（食品科学与工程专业论文）hcn离子通道起搏功能的分子基础.pdf

山东师范大学硕士学位论文 中文蓁霪羹一飘翟纂赛缓鏊i 鏊蔫露雾薹霆蕊蔫鬣墓。霎墓墼 重季雾嚣囱羹墓鬈霎篓娶藕l 篓邕嚣茎矧藩l ；越羹壅勇鋈蕊墅霎i 鋈蔻邕攀荔籀 篓囊蠹麓拦垡，塑羹蓁蘑缓蕊霞妻强。冀葱霎露霎琴疆耍亘蚕冀霆蘑鍪i 蠹嚣帑 塑蓁垂霪翼羹霾i 霎霪嚣羹蠡霾鬟爨a t e d c y c l i cn u c le o t i d e - m o d u l a t e d ) c h a n n e l s 砂s y s t e m a t i c l e n g t ha i t e r a t i o n s o r i g i n a l l yp u b l i s h e dinp r e s sa sd o i ：lo 10 7 4 j b c m 4 0 8 7 4 7 2 0 0o n a u g u s t8 ，2 0 0 4j b i 0 1 c h e m ，v 0 1 2 7 9 ，i s s u e4 2 ，4 3 7 5 2 4 3 7 5 9 ，o c t o b e r15 ，2 0 0 4 一一 【2 3 】o h ，s v e r s e l i s ，v = k b a r g i e l l o ，t a c h a rg e sd i s p e r s e do l ，e rt h ep e r m e a t i o n p a t h w a yd e t e r m i n et h ec h a r g es e l e c t i v i t ya ndc o n d u c t a n c eo fac x 3 2c h i m e r i c h e m i c h a n n e t jp h y s i o lm a r2 7 【2 4 】 b a r b a r am u c h , c h r i s t i a nw a h l - s c h o t t , x i a n g a n gz o n g , a n g e l as c h n e i d e r , l u d w i gb a u m a n n ， s v e nm o o s m a n g , a n d r e a sl u d w i g ，a n dm a r t i nb i e l r o l eo f s u b u n i th e t e r o me r i z a t i o na n dn - l i n k e d g l y c o s y l a t i o n i nt h ef o r m a t i o no f f u n c t i o n a lh y p e r p o l a r i z a t i o n - a c t i v a t e dc y c l i cn u c l e o t i d e - g a t e dc h a n n e l s t h e j o u r n a lo fb i o l og i c a l c h e m i s t r y 、内1 2 7 8 ，n o 4 4 ，i s s u eo fo c t o b e r31 ， p p 4 3 7 81 - - 4 3 7 86 ，2 0 0 3 孳。 2 5 】r a i n e rs u r ge s ，a m yl b r e w s t e r , r o l a n da b e n d e r , h e i n zb e c k , t h o m a sj f e u e r s t e i na n dta l l i ez b a r a m d l e g u l a t e de x p r e s s i o no fh c nc h a n n e l sa n dc a m p l e v e l ss h a p et h ep r o p e r t i e so f t h ehc u r r e n ti nd e v e l o p i n gr a th i p p o c a m p u s , e u r o p e a n j o u r n a lo f n e u r o s c i e n c e , v 0 1 2 4 ，p p 9 4 一l0 4 ，2 0 0 6 2 6 】na l d i n i l ，bl o m e v ，g a l l a yp e ta 1 i nv i v og e n ed e l i v e r ya n ds t a b l e t r a n s d u c t i o no fn o n d i v i d i n gc e l l sb yal e n t i v i r a lv e e t o r j 】s c i e n c e ，19 9 6 ，2 7 2 ： 2 6 3 2 2 6 7 【2 7 】d ur i n g m j ，na e g e l ej r , o m a l l e rk l ，e ta 1 l o n g - t e r mb e h a v i o r a lr e c o v e r y 锄p a ki ns o n i a nr