（食品科学专业论文）乳源酪蛋白糖巨肽的分离与纯化研究.pdf

中文摘要 酪蛋白糖巨肽( c a s e i ng l y c o m a o m p e p t i d e ，英文缩写c g m p ) 是一种具有生物活性的高纯度 乳清蛋白。它是与乳过氧化物酶、乳铁蛋白及蛋白水解酶、胨等共存于乳清中的微量蛋白质。 酪蛋白糖巨肽是在干酪生产过程中，凝乳酶分解乳中 酪蛋白后释放的一种c 末端亲水性糖 肽。干酪乳清是酪蛋白糖巨肽工业化生产的理想原料，但由于乳糖、乳清蛋白及灰分的存在 而使其大规模生产存在一定的技术困难。基于酪蛋白糖巨肽耐热性及其聚合体与单体分子量 的不同，改进分离方法旨在保证大规模生产的产量与较高的纯度。 本实验以市售乳清粉为原料，还原后采用超滤的方法分离制备酪蛋白糖巨肽，通过控制 超滤的温度、时间、压力等条件，得到最佳超溏控制参数。 酪蛋白糖巨肽同时也是一种具有多种营养及医疗功用的生物肽实验室通常用凝乳酶消 化n 酪蛋白去除n 酪蛋白片断以制各酪蛋白糖巨肽。酪蛋白糖巨肽用超滤和离子交换的方法 从酪蛋白酸盐水解液中分离出来已有报道，用凝胶色谱法分离的相应信息却很少。本实验采 用s e p h a d e x g 一1 0 0 凝胶对超滤后得到的酪蛋白糖巨肽混合物进行纯化，本实验对凝胶柱尺寸、 洗脱液、洗脱液流速等进行了研究，经后续鉴定，结果表明纯化效果明显。 最后用s d s 一尿素凝胶电泳和氮基酸分析仪对纯化后的酪蛋白糖巨肽分子量和含量进行 定量分析，结果表明，酪蛋白糖巨肽的平均分子量为3 1 6 3 7 ，和已报道的糖巨肽分子量3 2 0 0 0 相吻合；c g m p 占乳清蛋白总量的2 2 3 5 ；超滤法分离c g m p 效果较明显，c g m p 占超滤 冻干粉总蛋白含量的5 8 9 l ，冻干粉中c g m p 蛋白含量为乳清粉中c g m p 含量的2 6 倍。 s e p h a d e xg 一1 0 0 纯化c g m p 效果显著，但也有不足之处，经s e p h a d e xg 1 0 0 纯化的c g m p 并不是百分之百的纯物质，其中还含有一部分杂蛋白，肽，可能由于其分子量和分子空间结构 和c g m p 相近，凝胶层析和电泳的方法都没办法很好的分离，而凝胶扫描软件认为电泳图中 1 泳道和2 泳道只含有一种物质。因此，这也提示我们，对一种蛋白的分子量和含量进行测 定时，多种实验方法的测定可以提高测定的准确度和精确度，根据蛋白分子量，等电点，疏 水性，热稳定性不同等特点，选择多种分离、纯化方法，可以得到纯度较高的目的蛋白。 关键词酪蛋白糖巨肽；凝胶色谱：超滤； v 东北农业大学工学硕士学位论文 s t u d y0 nt h es e p a ra t l 0 na 全t d p l 吣f i c a t l 0 no fg l y c o m a c r o p e p t i d e d e r i v e df r o mm i l k a b s t r a c t c a s e i ng l y c o m a c r o p e p t i d e ( c g 如口) i sah i g h l yb i o l o g i c a l l ya c t i v ew h e yp r o t e i nw i t hs u p e n o r p u r i t y i ti s o n eo ft h ei m p o r t a n tm i n o rp r o t e i n s p r e s e n ti nw h e ya l o n gw i t hl a c t o p e r o x i d a s e ， l a c t o f e r r i na n dp r o t e a s ep e p t o n e s t h eg l y c o m a c r o p e p t i d e sa c t s 嬲ab i o l o g i c a lp e p t i d e w h i c hh a s s e v e r a ln u t r i t i o n a la n dm e d i c a lf u n c t i o n s p r e p a r a t i o no fg l y e o m a c r o p e p t i d e si nt h el a b o r a t o r yi s u s u a l l yc a r r i e do u tb yc h y m o s i nd i g e s t i o no fp u r e c - c na n dr e m o v a lo fp a r a - l c - c nf r o ms o d i u m c a s e i n a t e g l y c o m a c r o p e p t i d e sh a v e b e e ni s o l a t e df r o m c h y m o s i n h y d r o l y z e d c a s e i t a t eb y u l t r a f i l t r a t i o na n di