（食品科学专业论文）利用原生质体融合技术进行米曲霉新菌株的选育.pdf

利用原生质体融合技术进行米曲霉新菌株的选育 食品科学专业 研究生唐洁指导教师车振明 摘要 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 是酿造业中的重要微生物，在其生长过程中 能分泌多种酶系，其中较重要的是蛋白酶，可将豆类中的蛋白质降解成多肽、 氨基酸等可溶性氮物，对酱油、豆瓣、米酒等的产率和风味起着重要作用；然 而现在工业用米曲霉菌株蛋白酶活性高的往往生长速度慢，生长速度快的菌株 往往蛋白酶活性低，这就大大降低了生产效率，影响了生产质量。所以目前我 国的酿造业中，米曲霉菌株的选育是个热点。现在国内对米曲霉菌株的选育方 法主要采用物理和化学的诱变，但是诱变工作量大，随机性也较大，不易得到 理想菌种。针对生产实践中的这一情况，本试验通过原生质体融合方法来选育 生长速度快且蛋白酶活力高的新菌株。原生质体融合，就是将双亲株的微生物 细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加 入物理的或者化学的或者生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝 集，通过细胞质融合，核融合，而后发生基因组间的交换重组，进而可以在适 宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，再通过合理的筛选程序，从再生细胞中 获得重组子的过程。 本试验选取了生长速度快但蛋白酶活性低的米曲霉菌株a s 3 9 5 1 和生长速 度慢但蛋白酶活性高的米曲霉菌株c i c c 2 3 3 9 作为原始亲本菌株。首先选用纤 维素酶、溶壁酶、蜗牛酶以7 ：3 ：1 比例混合配成复合酶对其细胞壁进行酶解 制备原生质体，其原生质体形成量约为1 0 0 个m l ；然后选用紫外、微波及超声 波三种不周的灭活方法进行双亲灭活，探讨每种灭活方法的最佳条件，并通过 所得融合子的性状选出最适合米曲霉的灭活方法。结果发现米曲霉菌株 a s 3 9 5 1 采用紫外灭活，米曲霉菌株c i c c 2 3 3 9 采用超声波热灭活方法，其 融合子性状最好。在选取最佳灭活方法的基础上，我们采用了原生质体电融合， 探讨了电融合的最佳条件，即成串脉冲频率1 m h z ，成串电压4 0 v ，融合脉冲 电压4 0 0 v ，脉冲宽度8 0 1 a s ，脉冲个数6 个；通过电融合初筛出一批新菌株， 并与传统p e g 融合法选育出的菌株进行了性状上的比较；最后对初筛出来的 米曲霉菌株进行传代实验，每隔两代通过福林一酚法测定其蛋白酶活力的高 低，最终得到三株融合菌株e f l 0 2 、e f l l 3 和e f l 7 7 ，它们的蛋白酶活力分别 为6 5 4 0u 幢、7 6 8 0u g 、6 5 0 0u g 。这三株融合株既具备亲本菌株a s 3 9 5 1 生长 速度快的特点，又具备亲本菌株c i c c 2 3 3 9 蛋白酶活力高的特点，同时遗传稳 定；其中，融合株e f l l 3 的蛋白酶活力还高于c i c c 2 3 3 9 。 关键词：米曲霉，蛋白酶，灭活原生质体，原生质体电融合，融合子 ar e s e a r c ho n s c r e e n i n gn e w s t r a i no f a s p e r g i l l u s o r y z a ew i t hp r o t o p l a s tf u s i o n s p e c i a l i t y f o o ds c i e n c e p o s t g r a d u a t et a n g j i e a d v i s o rp r o f e s s o rc h ez h e n m i n g a b s t r a c t a s p e r g i l l u so r y z a ei st h ei m p o r t a n tm i c r o o r g a n i s mi nt h e 自c t o r yo f b r e w a g e i t e x c r e t e dm a n yk i n d so f 嗣l 驴ed u r i n gi t sp r o c e s so fg r o w t h a m o n gt h e m , t h e m o s ti m p o r t a n te 1 z y m ei sp r o t e a s ew h i c hc a l ld e c o m p o s et h el e g u m ep r o t e i ni n t o m u l t i - p e p t i d ea n da m 劬a c i d s s oa s p e r g i l l u so r y z a ep l a y sas i g n i 丘c a n tr o l ei nt h e p r o d u c t i o na n df l a v o ro f f o o dm a n u f a c t u r i n gi n d 谢e s ，s u c ha ss o ys a u c e ，c h i n e s e b e a ns a u c e ，r i c ew i n ea n ds oo n h o w e v e r , t h es t r a i n so f a