（食品科学专业论文）POD和PG酶在高压脉冲电场中失活动力学研究.pdf

福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 辟在高压脉冲电场中失活动力擘研究 摘要 非热食品加工技术因为能最大限度保持食品的天然风味，正受到越来越多的 关注，而其中最具发展前景的高压脉冲技术也成为研究的热点之一。 在食品加工中通常用热处理来钝化食品中的酶活，近几年来，高压脉冲电场 ( p e f ) 作为在钝化酶活方面具有潜力的非热加工技术引起人们的普遍关注。 本研究使用大连理工大学设计的高压脉冲系统，选取辣根过氧化物酶( p o d ) 及聚半乳糖醛酸酶( p g ) 这两种热稳定性较高的酶为目标酶，水和醋酸缓冲液 为介质，高压脉冲电场对其活力的影响，探讨p e f 电场强度、作用时间与p o d 、 p g 酶活力变化的关系，并建立数学模型。 l 、首先进行p e f 技术的非热力处理验证，试验结果表明，在流速l o m l m i n ， 场强达到2 0 k v e m ，脉冲频率1 2 8 h z ，脉冲宽度为1 7 | _ t s 的脉冲条件下物料的温 升为3 0 ，证明本套装置的高压脉冲电场处理过程为非热力处理。 2 、p e f 处理可以钝化p o d 活力：方波条件下，脉冲宽度为1 7 胪，p e f 电 场强度和脉冲数目均对p o d 酶失活有显著影响( p 0 0 1 ) ，随脉冲电场强度( 1 0 k v e m 2 0k v c m ) 的增强和p e f 作用时间的增加，p o d 酶活钝化效果都增强， 当2 0 k v e m ，8 0 个脉冲数时，水( p h = 6 4 ) 中的p o d 酶失活达到最大。其残余 相对活力降低到1 9 8 12 0 k v e m ，1 1 0 个脉冲数，缓冲溶液( p h = 5 6 ) 中p o d 的残余相对活力降低到3 5 。 3 、p e f 处理可以钝化p g 活力：方波条件下，脉冲宽度为1 7 1 a s ，p e f 电场 强度和脉冲数目均对p g 酶失活有显著影响( p o 0 1 ) ，随脉冲电场强度( 1 0 k v e m 2 0k v c m ) 的增强和p e f 作用时间的增加，p g 酶活钝化效果都增强， 当2 0 k v e m ，2 7 0 个脉冲数时，水( p h = 5 9 ) 中的p g 酶失活达到最大，其残余 相对活力降低到o 1 4 ；2 0 k v e m ，1 1 0 个脉冲数，缓冲溶液( p h = 4 0 ) 中p g 活 力下降到3 1 2 。 4 、一级动力学方程剐= 矿4 ，能够描述p e f 作用时间与p o d 、p g 酶失 活的关系，相关系数r 2 分别大于o 9 8 和o 9 3 存在有临界场强e c ，p o d 在水溶液中的e c 为o 0 l 蛀0 0 0 3 5k v e m ，在缓冲 溶液中的e c 为1 0 1 9 + 0 3 4 k v e m ：水溶液p g 的临界场强e c 为9 1 1 士- 0 2 4 k v e m ， 福建农肄大学硕士学位论文 p o d 和p g 酶在高压臃冲电场中失活动力学研究 缓冲液中p g 的临界场强e c 为1 0 0 5 士o 4 6k v c m 。 5 、p e f 电场强度e 与方程j 谢= e - k 4 中常数k e 的关系，可用指数方程表 达，即k e = k 。i 。e 【。5 一”，拟合所得的r 2 均大于0 9 8 。 6 、方程r a = e 一置c 【川1 ，可用于描述p e f 电场强度和作用时 间两个因素共同作用下，p o d 、p g 酶失活的情况。 7 、p e f 处理可以降低胡萝卜汁中p o d 酶活力，电场强度为1 2 5 k v c m ，脉 冲数为2 0 个时，p o d 活力下降到8 5 2 4 。 关键词：高压脉冲电场( p e f ) ，辣根过氧化物酶，聚半乳糖醛酸酶，失活动力 学 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 酶在高压脉冲电场中失活动力擘研究 a b s t r a c t p u l s e de l e t r i cf i e l d s ( p e f ) i so b eo f t h em o s tp r o m i s i n gt e c h n o l o g i e si nt h ef i e l d o f n o n - t h e r m a lf o o dp r o c e s s i n g , w h i c hc a nm a i n t a i nt h eo r i g i n a iq u a l i t yo f t h ef o o di n ag r e a td e g r e e i nr e s p e c to ft h el l s eo fp e fa sp r e s e r v a t i o nt e c h n o l o g y , i t si m p a c t0 1 1f o o d q u a l i t yd e g r a d i n ge b z y m e si so f