（食品科学专业论文）乳粉蛋白质快速检测方法的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 y 9 0 4 8 7 0 摘要 摘要 乳制品是营养最全面的食品之，近年来乳制品的产量上升很快，但快速的增长亦造成原 料和成品掺假的现象非常普遍。其中蛋白掺假是常见的种方式。国家标准规定的乳粉蛋白质 - 测定方法是基于凯氏定氮法因此理论上任何古氮物质的加入均折算成为蛋白质含最。所以常 用的掺假方式为加水后加入水解动物蛋白、大豆蛋白、尿素等无机氮类。另一种则为低蛋白或 无蛋白的制假乳制品，如2 0 0 4 年的“阜阳劣质奶粉案”。乳品掺假不但严重影响了市场信誉， 亦对人体会产生一定的危害，寻求一种高效快速的定量和检测掺假的方法已成为当今乳品工业 的重要工作，具有重要的经济和社会价值。 本课题从蛋白质的快速测定方法入手，选取了分光光度法中的考马斯亮蓝法和福林一酚法来 研究；研究了考马斯亮蓝试剂和福林酚试剂与乳粉蛋白质含量之间的显色关系：实际测定结果 与凯氏定氮法( 国标法) 的比较：乳粉中常见掺假物对显色的干扰：以及掺假物添加后对蛋白 质实际检测的效果。考察了显色溶液的吸光度值与色度值的线性关系，色差计应用于蛋白质测 定的可能性。 主要结论如下： ( 1 ) 采用标准蛋白或者已知乳粉标样，考马斯亮蓝法都能准确测定乳粉中的蛋白质含量， 测定结果与国标法没有显著差异。而且一些常见的掺假物( 如铵盐、氨基酸、碳水化合物、淀 粉等) 不与考马斯亮蓝试剂发生显色反应，不干扰蛋白质的测定。所以考马斯亮蓝法是一种很 好的蛋白质快速测定方法。 ( 2 ) 福林酚法只有采用已知乳粉标样制各的曲线，才能准确测定乳粉中蛋白质含量，测 定结果与国标法没有显著差异。而该法的干扰因素很多，很多掺假物都能与其反应，因此只能 应用于束掺假的乳粉蛋白质测定。 ( 3 ) 在掺加脲的乳粉中，考马斯亮蓝法和福林酚法不受添加脲的影响，都能准确测定出 真实的蛋白质含量。在掺植脂末的乳粉中，考马斯亮蓝法坷；受脂肪的影响能准确测定出真实 的蛋白质含量；而福林酚法的测定结果偏高。在掺多肽蛋白粉的乳粉中，考马斯亮蓝试剂不与 多肽反应，能准确测定出真实的蛋白质含量；而福林一酚试剂能与多肽结合，发生显色反应使 得测定结果偏高。 浙江大学硕士学位论文摘要 ( 4 ) 不管是考马斯亮蓝法或福林酚法，其显色溶液的色度值与吸光度值之间存在良好的 线性关系其中尤其以色度b 值的线性最好，色度g 值的变化幅度最大。说明有可能建立溶液 颜色信息与蛋白质含量之间的关系，来简化蛋白质含量的测定。 综上所述，考马斯亮蓝法可以应用于乳粉蛋白质含量的快速测定中。可以开发成商品化试 剂盒来进行现场的快速检测。 关键词：乳粉蛋白质，考马斯亮蓝法，福林酚法，掺假乳粉 2 浙龃：大学硕士学位论文 a b s t r a e t a b s t r a c t d a i r yp r o d u c t sa r et h em o s tn u t r i t i o u sf o o d i nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h eg r o w t ho fd a i r yp r o d u c t s ， a d u l t e r a t i o n si nd a i r yp r o d u c t sa r eb e c o m i n gm o l ea n dm o r ep o p u l a r p r o t e i na d u l t e r a t i o ni st h e p o p u l a rw a y d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nc o n t e n to fm i l kp o w d e rw h i c hi sc o n s t i t u t e db yg o v e r n m e n t s t a n d a r di sb a s e do nt h ec l a s s i c a lk i e l d a h lm e t h o d t h i sm e t h o dc o n v e r t sa l ls u b s t a n c e sw h i c hc o a t a i n n i t r o g e ni n t op r o t e i nn i t r o g e ni np r i n c i p l e t h e r e f o r e ，p o p u l a rw a yo fp r o t e i na d u l t e r a t i o ni sa d d i n g h y d r o l y z e da n i m a lp r o t e i n s ，s o y b e a np r o t e i n s ，u r e a , e t c a n o t h e rw a yi sa r t i f i c i a ld a i r yp r o d u c t st h a t c o n t a i nl o w - p r o t e i no rn o n - p r o t e i n f o re x a m p l e ，“p o o rq u a l i t ym i l kp o w d e r se v e n t i nf u y a n gc i t y d a i r