s p e r g i l l u so r y z a eo f t e n s h o w sl o wp r o d u c t i o na b i l i t yi nf a c t o r yp r a c t i c e ，f a l l i n gi nt h ec o n d i t i o n so fe i t h e r f a s t g r o w i n gs t r a i nw i t hl o wp r o t e a s ea c t i v i t yo rh i g ha c t i v i t yi ns l o w - g r o w i n go n e s t h i sp h e n o m e n o nd r o p p e dt h er a t i oo fp r o d u c i n g a n dd i f f i c u l tt of o r map r o d u c t l i n e a tp r e s e n t , t h em e a n 5o f s c r e e n i n g a s p e r g i l l u so r y z a em o s t l y a d o p t e dm u t a t i o n i no u rc o u n t r y , b u ti t sd i f f i c u l tt og a i na ni d e a ls t r a i n h e n c e ，o u re x p e r i m e n ti s s c r e e n i n ga s p e r g i l l u so r y z a ew i t l lp r o t o p l a s tf u s i o n p r o t o p l a s tf u s i o ni sap r o c e s s o fg a i nah e wf u s a n tf r o mt h er e g e n e r a t i o nc e l l f i r s t l y ，w ed e c o m p o s et h ep a r e n t s m i c r o o r g a n i s mc e l lr e s p e c t i v e l yb yt h ee n z y m ew h i c hc a ns e tf r e et h ec e l lw a l l ，a n d n l a k et h e mb e c o m ep r o t o p l a s t t h e nj o i nt h ep h y s i c so rc h e m i s t r yo rb i o l o g i c a l c o n d i t i o nt oh e l pf u s i o n , m a k ep a r e n t ss t r a i n s p r o t o p l a s tc o l l e c t e dt o g e t h e r , a n d m a k eg e n ec o m m u t a t i o na n dr e o r g a n i z a t i o nt h r o u g hc y t o p l a s mo rn u c l e u sf u s i o n t h e nc a l lr e b o r nt h ec e l lw a l lu n d e rt h ef e a s i b l ec o n d i t i o n a n dw ec a ns c r e e nt h e m t h r o u g hr e a s o n a b l ep r o c e s s h e n c e ，w ec a na c q u i r en e ws t r a i n s t h i se x p e r i m e n ts e l e c ta s p e r g i l l u so r y z a es t r a i na s 3 9 5 1a n dc i c c 2 3 3 9a s t h ep a r e n t ss t r a i n f i r s t l y ，w ec h o o s ec e l l u l a s e ，l y w a l l z y m ea n ds n a i l a s ea s1 y t i c e n z y m e s ，a n dt h em i x e dr a t i oo f t h e mi s7 ：3 ：1 w eg a i np r o t o p l a s ta l t e rs t r a i n s c e l l w a l ld e c o m p o s e db yl y r i ce n z y m e s ，a n dt h er a t i oo fp r o t o p l a s tf o r m a t i o ni sa b o u t 1 0 。