p a r t i c u l a ri n t e r e s t p e f1 陀a t m e n tw a sp e r f o r m e du s i n gal a b o r a t o r ys c a l ep u l s eg e n e r a t o rs y s t e m ( d e s i g n e db yd a l i a nu n i v e r s i t yo ft e c h n o l o g y ) t h er e l a t i v er e s i d u a la c t i v i t i e so f c o m m e r c i a le n z y m c so fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( p o d ) a n dp o l y g a l a c t u r o n a s e ( p g ) w h i c ha r et h e r m a lr e s i s t a n c ew c r ei n v e s t i g a t e dw i 也p e ft r e a m l e n t si nw a 舡才a n d n a - a c e t a t eb u f f e r ss o l u t i o nr e s p e c t i v e l y t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np e fe l e c t r i c i n t e n s i t i e s t r e a t m e n t st i m ea n dt h er e l a t i v er e s i d u a la c t i v i t i e so fp o da n dp gw e 坞 d i s c u s s e dr e s p e e d v e l y , t h e nt h em a t h m e t i c a lm o d e l s ，e 他b u i l t 1 t h i s p a p e r c o n f i r m e dp e f b e l o n g i n g t on o n - t h e r m a l c a t e g o r y o f p a s t e u r i z a t i o nw i t h o u tt h e r m a le f f e c t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tu n d e rt h es t r o n g e s t p r o c e s s i n gc o n d i t i o ni nt h ee x p e r i m e n t s ，t h er a n g eo fe l e v a t e dt e m p e r a t u r ew a sl e s s t h a n3 0 w h i c hm e a r lt h a tp e fi sn o n - t h e r m a lt e c h n o l o g y 2 t h ea c t i v i t i e so fp o dw a si n h i b i t e di m m e d i a t e l yw i t l lp e fi r e a r n e n t ：t h e p a r a m e t e r si nt h ee x p e r i m e n ti n c l u d e ds q u a r ew a v ep u l s e so f17 1 a s ，d i f f e r e n c e si n e l e c t r i cf i e l ds t r e n g t h0 0k v c m 2 0k v e m ) a n dn u m b e r so f p u l s e s ( u pt ol l o ) t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n a c t i v a t i o no fp o dw a ss i g n i f i c a n t l y ( p 0 9 8 r 铷9 3 r e s p e c t i v e l y t h ec r i t i c a le l e c t r i cs t e n g t h ( e c ) o fp o di nw a t e ra n dn a - a c e t a t eb u f f e rs o l u t i o n s a 聆0 0 1 9 - 1 - 0 0 0 3 5k v c ma n d1 0 1 9 + 0 3 4k v c m , r e s p e c t i v e l y a n de co f p oi nw a t e t i s 9 1 1 土0 2 4 k v c r a , a n d1 0 0 5 - 1 - 0 4 6 k v e m i t s w h e ns o l u t e d i n n a - a c e t a t e b u f f e l 5 t h er e l a t i o n s h i po f e l e c t r i cs u e n g t 6 ( e ) a n dc o n s t a n tk ec o u l db ed e s c r i b e db y t h ek e = k 。