yp r o d u c t sa d u l t e r a t i o n sn o to n l ya f f e c tm a r k e tr e p u t a t i o n , b u ta l s oa r eh a r m f u lt op e o p l e sh e a l t h s oi ti si m p o r t a n tt od e v e l o pah i g h - e f f i c i e n c y , r a p i d , q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fa d u l t e r a t i o ni nd a i r y i n d u s t r yn o w t h i ss u b j e c tw a sb a s e do nt h er a p i dm e t h o d so fp r o t e i nd e t e r m i n a t i o n f i r s t l y , b r a d f o r da n d l o w r ym e t h o d sa m o n gs p e c t r o p h o t o m e t f i cc a l o r i m e t r yw e r ec h o s e nt oa n a l y z ep r o t e i nc o n t e n to f m i l kp o w d e r s e c o n d l y ，c o l o rr e a c t i o nb e t w e e np r o t e i nc o n t e n to fm i l kp o w d e ra n dg 一2 5 0 a n d f o l i o - p h e n o lr e a g e n tw e r ee s t a b l i s h e da tt h es a m et i m e ，a c t u a l l yd e t e r m i n a t i o n so fp r o t e i nc o n t e n t b yt h e s em e t h o d sw e r ec o m p a r e dw i t ht h a tb yt h ek i e m a h lm e t h o d t h i r d l y , t h ei n t e r f e r e n c eo f p o p u l a ra d u l t e r a t e ds u b s t a n c e s ( e g a m m o n i u ms a l t , a m i n oa c i d ，c a r b o h y d r a t e ，s t a r c h ) a n dt h ea c t u a l e f f e c to fd e t e r m i n a t i o no fa d u l t e r a t e dp r o t e i n sc o n t e n tw e r ei d e n t i f i e d f i n a l l y , c o r r e l a t i o nb e t w e e n a b s o r b a n c ea n dc h r o m a t i cv a l u eo f t h e i rs o l u t i o nw a si n v e s t i g a t e d i ts u g g e s t e dt h a tc o l o rd i f f e r e n c e m e t e rb ea p p l i e di n t ot h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nc o n t e n t ， t h em a i nc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) u s i n gs t a n d a r dp r o t e i n o rs t a n d a r ds a m p l eo fm i l kp o w d e r b r a d f o r dm e t h o dc o u l d a c c u r a t e l yd e t e r m i n ep r o t e i nc o n t e n to fm i l kp o w d e r ；a l lt h er e s u l t sw e r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t f r o mt h o s eo b t a i n e db yt h ek j e l d a h lm e t h o ds t a t i s t i c a l l y f u r t h e r m o r e ，s o m ep o p u l a ra d u l t e r a t i o nd i d n o tr e a c tw i t hg - 2 5 0r e a g e n ta n dn o ti n t e r f e r ew i t hp r o t e i nr e a c t i o n t h e r e f o r e ，b r a d f o r dm e t