a t sb ya nh s v v e c t o r e x p r e s s i n gt y r o s i n eh y d r o x y l a s e j 】sc i e n c e ， 1 9 9 4 ，2 6 6 ：1 3 9 9 2 1 4 0 3 2 8 】k apl i t t mg ，l e o n ep ，s a m u l s kir j ，e ta 1 l o n g - t e r mg e n ee x pr e s s i o na n d p h e n o ty p i cc o r r e c t i o nu s i n ga d e n o a s s o c i a t e dv i r u sv e c t o r si nt h em a m m a l i a nb r a i n 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t 1 1 1t h er e s c e l l ty e a r s ，t h ed e v e l o p m e n t0 f p a c e l l l d 泐p r o p o s e s a n o v e ls t r a t e g yt o 骶a ta r d l 灿i a i no r d e rt os a v em el i v e so ft h o s ew h os u 脑e d h o w e v e r ，t he i m p l 锄t a t i o no f p a c e m a k e r c a n o n l yh e l pr e i i e v es m p t o mb u tc a nn o tr e m o v em ed i s e a s ef 如mt h e rootfurtherm o r e ，i t i sr i s k yt oi m p l a l l t e l e c t r i cp a c e m a k e rd e v i c e si n the p a t i e n t s e s p e c i a l i yf o r t h ey o u t h ， it i sq u i t e d i 瓶c u l tt o d o t h i sb e c a u s et h e i rh e a r t si s d e v e l o p i n g a sa result，a n o v e ls t r a t e d ，p r e s e n t i t s e l fa c c o r d i n 舀y t h e heanbeat o r i 西n a t e s 丘o mas o c a l l e di fi o nc _ h a l l n e le x p r e s s e di ns i n o a t r i a i node(san)，a c t i v a t e d b ym e 1 b r a n eh y p e 叩o l a r o z a t i o n ，觚di sa 1 1 i m p o r t a n t mtributcr t op a c em a k i n g h c ni st e 肌e da sh y p e 单o l 撕z a t i o n - a c t i v a t e d ，c y c l i c n u c l e t i d e - m o d u l a t e d ( h c n ) c a t i o n ch锄e1tllisg e l l e i l ye n c o d e d 蓁霄l 蓁薅y 弼巨h 滓薹之丛 j 2 蓁；r 瞳至y i ； 街葶l 霎k 蓁塞羹l l 著兰囊季f 塾萋蓁俺淄竖蓁；薹型霾耋夔蓠丛甓鬣鑫墨o | 嚣季舂篓型雾霎塞! di 冀 豢娄箩蠹囊霆萋l r | 型雾写川奏霎羹n i 曼； 鋈蒌厶1 藿_ 竽f 甥娥嚣! b 囊飞l 常豸i 孪i j l 垂蚕霍! 妻茎荔i 季孽囊搴薹妻蓁薹羹蓁雾i 荆蚕冀蓁耋莺 耋氨孽! 蠹爱霎主萋i 攀l p a c e m a k e rc r e a t e d 缈g e n e t r a n s f e r j 】n a t u re ，2 0 0 2 ，4 19 ( 1 2 ) ：1 3 2 2 1 3 3 世6 、聪亳聪螅蕉超极化激活的环核营酸门控的离子通道s 生物心脏起搏器构 建中国心脏起搏与心电生理杂志2 0 07 年第2 l 卷第6 期5 3 5 4 7 】q u j ，p l o t n i k o va ，d a n i l o p , e ta 1 e x p r e s s i o n a n d f u n c t i o n o f a b i o l o g i c a l p a c e m a k e r i n c a n i n eh e a r t j c i r c u l a t i o n ，2 0 0 3 ，10 78 ：1 10 6 1 10 9 ， 【4 8 】p o t a p o v a i ，p l ot n i k o v a , l u z ，e t a l h u m a n m e s e