i e 【。5 一圳姐d 也e l 阳9 8 6 t h ek i n e t i cm o d e lo fi n h i b i t i o no fp o da n dp o a c t i v i t i e sa f t e rp e ft r e a l m e n t 咄s t u d i e d , r a = p 坼e 【1 “叽，删c h i m yd e 刚b e t h ec h a n g e s 。f p o d a n dp gr e l a t i v ea c t i v i t i e sw i t ht h ec o e x i s t e n c eo fp e f e l e c 仃i cs 帆唧a n dt r e a t m e n t t i m e 7 p e ft r e a t m e n t 啪d e c r e a s et h ep o d a c t i v i t yi nc a r r o tj u i c e ，t h er e s i d u a l r e l a t i v ea c t i v i t yi sd o w nt o8 5 2 4 w h e ne l e c t r i cf i e l ds t r e n g t ha n dn u m b e r so f p u l s e s a l e1 2 5 k v e ma n d2 0 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s ( p e f ) ；h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( p o d ) ； p o l y g a l a c t u r o n a s e ( p g ) ； i n a c t i v a t i o nk i n e t i c s i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名珊、宦 醐：矽7 ，乡 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或 部分内容可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 保密，在年后解密可适用本授权书 口 不保密，本论文属于不保密 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 指导教师亲笔签名： 伤、宜 脚从 l 1 九 、 气 刚叩 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p o 酶在高压脉冲电场中失活动力擘研究 第一章绪论 近年来，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，食品的健康要素与最 少加工量食品( m i n i m a l l yp r o c e s s e df o o d s ，m p f ) 理念愈来愈受到人们的重视， 要求食品加工者不仅要保证食品的安全性和稳定性，而且还要尽量保持其原有营 养成分和新鲜度【l 】。传统的使食品中酶失活的方法是热处理，热处理的温度因所 含酶的不同而不同，但大都是在6 0 9 0 的高温短时( h t s t ) 或是超高温短时 ( 唧) 灭酶的方法。这种方法的优点是灭活效果好，但是高温处理大大损害 了食品原有的风味，品质以及营养素等【2 】。非热力加工技术可以最大限度地保留 食品原有的生鲜风味和营养，因此成为当前食品加工新技术研究与开发的热点。 研究证明高压脉冲电场( p u l s e de l e c t r i cf i e l d s ，p e f ) 能够很好得杀灭牛奶、果 汁等液体食品中的微生物【3 】，与大量的p e f 破坏微生物组织的研究相比，p e f 在抑制酶活力方面的报道相对较少，相关的研究如下。 1 脉冲电场处理酶的研究进程 早在1 9 6 7 年e a r l i e r ，g - i l l i l a n d 和s p e c k 开始了使用电击使酶失活的方法 4 1 ， 其研究采用的电压为1 5 k v ，电极距离为1 6 m m 6 4 m m ，失活的酶包括乳酸脱 氢酶、胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌中的蛋白酶。这种方法和脉冲电场灭酶的方法不 一样，电解液在放电过程中电极的铜端会释放一些毒素。而脉冲电场在对微生物 失活的同时仅会少量地增加食品的温度，从而不影响食品的品质和风味由于反 应在瞬间进行，也不会发生电化学反应。因此这种技术对酶的活性影响也广泛受 到研究者的注意。 