h o dw a s ag o o d ，r a p i dd e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nc o n t e n t 浙江大学硕士学位论文a b s t r a c t ( 2 ) o n l yu s i n gs t a n d a r ds a m p l eo fm i l kp o w d e r , l o w r ym e t h o dc o u l da c c u r a t e l yd e t e r m i n e p r o t e i nc o n t e n to fm i l kp o w d e ra n da l lt h er e s u l t sw e r en o ts t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n tf r o mt h o s eo b t a i n e d b yt h ek j e l d a h lm e t h o d b u t ，l o w r yw a si n t e r f e r e db ym a n ys u b s t a n c e s ，i to n l yc o u l db ea p p l i e di n t o t h ed e t e r m i n a t i o no fu n a d u l t e r a t e dm i l kp o w d e r ( 3 ) b r a d f o r da n dl o w r ym e t h o dc o u l da c c u r a t e l yd e t e r m i n ep r o t e i nc o n t e n to fm i l kp o w d e r w h i c hw a sa d u l t e r a t e dw i t hu r e a b r a d f o r dm e t h o dw a sn o ti n t e r f e r eb yf a t , s oi tc o u l da c c u r a t e l y d e t e r m i n ep r o t e i nc o n t e n to fm i l kp o w d e rw h i c hw a sa d u l t e r a t e dw i t hn o n d a i r yc r e a m e r b u tt h e r e s u l t so f l o w r ym e t h o dw e r eal i t t e rh i g h e r g 一2 5 0r e a g e n td i dn o tr e a c tw i t hp o l y p e p t i d e s oi tc o u l d a c c u r a t e l yd e t e r m i n ep r o t e i nc o n t e n to fm i l kp o w d e rw h i c hw a sa d u l t e r a t e dw i t hh y d m l y z e da n i m a l p r o t e i n s b u tf o l i n p h e n o lr e a g e n tc o u l db i n dw i t hp o l y p e p t i d ea n dc h a n g e ? o l o r , t h er e s u l t so f l o w r y m e t h o dw e r eal i t t e rh i g h e r ( 4 ) n o to n l yb r a d f o r dm e t h o do rl o w r ym e t h o d , c o r r e l a t i o nb e t w e e na b s o r b a n c ea n dc h r o m a t i c v a l u eo f t h e i rs o l u t i o nw a sv e r yg o o d t h el i n e a r i t yo f c h r o m a t i cb l u ev a l u ew a st h eb e s t ；t h er a n g eo f v a r i a t i o no fc h r o m a t i cg r e e nv a l u ew a st h eb i g g e s t i ts h o w e dt h a ti tw a sp o s s i b l et of i n dt h er e l a t i o n b e t w e e ns o l u t i o nc o l o ri n f o r m a t i o na n dp r o t e i nc o n t e n tt os i m p l yd e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nc o n t e n t i ns u m m a r y , b r a d f o r dm e t h o dc a nb ea p p l i e dt or a p i d l yd e t e r m i n ep r o t e i nc o n t