（食品科学专业论文）发酵法乳清蛋白小肽产量分析及控制条件的研究.pdf

摘要 乳清是干酪生产的副产品，乳清中含有蛋白质、乳糖、维生素、矿物质等营养物质，通过优化干 酪乳杆菌与嗜热链球菌的混合发酵条件，可水解乳清中的乳清蛋白，可获得的发酵产物为二肽、三肽、 四肽等小肽。 针对这一问题主要进行以下研究： 以干酪乳杆菌与嗜热链球菌增长量为指标t 首先采用单因素试验，对干酪乳杆菌与嗜热链球菌 在乳清中发酵条件进行了研究，得到两者在乳清中混合发酵的最佳单因素范围。 以乳清蛋白水解度为指标，采用响应面设计优化试验条件。首先通过p l a d c e t t - b u s u a m 设计筛选 试验因素，再进行b o x - b e h n k e n 组合设计，研究干酪乳杆菌与嗜热链球菌混合发酵乳清产肽条件，获 得最佳发酵组合。研究结果为：干酪乳杆菌与嗜热链球菌混合比例1 ：1 。乳清中蛋白质与乳糖比例 为3 ：5 ，乳清物质，乳清千物质浓度为9 4 5 ，干酪乳杆菌与嗜热链球菌混合接种量4 1 7 ，发酵时 间6 5 h 。最佳乳清蛋白水解度为6 2 5 。 采用h p l c 法测定最佳优化发酵组合下发酵液中二肽、三欣、四肽等小肽含量。测得二肽含量 为1 4 4 m g m l 、三肽含量为1 5 5 m g m l 、四肽含量为5 2 7 m g m l 。 经研究得出结论，利用干酪乳杆菌与嗜热链球菌混合发酵乳清可以得到部分蛋白水解产物。 关键词：乳清粉发酵乳酸菌小肽 a b s t r a c t t h ew h e ti sak i n do f b y - p r o o u c to f t h ec h e e s ep r e d u e t i o p _ p r o t e i n l a c t o s e ，v i t a m 札m i n e r a la n do t h e r n u t r i t i v em a t e r i a lw a si n v o l v e di nt h ew h e y o p t i m i z i n gt h ec o p i l l 越ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no f t h el c 砸e f s u b s p c a s e ia n d t h es t r e p t o c o c c u st h e r n o p h i l 淞，w h e yp r o t e i nw a sh y d r o l y z e d ，a n dd e p e p t i d e ，埘p 印n d e ， t e t r a p e p t i d ea a do t h e rl i t t l ep e p t i d ew a sa c q u i r e d t h es t u d yi sa sf o l l o w st ot h eq u e s t i o n ： ( d t a k i n gt h ei n c r e m e n to f l e a s e ls u b s p c a s e ia n ds t r e p t o c o c c u st h e r n o p h i l u sa st h ei n d i c a t o r s , t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t h et w os t r a i n sw a ss t u d i e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t , a n dt h eo p t i m u m 渤g e o f e a c hs i n g l ef a c t o rw a sc o n f i r m e d r a k i n gt h ed e g r e eo f h y d r o l y s i s 如t h ei n d i c a t o r , e x p e r i m e n tc o n d i t i o n sw e 他o p t i m i z e db yr s lf i r s t l y , t h e 懿非r i 删f a c t o r s 懈s c r e e n e d b y t h e d e s i g n o f p l , e d e e t t - b u s p l a d c c t t - b n s u a m u a m t h e n t h e c o p u l a t e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r cs t u d i e db yt h ed e s i g no f b o x - b e h n k e n a n dt h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o m b i n a t i o n w a sc o n f i r r a e d ：t h er a t i oo f l c a s e i s u b s p c a s e ia n dt h es