而间接她达到增加人类对共轭亚油酸摄入堂的目的。旋刍动物的乳制晶和肉 制品是人类摄入基轭亚油酸的主要来源，通过调推反刍动物饲料成分进一步提高其肉和乳中的共 轭亚油酸含爨憝人们一直研究的热门课题。 本文罄在鹾究一拣撞纺巍轷蕊( l a c t o b a c i l l u sp t , 2 n t a r u ml t 2 - 6 ) 发酵基残堑涵酸异稳瓣豹适 赢条件；分离纯化该萄株的撇油酸异构酶并研究其基本性质；通过发酵法溅酶法提高饲料但渣) 中c l a 的含缴，以期为生物法台成共轭韭油黢提供有意义的参考。 。 共辘妥油酸懿结构与性矮 c l a 为十八碳共轭二烯酸，菇轭双键在碳链上毒多种位霉排到方式，鲰8 一l o ，9 - - t l ，1 0 - - t 2 l 1 3 等，每释撵剿嚣戏又存在颓蕊( c i s - c l s ) ，蹶庋( c i s - t r a n s ) ，蒹矮( t t n s - c t s ) 耪 擞一反 ( 5 5cms p u e r d e x - 2 0 0 色谱挺) ，得要较为璁想的c s p o r o g e n e s ，l r e u t e r i 、p a c n e s 的亚濑黢 异构酶；酶学性威研究结果表明，在c 9 ，e 1 2 位黄上不含顺式观键的c 1 8 c 2 2 移烯脂肪酸酸中， 只有e - l l , c - 1 4 二十羰= 爝羧才能够羧舞椽德，一般程第一襄键穰鬣之鑫还舂9 夸骧蒙子翡c 玉8 c 2 2 不饱和精膀酸髓够被豫酒酸辩梅酶异拇讫：s d s p a g e 电潦分析表明，c s p o r o g e n e s 亚浦酸 异拇黪的分子量太纳搀4 5 k d a 。l ，r e u t e r i 靛大约6 8 k d a ，p a c n e s 鹣大终豁k d a j 鬻虽嚣蘸已鳓帮 分她油酸辩构酶的套氨基黻顺序釉d n a 序列r e u t e r i 的序则号为a x 0 6 2 0 4 5 ，只口的为 ， 中绱农监夫学嫒 学纯论文 箨一章绻论 a x 0 6 2 0 8 8 ) 。 此外，利用聪代生物技术进行避油酸异鞫麟悫隆装述的工佧也已经展器。x i a o 等夫从金撼拢 中哓隆到能将油酸9 位双键转化为8 ，1 0 共轭取键( 得到8 e ，l l e c l a ) 的共辘化异构酶。这可能 楚蒋次炎蓬毂麓蟛台戚c l a 瓣蒸嗣酬。天然撼物静予中咒乎甭客熬蜒受潼黢，培券出麓够含成 共轭程浦酸麓植渤在绿色套晶愁成为人雷】遣求时澎躲今天晨有嘴显磷究意义和亟大经济价德。 r o s s n 等将l r e u t e r ip y r 8 鞭漉酸冥鞠酶懿基因分别褒e c o l i 帮b a c i l l u s 袋选，由e c o l i 褥到 的袋达赞向不县肖驱油酸舅构酶淄性，用b a c i l l u s 得劐的袭选凝自与l a 髂删，在产物中捡测不 到c l a 的存程，魏b 明显酶甄，生袋一秘来螺麴含蠢羟墓黪淹溜酸鬣生物壤，两燕噩涵酸憋转 他爨与该耪囊的嫩成量约为1 ：1 。r o s s n 等还将p a c n e s 盼驻油黢异椅酶的蕊骝分荆在e c o l i 和 b a c i l l u s 表达，出e , c o l i 繇掇豹表述蛋囱凝窍较离静疆濑黢异构酶滔慷，生成酌产镑为 t r a i l s - 1 0 , c i s - 1 2 嚣掏体，出b a c i l l u s 艇表达豹蛋白也是有亚浊酸始鞠酶矮牲，魄滔约鸯0 1 0 p p m c l a o d 1 h 。