m 1 s e c o n d l y ，w e r e s e a r c ho np r o t o p l a s ti n a c t i v a t i o n t h em e t h o d so f i n a c t i v a t i o na r eu l t r a v i o l e t i n a c t i v a t e ，m i c r o w a v e - i n a c t i v a t ea n du l t r a s o n i c - h e a t i n a c t i v a t e a f t e rr e s e a r c ht h eb e s tc o n d i t i o nf o ri n a c t i v a t i o nb ye v e r yd i f f e r e n t m e t h o d , w eg a i nt h er e s u l tt h a ta s 3 9 5 1i n a c t i v a t e db yu l t r a v i o l e ta n dc i c c 2 3 3 9 i n a c t i v a t e db yu l t r a s o n i c h e a t o nt h eb a s e o fi n a c t i v a t i o n ，w er e s e a r c ho nt h e e l e c t r of u s i o n t h eb e t t e rc o n d i t i o no fe l e c t r of u s i o ni s1 m h zf o rp u l s ef r e q u e n c y , 4 0 vf o rp r e s s u r eo fb e i n gs t r i n g ，4 0 0 vf o rf u s i o np u l s ep r e s s u r e ，8 0 p sf o rp u l s e w i d t h ，6f o rn u m b e ro f p u l s e t h r o u g he l e c t r of u s i o n ，w eg a i ns o m en e ws t r a i n sa n d c o m p a r e dw i t ht h es t r a i n sw h i c hf u s e db yp e g a tl a s t , w es c r e e n e dt h r e ef u s e d s t r a i n sw h i c hn a m e de f l 0 2 ，e f i1 3a n de f 2 2 2 b o t ho ft h e mr e p r e s e n t e dw e l l c h a r a c t e r i s t i c s t h e p r o t e a s ea c t i v i t yr e a c h e d6 5 4 0 u g ，7 6 8 0 u ga n d6 5 0 0 u g r e s p e c t i v e l y , t h ea c t i v i t yo f e f l l 3m u c hh i g h e rt h a np a r e n ts t r a i n a s 3 9 5 1 k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u s o r y z a e ，p r o t e a s e ，i n a c t i v a t e dp r o t o p l a s t ，f u s a n t ， p r o t o p l a s te l e c t r of u s i o n 西华大学硕士学位论文 申明 本人申明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含其他人已经 发表或撰写过得研究成果，也不包含为获得西华大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师的指导下取得的，论文 成果归西华大学所有，特此申明。 作者签名届 k2 0 0 7 年5 月1 日 秘猢。日 6 6 西华大学硕士学位论文 0 引言 米曲霉( a s p e r g i l l u s o r y z a e ) 属于丝状真菌中的半知菌亚门，为丝孢纲、丝孢 目、丛梗孢科、黄曲霉属，属于需氧型丝状真菌，察氏培养基上，菌落形成较 快，培养1 0 天后，直径可达5 , - 6 厘米，质地疏松，中央呈现絮状，初为白 色、黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。米曲霉孢子萌芽条件是水 分活性0 7 5 , - , 0 9 ，最适温度2 8 - 3 2 ，p h 6 5 7 5 。生长水分为3 4 - , 4 5 ，生长 最适温度为3 2 , - - 3 5 ，生长p h 6 5 “8 ，产酶温度2 8 3 0 【i 2 】。 米曲霉是酿造业中的重要微生物，在其生长过程中能分泌多种酶系，其中 较重要的是蛋白酶，可将豆类中的蛋白质降解成多肽、氨基酸等可溶性氮物， 对酱油、豆瓣、米酒等的产率和风味起着重要作用；然而现在工业用米曲霉菌 株蛋白酶活性高的往往生长速度慢；而生长速度快的菌株往往蛋白酶活性低， 这就大大降低了生产效率，影响了产品的质量。提高米曲霉的蛋白酶活力，可 以提高原料的利用率，缩短生产周期，降低成本，这也是利用米曲霉进行生产 的企业长期以来的奋斗目标【3 】。目前我国的酿造业中，米曲霉菌株的选育主要 采用物理和化学的诱变方法。i 刍f e r e n c z y 于1 9 7 4 年首次报道了白地霉营养缺陷 型突变株的原生质体融合之后，人们发现原生质体融合技术大大提高了菌种选 育的成功率，所以原生质体融合工作在丝状真菌中广泛开展。