t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u si sl ：l ；t h er a t i oo f t l w h e yp r o t e i na n dt h el a g l o s ei s3 ：5 ：t h ew h e ya n dt h es o l i dw h e y s u b a a n e w a s9 4 5 ；t h ei n o c u l a t i o n d o s a g e i s 4 1 7 0 6 ；t h e f n e n t a f i o n t i m e i s 6 5 h ；t h e b e s td c 晷翳o f h y d r o l y s i s o f w h e y p r o t e i n i s 6 2 5 t h ed e p e p t i d e ，t r i p e p t i d e ，t e t r a p e p t i d ea n do t h e rl i t t l ep e p t i d ew 自l ed e t e c t e db yh p l c t h e n t e n to f d e p e l n i d e i s1 4 4 m g m l , t h ec o t e m o f t r i p e p t i d e i s1 5 5 m g m l , t l c o n t e f n o f t e _ 咖| p 唧b d e i s5 2 7 m g m l t h er e s u l ts h o w e dt h 缸p a r to f t h ep r o d u c to f h y d r o l y s i sw a sa c q u i r e db yt h ec o p u l a t ef e r m e n t a t i o no f t h e c a s e is u b s p e e ia n dt h e r e t n o e o e c u st h e r n o p h i l u s k e y w o r d s ：w h e yp o w d e r ；, f e r m e n t i o n ；l a c l o b a c i l l n sl a c t i c ；o l i g o p e p t i d e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 1 磊 时间：& 田1 年月7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不 同方式在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间：文一7 年月序日 时间：矽叼年b 月矿日 臻叶 ：厄v 鲁 i 签 蛐 酩 触 程 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第章g l 言 第一章引言 干酪是乳制品中最主要的产品之一，世界上每年生产的牛奶约有4 0 左右用于加工千酪【” 在生产干酪的同时，也产生了大量的乳清，而乳清的利用仅仅限于饲料加工或作为食品加工中 的配料 乳清是一种总干物质含量在6 0 0 - 6 5 的不透明浅黄色液体，固形物占原料乳中总固形物 含量的一半。乳清中的营养成分丰富，其中乳糖含量占7 0 以上，乳清蛋白含量为o 7 左右。 此外，乳清中还有牛乳中的磷脂、脂肪、矿物质及维生素等营养物质【3 】【】。 乳清蛋白是一种优质蛋白，其利用价值极高，如何有效的利用乳清蛋白，是近几年食品科 学界研究的热点之一。 1 1乳清的成分及性质 乳清粉就是液体乳清的干燥产品，乳清粉的生产过程基本与奶粉生产工艺设备相同。乳清 粉根据加工方法的不同，可基本分为四大类：甜性乳清粉、酸性乳清粉、脱盐乳清粉、低乳糖 乳清粉【9 j 。表1 - 1 为这几类乳清粉的组成 1 1 1 乳糖 表1 1 几类乳清粉的组成( ) t a b l e 卜it h ec o l l l p o s eo f s e v e r a lt y p e so f w h e yp o w e r ( ) 乳清粉中的糖类几乎都是乳糖，莪耱不仅可以为机体提供能量，还有多种营养保健功能。 但因其易吸潮而限制了它的应用，目前市售乳清粉系列中出现了通过去除部分乳糖制得的低乳 糖乳清粉1 6 】；乳清浓缩蛋白( w p c ) ，包括w p c 3 0 、w p c 4 0 、w p c 5 0 、w i ：，c 6 0 、w p c 7 5 、g r p c s o 。 数字代表制品中蛋白质最低的含量m ：以及乳清分离蛋白( w p d ，是指从乳清中完全的去除非蛋 白质成分，最终干燥产品中蛋白质的含量不低于9 0 的乳清蛋白制品，其组成见表i 2 所示棚 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第章引言 表1 2 不同乳清蛋白质的典型组成( x ) t a b l e1 - 2t h ec o m p o s eo f d i f f e r e n tw h e yp r o t e i np r o d u c l s ( ) 1 1 2 维生素及矿物质 乳清中的矿物质处于良好的平衡状态，其中钾和钠的比例为2 ：l ，具有完全的营养功效。 