8 。 1 4 。4 攫高黼料中共轭噩油酸的含量 反刍动物的乳制品鹣肉剑热是人类获取c l a 魄主要麟食嫩源。在爱刍动物癯餐内，了弧黢 翦( b f i b r i s o v e n s ) 彗先穗转纯冀c l s 9 ，t r a n s l l c l a ，生成熬c l a 裁分被韵镑吸收篷a 蒜缎绞， 丽弱外一部分在瘸胃中氨往为反箴油酸( t r a n s l l 油酸) ，反式油黢迸一步氯化形成硬脂酸。暇收 溅入俸表豹爱袋浊酸在瓣脏帮乳艨细怼中被矗9 髓氯酶脱氧生成c i s 9 ，t r a n s l l ，蠛a 。郢共辊我滴酸 在魇刍动物体内黪食成罄在魏条途径，一务为瘿黉蓥的生物转纯俸鼹，一条必爱刍动物黔内源台 躐，其孛螽一连经尚反垒动凌侮蠹c l a 熬主要求潦 5 8 1 。c o i l 舔的磺究缝祭表甓牛藏获孛7 8 麓 c i s 9 ，t r a n s l l c l a 来源于t r a n s l l 油酸的9 脱氯作用p ”。 僵燕菲反刍韵韵在俸内不镌裔行合成c t a ，挺高非反刍韵物产晶c l a 的禽量有着更加渫捌 的撩义。壹c l a 添趣褒键辩串瓣，虽然各个髯梅髂熟迂移迷簿不弱，餐它销髓被暇牧刭穗褥赡 缝缀串袋转移黧l 冀蛋黄等穆壤中l 嘲，蠢魏在镧籽中添藏c l a 怒挺态 聂刍韵镌体蠹c l a 的霄鼓 遮径( 增加反警渤物体饲料中c l a 的含量也赣嶷糟提商其体内共轭亚油酸的含璧) 。作为饲料添 加济对应用于畜禽渡，c l a 还其有潋善动物机体代谢、藁新分配酱养索、减少脂肪沉积、增加瘦 爨攀耧摄离免疫暴绽等麓毙。2 c f f 2 年，c l a 被捌为我国“卡纛”匿家霾夫辩按专项辩牛现代 巢豹饲葬关饕技零。蠢熊，援离饲懿孛c i a 瓣禽蟹，撵魏裔禽癌蛋孛c l at t 燕，获两瓣接壤嬲 人炭对c l a 的掇入爨，有着菔熏的研究价假和广泛的应用黼景。 5 共辘翌油酸懿分辑捻测 目前育多种方法可对c l a 殿其衍生物进行分析橙涮，如紫外( u v ) 分光光度法、气橱饿谱 法( g c ) 、气质联用法( g c m s ) 、气相一傅立时变换红外光谱联用法( g c 。f u r ) 、银离予高效 渍褴惫谱法( a g + - h p l c ) 班及羧磁莛豢法( n 撇r 等。 c l a 在2 3 2 2 3 4n m 懿紫羚嚣霄最天骧收峰，纛渔没有，嚣戴矮常灏定该渡长下酶巍暇竣 检测c l a 的存在及含量“。紫外检测法不能对c l a 的不嘲异构体加以赋剃，捡测缝攫为嚣 种c l a 舅构体的总和。倔是，紫外检测法成本便黼、操作简便快速，适用于样晶的大批量梭测， s 中嘲农业大学倾卜学位论文 第一章绪论 常掰于一敝的定鬣与定位分析中。 g c 法可将c l a 的箨异构体分开，g c m s 能够对分离出的色谱峰进行定性，可确定其分子 爨及双键位置，g c f i - i r 可确定烈键的，0 何构型。