e n to fm i l k p o w d e r ak i n do f c o m m e r c i a lk i tc o u l db ed e v e l o p e dt od e t e r m i n ep r o t e i nc o n t e n to nt h es p o t k e yw o r d s ：p r o t e i nc o n t e n to f m i l kp o w d e r , b r a d f o r dm e t h o d ，l o w r ym e t h o d ，a d u l t e r a t e dm i l k p o w d e r 2 浙江大学硕士学位论文 绪论 第一章绪论 1 1 牛乳的化学组成及营养价值 牛乳是乳牛为其哺育幼仔由乳腺所分泌的一种白色或略带微黄色、不透明、微有甜味的液 体。乳中含有适合其幼子生长发育所必需的有营养价值易消化的物质。乳是多种物质组成的混 合物，乳中各种物质相互组成分散体系，是具有胶体特性的生物学液体。乳的主要组成是水分、 脂肪、蛋白质、乳糖、矿物质、维生素等【”。 1 1 1 水分 水分是乳- | i 的主要组成部分，占8 7 8 9 ，是乳- 1 其他物质的分散介质。水中溶解各种可 溶性盐类、碳水化合物、维生素和一少部分蛋白质。在牛乳中以游离水、结合水和结晶水三种 形式存在。牛乳中大量水分的存在，使其容易被消化和吸收：此外，水作为很好的溶剂，能溶 解乳中除脂肪和蛋白质外的其他物质，它还能调节人体内的水分浓度，促进体内废物的排放i ”。 1 1 2 乳脂肪 乳中脂类化合物是指乳脂肪和类脂两类化合物。其中9 7 9 9 的成分是乳脂肪，还有大约 1 左右的磷脂和少量甾醇，游离脂肪酸等。乳脂肪以微细的球状呈乳浊液分散在乳中平均含 量为3 , 5 5 0 。乳脂肪是各种脂肪酸的甘油三酯的混合物，即分子的甘油和三个相同或不同 分子的脂肪酸结合而成。 乳脂肪中短链低级挥发性腊肪酸含量达1 4 左右，熔点为2 8 3 6 c 。乳脂肪以细微球状存 在，具有很好的消化性。乳脂肪的特点使其具有以下营养价值：( 1 ) 提供能景，l g 脂肪氧化后 能释放出3 7 6 千焦热量：( 2 ) 提供人体必需的脂肪酸；( 3 ) 脂溶性维生素( a 、d 、e 、k ) 运 输的载体：( 4 ) 参与人体内复杂的脂类代谢”。 浙江大学硕士学位论文绪论 1 1 3 乳蛋白质 牛乳含氮物质中主要有乳蛋白质和非蛋白态氮，含量为2 8 3 8 。其中乳蛋白质约占9 5 * , ， 非蛋白态氮仅占5 左右。乳蛋白质包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白，乳清蛋白又 由对热不稳定的乳白蛋白和乳球蛋白，还有对热稳定的小分子蛋白和胨所组成。乳中的非蛋白 质态氮基本上是机体蛋白质代谢的产物如氨、尿素、肌酸等。 乳蛋白质包含人体生长发育所需要的全部必需氨基酸，而且人体对乳蛋白质晟易消化吸收， 消化率可达9 8 1 0 0 。乳蛋自质的生物价是8 5 ，是一种全价蛋白质。此外，乳蛋自质也是人体 补充热量的来源。l g 蛋白质在体内氧化后供应的能量为1 6 7 4 千焦”j 。 1 1 4 碳水化合物 乳中的碳水化合物主要为乳糖含蹙为4 5 5 0 。乳糖属于双糖类，甜度为蔗糖的l 6 ， 水解时可生成一分子a 葡萄糖和一分子a 半乳糖，仅存在哺乳动物的乳汁中。 乳糖的营养价值：( 1 ) 作为能量来源，l g 乳糖氧化后能产生1 7 1 5 千焦热量；( 2 ) 水解产 生的半乳糖能促进婴儿大脑及神经组织的发育；( 3 ) 乳糖在肠道乳酸菌的作用下形成乳酸，抑 制有害菌的生长维持肠道健康：( 4 ) 乳糖在肠道内发酵产酸促进钙、磷等矿物质的吸收唧。 1 1 5 矿物质 无机物也称为矿物质，通常以灰分的量来表示无机物的量。一般牛乳中灰分的含量为 0 3 0 1 ，2 1 ，平均o 7 左右。乳中的矿物质含有钙、磷、钠、镁、铁、锌、铜、锰、钼等， 主要以可溶性无机磷酸盐及有机柠檬酸盐的状态存在。牛乳中的钙和磷容易被人体吸收利用。 能促进人体牙齿和骨骼的生长，是人体补充钙的最佳来源之一【“。 1 1 6 维生素 维生素是维持人体正常生理功能所必需的一类化合物，人体一般不能自行合成，需要从食 物中摄取。而牛乳中含有几乎所有己知的维生素，维生素a 和b 2 的含量很丰富，但维生素d 含量很少，是人体补充维生素的良好来源1 7 1 。 2 浙江大学硕士学位论文 1 2 乳粉的生产 1 2 1 乳粉的概念 所谓乳粉是指以新鲜牛乳为原料，或以新鲜牛乳为主要原料，添加一定数量的植物或动物 蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等配料，经杀菌、浓缩、干燥等加工工艺除去大部分水分而制 成的粉末状产品 8 1 。 1 2 2 乳粉生产的意义 乳粉是一种营养价值高的产品，由于乳粉中水分含量很低，它能一直保持乳中的营养成分。 乳粉的生产主要有以下几个意义 9 , 1 0 l ： ( 1 ) 乳粉中水分含量很低，抑制了微生物的生长繁殖，延长了产品的货架期： ( 2 ) 乳粉冲饮方便，经济实惠，可以根据个人的需要随意冲调。