同时含有乳中几乎所含的所有维生素 9 1 。 1 1 3 蛋白质 乳清中含有的蛋白质大部分为乳清蛋白。乳清蛋白是一种高营养价值的蛋白质，是可获得 的最全面营养的天然蛋白质之一”。大多数乳清蛋白产品的蛋白质效价p e r 值为3 1 ，超过了 酪蛋白的p e r 值2 5 ，仅次于鸡蛋蛋清的p e r 值3 9 l i “。一般认为当某蛋白质的p e r 值超过2 5 时，则被认为是高营养优质蛋白厨“j 1 1 3 1 通过比较蛋白质营养价值常用的三种指标：蛋白质效 价( p e r ) ，生物价0 3 v ) 和蛋白质净利用率( n p u ) ，得出乳清蛋白是一种优质的蛋白质，见表l - 3 、 1 - 4 ”科学研究证实乳清蛋白不仅易于被消化吸收。而且其必需氨基酸种类全面且含量高于 其它食用蛋白质”， 襄i 3 主要蛋白质的营莽价值 t a b l e l 3p e r o f d i f f e r e n tp r o t e i n 2 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 罾曼皇量量置量i 曼i 岂曼置邑曼曼鼍皇! 皇舅置 襄i 4 乳蛋白、酪蛋白、乳清蛋白中必须氨基酸的含量( 1 0 0 1 蛋白质) t a b l e l , 4 n 比龉鞠l ya m i n o a c i d c o 毗e i i t o f m i l k p 埘n 韶s e m a n d w h e yp r o 啊n ( g ，i o o g p t e i n ) 1 2乳清蛋白的组分 牛奶的乳清蛋白中主要的蛋白质成分为 乳球蛋白( 争l g ) 、母乳白蛋白( a - l a ) 、牛血清 蛋白( b s a ) ，免疫球蛋白、各类蛋自酶，其他少量组分如乳铁蛋白( o 3 5 绚和乳过氧化物酶( o 2 5 ) 等，它们的特性见表i - 5 所示【1 6 l 【1 7 1 。 襄l - 5 各乳清蛋白的特性 t a b l e1 - 5 s t i co f w h e yp r a t d a 1 2 1 p 乳球蛋白 p 乳球蛋白在生理状态的p h 条件下，常以稳定的= 聚体形式存在，二聚体呈椭圆状，长 约6 9 5m ，宽约3 6 r i m 。研究发现p 乳球蛋白二级结构包括1 仉1 5 a - 螺旋，晰叠和4 7 无 序结构刚在p h 3 5 时。争乳球蛋白二聚体解离【i s j 【 l g 的具体功能还不是很清楚，可能 的功能是结合脂肪酸或脂肪，b 乳球蛋白可对脂溶性营养素如维生素e 进行预结合，从而促进 3 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章引言 人体吸收营养素【2 1 1 。 1 2 2 q 乳白蛋白 旺- 乳白蛋白在牛乳中是一个结构紧密的球型蛋白，三维大小为2 2 x 4 4 7 s m 的扁椭圆体 口“在生理状态的p h 条件下，其二级结构包括2 6 的d _ 螺旋，4 的b 哳叠结构和6 0 的无 序结构。乳白蛋白对热最稳定，是一种唯一能结合钙的乳清蛋白成分；是乳糖合成酶的组成亚 基，控制着乳中乳糖的含量嘞。 。 1 2 3 乳铁蛋白 乳铁蛋白是高度糖基化的糖蛋白，促进肠细胞的生长和双歧杆菌的繁殖田1 脚】。乳铁蛋白还 是一种选择性抗菌剂，通过鳌合游离的铁，能够控制需铁微生物生长。通过蛋白酶的消化作用， 乳铁蛋白能够转化成乳铁蛋白素，是一种具有抑制革兰氏阴性菌和酵母菌活性的肽明。 1 2 4 血清蛋白( s a ) 血清蛋白来自血液，乳中分离出的s a 与其血液中s a 有相同的化学和免疫学特性s a 在 肝脏中合成，通过特异性受体经乳腺细胞转运进入乳中嗍鲫。s a 可以结合乳中甲状腺素、锌 和铜等，然而s a 可以和1 9 6 竞争初生幼仔胃肠道载体，降低幼仔对i g g 的吸收口8 l 唧。 1 2 5 乳过氧化物酶 是一种天然抗菌剂与乳铁蛋白不同，乳过氧化物酶是通过酶促反应杀死或抑制某些革兰 氏阴性细菌( 包括大肠杆菌和某些沙门氏菌菌种) 和革兰氏阳性菌p o l 。这个酶促反应还包含两个 协同因子过氧化氢和硫氰酸盐离子，与乳过氧化物酶一起组成乳过氧化物酶系统，热稳定性很 高。乳过氧化物酶系统的功效取决于p h 值、温度和细胞密度等因素”主要在牛奶中提供抗 菌活性 3 2 1 1 2 6 乳清蛋白的功能特性 4 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 乳靖蛋白具有如抗菌、抗病毒、调节免疫力，降血压、降血脂、抗癌等多种功能特性。而 这些功能特性的决定因素主要有以下二部分：一是乳清蛋白本身所含有的蛋白质或蛋白质中的 氮基酸种类脚j 唧；如乳铁蛋白，主要是在体内清除部分致病菌生长所需要的铁离子( 清除肠道 内的铁离子) 而牛乳铁蛋白及其在体内被消化产生的乳铁转运蛋白降血压功能的机理与富含 半胱氨酸和谷氮酸有关，因这两种氨基酸是体内合成谷胱甘肽的前体口“。另外。乳清蛋白的降 胆固醇，调整脂类代谢及免疫调节功能主要与乳清发酵过程中产生的生物活性肽有关，如阻止 结合有胆固醇之类的物质在巨噬细胞内的沉积，防止粥样硬化发生，抑制细胞增殖，抑制a c e 抑制肽等功能川p “。 