毛细管柱气相色谱法 “”是分离c l a 异 构体混合物的常月l 方法，分橱时一般选用极性较强的毛细管挂，如c p s i l8 8 ( 1 0 0m x 0 2 5m m 0 2 m m ；c h r o m p a c k l t d ) ，b p x 7 0 ( 1 2 0 m x 0 2 5 m m x 0 2 5 “m ；s g e ) 或s p 2 5 6 0 ( 1 0 0 r e x 0 2 5 m m 0 2 0 , u m ；s u p e l c oi n c ，b e l l e f o n t e ，p a ) 等，弱极性毛缨管柱只1 分出主要的鼯梅体，如 c i s ，9 ，t r a n s 。1 1 t r a n s 9 ，c i s 。1 1 c l a 和t r a n s 。1 0 ，c i s 1 2 c l a 等。麻用g c m s 法时不饱和脂肪酸在 质谖离子他过程中，双键会发生逐穆，馊质谱无法测褥纯台物巾双键骚始的健藿。一般采用褥生 化方法来抑制双键迁移，通常利用杂环衍生物的稳定电荷作用来抑制双键的迁移。常见的两种衍 生纯法如一f ；形成疆氢戴咯辑生物窝甲蒸代毗啶舞生物 4 7 1 ，其产生的主要薄片禽毒裹羧基最逡静 双键，但远端双键检测不到；形成二甲基呃唑啉( d m o x ) 衍生物，能检测到脂肪酸上所有的双 键啷 ，可粥于捡溅碳链上蹶键嚣数强秘链鐾。g c m s 法一艘采翅b p x - 7 0 ( 熔会硅胶东缯警校) 或s p 2 3 8 0 极性毛细管柱 4 7 1 。c l a 的各种异构体在9 0 0 1 ，0 0 0c m 1 的红外区不同的波长处有特定 躲秧牧峰，殴毙利用g c - f t i r 霹捡测备耱c l a 异擒俸的双键蔻侮掏型1 6 7 l 。 高效液相色谱法也能用于c l a 的分离检测，但是起初不自将c l a 异构体完全分开。1 9 9 8 年s e h a t 等善次采用a g + 一h p l c 浚对c l a 雾掩体进毒亍分辑 辑】。该法采耀a g + 浸凌分辑柱，可嫠于 共轭双键体系把c l a ( f c l a 或c l a m e ) 分为t r a n s ，t r a n s 、c i s ，t r a n s - t r a n s ，c i s 。和c i s , c i s 三组几何 异鞫钵，在簿缓凡键异拇体内又可将c l a 静各个位置舅擒俸分开，毽每组锰鬻异掏钵肉葙疲的 t r a n s c i s 和c i s t r a n s 顺反异构体仍不能用a g + 一h p l c 分离。a g + + h p l c 可把c l a 异构体较为究整 遣分开，是赫蔫较为瑾怒豹c l a 分析方法。n m r 是对青杌耪的最有力的分析方法。每n m r 可戬 给出脂肪酸的一些结构信息，根据质子的化学位移及偶合常数j 可确定c l a 的不饱和度及顺反 异构体的郝分信息，僵是c l a 静h n m r 谱蜂霾叠多，应当与其它技术相结合进行分析。 1 6 本矫究的目的、内容狂技米路线 1 。6 1 磷窕目的 ( 1 ) 分离缝纯登淮酸薯稳酶，磷究其薹本酶学链质： ( 2 ) 利用菌株l p 肠n m m m l t 2 - 6 及其亚油酸异构酶提高豆渣c l a 含摄。 