o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h e r ei s ，h o w e v e r , l i m i t e di n f o r m a t i o na v a i l a b l e o nt h ep r e p a r a t i o no f t h i sg l y e o p e p t i d eb yg e lc h r o m a t o g r a p h y c h e e s ew h e yi sc o n s i d e r e dt ob et h e m o s ts u i t a b l es o u r c eo f g l y c o m a c r o p e p t i d e sf o ri n d u s t r i a lp u r p o s e s ，b u ti t sh i g hl a c t o s e ，p r o t e i na n d a s hc o n t e n tm a k e si tt e c h n i c a l l yd i f f i c u l tt oi s o l a t eg l y c o m a e r o p e p t i d e so nal a r g es c a l e o nt h e b a s i so f t h et h e r m o - r e s i s t a n c eo f g l y c o m a c r o p e p t i d e sa n dt h ed i f f e r e n c e si nm o l e c u l a r w e i g h to f i t s p o l y m e r i c a n dm o n o m o r i cf o r m s ，w eh a v em o d i f i e dad e v e l o p e dm e t h o do fi s o l a t i n g g l y c o m a c r o p e p t i d e sf o rt h ep u r p o s e so fl a r g e s e a l ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n ，i no r d e rt om a k ei t s t r a l g h t f o r w a r da n dm a i n t a i n i n gah i g hy i e l da n dp u r i t yi nt h eg l y c o m a c r o p e p t i d e sf r a c t i o n t h er e s e a r c hs e p a r a t e da n dp m p m dc g m pb yu l t r a f i l t r a t i o nf r o mc o m m e r c i a lw h e yp o w d e r t h eo p t i m u mp a r a m e t e ri n c l u d i n gu l t r a i i l t r a t i o nt e m p e r m u r e ，t i m e ，p r e s s u r ew a so b t a i n e d t h er e s e a r c hp 耐f i e dc g m pm i x t u r eb ys c p h a d e xg - 1 0 0 t h ei n f o r m a t i o na b o u tp u r i f y i n g c g m pb yg e l - c h r o m a t o g r a mw a sl i m i t e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a ti tg o to b v i o u sp u r i f y i n gr e s u l t t os e p a r a t ec g m p b ys e l e c t i n ga p p r o p r i a t ec o l u m ns i z e ，e l u e n t ，v e l o c i t yo f f l o w q u a n t i t a t i v ea n dq u a l i t a t i v ea n a l y s i sb yg e l - g e l a t i o na n da m i n oa c i da n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e a v e r a g em o l e c u l a ro fc g m pw a s31 6 3 7 ，a p p r o x i m a t e l yt o3 2 0 0 0w h i c hw a sr e p o r t e da c c o u n t i n g f o r2 