目前国内外利用 原生质体融合技术选育生长速度快、蛋白酶活性高的米曲霉菌株是一个热门课 题。 在米曲霉的原生质体融合育种方面，古屋武【4 】等( 1 9 8 3 ) 利用生长速度快 和蛋白酶活性高的菌株间进行了原生质体的融合获得了较好的二倍体菌株；我 国的邢来君【5 】等( 1 9 8 9 ) 也做了此类研究并选育出蛋白酶活力为6 8 7 8 5 t m i t g 的 高产菌株。近年来，尤其是日本这方面的报告甚多，牛岛重臣同( 1 9 8 4 ) 利用 高产蛋白酶和高产谷氨酰胺酶的菌株间进行了融合，并对其菌株进行了研究。 但是，现在国内外对米曲霉的原生质体融合育种多是利用诱变后得营养缺陷型 菌株作为融合亲本菌株的遗传标记，这就在很大程度上增加了选育的工作量， 而且这些遗传标记还往往会干扰菌株的正常代谢，影响菌株的一些重要性状。 针对生产实践中的这一情况，本试验选取了生长速度快但蛋白酶活性低的 西华大学硕士学位论文 米曲霉菌株a s 3 9 5 1 和生长速度慢但蛋白酶活性高的米曲霉菌株c i c c 2 3 3 9 作 为原始亲本菌株，采用复合酶对其细胞壁进行酶解制备原生质体，然后选用不 同的灭活方法进行双亲灭活后融合，从而选育生长速度快且蛋白酶活力高的米 曲霉新菌株。本实验采用了紫外、微波及超声波灭活的方法，探讨了几种灭活 方法的最佳条件，并通过融合率的大小以及筛选出的融合株的性状比较几种灭 活方法的优劣；在选取最佳灭活方法的基础上，采用了原生质体电融合，探讨 了电融合的最佳条件，并与p e g 融合法选育出的菌株进行了性状上的比较； 最后对初筛出来的米曲霉菌株进行传代，以判定其遗传稳定性。 2 西华大学硕士学位论文 1 原生质体融合文献综述 原生质体融合( p r o t o p l a s tf u s i o n ) 技术是起源于2 0 世纪6 0 年代，于7 0 年代发展起来的基因重组技术。1 9 6 0 年法国的b a r s k i 研究小组在混合培养两 种不同类型的动物细胞时发现了自发融合现象m 。f o d o r t s j 和s c h a e f f e r 于19 7 6 年分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物原生质 体融合现象得到证实，并建立起了相应的实验体系 9 1 。匈牙利的p e s t i 1 哪于1 9 7 9 年首先提出了融合育种提高青霉素产量的报告，进而开创了原生质体融合在实 际工作中的应用。 原生质体融合，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成 原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或者化学的或者生物的助 融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，而 后发生基因组间的交换重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁 来，再通过合理的筛选程序，从再生细胞中获得重组子的过程。原生质体融合 开辟了育种工作的新途径。 微生物遗传育种可以通过以下多种途径进行。利用物理、化学因素单独或 复合处理诱发突变是行之有效的，但是诱变工作量大，盲目性也大。一株菌种 经多次处理以后，其生活能力逐渐下降，例如孢子量减少不利于保藏和传代， 对环境的适应性减弱等。在连续多次处理后，菌株往往对诱变剂不再那么敏感， 难以进一步提高，并且对于某些菌株来说，诱变作用并不明显【1 1 】。 基因重组是微生物育种的重要途径。微生物中的有性杂交、准性生殖、转 化、转导都是基因重组在细胞水平上的反映。然而，基因转移并非所有微生物 都可以发生，原因是有性重组局限很大。迄今发现有杂交现象的微生物为数不 多，原核生物中发生结合出现基因重组是极为罕见的，一般只有1 0 击的概率， 对于无有性过程的微生物，并不是都能通过准性生殖发生基因重组。至于转化， 也只有部分微生物中发现，而且在可以转化的种属中，能进行转化的菌株很少， 这是目前转化育种的障碍。转导育种的关键是选择一种合适的温和性噬菌体作 媒介，把供体d n a 携带入受体细胞，这也不是能够普遍进行的。总之，要实 现基因重组并不容易，存在很多困难。 3 西华大学硕士学位论文 基因工程是现代生物技术中最引入瞩目的一方面，是微生物育种能够定向 的途径，因而也就要求有精密的实验、昂贵的酶制剂、高精的仪器设备，一般 实验室很难具备这些条件和实验水准。 微生物原生质体融合技术作为育种方法来说也有其缺点，主要是工作量 大、定向性差，然而与上述种种方法相比，它却有着以下几方面的优点【l2 】： ( 1 ) 去除了细胞壁的障碍，使得没有有性过程、没有转化和转导系统的 微生物，或者是相同结合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，而且可 以冲破种、属的界限，广泛地在有生产价值的微生物种间以至属间进行杂交育 种： ( 2 ) 原生质体融合后，两个亲株的整套基因组相互接触，可以有机会发 生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子； ( 3 ) 重组频率高； ( 4 ) 可以和其他育种方法相结合，把从其他方法得到的优良性状通过原 生质体融合再组合到一个单株中，又可以多个亲株融合一体； ( 5 ) 可以进行包含非活性原生质体的融合，即用温度、药物或紫外线照 射处理钝化亲株一方的原生质体，然后再与一亲株的活原生质体相融合，这样 可以在筛选中除去亲株一方，提高筛选效率； ( 6 ) 融合工作要求设备条件不高，一般实验室都可以进行。 