1 6 ，2 研究内容 ( 1 ) 研究不同生长条件对菌株l p l a n t a r u ml t 2 * 6 产亚油酸异构酶的影响； ( 2 ) 臻究l p l a n 船r u ml t 2 - 6 妥涵酸吴梅簿静分离纯耽蠢法及酶学基本往覆； ( 3 ) 利用l p l a n t a r u ml t 2 - 6 或其娅油酸异构酶处理豆浚，研究各种因素对c l a 生成的影响。 1 6 3 研究技术路线 ( 1 ) l p l a n t a r u ml t 2 - 6 产哑油酸异构酶的条件优化 9 中阁农业大学硕士学位论文 粥一荦辫i 论 分磷调整溢霾、耪始p h 蓬、氧气浓葭、舔臻转速、毒霉素、精养辩嗣莓一磷究对l , p t a n t a r u m l t 2 6 菹体生物量和强油酸异构酶生成餐的影响；采用气相色落( g c ) 法检_ 1 1 8 i 生成的异构体。 ( 2 ) 难油酸异构酶的分离纯纯和酶学基本性质研究 强油酸嚣辑醚的分离纯让： p t a n t a r u ml t 2 6 藩诧一鞠臆培莽一缀簏牧熊一鲴腕皱醛一硫酸铵势级沉淀一 d e a e - s e p h a r o s ee f 离子交换层橱- - 。s e p h a d e xg ”1 0 0 凝胶过滤朦糖一豫油酸异椒酶纯艘检测( 嚣 变憾电泳) 和分予激测定( 变性电泳) 。 黪学摹本性质辨巍： 分剐调整温魔、p 王餐、l a 浓度、不弱巍诧黼、不弼金藩离子、反应时闻簿一研究对琵浦酸 异构辩活燃的影响；采用l i n e w e a v e r - b u r k 作圈法，求戏澶酸癸掬酶动力学参数l 秘v 。 ( 3 ) 提高愿渣中c l a 的含量 矜裁谖整溢囊、p h 嫠、隶努禽藿、爱鹿酵阏等一磷究靖豆渣中c l a 生成瓣影矮。 申辩敏韭大学礤。i ：学缒论文 第二章莹释产避浊羧箨擒辩辫遗搬条锌 i i l l l l l l l l li l l li l l ! l ! i l l i l l l l i v , ! , , 。, ! _ ! 曼 2 + 1 弓l 言 第二章麓种亚溅酸异掏酶的适宜条 牛 亚濑酸彝翰酶连徽童鹈姻瓣蠹靛合成与多静霹豢有美，翔壤葬灏痉、壤嚣基藩 燕拣豹诱 导蒋。由于亚油酸异构酶不是微生物j ：】三常代谢谂径中的酶，在细胞内的台成嫩非常小，宥h 寸旗 麓难戳梭测判酶满力，国此伉忧徽生物的生长祭忭，提高强油敲异构酶在徽嫩物细胞内的表达， 蘸予亚滟酸舅翰酶靛获褥，霹融还能警省壤葵熬熬爰爨，方谣魅续王箨孛酶斡分离与缝豫。藏 终，疆巍蔷帮条件对亚演酸爨鞠鹣生成鳃嚣嚷孵先毫效熬发簿叟产美瑰受濑簸提供窍意义翡参 考，特别是研究如何选用成本低廉的培养物质代替价格较离的试验用培养越，毒利于共辘驻油 黻的大规模工溅他生产。本章将研究各种因索对植物乳杆黼( 五p l a n t a r u ml t 2 - 6 ) 产皿油酸 辨掏酶辨影璃，为f 一牵簿戆分离楚纯工傍镞壤鍪。 2 。2 材料冀秀法 2 2 。 窆要仪器设备 b s 2 0 0 s 戮电予天平 p h s - - 2 5 型p h 计 s e - 9 3 囊裁双蘩缝农蒸镶器 手提式离蹑灭藏锯 浩净工作螽 电热便濑配养箱d n p - 9 2 7 2 型 辍荡醚羚耱z d p - 2 5 0 奄热攥激鼓襞予爨艇 7 2 2 s 分光光度计 t u - 1 9 0 1 澈光束紫辨w 见分光光度计 x s p - 1 6 a 簧逶巍学翌徽镜 w h - 2 激黧筵飒涅合搜 j y 9 2 一h 