随时饮用； ( 3 ) 牛乳加工成乳粉后，其重量和体积都大大较少，有利于包装、贮藏和运输，大大节 省了运输费用； ( 4 ) 我国幅员辽阔、南北乳业发展不平衡，乳制品的高消费区往往不是奶源充足地区 乳粉的生产解决了奶源不足地区喝奶难的问题： ( 5 ) 奶牛产奶具有一定的季节性，乳粉的生产可以调节产乳的淡旺季节对市场的供应； ( 6 )我国整体的乳品加工业和奶牛饲养业已经不能满足人们的消费需要，复原乳的应用 带动了乳粉行业的发展； ( 7 ) 乳粉具有营养丰富，色、香、味俱佳的特点，很适合于作为其他食品的配料( 如巧 克力、糖果、冷饮、糕点等) ，在食品行业得到广泛的应用； ( 8 )在加工过程中。对乳粉的营养成分加以调整，一些特殊成分的强化，生产出具有一 定疗效的乳粉，满足社会不同人群的特殊营养需要( 低苯丙氨酸乳粉、高蛋白低脂 肪乳粉、乳糖分解乳粉等) 。 1 2 3 乳粉生产的发展趋势 乳粉是我国乳制品最主要的品种，占到固态乳制品产量的6 5 ，乳粉产值约占乳制品工业 浙江大学硕士学位论文 总产值的三分之一。随着人们生活水平和营养意识的提高，乳品工业的发展和科学技术的进步。 我国乳粉类产品的结构已发生了很大变化，适合不同人群营养需要的配方乳粉已取代原来以全 脂加糖乳粉为主的局面，逐渐成为主流。但近年来，由于液体乳的迅速发展，特别是保鲜奶、 u h t 奶等长货架期奶的出现，以及发酵乳制品、乳酸菌饮料和干酪产品的不断开发，使我国乳 粉类产品的生产量呈现逐年下降的趋势。然而婴幼儿配方乳粉却是个例外，由于人工育儿乳 粉需要量的增多，婴幼儿配方乳粉得到广大消费者和乳制品生产商的重视，有着相对稳定且数 量巨大的市场需求。此外，一些功能型乳粉如强化乳粉、特定人群需要的乳粉也逐渐进入市场， 由于其针对性强且具有一定的疗效，越来越受到人们的欢迎i i i , i 2 。 1 3 乳真蛋白 1 3 1 乳真蛋白的定义 蛋白质的测定主要通过测定含氮物质来确定，乳中的氮含量包括蛋白态氯( p r o t e i n n i t r o g e n ，p n ) 和非蛋白态氨( n o n p r o t e i nn i t r o g e n ，n p n ) ，其中前者占9 5 ，后者约占5 。 蛋白质是乳中的主要含氮物质；乳中还有其它含氮物，主要来源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌 酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、马尿酸、氨基酸和其它成分，这些成分构成了所谓的非蛋白氮。 乳真蛋白( t r u e p r o t e i n t p ) 即除了非蛋白态氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白，正常情况 下，天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。 传统上乳蛋白测定采用凯氏定氮法，它测定的是乳中总氮的含量，再乘以乳蛋白氦与蛋白 质的换算系数6 3 8 即为乳蛋白质含量。这样得到的蛋白质含量被定义为粗蛋白( c r u d ep r o t e i n 。 c p ) ，因为它含有蛋白氯和非蛋白氮。随着乳的计价更倚重真白质。对测定真蛋白( t p ) 则变 得越来越重视，因为只有真蛋自才有营养价值。 1 3 2 影响乳中蛋白质含量的因素 一般来说，牛乳中的真蛋白( t p ) 占粗蛋白( c p ) 的9 5 9 7 ，它们的差值为非蛋白态氮。 酪蛋白是真蛋白的主要部分，也是干酪加工中重要蛋白质，一般占粗蛋白的7 5 8 5 ，真蛋白的 7 9 8 9 。除了酪蛋白，其余的真蛋白为乳清蛋白。 4 浙扛大学硕士学位论文 乳蛋白质的数值不是一成不变的，会受到饲料、季节、种类品种、饲养方式、乳房炎和泌 乳期等因素的影响”】。主要有以下三个方面： ( 1 ) 遗传与环境：不同的乳牛品种其蛋白质成分有较大的差异。虽然通过遗传工程可以 改进蛋白产量但到目前为止并非易事。 ( 2 ) 饲料：饲料营养对乳蛋白的影响差异较大。增加饲料中c h ：o 能量和膳食粗蛋白、可 以少量增加奶蛋白1 ，净能量每增加1 0 0 0 k c a l ，可以增加0 0 1 5 单位乳蛋白质。改进蛋氨酸和 赖氨酸可以增加乳蛋白，饲料中的粗蛋白每增加l ，可以增加乳蛋白o 0 2 。增加饲料脂 肪会降低乳蛋白含量，但增) j l l l , 蛋白产量因为产量和含量负相关，随着乳产量增加蛋白质 含量下降，但下降的量不大，一般在日产量3 2 蚝时为2 9 2 ，3 6 k 时则为2 8 9 。粉碎饲料和 颗粒饲料混合饲养亦可以增加乳蛋白。 已有许多的研究表明，可以由饲料的变化来预n - l , 成份的变化，推荐使用尿素氮含量和蛋 白质产量来作为评价饲料的工具指标“】。 ( 3 ) 乳房炎：酷蛋白，乳白蛋白和乳球蛋白，在乳腺中合成。主要的血液成分作为前体如 氨基酸、葡萄糖和醋酸，9 0 的乳蛋白从血液成份中转化过来【”】。乳房炎本身不降低蛋白质合 成，但从嗜中性白细胞产生的胞质素和蛋白酶可以在乳腺q ，分解酪蛋白，降低乳品质和真蛋白 含量，虽然高体细胞乳的租蛋白相当于正常乳的9 9 ，但其酪蛋白仅为正常乳的8 2 。 1 3 3 乳蛋白质的测定 目前，乳的蛋白质含量可由下述三种方法分析： ( 1 ) 凯氏定氮法：测定总氮量n x 6 3 8 = 粗蛋白呻l ：在测定粗蛋白的基础上，美国科学家 于二十世纪九十年代已完成由凯氏定氮分析乳中真蛋白的方法。主要有直接法和闻接法，直接 法的原理为采用最终浓度为1 0 w v 的三氯醋酸沉淀乳中的蛋白质，用过滤法除去非沉淀部分 的三氯醋酸溶液和非蛋白态氮成分，将滤渣收集起来。用传统的方法进行定氮。