n c h y - m a o s t e mc e l ls a s ag e n e d e l i v e r ys y s t e mt ot r e a tc a r d i a cp a c em a k e r s , j c i r c r e s ，2 0 0 4 ，9 47 ：9 5 2 - 9 5 9 4 9 】y uh ，w uj ，p o t a po v ai ，e ta 1 m i n kr e l a t e d p e p t i d eab e t a s u b u n i t f o ，t h eh c n 如刀c h a n n e ls u b u n i tf a m i l ye n h a n c e se x p r e s s i o na n ds p e e d sa c t i v a t i o n c i r e r e s ，2 0 0 1 ，8 8 ：e 8 4 2 e8 7 5 0 】周琳，蒋文平，不两樊垄馓绍籀移蕴考荔钇力衰竭穆笱考野中华心血管杂志， 2 0 0 4 ，1 0 9 ：5 0 6 - 5 1 2 【51 】x u et ，c h oh c ，a k a r f g , e t a 1 f u n c t i o n a li n t e g r a t i o no fe l e c t r i c a l l y a c t i v e ca r d i a cd e r i v a t i v e sf r o mg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e dh u m a ne m b y o n i cs t e mc e l l sw i t h q u i e s c e n tr e c i p i e n tv e n t r i c u l a rc a r d i o m y o c y t e s i n s i g h t si n t ot h ed e v e l o p m e n to f 山东师范大学硕 ：学位论文 f u r t h e rs t u d yo nt h ep r o p e r t i e so ft h e mt h r o u g hs e v e r a lm u t a t i o n sa n dw eh a v eg o t p a c e m a k i n g - e n h a n c i n gc l o n i c s w ea d o p tl e n t i v e c t o r a st h ev e h i c l ew h i c hc a l l i n t e g r a t et h eg e n eo fi n t e r e s ti n t oh o s t sg e n o m es o 勰t oe x p r e s si ti nal o n g - t e r ma n d m o r es t e a d yw a y ，b u ei nm yc a s ei tn e e d sf u r t h e rr e c o n s t r u c t i o n k e yw o r d s ：h c n ，p o i n tm u t a t i o n ，d e l e t i o n ，p l e n t i l o x - 3 7 ，l e n t i v i r u s ， h e k 2 9 3 ，n e o n a t a lc a r d i o m y o c y t e s i i l 山东师范大学硕士学位论文 i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得一 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 ： 学位论文作者签名：钊t l ，五 、 导师签字：甜 学位论文版权使用授权书 贰坟 v 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：朗、】，五 签字日期：2 0 0 矿年多月) 一日 导师签字： 村谶 签字日期：2 0 0 g 年6 月】日 山东师范大学硕上学位论文 第一章综述 1 1 离子通道概述 1 1 1 离子通道 活体细胞不停地进行新陈代谢活动，就必须不断地与周围环境进行物质交 换。生物膜对无机离子的跨膜运输有被动运输( 顺离子浓度梯度) 和主动运输( 逆 离子浓度梯度) 两种方式。主动运输的离子载体称为离子泵，被动运输的通路称 离子通道。生物膜对离子的通透性与多种生命活动过程密切相关。 离子通道( 1 0 nc h a n n e i ) 是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，是神 经、肌肉细胞电活动的物质基础，离子通道由细胞产生的特殊蛋白质构成，它们 聚集起来并镶嵌在细胞膜上，中间形成水分子占据的孔隙，这些孔隙就是水溶性 物质快速进出细胞的通道。离子通道的活性，就是细胞通过离子通道的开放和关 闭调节相应物质进出细胞速度的能力，对实现细胞各种功能具有重要意义。