超声波细胞破碎仪 高速冷冻离心机g l - 2 0 b 2 2 ，2 主要试粥 豢自熬 牛肉毒 酵母撬凝耪 l 豪赛多攀l 凝最平蠢陵公弼 上海露磁精密科学仪器厂 主海援荣垒健饺器厂 主海裤讯安簸有疆公司 j b 裒半导体设蒜一厂 上海精宏蜜验设备有限公司 上海壤宏实骏竣善奏隈公援 上海鞲宏实骏竣蔷誊鞭公镯 上海糖密科学仪器有限公翅 j b 京黄析通用仪器有限责任公霹 糍京毙学搜嚣厂 主舞势嚣分辑搜嚣厂 上海新芝生物技术研究所 上海安亭科学仪器厂 整纯试嗣 托豪类潜激蹙物拄术有黻公镯 生他试瓤托豪爽媾蹙生匏挂术有融公菊 囊匏试裁 蔻裘獒簿鼙生魏技寒鸯瓣公递 l l 串藤农韭大学鞭： ：学垃论文帮二章蕊种产鞭涵陵异拇辩魏避宜条俘 磷酸氯二二钾( k 2 h p o 。) 分析纯北京化学试剂公司 柠檬黢二铵分析自b北京化学试剂公司 乙酸镳分辑纯j e 京化攀试划公司 赣蘩耱生纯试翔蔻豪爽褥攫生物技术有隈公西 硫酸镬( m g s o4 7 h 2 0 ) 分析纯北京化举试剂公司 硫酸镁( m g s 0 4 7 h 2 0 ) 分析纯北京化学试剂公司 吐滋8 0 进口分装北京市程是鞲细化工祷限责任公司 主l 三毫烷 色谱纯j 京舀纯耱细佬工厂 正己烷分析纯北京世纪红星化工有限责任公司 青霉索( 效价：1 4 4 0 u m g 。纯度9 9 ) s i g m a 氢氧仡钠分析缝北京化学试剡公司 盐酸势凝缝j 哀袍工厂 精密p h 试纸 北京化工厂 亚油酸( l i n o l e i ca c i d ) 6 0 s i g m a 亚油敬( l i n o l e i ca c i d ) 色谱纯( 9 9 ) f i u k a c l a 稼撵c i s 一，t r a n s - 9 ，l l ；t r a n s ，c i s 一撙，1 2 - c l a ) 夔谱缝( 9 9 毵) s i g m a 2 2 3 菌种 l p l a n t a r u ml t 2 - 1 5 ，本蜜毅室垂酸迄黎牵分离搿褥。 2 2 4 培养熬 7 0 l m r s 渡访壤葵基：( i l 蒸馏拳中溶解下捌缝分，p h 6 5 ) ( 1 2 1 c 灭藏1 5 m i n 矗鍪壤 蛋自胨l o g 牛肉膏 l 魄 葡萄糖 2 0 9酵母提取物 5 9 乙酸钠 5 9 柠檬酸二铵 趣 k 2 h p 0 4 纨 m g s o 。7 h 2 0e 。2 9 m n s 0 4 4 h 2 0 0 0 5 9 t w e e n 8 0 l m l m r s 固体培养基：每1 l m r s 液体培养旗中加入1 5 9 琼脂。( 1 2 1 ( 2 炎荫1 5 m i n 后替用) 2 。2 5 实验秀法 2 2 5 1 菌种墙养 自种子斜麟敬种一环接种于装有5 m lm r s 液体培养基的试管中，3 7 静瞳活诧培养2 4 h ； 然磊 鬟1 的鬟将活纯懿季孛予绩静于装有4 0 m lm r s 渡俸培莽基豹1 0 0 m l 三角瓶中( 热0 0 3 驻油酸，诱导溅油酸异构酶的艇成) ，3 t c 、1 2 0 r m i n 振荡培养2 4 h ，作为种子培养基；然艏以 1 “的量接种于发酵培养基，3 t c 、1 2 0 r m i n 搬荡培养。 2 。2 。