c a s t r o 等( 1 9 9 4 ) 在2 2 k v e m 的场强下，脉宽为o 7m s 0 $ m s ，2 0 个脉冲 处理使碱性磷酸酶失活达到4 4 【钉。 1 9 9 5 年，v c g a - m e r c a d o ，p o w e r s ，s w a n s o n 和b a r b o s a - c a n o v a s 研究了脉冲 电场对模拟牛奶( s u m f ，p h 6 1 1 ，o 0 5 6 m o l l ) 中血浆酶( 碱性蛋白酶，牛奶 中的原始酶) 活性的影响【叫，初始含量为1 0 0 i j t g 血浆酶m l 。由不锈钢平行平板 电极( 电极距离= 0 6c m ) 组成的连续处理室装置，可提供1 0 5 0 个2 p s 的脉冲。 电场强度在1 5 k v c m 4 5 k v e m 范围内变化，频率为0 1h z ，1 5 m l 的s u m f 以 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 辞在高压脉冲电场中失活动力学研究 4 5m 】m i n 的流速在一个密闭的循环系统中流通。操作温度为1 0 1 5 ，温度 由热电偶热交换器所测得。在1 5 ，3 0 k v c m 和4 5 k v c m 的条件下经5 0 个脉冲 作用后血浆酶的活性减少了9 0 ，效果与经4 0 ( 2 ，1 5 r a i n 的处理相同。变量分 析证明脉冲数目、电场和温度与血浆酶的失活有显著的关系达9 9 的自信区 间。 同年，该小组又采用p e f 处理了分别置于三种不同介质中的荧光假单胞菌 蛋白酶( v e g a - m e r c a d o ，p o w e r s ，b a r b o s a - c a n o v a 。s w a n s o n 和l u e d e c k e ，1 9 9 5 年；v e g a - m e r c a d o ，p o w e r s ，m a r t i n - b e l l o s o ，l u e d e c k e ，b a r b o s a - c a n o v a 和s w a n s o n ， 1 9 9 7 年) 1 7 , 引。一个连续式的处理室( v = 2 8 5 c m 3 。电极距离= o 6 c m ) 与蠕动泵相 连，溶液流速为0 5 l r a i n 。结果表明蛋白酶的失活与电场强度、脉冲数目和底物 有关：t s b 酵母抽提液中，在场强为1 8 k v c m ，脉宽为2 “s ，频率为0 2 5 i - i z 条件下 处理2 0 个脉冲，蛋白酶活力减少t s o ； 率、脉冲数分别为1 4k 、，c m 和1 5 k v c m ， 脱脂牛奶中，在脉宽为2 p a ，场强、频 1 h z 和2h z ，3 2 和9 8 次的情况下，其活 性各自降低了4 0 和6 0 ，然而，在2 5 k v c m0 6 h z 的条件下其水解蛋白的活性 提高；在酪蛋白缓冲溶液中蛋白酶的活性没有发生变化，这被认为是在p e f 处理 时酪蛋白保护了蛋白酶，酪蛋白和蛋白酶之阅可能形成了比单独的蛋白酶更加稳 定构象，防止了酶结构的展开。这些资料表明在应用p e f 处理的过程中环境条件 对酶的稳定性有着潜在的影响，所以在真正的食品中研究酶的活性是十分重要 的。 1 9 9 7 年，h o , m i t t a j 和c r o s s 研究了在水溶液中p e f 对几种酶的活性影响即 所使用的为指数衰减波，瞬间往复充电，场强1 3 k v c m 8 7 k v c m 之间，波宽为 2 1 x s ，频率为0 5h z ，由平行不锈钢电极组成的静态处理室( 容积= 4 9 5 c m 3 ，两 极距离= 0 3 c m ) ，酶溶液电导率在0 4 m s c m i m s c m 之间。初始温度为2 0 。 经p e f 处理后温度和p h 基本没有发生改变。 结果表明，除了溶菌酶和胃蛋白酶，其他酶的活性都是随着场强的增大而下 降，每种酶的活性变化各不相同。溶解在1 m o l l 乙醇胺+ 0 5 m m o l lm g c l 2 缓 冲溶液( p 8 9 8 ) 中的牛奶碱性磷酸酶，4 0 k v c m ，6 0 k v c m 和8 0 k v c m 的场强 条件，3 0 个脉冲，只有5 的失活率。大豆中提取的过氧化物酶在磷酸缓冲液 2 福建农# 大学硕士学位论文p o d 争p g 酶在高压脉冲电场中失活萄力擘研究 ( p h 6 ) 中，在不同场强中，分别用3 0 和1 0 0 个脉冲处理，发现场强对酶活力 有显著影响，而脉冲数的影响不明显只有5 显著性水平。当场强为7 3k v l c m ， 用1 0 0 个脉冲处理时，过氧化物酶活力降了3 0 。蘑菇中的多酚氧化酶，置于 磷酸缓冲液中( p h 6 5 ) ，分别在2 0k v c m ，5 0k v c m 和8 0k v c m 场强下，用 3 0 个指数衰减波( 瞬间往复充电) 进行处。当场强为8 0k v c m 时，失活率为4 0 。 麦芽中的脂肪酶溶解在去离子水中，用8 7 k v c m 场强，3 0 个脉冲处理失活8 5 。 