离子 通道的功能、结构异常与许多疾病的发生和发展有关【1 l 。 1 1 2 离子通道的发现和研究历史 在生物电产生机制的研究中发现了生物膜对离子通透性的变化。1 9 0 2 年j 伯恩斯坦在他的膜学说中提出神经细胞膜对钾离子有选择通透性。19 3 9 年a l i 霍奇金与a f 赫胥黎用微电极插入枪乌贼巨神经纤维中，直接测量到膜内外电位 差。19 4 9 年a l 霍奇金和b 卡茨在一系列工作基础上提出膜电位离子假说，认 为细胞膜动作电位的发生是膜对纳离子通透性快速而特异性地增加，称为“钠学 说”。尤其重要的是，1 9 5 2 年a l 霍奇金和a f 赫胥黎用电压钳技术在枪乌贼巨 神经轴突上对细胞膜的离子电流和电导进行了细致地定量研究，结果表明n a + 和k + 的电流和电导是膜电位和时间的函数，并首次提出了离子通道的概念。他 们的模型( h h 模型) 认为，细胞膜的k + 通道受膜上4 个带电粒子的控制，当4 个粒子在膜电场作用下同时移到某一位置时，k + 才能穿过膜。 另一方面，1 9 5 5 年卡斯特罗和b 卡茨对神经肌肉接头突触传递过程的研 究发现：突触后膜终板电位的发生是由于神经递质乙酰胆碱( a c h ) 作用于终板膜 上受体的结果，从而确认了受化学递质调控的通道。6 0 年代，用各种生物材料 对不同离子通透性的研究表明，各种离子在膜上各自有专一性的运输机构，曾经 山东师范大学硕十学位论文 提出运输机构是载体、洞孔和离子交换等模型。1 9 7 3 年和1 9 7 4 年，c m - 5 可姆 斯特朗、f 贝萨尼利亚及r d 凯恩斯、e 罗贾斯两组分别在神经轴突上测量到与 离子通道开放相关的膜内电荷的运动，称为门控电流，确认了离子通道的开放与 膜中带电成分运动的依从性。1 9 7 6 年e 内尔和b 萨克曼创立了离子单通道电流 记录技术，并迅速得到推广应用，近年用这种技术发现了一些新型离子通道，为 深入研究通道的结构和功能提供了有力的工具。 8 0 年代初，学者们先后从细胞膜上分离和纯化了一些运输离子的功能性蛋 白质，并在人工膜上成功地重建了通道功能，从而肯定了离子通道实体就是膜上 一些特殊蛋白质分子或其复合物。近年，科学家应用基因重组技术研究离子通道 的结构，1 9 8 2 和1 9 8 4 年，纽莫及合作者先后测定了n 型a c h 受体和n a + 通道 蛋白的氨基酸序列。 1 1 3 离子通道的功能和类型 离子通道依据其活化的方式不同，可分两类：一类是电压活化的通道，即通 道的开放受膜电位的控制，如n a + 、c a + 、c l 和一些类型的k + 通道；另一类是化 学物活化的通道，即靠化学物与膜上受体相互作用而活化的通道，如a c h 受体 通道、氨基酸受体通道、c a + 活化的k + 通道等。 1 1 3 1 钠通道 各种生物材料中，与电兴奋相关的n a + 通道有相似的基本特征。通道活化时 间常数小于1 毫秒，失活时间常数为数毫秒，n a + 电流的反转电位约+ 5 5 毫伏。 单通道电流记录显示，n a + 单通道电导为4 2 0 p s ，平均开放寿命数毫秒。 根据一些药物和毒素对n a + 通道功能的不同影响，可分为4 种类型：通道 阻断剂，如河豚毒素( t t x ) 、石房蛤毒素( s t x ) 。通道活化增强剂，如p 一蝎毒、 箭毒蛙毒素( b t x ) 、藜芦碱毒素( v e r ) 等。通道活化抑制剂，如一些局部麻醉 剂及其衍生物。通道失活抑制剂，如链霉蛋白酶、n 溴乙酰胺( n b a ) 等。 1 1 3 。2 钾通道 根据功能特性的不同，k + 通道可分为以下类型：慢( 延迟) k + 通道( k 通 道) ，也就是h h 模型中的k + 通道。单通道电流记录显示，单个k 通道电导在2 2 0 p s ，通道平均开放寿命为数十毫秒。该种通道可被四乙胺( t e a ) 等特异性阻断， 2 山东师范大学硕士学位论文 通道对k + 有高度选择性，这种通道在神经轴突和骨骼肌细胞膜中有较高密度。 快( 早期) k + 通道( a 通道) ，该种通道外向的k + 流在膜去极化的早期就出现， 表明通道的活化时间常数比慢k + 通道小得多，但在4 0 毫伏以上该通道即关闭。 电压钳位实验表明，其宏观电流动力学与n a + 电流相似。较低浓度的4 氨基吡啶 即能阻断该通道，它也可被四乙胺阻断。c a 2 + 活化的k + 通道( k ( c a ) 通道) ， 该种通道的开放，不但与膜电位有关，而且依赖于细胞内c a 2 + 的浓度，每个通 道需结合两个c a 2 + 才能活化。单通道电导可高达3 0 0 p s ，并有较长的开放寿命， 这种通道与c a 2 + 通道协同作用，对调节细胞膜电兴奋性的节律有重要意义。它 可被四乙胺、n 。四乙酸( e g t a ) 、奎尼丁和b a 2 + 阻断。内向整流的k + 通道，其 特征是：在膜超极化时通道开放与膜电位和胞外k + 浓度密切相关，通道开放时 产生内向k + 电流，单通道电导在5 1 0 p s 范围。 1 1 3 3 钙通道 c a 2 + 通道广泛存在于各种生物组织的细胞膜中。宏观的c a 2 + 电流动力学特 征与n a 2 + 电流相似，但峰值小且失活过程慢，可达数十到数百毫秒。