原生质体的制备过程中受影响的因素主要有培养基成份、培养方法、菌 龄、酶浓度、酶处理温度与时间、p h 值、渗透压稳定剂等。制备的原生质体己 经失去细胞壁j 仅有一层厚约1 0 n m 的细胞膜，它具有生物活性，但不是正常的 细胞，在普通培养基上不能生长，必须涂布于再生培养基上，使之再生为正常 的细胞。再生培养基需补加两类物质：一类是蛋白质、糖类或氨基酸等营养因 子：另一类是渗透压稳定剂。n a n n en a n n i n g 和c o s t e rj w 等( 1 9 8 5 ) 认为原生 质体形成、再生的适宜条件为蔗糖( 或甘露醇) 、丁二酸钠、k c l 、m 9 2 + 等适 宜浓度的高渗环境 ”】。不同的原生质体在培养基成分、培养温度等方面所需求 的再生条件有差别。在本实验中对于米曲霉原生质体制备菌龄、酶浓度、渗透 压稳定剂、酶处理时间等因素做了研究。 膜的融合是生物界中的普遍现象，如受精、胞饮、肌纤维的形成等均涉及 4 西华大学硕士学位论文 到膜的融合。在1 9 5 4 年，s t a h e l i n 就曾用连续照相追踪了炭疽杆菌的原生质体融 合。1 9 8 5 年，日本的冈田善雄发现灭活的仙台病毒可以诱发细胞融合，从而奠 定了细胞融合的技术基础。目前普遍采用的化学融合方法是在1 9 7 4 年才建立起 来的，当时，高国楠发现聚乙二醇( p e g ) 在c a 2 + 存在下能促使植物原生质体 融合，并显著提高融合频率。接着，p e g 的促融作用很快在微生物中得到证实， 成功地实现了酵母菌、霉菌、放线菌和细菌等多种微生物在株内、株间、种间 以及属问的融合，从而使原生质体融合技术在微生物方面形成了一个系统的实 验体系。目前，原生质体融合已成为微生物遗传育种的一种新工具。 近年来，随着分子生物学和分子遗传学的迅速发展，原生质体融合技术已 成熟的应用于微生物的遗传育种实践中。原生质体融合技术的特点是不依赖微 生物自身的结合能力，而是将杂交的两个亲株通过酶解作用加以剥除了细胞壁 并在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体【，然后在特定的 条件下促使其互相融合，并进而使两个亲株的遗传物质之问发生接触、交换以 产生重组体，并通过使原生质体再生细胞壁获得重组子。原生质体融合的基因 重组频率不仅比一般杂交高，而且可将重组的范围由种内扩大到种间甚至属 间。 原生质体融合育种一般包括如下步骤【”】：标记菌株的筛选；原生质体 的制备：原生质体的再生；原生质体的融合；融合子的选择；实用性 菌株的筛选。其基本过程如图1 所示。 5 西华大学硕士学位论文 f i g 1t h ep r o c e s so f p r o t o p l a s tf u s i o n 图1 原生质体融合过程示意图 1 1 原生质体融合的技术路线 1 1 1 亲本菌株的遗传标记 在原生质体融合的过程中，通常所用的亲株均要有一定的遗传标记以便于 筛选。亲本菌株的标记是否适当与融合子的检出效率和融合子中优良性状的保 持有很大的关系【1 6 】。当然，所需的目的基因并不一定与标记基因连锁，但它毕 竟可以大大减少工作量，提高育种效率。融合亲株获得遗传标记的方法可采用 常规的诱变育种方法，一般可以以营养缺陷和抗药性等遗传性状为标记。在此 必须注意的是标记必须稳定。采用抗药性菌株时，抗药性除可以作为标记外， 在实验中还可以排除杂菌污染的干扰。至于标记的数量，s c h a e f f e r 指出，每个 亲株都各带有两个隐性性状的营养缺陷标记就可以排除以后实验结果中获得 的原养型融合子是回复突变的可能。所以选择性标记也无须过多。如果已知融 合频率较高，为了减少标记对菌株正常代谢的干扰，也可以采用仅有一个标记 的菌株作为融合亲本。当然，最好选择对菌株生产性能没有影响的标记。特别 是对于工业生产菌来说，用诱变方法获得标记，往往对该菌株的生产性能影响 甚大。因此，在选择标记时，尽可能采用该菌株自身已带的各种遗传标记。 6 各种融台子v 圆圆蔫溘藩摧超嚣撇 腻槲一一一 一一 趴刮艚 黼 缝一一 捷一一 柽一 。四 群 西华大学硕士学位论文 除此之外，常用的亲本标记方法还有荧光染色标记、原生质体灭活等，也 可以采用孢子颜色和菌落形态等作为标记。实际应用中应根据不同的实验目的 确定遗传标记方法。 1 1 2 原生质体的制备与再生 1 1 2 1 原生质体的制备 制备原生质体，是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁 组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。 早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质 体，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体【1 7 】。在制备细 菌、放线菌的原生质体时，主要使用溶菌酶作为工具酶。但也有例外，1 9 8 7 年 t e m e y e r 等发现，b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s 的细胞壁对溶菌酶、几丁质酶、胰蛋白 酶以及蛋白酶等具有抗性，却可以被来自于本身的溶壁酶或者突变溶菌素 ( m u t a n o l y s i n ) 降解。