2 3 5 o f w h e yp r o t e i na n du l t r a - f i l t r a t i o nc o u l do b t e i nc g m p , a e e o u t i n gf o r5 8 9 1 o f w h o l e p r o t e i n , w h i c hi s2 6h i g h e rt h a nw h e yp o w d e r s e p h a d e xg - 1 0 0a l s oh a dl i m i t e da p p l i c a t i o n ，s u c h a st h ep r o d u c t i o nw a sn o tp u r e ，b u to fm i x e dp r o t e i n p e p t i d e t h er e a s o nm a y b et h e i rm o l e c u l a r w e i g h ta n ds p a t i a ls l r u c t u r ew e r es i m i l a rt oc g m pw h i c hr e s u l t e di ng e l c h r o m a t o g r a ma n d e i e c t r o p h o r e s i sn o ts e p a r a t i n gt h e m ，b u tg e l - s c a n n i n gs o f t w a r ec o n s i d e r e dt h e mp u r e t h e s er e s u l t s c l u e do nu st h a tm u l t i m e t h o d sc o u l de n h a n c ev e m c i t yw h e nf o r e c a s t i n gm o l e c u l a rw e i g h ta n d c o n c e n t r a t i o no f ap r o t e i n v i i 英文摘要 k e yw o r d sc a s e i ng l y c o m a c r o p e p t i d e ；u l 把d i l t r a t i o n ；g e l c h r o m a t o g r a m v t i i p o s t g r a d u a t ec a n d i d a t e ：h a i t a on a m a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p m f y i n gm a 引言 1 前言 干酪是乳业发达国家的主要产品，据资料统计，2 0 0 3 年，欧盟和美国分别有6 5 2 和 5 1 的鲜牛奶用于制造干酪，加拿大为4 4 7 ，亚洲的日本也达到1 4 8 。中国干酪生产量、 消费量都很低，但为了满足国内外商务人员、旅游者以及国内部分消费者对于干酪产品的需 求，我国的干酪进口量也以每年1 5 的速度在增加，虽然是低基数上的高增长率，但袭明了 奶酪是一个大有前景的产品。再者，随着我国2 0 0 8 年奥运会、2 0 1 0 年世博会举办时间的| 临 近，干酪生产和供应的问题已是近在眼前。当年日本和韩国都通过举办奥运会积世博会，使 国内奶酪消费渐成时尚。日本在1 0 年问干酪产量增加8 倍，目前年产量已达1 2 3 万吨，人 均占有量为2 5 6 千克，而韩国经过1 6 年的努力，年产量增加1 4 5 倍，2 0 0 0 年达4 3 ，0 0 0 吨。 一般每生产l k g 千酪可得9 k g 乳清( 吴士业等，1 9 9 9 ) ，全世界每年约有1 4 5 亿吨的液体乳 清产生。中国是世界乳清产品的最大进口国，进口量超过8 万吨，其中6 0 用于仔猪饲料生 产，4 0 用于婴儿奶粉生产。目前已有很多企业、科研院校研制乳清饮料或将乳清用于制作 冰淇淋。中国在干酪发展过程中所面临的个很大的问题就是乳溥的剥用，这直接关系到千 酪的价格，另外，如何合理利用乳清中的营养成分，增加乳品企业的附加值，减少环境污染 成为乳晶加工领域面临的技术问题。 近几年，美国、法国、加拿大、澳大利亚、瑞士及前苏联等国家在乳清综合利用方面已 取得较大的发展。他们主要是将乳清加工成浓缩物、乳清粉、乳清膏、乳清蛋白浓缩物和乳 清蛋白粉等，供人们实用或禽畜饲用，这对于提高产品质量、降低成本、增加企业经济效益 及防止环境污染具有重要意义。但从量上讲，这只利用了其中- - , j , 部分。大部分乳清返回牧 场作饲料或被排放掉，这不仅浪费了营养资源，降低了企业的经济效益，而且由于乳清中乳 糖含量较高，消耗水中的溶解氧，所造成的环境污染比污泥要大得多。在我国，由于经济、 技术和饮食风俗等多方面的原因，干酪处于起步阶段，生产的厂家较少，产量低且品种少， 但仅北京华冠乳品公司和东直门乳品厂两家每年捧放的乳清就有2 万吨左右；1 9 9 4 年投产的 包头骑士乳品集团公司，设计能力为日处理鲜奶5 0 吨，年产各种干酪1 5 0 0 吨，重制千酪7 0 0 吨，同样每年排放乳清2 万吨左右，乳清的产量非常大( 张敬荣等，1 9 9 6 ：v l a g r a n g e ，1 9 9 9 ； 张敬荣等，2 0 0 4 ) 。