c a 2 + 通道 对c a 2 + 、b a 2 + 、s p 都有高通透性，n i 2 + 、c d 2 + 、c 0 2 + 、m n 2 + 等离子能有效地阻 断c a 2 + 通道。 药物对c a 2 + 通道的作用可分为：通道阻断或抑制剂，可分为苯烷基胺类 ( 如异博定、甲基异博定d 6 0 0 ) 、苯硫氮类、双氢吡啶类等类型。通道激活 剂，一些双氢吡啶化合物如b a y k 8 6 4 4 等药物可活化c a z + 通道。 近年，对小鸡背根神经节细胞的研究发现有3 种类型的c a 2 + 通道：l 型， 该种通道在膜电位大于2 0 毫伏时活化，电流失活缓慢。单通道电导约2 5 p s 。 t 型，膜电位约6 0 毫伏时通道即活化，1o 毫伏以上通道电流幅值反而下降， 单通道电导约8 p s 。n 型，该种通道在膜电位不小于1 0 毫伏才能活化，但又 必须超极化到8 0 毫伏以下才能克服通道的失活，电流动力学比l 型快但比t 型慢，单通道电导约1 3 p s 。以上3 类c a 2 + 通道在不同细胞膜上选择性分布及密 度的差别，将影响各种细胞的生理功能。c a 2 + 通道除了对细胞电兴奋性有贡献外， 它通过调节细胞内c a 2 + 浓度，可进一步调节许多细胞功能。 1 1 3 4n 型乙酰胆碱受体通道 它是由神经递质a c h 活化的正离子通道。当突触前膜一次量子化释放数千 3 山东师范大学硕士学位论文 个a c h 分子，它们作用于突触后膜上的n 型受体时，受体通道开放，产生n a + 和k + 电流，引发突触后膜一个小终板电位( m e p p ) 。n a c h r 单通道电导在2 0 6 0 p s 范围，平均开放寿命数毫秒，通道电流反转电位约1 0 毫伏，近年发现该 种通道有多种电导态。通道的离子选择性较差，可允许数十种无机和有机正离子 通过，许多毒素和有机物能阻断或抑制该种通道，q 银环蛇毒( a b g t x ) 是n 型 a c h 受体通道的特异性阻断剂。 8 0 年代以来，已发现多种由神经递质和激素活化的受体通道，如谷氨酸受 体通道、多巴胺受体通道、5 羟色胺受体通道、y 氨基丁酸受体通道等。 1 1 4 离子通道的研究方法 离子通道结构和功能的研究需综合应用各种技术，包括：电压和电流钳位技 术、单通道电流记录技术、通道蛋白分离、纯化等生化技术、人工膜离子通道重 建技术、通道药物学、基因重组技术及一些物理和化学技术。 1 1 4 1 电压钳位技术 一般而言，膜对某种离子通透性的变化是膜电位和时间的函数。用玻璃微电 极插入细胞内，利用电子学技术施加一跨膜电压并把膜电位固定于某一数值，可 以测定该膜电位条件下离子电流随时间变化的动态过程。利用药物或改变细胞内 外的溶液成分，使其他离子通道失效，即可测定被研究的某种离子通道的功能性 参量，分析离子电流的稳态和动力学与膜电位、离子浓度等之间的关系，可推断 该种通道的电导、活化和失活速率、离子选择性等，并能测量和分析通道的门控 电流的特性。 1 1 4 2 单通道电流记录技术 单通道电流记录技术又称膜片钳位技术，用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表 面，使之形成1 0 1 0 0 g q 的密封( g i g a s e a l ) ，被孤立的小膜片面积为u m 2 量级， 内中仅有少数离子通道。然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放 产生的p a ( 1 0 一1 2 安培) 量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观 测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分 布、开放几率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之 间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧向外或膜的 4 山东师范大学硕士学位论文 内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液 成分以及施加药物都很方便。 1 1 4 3 通道药物学研究 应用电压钳位或单通道电流记录技术，可分别于不同时间、不同部位( 膜内 侧或外侧) 施用各种浓度的药物，研究它们对通道各种功能的影响。结合对药物 分子结构的了解，不但可以深入了解药物和毒素对人和动物生理功能作用的机 制，还可以从分子水平得到通道功能亚单位的类型和构象等信息。 1 1 4 4 通道蛋白分离、通道重建和基因重组技术 利用与通道特异结合的毒剂标记，可把通道蛋白质从膜上分离下来，经过纯 化，可以测定各亚单位多肽的分子量。然后，把它们加入人工膜，可重新恢复通 道功能。用于确定蛋白质氨基酸序列的基因重组技术的程序是：从细胞中分离出 含有与该种通道蛋白相关的m r n a ，置入某种细胞( 如大肠杆菌) ，经逆转录得到 c d n a 。用限制性内切酶将c d n a 切割成特定片段，再用核酸杂交方法钓出特定 的d n a 并克隆化。通过测定阳性克隆d n a 的核苷酸顺序，推断出相应的蛋白 质氨基酸序列。 