间接法则与直 接法相反，先测定乳中的总蛋白，再测定其非蛋白态蛋1 3 ，总蛋白减去非蛋白态蛋白则得到真 蛋白含量。 ( 2 ) u d y 染料染色法：只结合蛋白质包括酪蛋t i e r 7 乳清蛋白，u d y 采用蛋白与一定d h 的橙酸1 2 染料结台的原理测定乳中的氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸，其中多肽链长度须 浙江大学硕士学位论文绪论 在5 个氨基酸以上。其红色的色泽随结合的蛋白质含量而变化，色泽的减退与蛋白的浓度呈反 比，因此只要在一定的波长下测定其色泽的程度，即可计算得到蛋白的浓度口”。 ( 3 ) 仪器法：红外法，由于这种方法采用的是不同分子的物质与特定波长下的反应，因此 既可以渊定总蛋白，亦可以测定真蛋白，应用时以标定的物质为基础。 f r a n k 等测定表明1 ，不同的测定方法其数值有一定的差异，u d y 法因为只结合蛋白质的 部分多肽键，其读数较凯氏定氮法低。由于红外测定的为真蛋白，因此读数亦较凯氏定氮法低。 红外法可分析乳中的总蛋白和真蛋白，目前美国大部分的d h i a 实验室采用红外分析仪测 定乳中真蛋白，但在2 0 0 0 年咀前以及世界上大部分国家，目前仍分析总蛋白。因为红外不能直 接测定乳中的非蛋白态氮，红外仪器分析必须用凯氏定氮法来标定。直接凯氏法测定粗蛋白， 乳中非蛋白态氮的测定则通过上述间接法测定，然后将真蛋白加上非蛋白态氮得到的蛋白与红 外分析仪作校对。因为非蛋白态氨的蛋白值与粗蛋白的比值不是恒定的而随脲的含量变化而 变化这样如果用红外或其它仪器测定粗蛋白时就会有较大的误差。 1 3 4 计价体系的改变 根据2 0 0 0 年月1 月实施的美国联邦乳市场改革法令( f e d e r a l m i l k m a r k e t i n g o r d e r r e f o r m ) ， 美国的生乳收购采用真蛋白进行计价。早在美国以前，法国和澳大利亚已实施按真蛋白进行计 价的方法口”。根据美国国家奶牛改良协会( d h i a ) 的建议，这种计划的好处可以归纳为如下 几点： ( i ) 真蛋白较好地反应出乳的真正营养价值，在干酪加工中较好地反应出干酪的产量； ( 2 ) 目前广泛采用的以红外原理为基础的测定仪器不能识别非蛋白态氮。因此采用仪器测 定可以真实地测定出真蛋白的含量，仪器在标定时不需重新加上新修正系数。 同样采用新的真蛋白计价体系，同时存在一些问题，主要是： ( 1 ) 必须有先进的分析仪器作为保证，目前广泛应用的为红外分析仪超声波亦在理论和 实践方法取得突破，不久的将来亦可能广泛应用。 、 ( 2 ) 以前所得的数据和今后所得的数据之问以及世界各国的数据容易造成误会，特别是在 奶牛育种方面。解决的方法是通过瑞典的国际公牛中心( i n t e rb u l lc e n t e r ，s w e d e n ) 查询。事 实上目前只有法国、美国、澳大利亚全部采用真蛋白计价。 6 浙江大学硕士学位论文 1 4 牛乳的掺假 牛乳含有人体所必需的全部营养物质，是最容易被人们消化吸收的食物之一。近年来，随 着人们生活水平的不断提高，对牛乳营养价值的认识加深；乳制品的产量上升很快，从几年前 人均年消费8 公斤增加至2 0 0 4 年的2 5 3 公斤，年增长速度达到2 0 以上，其中2 0 0 4 年比2 0 0 3 年增长了2 5 左右。但快速的增长亦造成原料乳和乳制品掺假的现象非常普遍，尤其存在于一 些小型乳品加工企业中。 乳品掺假概括起来主要有两种方式：一是在牛乳中掺加合成乳，合成乳是由尿素、烹饪油、 清洁剂、苛性钠、糖、盐和去脂乳粉等在水中混和而成的，它不含有天然乳，没有天然乳所具 有的重要营养成分。二是往牛乳中兑水，然后为了增重再加入蛋白粉、豆浆、米汤、植脂末、 尿素、各种盐等来提高乳的比重及蛋白、脂肪含量f 2 3 】。 1 4 1 牛乳中常见的掺假物 牛乳中最常见的掺假物有：水、米汤、豆浆、淀粉、蔗糖、食盐、碳酸钠、双氧水等。这 些掺假物的掺加动机及危害见表1 - 1 。 1 4 2 乳制品掺假的现状 在经济利益的驱动下，个别乳品生产企业已不在局限于以往的造假方式开始使用部分食 品添加剂来掺假。目前乳制品中掺假主要是添加植脂末和动物水解蛋白 2 4 】。 ( 1 ) 植脂末 植脂末是以氢化植物油、酪蛋白、糖浆、麦芽糊精、乳化剂为主要原料，经过混合、乳化、 喷雾干燥生产而成的粉末产品，其组织结构类似奶粉因此又称奶精，是食品工业广泛采用的 高档原料。植脂末具有良好的溶解、乳化、分散性能，且与其他原料无任何排斥作用，在食品 工业中应用广泛，因其不易被氧化作用破坏，使产品保质期延长。可以在乳品、面食及冰淇淋 中全部或部分代替全脂乳粉。植脂末的油脂为植物油脂，在氢化过程中容易产生反式脂肪酸， 本质上区别于乳脂肪，营养价值很低。植脂末的价格比乳粉便宜半左右，个别乳品生产企业 利用植脂末的这些特性来提高乳制品的脂肪含量，达到以假乱真，降低成本，牟取暴利的目的。 浙江大学硕士学位论文绪论 浙江大学硕士学位论文 ( 2 ) 水解动物蛋白 水解动物蛋白是以动物蛋白质为原料，经严格控制的水解或酶解反应后，再经过喷雾干燥 等工艺精制而成。水解动物蛋白蛋白质含量高，富含多种氨基酸，是一种具有胶体保护性、表 面活性、保水性、粘结性、成膜性、乳化性等多方面特性的营养添加剂。水解动物蛋白可应用 于食品、医药、化工等多个行业中。个别乳品生产企业利用水解动物蛋白蛋白质含量高的特点， 通过在乳制品掺加来冒充乳蛋白质的目的。