因此，合理开发大量乳清资源并提高其附加值已成为食品科研人员及相关 企业十分感兴趣的课题。 近一、二十年来超滤和反渗透等新技术的应用，使乳清的综合利用和开发取得了很大的 进步。但这些方法主要用于分离和开发提取乳清中的乳清蛋白、乳糖等营养成分作为特殊用 途。而大规模的乳清处理，仍然采用浓缩和喷雾干燥的工艺制成甜性乳清粉，广泛的用作食 品工业的原料。乳清粉作为经济的乳圃形物来源及强化色泽的添加物，可作为营养保健奶的 乳固形物添加剂，还可用在焙、烤、糖果及其它食品中。收到了良好的营养和经济效果。目 前，估计有超过3 5 种不同类型的乳清制品可应用在食品、饲料、药品和化妆品工业中( 陈历 俊等，1 9 9 5 李红梅等，2 0 0 2 i 管萍等，2 0 0 3 ；李涛等2 0 0 4 ) 。 乳清蛋白是乳清中主要的营养与活性物质的集合体。作为一个群体，它具有多种生物活 性功能和营养功能。乳清蛋白中的主要成分为b 辱l 球蛋白( 占乳清蛋白的4 8 ) 、n 一乳白蛋自 ( 1 9 ) 、多肽类( 2 0 ) 、乳清白蛋白( 5 ) 、免疫球蛋白，另外还含有少量乳铁蛋白与乳过 氧化酶，具有较高的营养价值( m e i s e lh 2 0 0 1 ) 。 乳源酪蛋白糖巨肽( 简称糖巨肽) 是乳清中一种活性多肽，它源于牛乳中的b 酪蛋白， 是n 酪蛋白的酶解产物。该多肽特殊的氨基酸组成和活性糖结构，决定了其具有巨大的生理 活性功能。酪蛋白糖巨肽含量约为乳清蛋白的1 5 n 2 5 ( 唐传核等，2 0 0 0 ；m e i s e l h 。2 0 0 1 ) ， 这么高的含量及生理活性决定了其潜在的商业价值，决定了其研究的意义和开发的合理性。 随着食品分离技术的发展和分离材料的完善，开发具有保健功能和医药功能的酪蛋白糖巨肽 产品成为可能。 1 1 乳清蛋白质的结构和性质 乳清的营养成分相当于除去酪蛋白的脱脂乳，约占牛乳营养成分的5 5 ，固形物含量达 6 7 其中粗蛋白0 6 0 8 ，粗脂肪0 3 0 4 ，乳糖3 - - 5 0 o ( v l a g r a n g e ，1 9 9 9 ) 。乳 清蛋白的组成和结构特征如表1 - 1 所示。 表卜1 牛乳蛋白质的结构特征 t a b l e1 - 1s t r u c t u r eo f p r o t e i ni nm i l k 乳清按生产干酪( 或干酪素) 时工艺的不同分为甜性乳清、酸性乳清和含盐乳清。甜性乳 清是措生产契达干酪( c h e d d a rc h e e s e ) 或用凝乳酶凝固的其它类型的干酪或干酪素时产生的乳 清，其n h 值约为6 0 ：酸性乳清是指生产农家干酪( c o t t a g ec h e e s e ) 、稀奶油干酪( c r e a mc b e e s e ) 、 费塔干酪( f e t ac h e e s e ) 或用乳酸凝固的其它干酪( 或干酪素) 时产生的乳清，其p h 值约为4 6 左 右；含盐乳清是指生产干酪( 干酪素) 时另外加了食盐而得到的乳清( 唐传核等，2 0 0 0 ) 。新鲜 乳清的基本组成如表1 2 所示。 表1 - 2 干酪乳清总干物质组成 t a b l el 一2c o m p o s i t i o no f d r ys u b s t a n c ei nc a s e i nw h e y 2 乳清蛋白是一种高营养价值的蛋白质，其效价比( p e r ) 为3 0 ，超过了酪蛋白的p e r 值 ( 2 5 ) ，仅次于鸡蛋蛋清的p e r 值( 3 8 ) 。一般认为当蛋白质的p e r 值超过2 5 时，则被认为是 高营养优质蛋白质。乳清蛋白中的氨基酸非常丰富，其含量等于或大于f a o w h o 提出的对 幼儿和成人的推荐值，浓缩乳清蛋白的氨基酸组成最接近母乳成分，是种易消化、高营养 价值、对婴儿生长特别适合的蛋白质。因此f a o w h o 提议在婴儿食品中的蛋白质至少有6 0 应该是乳清蛋白质。基于同样理由，乳清蛋白质也是断奶食品一种极好的蛋白源，它还可以 应用于中老年奶粉配方，是老弱病患者的良好营养补充。乳清中的糖类几乎都是乳糖，乳糖 不仅可为机体提供能量，它还有多种营养与保健功能。乳糖由一分子半乳糖和一分子葡萄糖 构成，半乳糖是形成脑苷脂和粘多塘一末梢脑膜组织重要组成成分的主要来源；乳糖中的葡 萄糖经异构化变成异构化半乳糖，可促进肠道中双歧杆菌及革兰氏阳性菌群的生长，这些细 菌对人体的营养、代谢调节及预防保健具有多种生理功能。另外乳清矿物质处于良好的平衡 状态，其中钠和钾的比例为2 ：l ，具有完全的营养功效( 马俪珍等，1 9 9 9 ) 。 乳清蛋白作为功能性食品还有其它增进人体健康的功能，它包括：乳清蛋白在运动营养 中的价值：对结肠癌的防止作用：乳清蛋白控制胆固酵水平的作用；乳清蛋白的增强免疫力 的作用：乳清蛋白对骨骼生长的影响：乳清蛋白在减肥问题上的应用潜力。 由此可见，乳清蛋白不仅提供营养，还具有生理功能。