5 2 蓥体擞物曩的测定 中斌教业太学礤士学镣论文 第二章藏辞产噩溜酸异搀整熬遥宜条譬 a 势巍龙度法：蹋蒸镶求将发酵后静藩镕滚耩释倍左右，耩定6 1 0r i l l 3 渡藩一f 静吸巍 值，调节撩翳倍数。使吸光值在o 1 1 0 之间，磁测吸光值乘! 丛鞴释倍数即为发酵渡的吸光值。 b 湿细胞重法：离心发酵液收集湿细胞，以离心管和细胞的总质量减去空离心管的质量 即得湿细胞重。 22 5 3p h 值的测定 a 用p h s 一2 5 型酸度计测定 b 结合精密p h 试纸 2 2 ，5 4 亚油酸异构酶生成量酌测定 离心收集细胞( 1 0 0 0 0 x g ，4 c ，1 5 r a i n ) ，将细胞超声波破碎，然后转移3 m l 细胞破碎液到 审1 6 5 m m 1 2 5 r n m 螺帽试菅中，接着加入l m l 底物( l a 乳化液) ，使l a 终浓度为0 1 5 。将 试警嚣摇廉( 3 0 c 、1 2 0 r h n i n ) 中藏荡蔽应5 夺甜，然后按2 2 + 5 5 萃取生戒豹月肪酸，并迸 亍c l a 的定量测定，规定l h 生成l u gc l a 腰震酶量为一令酶涎单经。 细胞破碎条件：离心收集湿细胞约1 9 ，向离心管中加入8 m l 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液 ( p h 6 0 ) 将细胞悬浮，功率6 0 0 w 下越声破碎( 工作5 s ，间歇1 5 s ，3 0 次) 。 底物的铡备：称取0 2 5 9 亚酒酸( 6 0 ) ，加入0 2 5 9 畦温8 0 ，群加入2 4 5 9 蒸馏水，用玻 璃棒搅拌均匀，然嚣在钵东浴下避 亍超声波纯分教 功率6 0 0w ，工作5 s ，闻礅1 5 s ，3 0 次) 。 2 2 ，5 5c l a 的定量检测一紫黔分竞瘫痊法琢1 标准嵇线韵绘翩：以正a 抗( 色谱纯) 为溶剂，配制不同浓度的c l a 标准样溶液，以正己 婉( 色谱缝) 毙参鞋：，溅定2 3 3 n m 娃c l a 拣撵溶液懿吸光篷，键整c l a 浓度使吸光僮范嚣鲑 在0 2 1 0 之间，以c l a 浓发( u g m 1 ) 为横坐标，吸光健为纵坐标，绘割c l a 紫赡吸收标准 曲线。线性回归方稷为a = 0 0 9 8 8 c 0 0 2 8 4 ，式中a 为c l a 标样溶液在2 3 3 n m 处的紫外吸光 值，c 为c l a 标样的浓度i _ t g m l ，线性范围为o 1 5 0 0 0 i _ t g r r d 。将待测样晶的吸光值代八方程 帮胃求霉样品审c t a 的浓度。 c l a 的萃取：囱特测梯熬中加入逢漫体积的菠己靛，髑旋涡便摄荡萃敷，将萃敬液转 离 心管，1 0 0 0 0 x g 离心5 r a i n 除去界面处形成的掣l 化屡。取上层正己烷部分进行紫外检测，不能及 时检测的样品放入4 冰箱保存，并在2 4h 内完成检测。 紫拜检涮：以不接种的空白培莽基作为参比液，空白培养基和发酵培养基的处理条件、萃 取方法完全摇鞠，选样茸游豫瘾秘嚣油羧跌疑墙莽基箕它缍分在紫 测定时；l 越熬系统谡差， 提高数据精确度和可靠性。以空白壤葬基为参比，测定样品在2 3 3 n m 处的党吸收，摄据c l a 紫外暇收标准曲线和稀释倍数计算样品中c l a 的魑。 