将黑曲霉中提取的葡萄糖氧化酶置于5 0 m m o l l 醋酸钠缓冲溶液( p h 5 1 ) 中， 场强在1 7k v c m 6 3k v c m3 0 个脉冲处理，酶活力随着场强的增大而减小，当 场强大于5 0k v c m 时，酶活力就不随场强变化。5 0k v c m ，3 0 个脉冲处理后， 酶失活7 5 。地衣芽孢杆菌中的o 淀粉酶溶解于去离子水中，2 0k v c m 8 0 k v c m3 0 个脉冲处理，同样酶活力随着场强的增大而减小，场强8 0k v c m 时， 酶失活8 5 。 对于溶菌酶和胃蛋白酶来说，p e f ( 场强1 3k v c m 8 0k v e m 脉冲数3 0 ) 场强的增大似乎能够刺激其活性。在1 3 5 k v c m 时，其失活为6 0 ，当场强增 大到5 0k v c m 时，其失活仅为2 0 ，场强大于5 0 k v e m 时，进一步增大场强导 致降低残留溶菌酶活力。p e f 使胃蛋白酶的活性增大，当场强为4 0 k v e m 时， 其活性最大，是原来的2 6 0 。 g i n e r 与他的小组( g i n e r ，g i m e n o ，o r t e g a , b a r b o s a - c a n o v a s 和m a r t i n - b e l l o s o ， 1 9 9 9 ；g i n e r ，c d m e n o ，r o s e l l ，b a r b o s a - c a n o v a s 和m a r t i n - b e l l o s o ，1 9 9 9 ：g i n e r , r a u r e t - a r i n o ，b a r b o s a - c a n o v a s 和m a r t i n b e h o s o ，1 9 9 7 ) 研究了p e f 对苹果、桃子 和梨中的多酚氧化酶( p p o ) 的影响。场强2 4 k v e m ，波宽2 0 p , s ，经过3 0 0 个双 极指数衰减波处理，苹果p p o 的活性降低t 9 7 ，增加场强或脉冲数，失活程度 提耐1 0 】；场强2 4 k v c m 下，双极指数衰减波处理，桃子中的p p o 活性最多降低7 0 1 1 1 。在恒定的场强条件下，桃子p p o 的失活与总处理时间呈一级动力学模型关系。 场强2 2 3 k v c r n ，3 0 0 次脉冲可使梨中的p p o 最大限度的失活，达6 2 ，其失活与 总处理时间呈零级动力学模型关系 1 2 1 。 1 9 9 9 年，y e o m ，z h a n g 和d u n n e 研究了在方波( e = 2 0 k v c m 5 0 k v c m ， r - - - - 4 p s ， n = 2 0 0 5 0 0 ，f = - 1 5 0 0h z ) 条件下木瓜蛋白酶的活性【1 3 】1 5 0 m l 的酶溶液以 福建农林大学硕士学位论文p o d 和l o 辞在高压脉冲电场中失活动力学研完 0 7 7 m l s 的速度通过4 个共场流管处理室( 处理室之间的冷却介质控制在1 0 c ) 。 在p e f 处理期间，温度不超过3 5 。处理后立即检测木瓜蛋白酶的活性，发现p e f 对其活性并没有影响，然而，将处理过的木瓜蛋白酶溶液4 放置2 4 h r 4 8 h r ， 木瓜蛋白酶发生了明显的不可逆的变化。2 0 k v c m 5 0 k v c m 的场强，经5 0 0 个脉 冲数处理的木瓜蛋白酶溶液在4 放置2 4 h r ，其活性降低了8 5 。y o e m 等人认为 木瓜蛋白酶失活的主要原因并不是酶活性部位( 半胱氨酸残基) 的氧化，而是在 p e f 条件下所引起的木瓜蛋白酶的m 螺旋结构的丧失。 2 0 0 0 年，y o e m ，s t e a k e r ，z h a n g 和m i l l 在研究p e f 对橙汁品质影响的过程 中，研究了p e f 对果胶甲酯酶活力的影响1 1 4 。p e f 设备是由几个共场流管不锈 钢处理室( 截面直径= 0 6 3 5 c m ，电极距离= i c m ) 组成，桔汁流速为9 8 l h r 。波 宽1 4 p s ，场强3 5 k v e m ，频率6 0 0 h z ，总处理时间5 9 p s ，处理前温度2 4 ，处 理后温度6 0 ，酶活力发生了不可逆的降低为8 8 。 2 0 0 4 年，y a n g ，l i 和z h a a g 进行了p e f 使胃蛋白酶失活的研究1 1 5 1 。胃蛋白 酶溶液通过6 个共场流管处理室。酶的失活与电场强度、溶液电导率、p h 值有 关，并与电场强度呈一级方程式关系。在3 4 2k v e m 场强下，以7 5 m m o l l 盐 酸( p h 2 0 ) 为介质，胃蛋白酶一级活力学失活常数为0 0 1 21 m s 在p e f 处理 时酶发生凝聚，但酶的失活早于凝聚。圆形二色性法分析表明该酶的失活与其b - 折叠结构的破坏有关，在2 1 5 r i m 处，经p e f 处理的酶的相对残留活性与相对摩 尔圆周率有关。由p e f 和热力引起的酶的失活都与其二级结构的改变有关。 