随着人们对生物活性认识的提高， 乳制品必将成为全世界发展功能食品的核心。如今大量从乳清中制取的具有功能性及生物活 性的成分，已经工业化生产。因此，乳清生理功能的新发现将对全世界的食品工业产生巨大 影响。 1 2 乳源酪蛋白糖巨肽的结构和性质 1 2 1 牛r 酪蛋白糖巨肽的结构特性 酪蛋白糖巨肽被认为是乳清中一种神秘的活性多肽，它在1 9 5 3 年就引起了研究人员的 注意，j o l l 6 s ( 1 9 7 3 ) 等人发现经凝乳酶处理的牛乳以及酪蛋白盐溶液中，1 2 的三氯乙酸 ( t c a ) 溶液中可溶性氮含量明显增加。此后，人们主要关注凝乳酶对廿酪蛋白的作用机制。 1 9 5 6 年w a u g h 等发现了k - 酪蛋白：1 9 6 5 年d e l f o u r 等人发现k - 酪蛋白的特定位置经凝乳酶 切断，生成不溶的副k _ 酪蛋白和t c a 可溶的酪蛋白糖巨肽两部分。牛b 酪蛋白被凝乳酶水 解后生成副b 酪蛋白和酪蛋白糖巨肽( c g m p ) 两部分的示意图如图l 1 所示。 一一。一。一銮2 ：生譬兰銮：三兰2 拦三。，。：，。，。，。一 脚茹p 。，。篇一壁一l ! i 各0 一嚣卜一c o 。， 士h 2 0 l o 审 一嗣蒜k ：h 剁一如品管 图1 1b 酪蛋白+ 水一副p 酪蛋白+ 酪蛋白糖巨肽 f i g u r e1 - 1 c - c a s e i n + h _ o p a r 矗莨c 舔萌n + g l y c o m a c r o p e p t i d e 自此，酪蛋白糖巨肽才被人们发现。酪蛋自糖巨肽( c a s e i ng l y c o m a c r o p e p t i d e 。英文缩写 c g m p ) 是在干酪生产过程中，经凝乳酶分解乳中b 酪蛋白后所释放的一种c - 末端亲水性糖 肽。通常此可溶性多肽含有较多的糖链，于是被称为“糖巨肽”，面由酪蛋白来源的此类肽都 统称为“酪蛋白糖巨肽( c g m p ) ”。c g m p 不含芳香族氨基酸( p h e ，t y r t r y ) ，含五种不 等量的糖类，如n - 乙酰神经胺酸( 俗称涎酸) ，半乳糖，n 一乙酰半乳糖胺等。研究发现，在干 酪制作过程中加入凝巍酶后，静酪蛋白首先被水解，然后酪蛋白胶粒才发生凝固，因此昏酪 蛋白对乳中酪蛋白具有保护作用，酪蛋白糖巨肽是生产干酪的副产物。 有研究指出( m a r s h a l ls ct 9 9 1 ) ，甜孚l 清中c g m p 的含量约为1 2 1 5 班，估计相当 于总乳清蛋白含量的1 5 2 5 左右( 乳清蛋白占乳总蛋白的0 6 0 a 0 8 ) 。牛p 酪蛋自来 源的c g m p 氨基酸序列已清楚，它是从牛b 酪蛋白的n 末端1 0 6 位氨基酸( m e t ) 开始至1 6 9 位c 末端( v a d 结束的“个残基构成的。图1 - 2 为牛c g m p 的氨萋礁序列凋谱 啪啪 1 0f 舯 h m e l a i a 1 i e p m p 坤t l y 0 - 舳n - g i n s p l 栌一t h r g l u - - 什o - t h r - l l e - 鼬h t h r - l i e f m 柏 k 轴f g t y 。g u p r o t h r 。s 耳t l i r p f o - 了h - 两d - g l u a k - v a i l g i u - s e t - t h r - 妇i - a j a t k 怕r i e n tbi l i e i 删郅 晰 “u g f u - i 舳p 】9 r p r o a i u - w l - l i e - g l u 6 e r p r o - p r o a u l i e a s n - t h r 埘- g i n 垤卜t h r r i 矗n t b l a 硼p 科 8 m t h r - v l i o h 注：m e t - 硫氨酸( 蛋氨酸) ：a l a - 丙氮酸；i k 异亮氨酸；p m - 脯氪酸；l y s - 赖氮酸；a m 一天冬酰胺i g i n 谷胺酰胺；a s p 天冬氮酸；t h r - 苏氨酸；g l u - 氨酸：s c r - 丝氨酸；g 1 y - 甘氨酸；v a b 缬氯酸 圈1 2 牛c g m p 氨基酸序列图谱 t 咖l e l - 2 c h a r t o f a m i n o a c i ds e q u e n c e i nc o w 牛乳来源的c g m p 有a 和b 两种遗传变异型。其不同在于该多肽链的1 3 6 位和1 4 8 位 4 引言 的氨基酸不同，a 型的1 3 6 位和1 4 8 位残基氨基酸分别为t h r 和a s p ，而b 型为i l e 和a l a 。 此外，该多肽的1 3 1 、1 3 3 、1 3 5 、1 3 6 和1 4 2 位的苏氨酸o 蝴基为配糖体他的部位，1 4 9 位 的丝氨酸为磷酸化的部位。 1 2 2 羊r 酪蛋白糖巨肽的结构特性 对山羊，绵萃c g m p 的化学分析、定量分析的信息相对较少。