2 2 5 6 温度对亚油酸弊构酶生成的影响 每只1 0 0 m l 三角瓶装m r s 培葬基5 0 m l ，将壤养基分成三维，每缨三瓶。接秘詹，终三维 培养基分别置3 0 ( 2 、3 7 、4 5 下进行培养。生长2 4 h 后，离心收集细胞，然后按2 2 5 4 进行驻油酸异构酶的活力检测。 t 3 审麓农监夫学磺士举缱豫文 辩嚣釜鞭产聪滟酸箨橡辩瓣蘧赢辩悔 ! , ,h i l l ! ：l u u i i i , q , , , u , 需 2 ；2 ，5 7 耪始溺辩蓬涟酸凳辫鹣生成鹣影媾 趟只l o o m ! 兰鹞簸装m r s 蛾器基5 0 m 1 ，将撼蒡彗分浅七鳃，每缎兰糕，鲻6m 戆h c i 、 n a o t t 溶滚将嚣缒蜷葬蓥磷分剩调节为4 5 、5 , 5 、6 , 5 、z 5 、8 , 5 、9 , 5 、1 0 ，5 。羧弹臻赛鬃，救 蕊缩髓，蒸嚣赣2 。2 5 + 4 避嚣豫穗陵器穗酶瓣活力硷溺； 2 2 、5 8 氯气对溉油酸辩构酶嫩成的影晌 簿只t 8 0 m l 兰辩簸装m r s 璐器萋5 0 m l ，将薅棼萋势籀辩糍，键缝三糕。鳃箨筮气驻避氧 气艇爝端塞辩粒；爨一缀甭鹱避簸气，著鬻，蕞滤毒封弱。攘转培器嚣，牧懿缀鼹，蕤嚣羧 2 。2 + 5 ，4 遴行躐浦酸异构酶静活力稔测。 2 + 2 。5 。g 摇痣转遴瓣翌演酸羚拣懿生成鹃辫酾 跨冀1 0 0 r o t 兰燕簸装m r s 踏举羹5 0 m t ，瓣塔券茎努鸯兰懿，每经三疆。接耱茧，喾爨努 巍京撼床转速为1 0 0 r r a i n 、1 2 0r r a i n 、1 4 0r r a i n 袋俘下墙莽。藤棒生长2 4 h 麓，牧集蹋滕，然 麟娥2 ，2 5 4 迸豁鞭渣酸异构躐瓣洼力捻测。 2 ，2 5 糟纛羧淤辩亚漓酸茹稳鹣生成羽彰鹬 辞只l o o m l 三角簸装m r s 璃养基5 0 r a l ，褥穗莽基努为秘辍，每缀三麟。番缝m 薹 s 璐莽 熬中l a 自g 入爨矜嬲为0 0 0 0 、0 ，0 5 0 、0 0 7 5 镕do d 0 0 0 。搂黪焉，3 7 、1 2 0 r r a i n 条髂下 缀鹅蝽葬2 4h ，热麓鬻心牧巢缁藏，援2 ，2 5 ，4 遴幸亍曼酒酸黪糖酶熬活力羧溅。 2 ，2 、5 蠢辇素黠麓静囊长疑链瀚酸雾耩鹣氅袋趣影璃 每其1 0 0 m l 三霸撬装m r s 燃薄基5 0 m l ，将罐葬基分梵八熄，每缀三糕。耀嚣8 0u h n l 霸 2 3 0 4 0 u m l 熬费辫褰溶涟褥备缀璐器基母毒箨綮粒禽量分澍键至为7 。2 x 1 旷u m l ，1 4 4 x 1 0 、3 u m l ，2 & 8 x 1 扩u m l ，5 7 6 x l 扩戳曛1 1 5 2 x t f f 3u m t ，2 3 0 4 x l 酽嚣嬲l ，3 4 5 。6 x 1 0 - 。u r o t ， 5 7 & 0 x l f f 3u m l ，2 3 0 4 0 x 1 0 - 3u m l 。接种培养2 4 h 屠， | 受集绷拣，然后援2 2 ，8 4 迸行受浦酸 释檎瓣斡涵力捻涮。 2 ，2 s ，1 2 蘩拣缴长疑产薅辫鞠麴线 每炙1 0 0 m t 兰角瓶装m r s 璜莽基5 0 m l 。菸鼯捌柏糕。撩神鹾置相爵藏粹下培养，簿黼溅 小j 孪瑕出嚣瓶，攘2 。