1 1 5 离子通道病( c h a n n eio p a t h y ) 离子通道病是指离子通道的结构或功能异常所引起的疾病，具体表现在编码 离子通道亚单位的基因发生突变或表达异常，或体内出现针对通道的病理性内源 性物质时，离子通道的功能发生不同程度的减弱或增强，导致机体整体生理功能 紊乱，形成某些先天性或后天获得性疾病，主要累及神经、肌肉、心脏、肾脏等 系统和器官。迄今为止，研究比较清楚的离子通道病主要涉及钾、钠、钙、氯通 道领域，现简介如下。 1 1 5 1 钾通道病 钾离子通道在所有可兴奋性和非兴奋性细胞的重要信号传导过程中具有重 要作用，其家族成员在调节神经递质释放、心率、胰岛素分泌、神经细胞分泌、 上皮细胞电传导、骨骼肌收缩、细胞容积等方面发挥重要作用。已经发现的钾通 道病有常染色体显性良性家族性新生儿惊厥 ( b e n i g nf a m i l j a ln e o n a t a ic o n v u l s i o n s ，b f n c ) 、1 型发作性共济失调 5 山东师范大学硕士学位论文 ( e p j s o d i ca t a x j at y p e1 ) 、阵发性舞蹈手足徐动症伴发作性共济失调 ( p a r o x y s m a lc h o r e o a t h e t o s i sw i t he p i s o d i ca t a x i a ) 、癫痫、1 一，2 一，5 一，6 一型 长q t 综合征、j e e 和l a n g e n i e i s e n 综合征f 2 l 、a n d e r s e n 综合征【3 l 等。 1 1 5 2 钠通道病 钠离子通道在大多数兴奋细胞动作电位的起始阶段起重要作用，已经发现 的钠通道病有高钾型周期性麻痹、正常血钾型周期性麻痹、部分低钾型周期性麻 痹、先天性副肌强直、各型钾加重的肌强直、先天性肌无力、3 型长q t 综合征、 1 型假性醛固酮减少症、l i d d i e 综合征【4 】、全面性癫痫热性发作叠加症 ( g e n e r a i i z e de p e p s yw i t hf 色br i e s e l z u r e sp i u s 【5 1 ) 等。 1 1 5 3 钙通道病 钙离子通道广泛存在于机体的不同类型组织细胞中，参与神经、肌肉、分泌、 生殖等系统的生理过程。已经发现的钙通道病有家族性偏瘫型偏头痛、低钾型周 期性瘫痪、2 型发作性共济失调、6 型脊髓小脑共济失调、中央脊髓性肌病 ( c e n t r a ic o 怕d i s e a s eo fm u s c i e ) 、恶性高热、l a m b e r t e a t o n 肌无力综合征网、 癫痫等。 1 1 5 4 氯通道病 氯离子通道广泛分布于机体的兴奋性细胞和非兴奋性细胞膜及溶酶体、线粒 体、内质网等细胞器的质膜，在细胞兴奋性调节、跨上皮物质转运、细胞容积调 节和细胞器酸化等方面具有重要作用。已经发现的氯通道病有先天性肌强直 ( t h o m s e n 型) 、隐性遗传全身性肌强直( b e c k e r 型) 、囊性纤维化病、遗传性肾结 石病、3 型b a r t t e r 综合征【7 l 等。 需要说明的是，相当数量的离子通道病并不是新出现的疾病，而是早已出现 甚至早被熟知的疾病，只是此前一直未发现其在离子通道水平存在病变，如癫痫、 偏头痛等；有些离子通道病为单一离子通道结构或功能异常而至，如1 型发作 性共济失调是由于k c n a l 基因突变引起，该基因位于染色体1 2 p 1 3 上，编码电 压依赖性钾离子通道；也有些离子通道病涉及多种离子通道结构或功能异常，如 癫痫与l 型电压依赖性钙通道( a 1d 亚单位基因表达减弱) 、电压依赖性钾通道 ( k c n q 2 和k c n q 3 基因突变) 、乙酰胆碱受体通道( a 4 和b 2 亚单位基因突变) 6 山东师范大学硕十学位论文 等有关。 1 2h c n 基因家族 1 2 1h c n 基因家族概述 h c n 编码的超极化激活的环腺苷酸激活的阳离子通道绝大多数存在于心肌 和中枢及周围神经元等起搏和可兴奋细胞中【8 6 1 。h c n 在神经组织中编码i h 电 流，在维持神经元静息膜电位及神经网络功能方面起着重要作用。例如参与机体 记忆的海马组织就有3 种亚型的h c n 基因表达，且在海马的不同发育时期，各 亚型的分布有所不同。h c n 在心肌组织编码l f 电流，最初在7 0 年代末被发现， 由于其超极化激活和可被肾上腺素增强的特性以及内向性，而被确认为起搏电 流。但是直到9 0 年代末编码l f 离子流的通道分子才被相继克隆，称为超极化 激活的环核苷酸门控的离子通道( h y p e r p o l a r i z a t i o n - a c t v a t e dc y c l i c n u c l e o t i d e g a t e dc h a n n e l ，h c n ) 。由于h c n 与心脏起搏的产生和调节关系 密切，所以被称为起搏基因。近年来不仅对该基因功能结构的研究不断深入，而 且利用其构建生物心脏起搏器也取得了初步的成果。 1 2 2h c n 的4 种亚型及其分布 h c n 有四个亚型，分别是h c n l ，h c n 2 ，h c n 3 和h c n 4 。