j o l l 6 s 及a l a i s ( 1 9 7 3 ) 做 了大量的相关工作，他们从山羊k - 酪蛋白中分离出了c g m p 并报道了其化学成分，认为山羊 c g m p 与牛c g m p 氨基酸组成及序列不同，山羊c g m p 由6 6 一残基肽( 1 0 5 1 7 1 残基) 组成， 理论分子量为6 8 2 4 ，包含碳水化合物及磷的山羊c g m p 的表观分子量约为7 5 0 0 。与牛c g m p 序列相比，山羊序列中含有1 9 个替代子及两个插入子( v a i 1 3 2 ，h i s - 1 3 3 ) ，其中甘氨酸和亮氨 酸在羊乳中不存在而在牛乳中存在，组氨酸在羊乳中存在而在牛乳中不存在，这反映了物种 之间的差异。山羊乳中涎酸( 一种活性多糖) 含量的9 9 9 与蛋白质结合( 而非神经节苷脂) ，释 放入甜乳清的占7 5 ( v v ) ( s i l v a - h e r n a n d e z i 乙，e t a l , 2 0 0 2 ) 。另据报道，山羊c g m p 的 6 6 - 残基的等电点为4 8 ，它较牛c g m p 变体a 及b 的6 4 碱基肤( 4 0 4 和4 1 4 ) 稍高。c g m p 分子量取决于p h 值，p h = 7 时分子量( 约为3 3 0 0 0 ) 较高，这是由于此时呈三聚体或四聚体，酸 性时呈单体。分子量约为7 5 0 0 。牛、绵羊、山羊这三个物种c g m p 的a a 组成相近( 尤其是 绵羊和山羊) ，但并不完全相同( j o l l e s ，e ta 1 1 9 7 3 ) 。 1 2 3 酪蛋白糖巨肽的特性 经凝乳酶处理静酪蛋白产生的c g m p 中含有大量的活性多糖，许多研究者( t r a n b a k e r , ， 1 9 7 0 ；f i a t , e ta 1 ，1 9 7 2 ；j o l l e s , e t a l 1 9 7 3 ；f o u m e t ，e ta 1 ，1 9 7 5 ，1 9 7 9 ；d o ie a 1 ，1 9 7 9 ；s a i t o i t o h ， 1 9 9 2 ) 都对c g m p 中所含的糖类进行了研究，发现常乳期牛乳酶解后产生的”酪蛋白糖巨肽 中共有五种糖，它们是： ( 1 ) 单糖g a l n a c - o - r ； ( 2 ) 双糖g a l1 3i 一3 g a l n a c o - r ： ( 3 ) 三糖n e u a c n2 3 g a lt b1 3 g a l n a c o - r ； ( 4 ) 三糖g a lb1 3 ( n e u a c 2 6 _ g a l n a c - o - r ； ( 5 ) 四糖n e u a cn2 3 g a lb1 3 m e u a c 2 6 ) g a l n a c - o r 其中：g a l 是半乳糖；g a l n a c 是n 乙酰半乳糖胺；n e u a c 是唾液酸。 涎酸是p 酪蛋白糖巨肽中含量较高的活性单糖。它是神经氨酸的涎基诱导体的总称涎 酸的p h 值约为2 6 在自然界中主要以n 乙酰神经氨酸( n e u 5 a c ) 形式广泛存在于植物之外 的生物体中。研究表明涎酸具有许多的生理功能。最主要的生理功能是在生物体内防御机制 中起较重要作用。人的母乳中含有高浓度的涎酸，经大量研究发现其与乳婴儿的发育以及感 染防御机制具有较大的关系；此外，最新研究显示涎酸还具有抑制引起下痢原因的病毒感染 作用和提高学习能力的效果，同时，一部分的涎酸可移至脑内，从而与脑的发育具有较大的 关系( w a r r e n ，1 9 5 9 ) 。而乳中约7 5 以上的涎酸存在于c g m p 中，因此其生理功能不言 而喻。 与c g m p 有关的大量体外及体内实验显示，该多肽具有多种生理活性功能。糖巨肽的 生理功能主要有： ( 1 ) 它能结合霍乱和埃希氏大肠杆菌的肠毒素。霍乱弧菌能产生的霍乱毒紊亚单位a 和亚 单位b ，b 亚单位是与细胞壁上寡糖结合的位点，一旦结合，亚单位a 激活细胞上的腺苷酸环 化酶，这种酶会使细胞失水，从而导致腹泻，可能还会死亡。研究己表明( k a w a s a k i ，1 9 9 2 ) 霍乱毒素亚单位a 和b 的受器是一种神经节苷脂，这种神经节苷脂与糖巨肽的寡糖结构类似， 因此，c g m p 有结合霍乱毒素和埃希氏大肠杆菌毒素的特性。 ( 2 ) 塘臣肽能抑制病原体包括病毒和细菌等黏附至细胞，保护机体免受病原体的感染。许 多细菌和病毒是通过黏合荆与宿主结合的s t c i j i n 对黏合剂及接受器的特性进行了大量的研 究，认为糖巨肽能和病毒、细菌结合主要是因为糖巨肽链上的单糖( 涎酸) 与接受器有足够的 相似性，它们能堵塞接受器，因此可抑制细菌和病毒黏附至细胞。n e s s e r 等人一直在研究牛 乳组成成分对抑制龋齿发生的机制，研究表明，c g m p 能减弱龋齿发生的机制是c g m p 能使 产生牙齿噬菌斑的微生物组成发生改变，使其微生物群由葡萄球菌变为由很弱致癌性的防线 菌组成，研究同时发现糖巨肽不仅抑制龋齿而且可使牙齿重新无机化。 ( 3 ) 糖巨肽能抑制胃分泌物。