1 3发酵乳清的研究概况 水解乳清蛋白的方法研究大多集中于酶解乳清蛋白的方法，但是酶解法存在主要的问题是 酶解乳清蛋白时，控制不当易造成产物苦味物质的增加，苦味物质是直接影响食品风味和口感 的，这明显限制了乳清蛋白酶解产物的应用网【剪1 【椰l 。目前一些研究直接利用微生物水解乳清 蛋白生产多肽，乳酸菌等微生物含有内源酶，内源酶的肽酶谱系非常广泛，并且脱苦功效良好 4 1 1 郴l ，具有价格相比直接酶解低廉，来源广，发展前景广阔等特点。因此选择适当菌种发酵乳 清，充分水解乳清蛋白，产生大量的功能性小肽，提高产品的生物效价；同时又可以减轻产品 中的苦昧，易于消费者接受，有很大的发展前景1 4 3 1 州。 乳清发酵制品的功能性是与其营养成分是分不开的，乳清蛋白对其功能性影响最大，选用 合适的菌种并进行配合发酵，较大程度地水解乳清蛋白，获得更多具有生理功能的小肽，有利 于人体吸收和剩用，对提高乳清制品的生物效价具有十分重要的意义i 4 ，j 。 1 4 乳酸菌发酵产肽的研究现状 1 4 1 乳酸菌发酵产肽菌种的研究 发酵乳清所选用的菌种多为乳酸菌乳酸菌是一种有益微生物，不仅存在于乳及乳制品中， 也存在于人畜肠道中。乳酸菌耐酸，能适应肠道生态环境。便于在人体肠道内繁衍增殖自然 界存在的乳酸菌很多，被列为可以用于保健食品的菌种见表1 7 i 蛔 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 表l - 72 0 0 1 年卫生部公布的可用于保健食品的菌种 t a h i t i - 7p r o b i o t i c su s e di nh e a l t h yf o o dw h i c hp u b l i s h e db yb o a r do f h e a l t hi n2 0 0 1 益生营类真菌类 两歧双歧杆菌b i f i d o b a c t e z i b i f i d u m 婴儿双歧杆菌矗i n 点a n t i s 长双歧杆菌昱j f m 短双歧杆菌且b r e b e 青春双歧杆菌且a d o l e s c e n t i s 保加利亚乳杆苗l a c t o b 8 c i l l u s b u l g a r i c u s 嗜酸乳杆菌厶a c i d o p h h u s 于酪乳杆菌干醣亚种厶c a s e is u b s p c a s e i 嗜热链球菌s s t r e p t o c o c c u st h e z o p h i l u s 罗伊氏乳杆菌伽f a 胁f j 雌r e u t e r i 酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 产朊假丝酵母c a d i d aa t i l i s 乳酸克鲁维酵母盯鲫 r 蚀 l a c t i s 卡氏酵母s a c c 胁o m y c e $ c a r l s b e rg e n m s 蝙蝠娥拟青霉p a e c i l o 目c e sh e p i a l i d c h e ne r 矗b i s p , r o y 蝙蝠娥被毛孢l l i r s u t e l l ah e p i a l i dc h e n 靠, t h e n 灵芝g a n o d e z m u c t d u m 紫芝g a n o d e r m as i e n e s i s 松衫灵芝g a m p d e r , a 蝴p 红曲霉l l o n a c u sa n k a 紫红曲霉m o n a c u s 础印 乳酸菌的生理功能主要有：维持肠道菌群的生态平衡、抑制病原菌、抗感染、降低血清胆 固醇、改善乳糖不适症、营养作用等。归纳其机理主要是乳酸菌耐酸，在肠道中定居后可拮抗 菌群失调；同时发酵乳糖产酸降低环境中p h 值，产生细菌素抑制腐败菌生长代谢过程中利 用胆酸盐促进胆固酵代谢，促进钙、磷、铁及维生素d 的吸收1 4 7 j 。 微生物发酵乳清生产食品主要采用的菌种也是乳酸菌，虽然乳酸菌的蛋白酶活力比较弱， 但对于乳酸菌的生长至关重要，对乳制品的风味也有一定的作用，乳酸菌是有严格的营养需求 的化能异养型菌株，其自身缺乏数种必需氨基酸合成能力，必须通过蛋白酶系降解菌体生长环 境中的蛋白质。经由寡肽及氮基酸转运系统进入菌体岬】【4 9 l ，由菌体内肽酶水解成短肽和游离氨 基酸，然后被菌体利用，菌体生长后分泌的蛋白酶又将环境中蛋白质水解后释放出来的各种短 肽。 1 4 2乳酸菌发酵产肽性篚的研究 利用乳酸菌发酵水解乳清蛋白生产小肽，主要是利用乳酸菌菌体内的内源酶中存的广泛的 肽酶谱系，具有较好的脱苦作用，且价格低廉、来源广泛。 活性肽是指有特殊生理功能的肽类物质。m u l l a l l u 等人研究发现，人类摄食蛋白质经消化 道酶的作用后，并非以氨基酸的形式吸收的，更多是以低肽( 如二肽、三肽等) 形式吸收，某些 低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时具有调节人体生理机能的功效，某些功 效是原有食品蛋白质或其组成氨基酸所没有的独特的生理功能【，”。因此生物活性肽的研究开发 是食品学界的一个新的起点，它为利用生物价不高的蛋白质资源来生产人类的保健食品基料提 6 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章引言 供了可能性p ”。