这四种亚型在 不同的组织中分布不同。同一亚型在不同组织中编码的电流的激活曲线亦不同。 就激活来讲，h c n l 比其它几种亚型要快，h c n 4 最慢。【1 刀这四种亚型都在心脏 中有表达，只是不同的物种表达强度有区别。窦房结中表达最多的是h c n 4 ，推 测是这种慢激活的通道通过1 3 肾上腺素的作用调节起搏功能和心率快慢，而 h c n l 和h c n 2 只在维持心肌细胞的静息电位中起作用。但h c n 2 在心脏中主 要存在于心室肌，它的统道动力学性能介于h c n l ( 快) 和h c n 4 ( 慢) 之间， 而对c a m p 的反应则与h c n 4 相似，相当或大于h c n l 。由于这些特点，近年 来多采用发送h c n 2 增强i f 来构建生物起搏剐1 8 倒。 在视网膜、及脑组织中上表达居多的是h c n l 。h c n 的四种单体一般形成 二聚体或多聚体发挥作用，可以起到比单个通道电流增强的作用。【2 0 1 1 2 3h c n 的分子结构 h c n 的分子是一种六次跨膜的膜蛋白，这六个跨膜区分别称为s 1 s 6 ，与 7 山东师范大学硕士学位论文 电压门控的钾通道高度同源，其中s l 、s 2 及它们之间的连接环决定了各个亚型 的激活曲线的不同【2 1 1 ，s 4 带正电荷是电压感受区域决定通道的电压依赖性， s 3 s 4 之问的连接部分的长短对通道的开放有重要的调节作用【2 2 1 ，高度保守的 s 5 s 6 之间的小孔结构是通道正常发挥功能所必须的【2 3 】。胞内区的n 端是糖基 化位点，只有糖基化以后才能发挥作用。【2 5 】包内区c 端的c n b d 是超极化激活 的环核苷酸控制的离子通道的共同结构，就h c n 来讲，该结构与c a m p 结合， 通过其在细胞内水平含量调节通道的开放程度。 1 2 4h c n 与心脏起搏 j 下常心跳的产生源在右房的一个特定区域，即窦房结。h c n 负责窦房结细胞 舒张期的去极化和自动节律性以及心脏的正常起搏。h c n 离子通道与其他电压 门控通道不同，它的激活依赖于细胞膜的超极化，而一般电压门控通道只在膜电 位去极化时激活。如此一来h c n 通道在复极未期丌放，以及接下来的动作电位 去极化时失活，保证了在舒张术期触发新的动作电位。 1 2 5h c n 与心脏起搏的调节 窦房结内存在密集的交感和副交感神经，它们通过释放神经递质( 乙酰胆碱、 儿茶酚胺) 调节心脏的自动节律性，而h c n 离子通道对这些神经递质高度敏感。 乙酰胆碱和儿茶酚胺通过沿着电压轴向更负或更正的方向转换激活曲线来调节 i f 电流。这种调节机制首先在自体窦房结细胞离子通道中被证实，随后在克隆的 h c n 通道中也被证实。【2 6 】研究表明在所有h c n 家族成员中，c 端与c a m p 结 合后解除了c 连结子和它的抑制性相互作用，从而改变了离子通道的活性。乙 酰胆碱抑制了腺苷酸环化酶的活性以及c a m p 的生成，故可以使if 电流的激活 曲线向更负的方向转换，而儿茶酚胺则正好相反。 1 2 6h c n 与心脏起搏疾病 因为心脏起搏通道h c n 在窦房结细胞舒张末期的去极化以及心跳节律的自 动调节方面起着的关键作用，所以某些先天的窦房结功能紊乱可能是起搏通道的 遗传缺陷造成的。h c n 2 基因敲除小鼠表现出窦房结的节律障碍、窦房结h c n 离子电流的减少以及最大舒张电位向更负方向的转换【2 7 1 。h c n 4 缺失鼠则if 减 少了8 0 ，离体心脏的收缩率也减少了4 0 ，并且丧失了对c a m p 的反应性【2 8 1 。 山东师范大学硕一l 学位论文 中h c n l 、h c n 2 和h c n 4 在心脏中表达，但它们的相对m i a 富集量因心脏 的不同区域及不同种属、年龄甚至疾病状态而不同。它们与c a m p 的结合物可以 被移向更正的电压水平，从而在一定电压范围内有效的增加内向电流。因为在电 压依赖激活方面没有很大的区别，选择h c n 基因作为生物起搏基因是以c a m p 敏感性及其通道动力学为基础，h c n 2 和h c n 4 两者对c a m p 反应强烈，但h c n 2 比h c n 4 有更快的动力学，所以h c n 2 被应用在目前的研究中。 q u 等【4 7 】研究发现过度表达的h c n 2 在心肌中可能产生类似i f 的具有激发心 脏搏动的起搏电流。他们将一组动物的左心房接受整合了h c n 2 + g f p 绿色荧光 蛋白的腺病毒的注射，另一组动物的左心房仅接受整合g f p 腺病毒的注射，3 4 天后，刺激迷走神经来抑制窦性心率，接受了h c n 2 + g f p 的动物产生了来源 于注射部位附近的心房激动，而仅接受了g f p 的动物没有此现象。【4 8 】此外，从 注射部位分离出来的心肌细胞显示i h c n 2 电流比未注射部位的i f 电流大1 0 0 l o o o 倍。 为了观察这样的起搏电流是否能够驱动短暂房室阻滞的心室，p l o t n i k 州等 将一组狗通过导管在左束支注射包含了h c n 2 + g f p 的腺病毒，4 7 天后刺激迷 走神经产生房室阻滞，接受了h c n 2 的动物产生了来源于注射部位附近的稳定的 心室自身逸搏节律大约6 0 次分，其频率明显快于对照组( 对照组是注射g f p 、 生理盐水的动物) 。