2 0 0 5 年，钟葵，胡小松，廖小军等人，研究了p e f 对辣根过氧化物酶及果 胶酶的结构及活性的影响【1 6 1 9 。结果表明p e f 可钝化这两种酶的活性。辣根过 氧化物酶在2 5k v c m 、2 0 7 次脉冲时，活性降低1 6 7 ；2 2k v c m 、1 2 1 4 次脉 冲，为3 4 7 ，处理其间溶液温度不高于4 0 。4 c 放置2 4 h r 4 8 h r ，活性有缓 慢下降。经圆形二色性法和荧光光谱法分析，该酶的a 螺旋结构下降了3 5 1 ( 1 0 0 c 加热5 m i n 丧失5 7 7 ) ，相对荧光强度有所上升。p e f 使该酶失活与m 螺旋构象的改变和相对荧光强度上升有关果胶酶在2 5k v e m 、1 4 4 9 次脉冲时， 活性最高降低了6 5 3 。活性变化与p e f 电场强度和脉冲之间存在良好的线性 相关。r 2 分别达到0 9 8 8 和0 9 5 3 。p e f 处理( 6 2 1 ) 次脉冲后果胶酶的荧光强度 4 强建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 蚌在高压脉冲电场中失活动力学研究 增加，整体变化趋势是随电场强度增强荧光强度先增加后下降，但荧光强度值都 低于热处理( 1 0 0 ，5 r a i n ) 后酶蛋白的荧光强度值。说明p e f 可以有效钝化果 胶酶的活性，并且改变其构象。 纵观历年来的研究发现，酶对p e f 的抗性比微生物对p e f 的抗性要强，这 就使脉冲电场对酶处理的操作强度比微生物高一些【捌。另外脉冲电场对酶的影 响不是一成不变的，可能会有影响，也可能没有影响，即使有影响也不一定就有 失活，也可能是增活。这主要是因为脉冲电场对酶的作用受诸多因素的影响，比 如操作参数、介质条件以及酶本身的条件等【2 1 1 。 表1 1 中列举了几种酶在p e f 作用下的活性变化阎。 表l lp e f 处理对各种酶的影响 t a b l 一1l i t e r a t u r er e v i e w0 1 1t h ee f f e c t so f p u l s e de l e c t r i cf i e l d s0 1 1e n z y e m s 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 砖在高压脉冲电场中失活动力学研究 注：e 一电场强度；f = 脉冲宽度：脉冲数目；产脉冲频率。 2 影响p e f 处理酶活力的因素 2 1 操作参数对酶活力的影响 影响酶活力的因素主要与脉冲电场操作参数有关，如电场强度、脉冲持续时 间、脉冲数目和脉冲波形，它们是决定酶灭活效果的主要因素。 c a s t r o 等( 1 9 9 4 ) 在2 2 k v c m 的场强下，脉宽为o 7m s 0 8 m s ，2 0 个脉冲 6 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 酶在高压脉冲电场中失活动力学研究 处理使碱性磷酸酶失活达到4 4 ，而h o 使用2 i t s 脉宽的电脉冲处理仅使碱性磷 酸酶失活5 。经过比较，h o 等认为对酶的活性减少来说，脉宽和脉冲波形可 能比电场强度更有影响力，其中又以方波的钝化酶效果最好。他们认为脉冲电场 强度增加了脂疏水区域在磷酸酶的易接近处，从而不会导致蛋白质水解。 v e g a - m e r c a d o 等( 1 9 9 5 ) 于1 5 c 的操作温度下，3 0 k v c m 和4 5 k v c m 的 条件下经5 0 个脉冲作用后血浆酶的活性减少了9 0 。酶的活性与电场强度与脉 冲数目有关。在8 0 k v c m 和8 8 k v c m 的场强下3 0 个脉冲可分别使2 0 c 的小淀 粉酶有脂肪酶失活9 0 。若其他条件不变，减少脉冲数则失活也有所降低。 2 2 酶的类型对酶失活的影响 酶的失活程度与酶的类型也有关。不同酶的最佳失活条件不一样，不同酶的 变性程度也不一样。根据1 9 9 7 年，h o ，m i t t a l 和c r o s s 研究了在水溶液中p e f 对几 种酶的活性影响的试验中可以看出，同样的处理室装置，同样的电场参数和处理 条件，脂肪酶、葡萄糖氧化酶和热稳定的a 淀粉酶活力减少比较大，可以达到 7 0 8 5 的范围；过氧化物酶和多酚氧化酶的活性减少3 0 4 0 ；而碱性磷酸 酶只减少了5 。溶菌酶和胃蛋白酶的活性反而有所增加唧。 这可能与酶的内部结构有关。不同的酶其活性间位和结构都不同，从而使得 在相同操作条件和介质条件下酶的失活程度也不一样吲 2 3 其他因素对酶失活的影响 p h 、温度、含酶介质和食品组成情况等对脉冲电场灭酶的影响还有待进一步 研究。 2 3 1p h 对酶失活的影响 在p e f 处理过程中，有人研究y p h 对多酚氧化酶( p p o ) 和过氧化物酶( p o d ) 稳定性的影响。p h 范围设置在4 7 ，电场强度设置在2k v c m 3 1k v c m ，脉宽 为4 p s 4 0 t t s ，脉冲数为1 0 1 0 0 0 。