生物活性肽来源于多种蛋白质，包括乳蛋白，各种动物及植物蛋白州。 乳清蛋白中含有各种生物活性肽也越来越受到人们的重视，最近的研究表明乳清蛋白生物 活性肽具有以下功能：a c e 抑制活性，类似镇静物活性，抗血栓活性。胆固醇降低活性等。正 因为乳清具有这些生物活性肽，乳清逐渐应用于生产具有心血管健康功能食品等。近年来国外 研究开发出添加乳清蛋白质水解物的婴儿配方乳粉，2 0 世纪5 0 年代日本森永乳业以酶水解酪 蛋白物制取了第一代酪蛋白肽和氨基酸混合物，并用于低抗原性乳粉生产；6 0 - 7 0 年代相继开 发出高度水解的乳清蛋白肽混合物，由于以上两代产品游离氨基酸含量过高引起苦味，影响产 品的风味和生物效价；9 0 年代又推出了低度水解的乳清蛋白肽混合物，含1 0 - 1 5 个氨基酸组成 的肽和小于2 0 的游离氨基酸。产品的风味和生物效价也有了明显改善口”。 目前酶解的研究方法占主要地位，研究发现乳酸菌，包括干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加 利亚乳杆菌等微生物能水解牛乳蛋白产生一些活性肽吲 5 r l 。据资料显示，1 9 9 9 年m a e b e l e m , b eg i b b s ，b h l e e 他们做了用乳清水解得到活性肽的研究，所用的菌种为k l u y v e r o m y c e s m a r x i a n u $ v a ，：m a p x i a n u sa t c c 2 8 2 4 4 ，并对水解产品做了h p l c 分析。确定其氨基酸序列p 研 另外2 0 0 3 年，b e l e m 用k l u y v e r o m y c e sm d r i o n u sv a t m a r a n u s ，发酵乳清产生一种具有抗高血压 的多肽，测定其序列为( t y r - l e u - l c u - p h e ) 例我国利用乳清蛋白制各生物活性肽采用的方法也 多为酶水解法，采用微生物发酵的方法制各生物活性肽的报道鲜见i 鲫】1 6 1 1 ；并且我国生物活性肽 的研究方向多从医药角度出发，限制了活性肽药食两用功能的发挥。故市场上国产的活性肽食 品寥寥无几，生物活性肽功能食品的开发研究成为当前生物活性肽研究的热点之【6 2 】。因此利 用微生物水解乳清制备活性肽的研究具有广阔的市场前景邮j 。 1 5 研究的目的和意义 近些年来世界上的乳清产品贸易量逐年增长，1 9 9 5 2 0 0 0 年问，乳清产品的全球贸易从2 6 5 万吨增长到了4 8 5 万吨，平均每年以1 2 8 的速度递增 6 7 1 美国和欧盟统治着国际乳清市场， 2 0 0 0 年出口量大增，比1 9 9 9 年增长了3 5 ，高附加值的乳清产品分别占其乳清出口量的9 和1 8 嗍中国乳业经过近t o 年的发展，我国在奶牛头数、产奶量、乳制品种类和产量上 均有了较大的提高，市场上充满着国内外的优质乳制品。我国每年乳清粉进口量逐渐增加，2 0 0 6 年乳清粉进口量达到1 8 4 5 0 5 1 吨乳清粉主要应用于食品配料以及饲辩生产 在我国千酪处于起步阶段，虽然生产的厂家较少，但仅北京华冠乳品公司和东直门乳品厂 两家每年捧放的乳清就有2 万吨左右。干酪发展过程中所面临的一个很大的问题就是乳清的利 用，这直接关系到干酪的价格。1 9 9 4 年投产的包头骑士乳品公司，全部设备和技术都从外国进 口，设计能力为日处理鲜奶5 0 吨，生产干酪，同样每年捧放2 万吨左右的乳清。根据国外生产 乳清粉的经验：乳清粉生产量不足2 0 吨时，其效益就不高。目前生产中大量的乳清采用直接捧 放，不仅降低牛奶的可获得经济价值，同时增加了环境的污染。 因此，利用乳清粉开发优质保健品已具备了丰富的原料资源。并具有重要的经济效益和社 会效益。本课题的研究主要是利用微生物发酵乳滴，分析产生小肽物质的种类和含量分布，为 利用乳清肽生产保健食品或保健食品原料进行基础的探索。 7 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 1 5 1 乳清肽的功能作用 乳清蛋白中含有多种肽类，具有多种生理功能： ( 1 ) 吗啡片肽 源于动物乳中酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白和血红蛋白、植物蛋白酶解制而得。是最早的 食品类蛋白肽，具有镇痛、调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温、消化系统及内分泌等功能1 7 5 1 7 9 1 。 乳清中的阿片肽类：a 一乳清蛋白中含量有一个阿片活性序列，即。一乳清蛋白5 0 - 5 3 个氨基酸 序列称为乳啡肽；与此相似，b 一乳球蛋白也含有一个阿片活性片段，即b 一乳球蛋白1 0 2 1 0 5 氨基酸片段称为p 乳啡肽；牛血清白蛋白3 9 9 - - 4 0 4 个氨基酸残基片段来源的s e r o r p h i n 也有阿 片肽活性 s 0 1 ( 2 ) 类吗啡拮抗肽 由牛乳b 酪蛋白经胰蛋白酶作用分离而得，与类吗啡肽相拮抗，具有抑制血管紧张素转换 酶与平滑肌收缩活性等功用。乳清中含有的拮抗肽类有l a c t o f e r o x i n a 、f e r o x i n b t m 。 ( 3 ) 血管紧张索转换酶抑制肽( 简称a c e i 肽) 最初是从天然蛇毒中分离或细菌胶原酶降解胶原蛋白或牛乳酪蛋白、大豆、玉米、沙丁鱼、 虾蛋白等酶解而制得的a c e i 肽，是血管紧张素转换酶抑制剂，具有降血压的显著功效。其低 肽易消化吸收。具有促进细胞增殖、提高毛细血管通透性等作用，可用做降压功能食品基料。人 工合成的与d 一乳清蛋白5 0 - - 5 3 片段对应的。一l a c t o p h i n 和口一乳球蛋白酶解片段1 4 2 1 4 8b l a c t o p h i n 具有a c e 抑制活性。可起抗高血压作用脾】i s 3 1 。 ( 4 ) 抗菌肽 又称抗微生物肽，广泛分布于自然界，在原核生物和真核生物中都存在，如植物、微生物、 昆虫和脊椎动物在微生物感染时迅速合成而得，也可以用基因克隆技术生产。来源于乳铁蛋白 1 7 4 l 氨基酸片段的l a c t o f e r r i c i n b 对革兰氏阳性菌和阴性菌具有抗菌作用，同时还具有抗真菌， 抗病毒、促进铁吸收、调节肠道菌群、抗氧化及胂痞等作用，可成为新的抗菡药物和功能食品 。 ( 5 ) 苦味肽 是蛋白质酶解液中的苦味物质，由某些疏水基团和疏水性氨基酸构成，可用活性炭吸附或 用某些端肽酶、乳酸菌、酿酒酵母等微生物进一步水解，脱出或减轻苦味后，其必需氨基酸的 s 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章引言 ii ii 含量较酶解液中更高，营养价值更大，可用做食品营养强化剂。 ( 6 ) 免疫调节肽类 j o h nm 纠n a r dk e y n e s 从人口- 乳清蛋白中分离得到一种三肤，其序列为d 乳清蛋白5 1 - 5 3 片段，这种三肽以l m g m l 的计量腹膜或皮下注射可使老鼠免受感染洳i 。 如果将未被利用的乳清进行合理的处理，充分利用其中含有的乳清蛋白质和乳糖吲。除了 可以给人类增加一项数量可观的优质蛋白质来源。还对有效保护环境。开发价格低廉的食品资 源，增加乳品加工企业的产品生产的附加值，促进乳品加工企业发展，创造更大的经济效益有 重大的意义i s 6 1l 忉 1 5 2 发酵乳清水解蛋白的意义 肽是由氨基酸通过肽键链接而成的化合物，他是机体组织细胞的基本组成成分。活性肽是 指有特殊生理功能的肽类物质。随着蛋白质化学、生理学与营养学的发展，人们发现，人类摄 食蛋白质经消化道酶的作用后，不象以前以为的那样以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽( 如 = 肽、三肽等) 形式吸收，某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时还具有 防病治病、调节人体生理机能的功效，有些是原来食品蛋白质或其组成氨基酸所没有的独特的 生理机能，许多活性肽的组成氨基酸并不一定是必须氨基酸。因此生物活性肽的研究开发是食 品学界的一个起点，它为人类利用蛋白质资源生产保健食品基料提供了可能。因此，以乳清为 原料利用乳酸菌发酵法生产生物活性肽，虽然乳酸菌的蛋白酶活力较弱，但对于乳酸菌的生长 至关重要，对乳割品的风味也有一定作用。乳酸菌是有严格营养需求的化能异养菌，其自身缺 乏数种必须氨基酸合成能力必须通过蛋白酶系降解菌体环境中的蛋白质，经由寡肽转运系统 运入菌体后，由菌体内肽酶水解成短肽，然后被菌体利用。菌体生长后分泌的蛋白酶又梅环境 中蛋白质水解后释放出各种短肽产生的小肽，不但可以被人体直接吸收用，还具有一定的保 健作用。 1 6 实验的主要内容 根据乳清蛋白的特点，应用资源丰富的乳清粉，选用干酪乳杆菌与嗜热链球菌作为发酵乳 清的菌种。分析其小肽产量、种类，并研究发酵工艺条件对产肽性能的影响。 1 6 1 两种菌株发酵乳清的单因素试验 9 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第章引言 选用干酪乳杆菌和嗜热链球菌菌株，分别进行单株发酵实验，以确定各自发酵水解蛋白的 能力。 ( 1 ) 主要研究发酵干物质浓度、发酵时间、蛋白质乳糖比例、菌种接种量对发酵的影响。 ( 2 ) 以发酵2 4 1 1 后两菌总菌数为测定指标对发酵效果进行检测。 1 6 2 菌株复合配比与培养条 ! # 试验 通过单因素试验后，将两种茁株混合发酵以确定混合后发酵的水解蛋白的能力。主要研究 混合后的发酵时间。混合比例等单因素对发酵产肽效果的影响。试验中以发酵乳清的蛋白水解 度为铡定指标。 1 6 t 3 乳清发酵产肽性能的多因素组合优化试验 混合菌株在发酵过程中受多种因素影响。因此，研究中要进一步探讨不同因素水平条件下 对发酵结果的影响。根据单因素实验确定的范围，以乳清蛋白水解度为检测指标，采用 p l a c k e t t - b u r m a n 设计，筛选对实验响应值影响大的因素，细化因素范围；以三因素三水平响应 面实验设计建立实验方案确定优化干酪乳杆菌与嗜热链球菌在骢清当中的混合发酵工艺条件； 获得千酪乳杆菌与嗜热链球菌混合发酵乳清最佳产肽性能的工艺条件。 