对于酵母菌、霉菌，大型真菌，由于其细胞壁组成更为 复杂，人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几 丁质酶等。 不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同，而且所需酶量也存在着 差异。周东坡【ls 】等研究发现，在使用溶菌酶制f k b a c i l l u ss u b t i l i s1 3 2 的原生质体 时，最适酶浓度为0 2 5 m g m l ，而对于b i l l u ss u b t i l 妇1 5 1 ，最适酶浓度则为 0 2 m g m l 。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶浓度过大时，酶 中往往含有对原生质体有害的酶类( 如过氧化物酶、核糖核酸酶等) ，髓着酶 量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时，必然会影响原生质 体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集，难于原生质体化；而且，细胞脱壁太 彻底，必然降低原生质体的再生率。 酶解温度也可以直接影响到原生质体化程度。人们多采用3 5 3 7 或 4 2 。放线菌的最适酶解温度为2 8 3 7 ，真菌的最适酶解温度为3 0 3 5 。 一般来说，最适酶解温度都要高于微生物的最适生长温度。在低于最适酶解温 度时，随着温度的升高，原生质体制备率不断提高，高于最适酶解温度，原生 质体的产量明显减少。 7 西华大学硕士学位论文 酶解时间在原生质体制备过程中也是一个非常重要的因素。周东坡等对 b a c i l l u ss u b t i l i s 酶解2 0m i n ，对c o r y n e b a c t e r i u mp e k i n e s e 酶解2 h ，可以使其完全 原生质体化。如果继续延长酶解时间，则再生率随酶解时间的延长而显著降低。 g a l l m e t z e r 在$ 1 ：各r p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u m 的原生质体时，酶解时间从2 0r a i n 延长到3 h ，原生质体制备率提高3 倍。k r e g e r 等报道用蜗牛酶制备s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 的原生质体约需3 6 h ，s a g a r a $ o 备g e o t r i c h u mc a n d i d u m 原生质体的时 间约为7 1 0 h 。可见，不同微生物的最适酶解时间差异很大。 原生质体制备液的p h 值，也可以直接影响到原生质体的制备。因为只有在 最适p h 值时，酶的活性才最高，酶促反应速率才最大。周东坡 1 8 , 1 9 】等制备 b a c i l l u ss u b t i l 括的原生质体时，认为p h 值7 5 左右为最适p h 值，p h 值低于7 o 则 对原生质体的制备率影响较大，而p h 值7 5 8 5 范围内影响较小。e y s s e n 发现 p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m 在p h 值4 o 8 0 的范围内均可释放原生质体，但5 5 为最 适p h 值。 制备原生质体前对菌体进行预处理，是提高原生质体制备率的有效手段。 它包括两个方面的内容，一是在培养菌体的过程中，人为控制培养条件，以改 变菌体的生长与生理状态，以便更有效地制备原生质体。周东坡等在制备 c o r y n e b a c t e r i u m p e k i n e s e 的原生质体时，在其对数生长初期加入了o 8 u g r a l 的青 霉素，由于影响到菌体细胞壁的形成，增强了菌体对溶菌酶的敏感性，便于原 生质体化。二是对己培养好的菌体在酶解前通过适当的药物处理，改变细胞壁 的结构，有利于酶对细胞壁的降解作用，常用的处理剂有b - 琉基乙醇、二硫苏 糖醇等。 由于原生质体对渗透压非常敏感，渗透压稳定剂对于原生质体的制备起着 重要作用。常用的渗透压稳定剂有k c i 、n a c i 、c a c l 2 、m g s 0 4 等无机盐和蔗 糖、甘露糖、山梨醇等，一般说来，丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜， 而酵母菌则使用糖或醇做稳定剂比较好。 此外，培养基组成、菌体浓度、菌体分散程度和遗传性等因素，也会不同 程度地影响到原生质体的制备。 8 一 西华大学硕士学位论文 1 1 2 2 原生质体的再生 原生质体再生是在稳定的再生培养基上重新形成细胞壁，恢复正常细胞形 态并继续生长繁殖，直至形成菌落的过程。处于不同生长时期的菌体，对各种 酶的敏感性不同，原生质体的制备率不同，而且原生质体的活性差异也很大， 许多学者认为，较年轻的细胞易制得大量的原生质体，同时此阶段的原生质体 再生率也较高【i 蜘。菌丝不同部位细胞释放的原生质体也有差异，一般顶端菌丝 比老菌丝产生的原生质体再生能力要强。酶解时间与原生质体再生率密切相 关，酶解时间过长会使再生率降低。 