通过免疫组化和生物物理的方法均可以证实在注射部位有 h c n 2 的过度表达。【4 9 1 但是，这种方法依然存在以下问题：( 1 ) 手术注射很容易 引起血肿，可能导致手术后2 4 4 8 小时的心动过速；( 2 ) 在窦性静止与出现心 室自身节律之间有5 3 0 s 的抑制期；( 3 ) 载体的活力期限问题。 1 4 2 细胞治疗 细胞治疗主要是指利用干细胞的治疗，它可以有效地避免基因治疗中的病毒 载体所带来的问题。干细胞是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞 群，它包括胚胎干细胞和成体干细胞( 造血干细胞和骨髓间充质干细胞) 。目前细 胞治疗主要是采用胚胎干细胞和成人间充质干细胞治疗。 1 4 2 1 胚胎干细胞治疗 胚胎干细胞在体外可以分化成心肌细胞【5 0 1 。x u e 等【5 1 】联合使用电生理和成像 技术发现具有电活动的供体人胚胎干细胞来源的心肌细胞在体外通过重组特定 1 4 山东师范大学硕士学位论文 的病毒载体( 1 e n t i v i r u s ) 进行稳定基因修饰后，可以和受体中静止心肌细胞在功能 上成为一体，产生节律性的电活动和收缩活动。将人胚胎干细胞来源的有起搏功 能的细胞种植在豚鼠的左心室上，利用实时激动标测系统证实了电活动从注射部 位向周围心肌的传播。当然目前还存在一些问题需要解决。第一，还需要进一步 的实验研究详细描述人胚胎干细胞来源的心肌细胞的电生理活动【5 2 1 ，例如人胚胎 干细胞时间依赖性的电重构等问题；第二，如何驱动胚胎干细胞向窦房结等自律 细胞分化并且如何鉴别、分离和纯化。最近有学者发现q 肌凝蛋白重链的测定 可以用来鉴定和描述早期胚胎干细胞来源的起搏和心房细胞，利用研究鼠胚胎干 细胞的技术很容易实现对人胚胎干细胞的分离和纯化；【5 3 】第三，分化好的窦房结 细胞是否能够驱动心脏；第四，鼠的胚胎干细胞存在着导致心律失常的潜力，人 胚胎干细胞是否也存在这种现象。另外胚胎干细胞还存在干细胞的相关问题如免 疫排斥，定向分化，瘤生成和伦理等问题。 成功使用上述方法的先决条件是移植细胞、起搏细胞或传导组织能与宿主细 胞形成结构和功能的整合。人胚胎干细胞来源的心肌细胞能在体外与已经存在的 心肌组织形成结构和功能的整合并产生单个功能多核体。如果用成体干细胞将可 以避免伦理和细胞排斥问题。【蚓 1 4 2 2 骨髓间质干细胞移植 大量的临床前研究【5 5 】证实了成人间充质干细胞和胚胎干细胞一样可以分化 成许多细胞系，包括肌肉骨骼组织和结缔组织，因此成人间充质干细胞在理论上 可以在合适的条件下分化成具有起搏功能的窦房结细胞，相关的动物实验和临床 实验有待进一步研究。但是利用成人间充质干细胞分化，同样也会面临胚胎干细 胞所面临的诸如定向分化和瘤生成等问题，因此有些科学家发现利用成人间充质 干细胞作为载体运送起搏基因到心脏从而产生起搏电流可能解决这些问题。 p o t a p o v a 等【5 6 】通过免疫组化和双膜片钳技术发现被注射到犬的心肌中的成 人间质干细胞在自身细胞之 x 山东师范大学硕士学位论文 膜片钳是一种可以直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难 易程度等特性的一种实验技术。【6 3 填基本原理是用一个尖端光洁，直径约为 0 5 3 啪的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入【6 4 1 ，然后在微电极另一 端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的 纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密 的封接【6 5 】，其电阻可达数个或数十个干兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口 处的那一片膜同其余部分的膜在化学上完全隔离出来，【删由微电极记录到的电流 变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。 6 刀如果在这一小片膜中只包含了一 个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子 经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。【6 8 l 应用：直接观察神经细胞，肌细胞，及其他各种细胞中的单一的离子通道蛋 白质分子对相应离子通透难易等特性。由于这时微电极不刺入细胞，即使用于纤 小的细胞也不致造成损伤。膜片钳实验技术及其各种变式，是从分子水平研究跨 膜离子移动和其他功能的重要手段。 1 6 研究目的与意义 本研究的目的是通过对英国曼彻斯特大学心血管研究中心雷鸣教授赠予的 携带h c n 基因的质粒图谱和其表达通道结构的分析，利用p c r 技术构建影响通 道功能的突变型，将其装载到慢病毒载体上检测其表达，并进一步研究在动物 模型上的功能。