2 5 。2 戆溺黼楼静生秘豢，接2 ，2 + 5 4 避纷堑油酸筹橘潞懿活力检测。 2 。2 。s 3 产魏c l a 瓣努辑 糟1 0 0 0 m l 三角耩装m r s 媾黪蒸7 0 0 r o t 。攘粹后培养越小辩，离心收桊蛹雅，麓1 5 m l 磷 酸飘= 钠一柠橡溅缓；串液( p h 6 0 ) 憋缀藤悬浮，辨邂蟹超声波艘醛( 6 0 0 w ，工 孽5 s ，麓歌1 5 s ， 3 0 敬) + 然嚣耱入蒜鹈t a * 毽量a 终浓囊为0 1 粥( 鼹匏裁餐辩2 2 。5 ，4 ) 。糨上述蘧襻壹摇窳 ( 3 0 、1 2 0 r m h l ) 率摄纂爱藏5 霹、游，熬嚣按”f 剃步骤逡稽蠛a 巽秘嚣势爨。 脂肪酸的萃墩和甲酯俄：向样品中加入5 僚体积的氯仿甲静混合物l 氯俯：举醇一2 ：l ，咖、 攮瓣攀褒形成熬c l a ，静止3 0 r a i n 。牧集下鬟舔努，然嚣墙冷糍糍心枫鞲心l o , 0 0 0 x g ，1 5m i n ， 辩 中国农业人学硕l 学位论文第二章苗种产亚油随异构酶的适宜条件 4 ) ，再用无水硫酸钠干燥，最后用旋转蒸发仪在3 0 。c 下蒸发除去溶剂，将残余物移入螺帽小 试管中，用氮气吹干1 7 1 i 。 取上述脂肪酸试样5 0m g 于烧瓶中，加入5 0m 1 盐酸甲醇溶液1 0 0 加热1 0r a i n 进行甲 酯化反应1 72 j ：然后加入蒸馏水1 0 0 m l ，将溶液移入分液漏斗中，再加入3 0 m i 正庚烷，振荡后 静止，收集正庚烷层；用3 0m l 正庚烷再次萃取水层，合并两次萃取物，水洗至中性。将萃取 物用无水硫酸钠干燥后，在高纯氮气保护下蒸发至约2 0 m l ，然后用气相色谱仪检测形成的共轭 亚油酸甲酯( c l a m e ) 。 气相色谱分析条件：按g b t 1 7 3 7 7 1 9 9 8 7 3 1 的方法，用日本岛津g c 9 a 气相色谱仪检测脂 肪酸甲酯化样品。手动进样；氢火焰离子化检测器f i d ；载气高纯n 2 ，燃气h 2 ，助燃气空气。 熔融石英毛细管柱c ps i l8 8 ( 5 0r n 0 2 2m m i d 0 2 m ，d i k m a ) ，固定柱温2 0 0 c ，进样 温度2 5 0 c ，检测器温度2 5 0 c ，柱前压力4 0k p a ，柱流速3 m l m i n ，分流比1 0 ：1 ，进样量1 “l ， 面积采用归一化法计算。 2 3 结果与分析 2 3 1 菌种 菌种由本实验室自酸泡菜中分离筛选所得，呈革兰氏阳性，短杆状，无鞭毛，不产芽孢， 菌体宽0 3 0 6 芦m ，长2 3u m ，能够在亚油酸诱导下生成亚油酸异构酶。细胞壁坚韧，一般 方法不易破碎。用a p l 5 0 多项实验鉴定系统确定该菌为植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ， 置信度9 6 1 ) 。电子扫描摄影如图2 - 1 所示( 中科院微生物所，1 0 0 0 0 倍) 。 该菌株的实验室编号为l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ml t 2 6 ，以下简称为l t 2 6 。 垂争 l t 2 - 6 熬蠖电键瓣冀 f i g 2 - 1s c a n