再生培养基是原生质体进行再生的最重要的外界因素之一【2 0 】。再生培养基 一般来说是在菌体正常生长的培养基中，补加两类物质，一类是营养因子，另 一类是渗透压稳定剂。真菌的再生培养基中常常补加酵母膏、蛋白质、糖类或 氨基酸等作为营养因子，而细菌、放线菌的再生培养基中常补加水解酪蛋白、 血清白蛋白、氨基酸和琥珀酸钠等作为营养因子，这些物质可能是作为细胞壁 合成的前体物质，也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢， 加速细胞壁合成的作用。用于再生培养基中的渗透压稳定剂有k c l 、n a c l 、c a c l 2 和m g c l 2 等无机离子物质和蔗糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和琥珀酸钠等有机物 质。再生培养基中的碳源会影响原生质体的复原率；加入含c a 2 + 、m 9 2 + 的稳渗 剂或加入蛋白质、氨基酸等营养因子可提高原生质体的再生率。有报道表明， 在真菌类原生质体制备时，以0 6 mm g s 0 4 作为原生质体稳定剂，可提高原生 质体的再生率【l8 j 。此外，加入某种菌体细胞壁提取物有利于原生质体细胞壁的 再生，如法国的s c h a e l l e 在再生培养基中加入大肠杆菌细胞壁制剂或热灭活大 肠杆菌细胞壁浓缩液，使细菌原生质体再生率增加l o 倍f 9 j 。 原生质体再生可以通过固体培养或液体培养两种方式完成，但是同液体培 养法相比，固体培养法明显有利于原生质体的再生。 此外，原生质体的再生率还受菌体预处理的方式、酶浓度、酶解温度、原 生质体的贮存时间和贮存方式、原生质体密度、再生方法、其本身的结构及是 否加入引物和琼脂硬度等多种因素影响。 9 西华大学硕士学位论文 1 1 3 原生质体的融合 原生质体融合就是将制得的原生质体在高渗的条件下混合，加入化学或物 理融合剂，使双亲株的原生质体发生凝集，细胞核融合，进而基因重组的过程。 1 1 3 1p e g 融合法 原生质体融合过程中，融合剂是关键。c a o 等人在1 9 7 4 年研究植物原生质 体时，发现了聚乙二醇( p l o y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 能大幅度诱导原生质体融 合。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。c a o 认为，p e g 分子中常有醚键，使其显示出弱的负电荷，可与水、蛋白质、糖类 分子的正电基团形成氢键，而使原生质体连在一起发生凝集，这种作用还可以 由于c a 2 + 的存在而加强。为了发挥p e g 促进细胞融合的效力，必须采用较高的 浓度( 4 0 5 0 ，分子量为6 0 0 0 ) ，但p e g 在高浓度下，细胞可能因脱水而受 到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是p e g 融合技术的 关键。 现在一般认为p e g 诱导原生质体融合的机制为【2 1 】：( 1 ) p e g 以一种分子 桥的形式沟通了相邻的质膜；( 2 ) p e g 改变了膜的通透性；( 3 ) p e g 降低了 质膜表面的势能；( 4 ) p e g 使质膜中镶嵌的蛋白颗粒凝聚，出现了容易融合 的无蛋白质颗粒的磷脂双层区域。 细菌一般用3 0 5 0 ( w v ) p e g ；真菌则采用2 5 3 0 ( w v ) 高分子 量的p e g ，p h 9 0 为佳；而曲霉属则采用2 0 p e g 6 0 0 0 ，母液为0 0 0 1 mc a c l 2 和 0 0 5 m 甘氨酸，p h 7 5 t 12 1 。k k a v 蚰a 曲等人对酿酒酵母的融合实科”】表明，采 用p e g 3 3 5 0 并：b l l n c a ( c h 3 c o o ) ：，浓度4 0 ，p h 7 0 ，融合频率最高；日本学者 m u n e k a z uk i s h i m o t o 2 7 】将嗜冷酵母与中温酵母通过p e g 融合，构建出低温果酒 增香酵母，发酵试验证明，苹果酸、乙醇、苯乙醇、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯 的产率较中温酿酒酵母有所提高。庞小燕 2 2 】等以酒精酵母和热带假丝酵母为亲 本，通过原生质体p e g 融合技术，获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的稳 定的酵母融合株，酒精发酵产量可达8 8 和1 1 5 。 p e g 诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点， 在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然p e g 作为融 1 0 西华大学硕士学位论文 合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较低及 经验性大等缺陷。近年来，一种物理融合技术细胞电融合技术迅速堀起并 显示出强大的生命力。 1 1 3 2 电融合技术 原生质体电融合是起始于2 0 世纪8 0 年代的细胞改良新技术。