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章实验材料及方法 2 1 材料 2 1 1 原料与主要试剂 第二章实验材料及方法 w p c 6 0市购 w p i市购 新鲜牛奶市购 二肚 s i g m a 三肽 s i g m a 四肽 s i g m a l - t y r o s i n es i g m a 甘氨酸 s i g m a a c y i a m i d e a 盯e s c o b i s - a c y l a m i d e a m r e s c o t r i c i n e s i g m a t r i sa n l r e s e o s o d i u m ld o d e c y ! s u f a t e a m r e s c o c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e ( 3 - 2 5 0a m r e s c o t e 哐d a m r c s c 二硫代苏糖醇北京赛百盛基因技术有限公司 琼脂糖北京奥博星生物技术有限公司 n 果糖北京奥博星生物技术有限公司 干酪紊北京奥博星生物技术有限公司 茚三酮上海三爱恩试剂有限公司 乙睛( 色谱纯) s i g m a 三氟乙酸( 色谱纯) s i g m a 脱盐乳清粉d - 7 0法国佳农 其他常用试剂均为分析纯 l o 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章实验材料及方法 2 1 2 仪器设备 p h s - 2 酸度计 7 9 1 磁力加热搅拌器 1 6 紫外可见分光光度计 s h b 1 1 m 循环水式多用真空泵 x i - i l 1 6 t 2 数控消化炉 l z 幻一g b 精密盖勃离心机 d k - 4 5 0 b 型电热恒温水槽 d y y - i i i 5 型稳压稳流电泳仪 d y c z - 2 4 d 型双垂直电泳槽 d y c z - 2 4 a 型电泳槽 1 g l l 6 b 高速台式离心机 全自动层析仅 3 0 0 m m m x l o r a m 层析柱 l l - 1 0 a t v p 高教液相色谱仪 t s k - g 2 5 0 0 p w ，7 5m mi d x 3 0 0 咖 4 6 x 2 5 0 m m5 “mc 1 8 反相色谱柱 微量移液器( 1 0 、2 0 0 、1 0 0 0 9 l ) 0 2 l m 滤器 上海雷磁仪器厂 金坛市虹盛仪器厂 北京普析通用仪器责任有限公司 郑州长城工贸有限公司 上海新嘉电子有限公司 哈尔滨龙泽科技公司 上海森信实验仪器有限公司 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 上海安亭科学仪器厂制造 b i o - r a d 公司 ， b i d 队d 公司 日本岛津 高效凝胶捧阻色谱柱t o s o h 公司 k r o m o i s l 瑞士 芬兰雷伯公司 德国s l l r t o t i u s 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章实验材料及方法 2 2 检测方法 2 2 1蛋白质含量的测定 采用国标g b t 5 0 0 9 5 - - 2 0 0 3 方法测定。准确移取待测溶液5 m l 于硝化管中，加入2 0 m l 浓h 2 s 0 4 ，5 9 k z s 0 4 ，置于硝化装置上消化，逐渐升温到5 0 0 ，待硝化液呈现绿色后开始计时， 在5 0 0 c 保持2 小时，冷却后移入1 0 0 m l 容量瓶中定容，取1 0 m l 此硝化液在凯氏定氮装置上 蒸馏并人工滴定定氮。 2 2 2 灰分测定 含氮量( g ) = 0 0 1 4 x c 聂x i ( 万v 1 而- 了v 0 ) x v 一2 单位：g ) xj u l u u c ：滴定用盐酸浓度( t o o l l ) v i ：滴定样品消耗盐酸的体积( m l ) v 0 ：滴定空白消耗盐酸的体积( m l ) v 2 ：样品溶液总体积 蛋白质含量= - 6 3 8 x 含氮量 采用国标g b f f 5 0 0 9 5 _ - 2 0 0 3 灼烧法测定。选取合适的坩埚，在5 0 1 2 下灼烧o 5 h 至恒重， 冷却称重，取1 0 m l 液体样品于已僵重的陶瓷坩埚中，水浴上蒸发至干，电炉上加热碳化，碳 化完全后置马福炉中在5 5 0 c 灼烧4 h ，灼烧到残渣呈现浅灰色恒重为止，冷却后称量重量。计 算如下： 灰分( 呦= 学1 0 0 w ：样品质量( g ) 呐：样品灼烧后坩埚与灰分的质量( g ) 1 1 1 2 ；恒重后的坩埚质量( g ) 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第- - 章实验材料及方法 2 2 3 脂肪含量的测定 采用盖勃式法测定。在牛乳乳脂计中先加入1 0 m l 硫酸，再沿着管壁加入混匀乳清l m l ， 不要使牛乳与硫酸混合，然后加入i m l 异戊醇，塞上橡皮塞用力摇匀，使之成为均匀的棕色液 体，静置数分钟。在盖勃氏离心机中，6 7 条件下离心5 分钟，取出后立即读数。 2 2 4 乳糖含量的测定 采用国标g b t 5 4 1 3 5 一1 9 9 7 中的莱因一埃农氏法。 2 2 5 发酵酸度的测定 称5 9 发酵液，注入容量为1 0 0 m l 的三角瓶中，用4 0 m l 蒸馏水稀释，加入l 的酚酞指示 剂2 3 滴，用0 1 n 的n a o h 标准溶液滴定，不断轻微摇动，直至微红色在3 0 秒内不消失为止， 滴定时所消耗o 1 n 的n a o h 标准溶液的毫升数乘以2 0 ，即为1 0 0 m l 发酵乳的酸度，以吉尔涅 尔度表示。