此外，目前水解动物蛋白的生产工艺会产生氯丙醇， 这是一种食品污染物，对人体健康有极大的危害。 1 5 乳粉蛋白质的检测方法 蛋白质作为乳粉理化指标之一其测定均采用g b t5 , 1 1 3 3 - 1 9 9 7 婴幼儿配方食品和乳粉 蛋白质的测定。g b t5 4 1 3 3 1 9 9 7 中规定的蛋白质测定方法为凯氏定氯法。凯氏定氮法是1 8 3 3 年由k i e l d a h l 首先提出的。是最为经典的蛋白质测定方法，测定结果的准确度和精密度都很高， 适宜于测定固态或液态的样品。直到现在，在国内外仍然应用普遍。 1 5 1 凯氏定氮法的基本原理 含氮的有机物与浓硫酸共同加热时，其中的碳、氢等元素被氧化成二氧化碳和水逸出，有 机氨转化为氨，并进一步与硫酸结合生成硫酸铵。通常称此过程为“消化”。 但是这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾来提高反应液的沸点，并加入硫酸铜 作为催化剂，以促进反应的进行，指示消化终点的到达。 浓碱可以使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓 度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液的氢离子浓度降低然后用标准无机酸滴定，直到恢复 溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所消耗标准酸的当量数计算出待测物中的总氮量，再乘 以蛋白质系数即为蛋白质的含量”。 1 5 2 凯氏定氮法的优缺点 凯氏定氮法是测定总有机氮的最准确的方法， 断的研究改进，该法具有应用范围广、灵敏度高、 是各种蛋白质含量测定方法的基础。经过不 回收率较好、使用仪器设各简单等优点。但 浙扛大学硕士学位论文 是该法操作费时，消化一个样品至少需要2 个小时，完成整个操作流程一般需要5 个小时左右， 并且在消化过程中产生大量的有害气体( 二氧化硫) 污染工作环境。危害操作人员的身体健康。 所以该法一般只能在实验室中由训练有素的实验员来完成”。 1 6 蛋白质的快速测定法 凯氏定氮法是生化研究中最基本的分析方法之一。为了达到能快速分析控制、减少环境污 染、简化操作过程、缩短测定时间等目的。人们又陆续创立了不少快速测定蛋白质的方法。如 双缩脲法、福林酚法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝法、近红外光谱法等m 】。现将研究较多、 应用较广的五种测定方法比较如下( 见表1 2 ) 。 1 7 分光光度法的选择 牛乳是一种多种物质的混合物( 乳糖，脂质，蛋白质，氨基酸尿素，肌酸酐等) ，它的组 成依赖于许多因素例如遗传育种，饲养计划和气候条件等。在过去的几年中，干酪的消费量增 加，因此牛乳中蛋白质含量的测定成为一个工业计价的重要因素。 采用分光光度法测定总蛋白普遍应用于很多领域 4 3 a q ，例如l 临床分析、生物化学、生理学、 药学研究以及很多其他领域。虽然凯氏法存在两个主要的问题，也就是，完成整个试验需要较 长的时间以及必需执行两种分析去测定非蛋白态氮( n p n ) 和总蛋白氮( t p n ) 之间的不同， 但是它被广泛应用于食品科学技术中并且作为一种公认的正式的标准参照方法。 目前，有许多关于分光光度法对于干扰蛋白质测定的物质的研究h ”。然而，并没有许多分 光光度法或者分光光度法和其他方法之间的比较研究，例如凯氏法。 在一系列乳粉样品蛋白质( 全腊奶粉，脱脂奶粉) 的测定中，本文进行了凯氏法与一些分 光光度法( 福林一酚法，考马斯亮蓝法) 之间的比较研究。 选择这些方法是因为它们容易操作并且它们之间是基于不同的反应。福林酚法( l o w r y 法) 中样品的吸光度依赖于一些氨基酸的浓度，同时也依赖于四肽的结合，因为它们能减少福 林酚试剂的还原性m ，4 7 郴1 。考马斯亮蓝法( b r a d f o r d 法) 是基于g 2 5 0 染料和蛋白质问的相互 作用，小肽或者氨基酸与g 2 5 0 染料没有任何反应。应该指出分光光度法的研究中考马斯亮 蓝法是唯一直接测量蛋白质的方法 4 9 , 5 0 , 5 1 】。选择福林酚法是因为在所有的分光光度法中，它 1 0 浙江大学硕士学位论文 是迄今为止最常用及研究的。 表i 2 不同蛋白质含量测定方法的比较 t a b l e1 - 2c o m p a r i s o na m o n gd i f f e r e n td e t e r m i n a t i o n so fp r o t e i nc o n t e n t 渐江大学硕士学位论文 1 7 1 福林一酚试剂法( l o w r y 法) f 1 2 0 o g 。o 艮r h n 、土r 。严仁。 少弋 f h ，o i 浙江大学硕士学位论文 素( o 5 ) ，硫酸钠( 1 ) ，硝酸钠( 1 ) ，三氯乙酸( o 5 ) ，乙醇( 5 ) ，乙醚( 5 ) ，丙酮 c 0 5 ) 等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只 须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会较浅，则必须提高 碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度l 2 倍。 ( 3 ) 注意点 进行测定时，加福林酚试剂时要特别小心，因为该试剂仪在酸性p h 条件下稳定，但上述 还原反应只在d h = 1 0 的情况下发生，故当福林- 酚试剂) j n n 碱性的铜一蛋白质溶液中时，必须 立即混匀，以便在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生 “】。 1 7 2 考马斯亮蓝法( b r a d f o r d 法) 1 9 7 6 年由b r a d f o r d 建立的考马斯亮蓝法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种 蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正得到广泛的应用。这一方法是目前灵 敏度最高的蛋白质测定法m 】。 ( 1 ) 实验原理 考马斯亮蓝g 2 5 0 染利存在着两种不同的颜色形式，棕红色和蓝色。在酸性溶液中它通过 范德华力与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置( l m a x ) 由4 6 5 n m 变为5 9 5 m n ，溶液的 颜色也由棕红色变为蓝色。在一定蛋白质浓度范围内( 1 0 1 0 0 0 1 t g m 1 ) 蛋白质和染料结合符 合比尔定律( b e e r 7 sl a w ) 5 6 1 。通过测定在5 9 5 n m 下的吸光度值a 5 9 5 ，可知与其结合蛋白质 的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 m i n 即可反应完全呈现最大光吸收，并可稳定 l h 之后，蛋白质一染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质一染科复合物具有很高的消光系数， 使得在测定蛋白质时灵敏度很高0 7 , 5 8 1 。 ( 2 ) 优缺点 优点： 灵敏度高，比福林酚法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 0 t g 。这是因为蛋白质与 染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有很高的消光系数，因而光吸收值随蛋 白质浓度的变化比福林酚法要大的多m 1 。 浙江大学硕士学位论文 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5 分钟左右。由于染 料与蛋白质结合的过程，大约只要2 分钟即可完成，其颜色可以在l 小时内保持稳定，且在5 分钟至2 0 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像福林酚法那样费时和严格地控制时 间i “。 干扰物质少。如干扰福林一酚法的k + 、n a + 、m 9 2 + 离子、ir i s 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、 巯基乙醇、e d t a 等均不干扰此测定法。 缺点： 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于不同蛋 白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用r 球蛋白为标准蛋白质以减少这方 面的偏差【6 2 】。 仍有些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、t r i t o nx 1 0 0 、十二烷基 磺酸钠( s d s ) 和氢氧化钠6 ”。 标准曲线在蛋白质浓度较大时有轻微的非线性，因而不能用b e e r 定律进行计算，而只 能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度“。 测定中，少部分蛋白一染料复合物会吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附最是 可以忽略的，实验完毕后可用乙醇将蓝色的比色皿清洗干净。 1 8 乳粉蛋白质快速检测的必要性 2 0 0 4 年，安徽阜阳农村“大头娃娃”的出现，引起了人们广泛的关注。这些婴儿头大，嘴 小，浮肿，低烧。令人震惊、愤慨的是，摧残、扼杀这些幼小生命的“元凶”，正是蛋白质等营 养指标严重低于国家标准的劣质婴儿奶粉。馊泛滥安徽单阳农村市场、由全国各地无良商人 制造的“无营养”劣质婴儿奶粉，已使1 8 9 名婴儿出现轻中度营养不良，1 2 名婴儿因重度营养 不良而死亡。 据分析制造劣质奶粉毛利率高达7 0 。为了牟取丰厚的利润，不法分子疯狂造假。他们 采用淀粉、蔗糖等价格低廉的食品原料，全部或部分替代乳粉再用奶精等添加剂进行调香调 味制造出的劣质奶粉，其中的蛋白质、脂肪、维生素以及矿物质含量远低于国家的相关标准， 导致婴幼儿营养不良、生长停滞、免疫力下降进而引发多种疾病造成死亡。 而蛋白质是评价乳粉质量好坏的标志性营养成分，根据国家卫生标准。婴儿配方乳粉i 蛋 1 4 浙江大学硕士学位论文 绪论 白质含量应不低于1 8 ，婴儿配方乳粉i i 、i i l 蛋白质含量介于1 2 1 8 之间，而这些劣质乳粉 的蛋白质含量低的只有0 3 7 、0 4 5 ，大多数只有2 、3 ，且维生素、矿物质含量也普遍不 合格。