有关糖巨驮与胃肠道收缩关系的材料引起了人们的广泛兴 趣。s t a r t ( s t a r te y a ，1 9 8 3 ) 等人认为减弱胃分泌物将会降低动物胃蛋白水解作用，这样会保 护乳中来源的免疫球虽自、乳铁蛋白及溶燕酶等蛋白质原封不动的穿过胃，这会有益于婴儿 以及免疫力低下的人增强免疫力。 “) 能促进双歧杆菌的生长。在鉴别双歧杆菌的一硬研究中，c , - y o m y 等人发现以n - 乙酰 神经胺酸结尾的寡糖能促进双歧杆菌的生长，并且他们提出这是由于末端的n 乙酰神经胺酸 脱落，暴露了一个g a l n a c 的缘故。 ( 5 ) 具有调节免疫系统的反应的功能( a z u m a ，1 9 8 4 ) 。糖巨默能捧制由l p s 激发的b 淋 巴细胞增殖和由眦a ( 植物血凝集素一p ) 激发的t 淋巴细咆增殖萁进一步影响是下讽免疫系 统和减弱口腔的耐受性，这将会给一个刚出生的动物种能够被保护的机制，使动物能抵抗 环境内很宽范围内的抗原。 舍有c g m p 的部分商品已经被应用到人们的生活当中。例如，在美国，加入c g m p 的 牙膏已经研制成功，它可以抑制龋齿和口腔溃疡的发生( b e r r o c a l ，1 9 9 3 ) ；有文章认为，把 糖巨肽加入到饼干、果冻等食品中能增进人体健康。使机体增强免疫力：在医药制品中加入 c g m p 用于血栓症的治疗：c g m p 能结合肠毒素的特性使它广泛的应用于婴幼儿食品当中 ( m a r s h a l ls c1 9 9 1 ) 。 此外，c g m p 具有独特的氨基酸组成，特别是几乎不含有芳香族氨基酸，可作为苯丙酮 尿症意者( p k u ，一种不能代谢芳香族氮基酸的遗传病) 膳食中首选的成分。 c g m p 含有较多的支链氨基酸( 如v a l 和i r e ) ，可用于多种肝病的治疗，相关的研究人员认 为，支链氮基酸与芳香族氨基酸的比率系数越大，其对肝病的治疗效果越好，经证实，此系 数约为2 0 左右时，c g m p 可作为肝病患者的膳食。效果很好。 6 最近一些研究表明，由c g m p 再降解所得的一些小肽还有类似鸦片的拮抗作用，有抑制 血小板凝集及降低血压效果等( s t a r t ，1 9 8 3 ：k a w a s a k iy 1 9 9 2 ) 。由于糖巨肤能增进人体健 康，所以人们对它越来越感兴趣，这必将加速糖巨肽尽快的应用于食品当中。 综上所述，c g m p 的发现和研究不仅开发了种新型的功能性因子。也为干酪乳清的开 发应用提供了思路。作为一种具有工业化潜力的蛋白质来源，c g m p 独特的酸性条件下的热 稳定性和可溶性预示了它在食品加工中的应用前景。另外近来发现的关于它在生物和营养 方面的功能为其规模生产提供了广阔的市场。由于c g m p 具有增进人体健康的功能，其在食 品和医疗方面必将有很大的应用前景。 1 3 酪蛋白糖巨肽分离技术 虽然早在1 9 6 5 年就发现酪蛋白糖巨肽，但由于对其生理功能、生物活性的认识和研究 方法的限制，酪蛋白糖巨肽这种具有广泛应用前景及利用价值的功能性多肽一直没得到人们 的重视，直到最近几年，苯丙酮尿症患者的增多和干酪产量的逐年增加使有关科研人员对这 种具有潜在商业价值的功能性多肽产生了极大的兴趣。尽管如此，有关c g m p 的报道还少的 可怜，干酪制造商和医药保健食品生产商对大规模生产c g m p 的方法也报以关切的目光。 酪蛋白糖巨肽的制备一直是人们关注的话题，很多方法被尝试用来制备和生产c g m p ， 但大多数方法不能应用于工业生产中。现将糖巨肽的分离方法做一下简单概述： ( 1 ) 热沉淀法：1 9 9 1 年，t a n i m o t o ( 1 9 9 1 ) 发明了一种制备c g m p 的方法，这种方法利用 了糖巨肽热稳定的性质，通过对乳清进行高温长时的热处理手段，使多余的杂蛋白变性、沉 淀来生产糖巨肽。但这种方法引起了乳清蛋白的变性其副产物不适台再利用。 ( 2 ) 化学沉淀超滤法：b e r r o c a l ( 1 9 9 3 ) 提出了一种生产c g m p 的方法，他先把含有乳糖 的乳清蛋白浓缩、絮凝，产生沉淀物和上清液，用超滤方法处理上清液，浓缩后的上清液用 乙醇处理，又产生了沉淀和二次上清液，然后对二次上清液进行收集并冻干，得到c g m p 粉 末，但这种加工方法很不方便，因而工业化生产起来困难重重 ( 3 ) 等电点沉淀超滤法：随着超率技术的发展和普及，2 2 r a n g ( 1 9 9 8 ) 又提出了一种生产 c g m p 的方法，它包括调整原料乳清的p h 值到4 以下，用5 0 0 0 或更小孔径的膜对滤出液进 行浓缩，浓缩液再调整p h 值到4 以上，大约6 5 左右时，用1 0 0 0 0 的膜再进行次超滤。该 方法得到的c g m p 有一个较高的纯度但超滤过程中膜很快就被蛋白质污染了，因此必须常 常清洗滤膜。该方法得到的c g m p 产量也十分有限，而且加工过程中要对乳清液进行稀释以 缓解溶液对膜的污染，但稀释原料乳清液需要浪费大量的水和消耗大量的能量。 “) 层析法：c g m p 中涎酸含量较高使这种糖肤的p i 较低，因此与阴离子交换剂结合紧密。 