自1 9 7 8 年 z i m m e r m a n n t ”】与1 9 7 9 年s e n d a 报道了电脉冲诱导植物细胞融合成功后， z i m m e r m a n n 及其同事做了大量的工作，终于在1 9 8 1 年创立了电场诱导融合技 术，这一技术将电学与生物化学恰当结合，产生了缓和而高频率的原生质体融 合效果。故原生质体电融合被视为遗传工程和细胞改良的有效手段。其原理是 在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿( r e v e r i s b l eb r e a k d o w n ) ， 瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发 生在两个相邻细胞的接触区域，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融 合【2 3 1 。 a b c f i g 2t h e 缸i l i t ya n d t h e o r yo f e l e c t r i c a lf u s i o n a t h em u l t i - p a r a l l e le q u i p m e n to f e l e e w i e a lf u s i o n ；b t h em i n i - c h a m b e ro f e l e c t r i c a lf u s i o n ； c p r o t o p l a s t sa r r a n g e dt h es h a p eo f c l u s t e r , a r i s e dt of u s i o ni nt h ea l t e r n a t i n ge l e c t r i cf i e l d 图2 电融合设备及原理图 a _ 平行多电极融合装置示意图；b 电融合微室示意图上：俯视图下：侧面； c 在交流电场中原生质体排列成念珠状、发生融合 蜘 一 一 一 一 一 一一 一i一 il一 西华大学硕士学位论文 在动物细胞方面，张铭等以草鱼( c e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 尾鳍组织 h g c 一8 7 细胞为材料，应用自制的b p 一8 8 型细胞电融合仪对鱼类细胞的电融 合条件进行了探讨和研究。在植物细胞杂交领域，用电融合方法也可以高频率 地融合植物原生质【2 5 2 6 ，并已获杂种植株【2 7 捌，与以往的病毒及化学融合方法 相比较，电融合存在操作简单，无化学毒性，对细胞损伤小，融合同步，可在 显微镜下观察融合过程以及融合率高的特点。b a t e s 2 9 等用z i m m e r m a n n 电融合 法进行烟草种内体细胞杂交，实验结果表明，抗体杂种的克隆形成 ：l p e g 法高 1 0 1 0 0 倍。 事实证明，该技术不但广泛用于动物和植物的细胞融合，而且在各类微生 物细胞的改良中也十分有效。如原核微生物克氏固氮菌与枯草芽孢杆菌的原生 质体融合；真核微生物中的酵母菌、霉菌中的黑曲霉以及食用真菌中的蘑菇等 均有原生质体电融合的报道。u s h i j i r n a l 3 0 等人曾成功地将米曲霉( a s p e r g i l l u s o r y z a e ) 和酱曲霉( a s p e r g i l l u ss o j a e ) 进行种间电融合。我国的周正红【4 6 】等将 黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) n 一1 1 ，n 一1 6 进行种内电融合，得到了性状优于 亲本菌株的杂合二倍体，其融合率为6 0 。余荔华【3 ”等通过米曲霉( a s p e r g i l l u s o r y z a e ) 与黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 的种间电融合，得到了稳定的重组子， 且生长速度快，蛋白酶活性高。 该法的优剧2 3 】：其一是在控制条件下，即一定强度的电脉冲和时间，对细 胞无毒无害，融合后的原生质体再生能力强；其二是直观性，操作可以在显微 镜下直接进行，能够全程观察到融合过程及融合后的细胞。再通过显微操作直 接将融合子移植到培养基上培养；其三是融合率较高，一般可达7 0 8 0 ，甚 至1 0 0 ；其四是膜的改变仅限于接触部位，整个原生质体所受的损伤较小， 可有效利用的原生质体比例较高。缺点是需要在专门的电融合仪和配套的融合 小室上进行，所需的设备费用较贵。 1 1 3 3 激光诱导原生质体融合技术 激光融合是让细胞或原生质体先紧密贴在一起，再用高峰值功率密度激光 对接触处进行照射，使质膜被击穿或产生微米级的微孔。由于质膜上产生微孔 是可逆过程，质膜在恢复过程中细胞连接小孔的表面曲率很高，处于高张力状 1 2 西华大学硕士学位论文 态，细胞逐渐由哑铃形变为圆球状时，说明细胞已融合了。影响原生质体的关 键是要控制微束激光的能量级，应使其稍低于质膜上产生明显微孔的能量密度 【1 3 】。 1 9 8 7 年始利用激光诱导融合的技术迅速发展起来，并很快被应用在动物细 胞及植物原生质体的融合中，后来又被用于微生物原生质体融合中。1 9 9 8 年陈 五岭【6 9 j 等又报道了激光诱导融合红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体。 激光融合优点是毒性小，损伤小，但由于其所需设备昂贵复杂，操作技术 难度大，很难推