实验表明，经p e f 处理后，介质的p h 并没有 影响p p 0 的稳定性，处理前后的p h 也没有发生变化瞰2 5 】而对- 于p o d 来说，p h 由7 减少到4 时会减少其稳定性陶；无论电场强强度值是多少，在频率为l h z 的条 件下，脉宽为l g s 的1 0 0 0 个脉冲处理可使p o d 达到6 0 的最大失活。处理后，室 7 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 酶在高压脉冲电场中失活动力学研完 温保藏2 虹后发现p o d 的活性继续减少，降低量是剩余活性的1 0 。 2 3 2 含酶介质对酶失活的影响 也有一些实验研究了蛋白质含量，介质电导率的变化和每处脉冲所含有的能 量对脂肪氧化酶( l o x ) 、p p o 和p o d 的活性影响。将p p o 和p o d 溶解在蒸馏 水中，浓度为1m g m l 5 m g m l ( 电导率为l o “砒m 9 0 p 咖m ) 。对于l o x ，p e f 处理条件为：酶的浓度l o m g m l ，室温下产生的电导率为1 0 7 m s e r a ，1 0 0 个脉 冲处量，脉冲宽度为5 p s 和4 0 p s ，频率为i h z ，电场强度为1 0k v e m 和2 0k v c m 。 研究发现，在酶的浓度范围办内蛋白质的含量对酶的稳定性没有很大的影响， p e f 处理后活性的量大减少量为1 0 ，当酶及底物同时存在时，会增加酶对电 脉冲的抵抗力【2 7 】。 蛋白质含量恒定的情况下，将介质的电导率从1m s e m 增加到4m s c m ；在 脉宽为1 雌，场强为2 0k v e m 时，将脉冲能量密度从3 s o j , m 增加到8 5 0 j k g ； 在脉宽为4 0 p s 、场强为8k v e m 时，将脉冲能量密度从1 6 0 0m c ( g 增加到3 9 5 0 j k g 。对p o d 和p p o 来说，介质的电导率并没有影响酶对p e f 的稳定性，酶活 力的最大减少量也只在15 2 1 1 。 1 9 9 4 年，c a s t r o ，s w a n s o n , b a r b o 鞠- c a n o v a s 和m e y e r 研究了在鲜牛奶，全脂 奶和脱脂奶中，p e f 对碱性磷酸酶的活性影响【5 1 。2 2 1 2 条件下，1 8 8 k v c m 的场强， 脉宽为4 0 0 p s ，2 0 个脉冲处理碱性磷酸酶的失活分别为6 0 ，2 和6 5 ( b a r b o s a - c a n o v a s 等，1 9 9 8 勰捌) 。 2 0 0 2 年，v a n , v e r a c h t e r t 和h c n d r i e k x 研究p e f 对几种不同来源的l o x 、 p p o 、果胶甲酯酶( p m 巳) 、p o d 、a p 和乳过氧化物酶在不同介质条件下活性的 影响鲫。首先，以去离子水作为介质，几种酶的活性不受p e f 影响。由于这种 在去离子水条件下的耐p e f 的稳定性，所以通过改变介质p h 值、蛋白质含量和 电导率来提高酶对p e f 的敏感性，然而这几种改变并没有降低酶的耐p e f 的稳 定性。然后，以较为复杂的液体奶或果蔬汁为介质，发现酶明显失活，但这是由 于p e f 产生的温升而引起酶的失活，属于热力致死。 有研究表明，温度对p e f 的灭酶活影响也很大，建议在操作过程中适量增 加样品的温度，可提高酶的失活效果。但是，温度增加有可过高，否则，酶失活 8 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 肆在高压脉冲电场中失活动力学研完 的主要因素是热处理而不是电场处理了。 3 酶失活动力学研究进程 目前，关于p e f 对微生物的影响比对酶的影响要多很多，特别是关于微生 物的杀灭效果及其动学机制的报道较多。微生物的p e f 破坏机制与传统的一级 动力学机制接近【3 0 1 。h t t l s h e g e r , p o t c l 和n i e m a n n ( 1 9 8 3 ) 1 3 1 】及p e l e g ( 1 9 9 5 ) 1 3 2 】曾 对介绍了p e f 对微生物失活的动力学机制。 g i n e r - s e g u i ( 1 9 9 7 ) 在p e f 条件下，使苹果中抽得出来的多酚氧化酶，活性最 大减少到9 7 ，并首次提议用一级方程来描述失活的动力学。 r a = 弛e - r x - ” ( 1 - 1 ) r a 为残留酶的活性( ) ，n 为脉冲数，k e l 为一级动力学常数，r a o 为曲 线的截距 r a = 见如口。“- 4 ( 1 - 2 ) r a 为残留酶的活性( ) ，e 为电场强度，k n i 为指数因素常数，r a o 为曲 线的截距。 h t l l s h e g e r s 方程首次用于描述p e f 下微生物的破坏，修正后的h ( 1 l s h e g e r s 方程可用于酶活力的抑制。 