其亲水性较其它乳清蛋白高，利用这一性质，e t z e l ( 2 0 0 1 ) 提出了一种利用糖巨肽与其它乳 清蛋白疏水性和等电点的不周对耱巨肽进行分离的方法，含有c g m p 的原料乳清过离子交换 柱收集没有吸附在离子交换柱上的馏分，浓缩脱盐后得到c g m p 。e r y c k 等人也提出了类 似的分离方法，e r y c k 等人认为，甜乳清中除静酪蛋白外还有含少量涎酸的蛋白质，如免疫 球蛋白，乳铁蛋白等，但这些蛋白质较c g m p 的等电点高( p i s ) ，疏水性强，在试验中从 7 d e a e s e p h e l 解析或吸附于苯基一琼脂糖上，因此从苯基琼脂糖柱洗脱的涎酸源于c g m p 而非涎酸化的其它甜乳清蛋白。这两种方法操作较方便，但分离材料价格昂贵，生产效率不 高且离子交换柱上蛋白沉淀物的清除存在着一定的问题，因此，这种方法也是有缺陷的且 由于乳糖、蛋白质及灰分含量高等原因，直接用干酪乳清做生产原料，大规模生产c o m p 也 存在一定的技术困难。 如上所述，c g m p 的分离纯化方法有很多种，纯化策略各不相同，关键的第一步是建立 自始至终的测定方法。目前为止，还没办法得到c g m p 的标样，有的研究人员用非蛋白氮的 含量作为c g m p 含量的一个指标，它们之间是有正相关性，但准确性并不高。 本实验设计基于c g m p 聚合体与单体分子量的不同，选择适当的超滤膜作为分离载体。 以市售乳清粉为原料超滤法分离制备c g m p ，采用s e p h a d e xo 1 0 0 对c g m p 混合物进行分 离和纯化，用凝胶电泳和氨基酸分析的方法对分离后的c g m p 的分子量和含量进行定量分 析。和上述几种分离法相比较，本实验在超滤过程中没有使乳清蛋白变性，分离方法简单、 实用，成本低，生产效率高。残留液中的乳清蛋白和乳糖也可以回收利用，以提高生产的附 加值：通过凝胶电泳和氨基酸分析仪分析c g m p 组成和纯度。 1 。4 酪蛋白糖巨肽的应用 c g m p 作为富含涎酸的多肽，具有与涎酸相同的调节免疫功能，如： ( 1 ) 抗感染的保护剂，c g m p 能结合肠毒素的特性使它广泛的应用于婴幼儿食品当中 ( m a r s h a l ls c1 9 9 1 ) i ( 2 ) 提高牙齿中氟的含量，在美甯，加入c ( m p 的牙膏已经研制成功，它可以抑制龋齿和 口腔溃疡的发生( b e r r o c a l ，1 9 9 3 ) ： ( 3 ) 促进i g a 抗体的产生；有的研究者认为，把糖巨肤加入到饼干、果冻等食品中能增进 人体健康，使机体增强免疫力：可以作为双歧因子活力增强剂和稳定荆： ( 4 ) c g m p 具有抑制或防止凝血症作用，把糖巨肽制成冻千粉或肠溶胶囊。在医药领域可 用于血栓症的治疗： ( 5 ) 具有一定的双歧杆菌增殖以及抗感染效果，可用于幼儿的调制乳粉中，使乳粉母乳化； ( 6 ) c g m p 还具有抑制胃液分泌的效果，期待应用于预防或治疗胃溃疡的医药及饮食当中； ( 7 ) c g m p 具有独特的氨基酸组成，特剐是几乎不含有芳香族氨基酸，可作为苯丙酮尿症 患者( p k u 一种不能代谢芳香族氨基酸的遗传病) 膳食中首选的成分。 ( 8 ) c g m p 含有较多的支链氨基酸( 如v d 和l l e ) ，可用于多种肝病的治疗，相关的研究人员 认为，支链氨基酸与芳香族氮基酸的比率系数越大，其对肝病的治疗效果越好，经证实，此 系数约为2 0 左右时，c g m p 可作为肝病患者的膳食，效果很好。 c 9 ) 最近一些研究表明，由c g m p 再降解所得的一些小肽还有类似鸦片的拮抗作用，有抑 制血小板凝集及降低血压效果等( 嗽n1 9 8 3 ) 。由于糖巨肽能增进人体健康，所以人们对它 越来越感兴趣，这必将加速糖巨肽尽快的应用于食品当中。 综上所述，c g m p 可广泛地应用于保健食品及药品中。大力开发乳清资源，提高乳清的 引言 综合利用水平。是目前食品行业的热门话题，而且c g m p 的开发利用为保健食品及医疗保健 药品提供一种全新的功能性原料。 1 5 酪蛋白糖巨肽超滤工艺流程简介 超滤( u l t e r a f i l t r a t i o n ，缩写u f ) 是一种以压力差为推动力的膜分离过程。是目前应用广泛的 分离、提纯技术，主要用于纯水制造、废水处理、乳清浓缩、果汁澄清等多个操作过程f 陈历 俊等。1 9 9 5 ) 。超滤的分离原理属于分子筛原理，超滤膜孔径一般为几十纳米到几百纳米，能 够截留相对分子量为5 0 0 以上的大分子物质和胶体微粒，在0 1 枷5 m p a 压差下，水和小分子 物质透过膜，大分子物质被截留，从而实现太分子物料和小分子物料( 水) 的分离( 李涛等， 2 0 0 4 ) 。 本实验采用天津膜天膜工程技术有限公司生产的中空纤维超滤膜组件。该设备由超滤 泵、膜组件、压力表及附属设备组成。 以乳清粉( 新鲜的干酪乳清) 为原料超滤法分离酪蛋白糖巨肽工艺流程如图1 3 所示： 9 东北农业大学工学硕士学位论文 书舞哺 圆+ 一l 鲥册c ( 州 广一 醚化至p 硝6 ，卜步i舢