每消耗1m l 的n a o h 溶液即为1 叮，活力以乳酸含量表示。 活力( 声消耗的氢氧化钠的体积数x0 0 0 9 1 0 0 发酵乳的质量1 0 3 2 2 2 6 蛋白质水解度的测定 采用国家药典中蛋白质水解度的测定方法，具体如下： 水解度( d e g r e eo f h y d r o l y s i s 。缩写为d h ) 的概念为： d h = 立1 0 0 k 式中：h 是水解后每克蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数( m m o v g ) ，h “是每克原料蛋白质的 肽键毫摩尔数( r e t o o l g ) 。 即用原料蛋白质中肽键被裂解的百分数来表示蛋白质被蛋白酶水解的程度。当蛋白质全部 水解成游离氨基酸时，d h 为1 0 0 ；没有水解时，d h 为0 对于某特定的蛋白质来说，h m 可认为是一个常数，它可以由组成该蛋白质的氨基酸的含 量计算得出。所以只要测出水解后蛋白质被裂解肽键数m 值) ，就可以计算出相应的d h 值。由 于每裂解一个肽键就同时新生成一个二n h 2 基和一个- c o o h 基，只要定量地测定出蛋白质水解 1 3 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章实验材料及方法 后新生成的一n i 1 2 基或- c o o h 基的量，就可以求得h 值。 测定蛋白质的二n h 2 基或c o o h 基的方法较多，主要有铜复合物紫外吸收法、邻苯二甲醛 法、三硝基苯磺酸法、茚三酮比色法和甲醛固定法等，其中茚三酮比色法和甲醛固定法是比较 常用的方法，何静( 1 9 9 7 ) 对茚三酮比色法和甲醛固定法两种方法的结果进行了比较，认为两 种方法的误差不大于5 ，本实验采用了茚三酮比色法进行测定。 茚三酮法测定水解液中栅2 含量( 赵新淮，1 9 9 4 ) 。取i m l 水解液定容至1 0 0 m l ，即稀释 1 0 0 倍。取此稀释液0 4 m l 于试管中，加入1 6 m l 蒸馏水、i m l 茚三酮显色剂，然后沸水浴中 加热，1 5 r a i n 后取出，于冷水中迅速冷却，加入4 0 乙酵溶液5 m l ，震荡。 以空白管调零，5 7 0 r i m 处测吸光度值。利用标准曲线计算水解液中姻2 的含量( m m o d ， 进而计算出水解度( d h ) 。 。! 窖型一0 5 5 朋：三1 0 0 ：丘塑l 1 0 0 j0，k 式中d h ：水解度 h ：水解后每克蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数( m m 0 1 ) ； h 每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数( r e t 0 0 1 ) ； f - n h 2 】：水解液的- n h 2 的含量( m m o l l ) ： 6 3 8 n 乳中蛋白质的含量( g l ) ； o 5 5 原料乳中游离- n h 2 的含量( r e t o o l g ) 。 2 2 7 干酪乳杆菌与嗜热链球菌活菌赦的测定 采用l o 倍连续梯度稀释法平板计数。 ( 1 ) 菌悬液在吸取之前要充分振荡，使得菌体细胞分散开来，无菌操作条件下用移液管吸 取己经摇匀的发酵液i m l 注入第一个含有9 m l 无菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀， 制成i ：1 0 稀释样液。 ( 2 ) 另取i m l 无菌吸管按上述操作顺序作1 0 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换 用一支i m l 无菌吸管。 ( 3 ) 根据实验样品的发酵情况和菌悬液浓度，选择2 , - , 3 个适宜稀释度，分别作l o 倍递增 稀释的同时，用稀释该稀释度的吸管取0 2 m l 稀释样液于无菌平皿内，每个稀释度做2 个平皿 ( 4 ) 稀释液移入平皿后，应及时将融化后冷却至4 5 的i v i r s 培养基放置于4 5 c 水浴保温， m r s 倾入平皿，平皿中培养基厚度应以0 5 c m 为宜。并转动平皿使培养混合均匀 ( 5 ) 待琼脂凝固后，翻转平皿，置温箱中培养2 4 h 后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀 释倍数，即得发酵液菌落总数 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二牵实验材料及方法 皇曼篁曼舅_ 一i i 曼量鼍量目曹曼蔓曼皇暑孽舅| | 目量皇e 皇舅舅曼! 曼皇皇量詈曼寡皇量 2 2 8乳清发酵产小肽含量的测定 选取优化组合试验中响应值( 乳清蛋白水解度) 最大的试验组样品，采用h p l , c 定性定量 测定样品中二默，三肽和四肽的含量。 采用瑞士k r o s m a i l 色谱分离柱、c ”柱2 5 0 x 4 6 m m 、流动相流速：o 1 m l m i n ，紫外检测 波长：2 2 0 r a n