脚1 0 0 ( 是) 帆班 ( 1 - 3 ) r a 为残留酶的活性( ) ，n 为脉冲数，n c 为r a 等于1 0 0 时的n 值的外 推临界值，e 为电场强度( k v c m ) ，e c 为r a 等于1 0 0 时e 值的外推临界值， k 为指数因素常数。 关于用f e r m i s 方程描述酶在p e f 下的抑制报道在2 0 0 0 年之前还没有发现。 仅p e l e g ( 1 9 9 5 ) 用这个方程表现了微生物在p e f 作用下的存活情况。g i n e r 及其他 人( 2 0 0 0 ) 在2 4k v e m 的p e f ( 指数衰减波) 处理下使番茄中提果胶甲酯酶的活 性减少9 4 3 3 1 。将p e f 处理后的p m e 失活数据用一级动力学、h f l l s h e g e r s 动 力学、f e r m i s 动力学方程对比，结果表明，这些模式与试验数据非常吻合。 r a = 瓦等而 ( 1 - 4 ) l + 口”，。 9 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 鳞在斋压脓冲电场申失活动力擘研究 r a 为残留酶的活性( ) ，e 为电场强度( k v c m ) ，e h 为r a 5 0 时e 值 时临界值，a 为e h 曲线斜度的参数( e m ，k v ) 。 根据前人的研究，经典的指数衰减方程、修饰h o l s h e g e r s 方程、f e r m i s 方 程都可以描述p e f 作用下酶失活动力学。通过r a 与e ( 脉冲数恒定) 或与n ( 电场强度恒定) 的关系确定可对电场参数作更一步进的优化，有助于工业化利 用，这些研究为我们的研究在方波条件下过氧化物酶、聚半乳糖醛酸酶失活动力 学，提供了很好的参考和依据。 4 本研究的立题背景、意义及研究内容 4 1 本研究的背景及意义 目前，复合果蔬汁饮料的已成为市场一个新的消费热点，胡萝卜蕃茄复合 果汁以其富含胡萝卜素和维生素c i 州，正愈来愈受到人们的欢迎。然而在胡萝 卜蕃茄复合果汁加工过程中，胡萝卜中的过氧化物酶和蓍茄中的聚半乳糖醛酸 酶是加工中所要钝化的两种酶，否则将严重影响果汁的品质【3 5 】。而这两种酶的 热稳定性相对较高，传统高温钝化势必会对果汁当中的其他营养成分，如胡萝h 素、维生素b l 、b 2 及维生素c 等，造成破坏。 过氧化物酶( i ) e r o x i d a s e ，e c1 i i 1 7 简称p o d ) 是果蔬中常见的一种酶，在 果蔬的加工和保藏中主要存在两方面的影响：过氧化物酶的活力与果蔬产品， 特别是那些非酸性蔬菜，在保藏期间形成的不良风味有关；过氧化物酶属于最 耐热的酶类，它在果蔬加工中常被用作热处理是否充分的指标。只有在充分热烫 使过氧化物酶基本失活的情况下，食品才能在长期保藏中保持良好的质量。因此， 过氧化物酶的失活程度是果蔬产品的一个主要指标【姗。 聚半乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t t t r o n a s e ，e c 3 2 1 1 5 ，简称p g 或e n d o p o ) 是可 分解果胶或果胶酸的酶类( p e c t i n o l y t i c c l l z y m e ) 中的一种，p g 在蕃茄的成熟、采 后贮藏、j j 口- r 和零售都起了重要的作用口7 1 。 本研究是在方波条件下，结合p e f 电场强度和脉冲数目，研究在p e f 条件 下溶液中的过氧化物酶和聚半乳糖醛酸酶活力的变化情况，建立p e f 电场强度 及处理时间与酶失活的动力学方程，希望能为研究p e f 钝化胡萝h - 蓍茄复合果 汁中的过氧化物酶和聚半乳糖醛酸酶做些基础性工作。 1 0 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 薜在高压脉冲电场中失活动力学研究 4 2 研究内容 本研究是选用辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，p o d ) 及聚半乳糖 醛酸酶( p e c t i n a s ef x o ma s p e r g i l l u sn i g e r ，p g ) 制剂稀释液为作用对象，探讨在 不同介质条件下高压脉冲( p e f ) 导致酶活力变化，并与温度致以上两种酶失活 作对比，研究了p e f 操作参数对酶活力变化的影响，通过p e f 操作参数与酶活力 变化的分析，建立在相对应介质条件下p e f 与酶活力变化的数学模型。具体方案 如下所示： 4 2 1 研究在相应介质条件下，热力高温对过氧化物酶、聚半乳糖醛酸酶活力的 影响； 4 2 2 研究在p e f ( 方波) 条件下，以水、缓冲溶液为介质，电场强度和脉冲数 目对过氧化物酶活力的影响； 4 2 3 研究在p e f ( 方波) 条件下，以水、缓冲溶液为介质，电场强度和脉冲数 目对过聚半乳糖醛酸酶活力的影响； 4 2 4 建立p e f 电场强度和脉冲数目与过氧化物酶、聚半乳糖醛酸酶活力变化的 数学模型； 4 2 5p f e ( 方波) 处理鲜榨胡萝卜汁，其中p o d 活力变化初试验。 福建农林大学硕士学位论文p o d 和p g 酶在高压脉冲电场中失活动力学研究 第二章高压