（食品科学专业论文）AChE固定化及其对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测方法研究.pdf

a c h e 固定化及其对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的 快速检测方法研究 牛乐 摘要：有机磷和氨基甲酸酯类农药是最常见的两类农药，也是目前为止仍然 最广泛使用的农药，它们是一种神经毒物，会抑制人及动物体内乙酰胆碱酯酶活 性，引起中枢神经系统功能紊乱，出现中毒症状，以至危及生命。近年来，农药 残留问题越来越多的受到人们的关注。虽然政府明令禁止将有机磷和氨基甲酸酯 类农药中的高毒、剧毒品种用于蔬菜果品的生产，但是不少地方仍在使用这些国 家明确规定在蔬菜上禁用的高毒剧毒农药，因食用含大量农残的蔬菜所引起的人 畜中毒事件时有发生，带来了严重的食品安全问题。 气相色谱及高效液相色谱技术检测农药残留具有很高的准确性和灵敏性，但 是它们需要昂贵的仪器设备、专门的操作人员以及严格的操作环境，检测周期也 比较长，不适合于市场和田问的现场快速检测。传统的快速检测方法因为敏感生 物元件酶的保存条件较为苛刻，检测又受提取液颜色的影响，给应用上带来诸多 不便。因此，急需研究一些快速、灵敏、便捷的检测方法，将高残留的农产品阻 挡在交易市场之外，以杜绝食品安全事故的发生。 本研究的目的是针对我国农产品小规模、分散式的产销特点，寻找一种简便、 快速、灵敏、可靠、实用的市场果品蔬菜中常见农药残留的快速检测方法。研究 内容及结果如下： ( 1 ) 对乙酰胆碱酯酶的测活方法进行优化，并对影响测活的因素进行了研究， 改进了乙酰胆碱酯酶的测活体系和有关参数，即：a c h e 酶液5 叽l ( 1 个固定化酶 片) ，底物碘化硫代乙酰胆碱5 叽l ，显色剂双二硝基苯甲酸5 0 9 h ，p h 8 0 缓冲液 2 9 m l ( 固定化酶测活时加入3 9 5 m l ) ，终止剂1 s d s l m l ( 固定化酶测活时不 用) 。 ，j 一 ( 2 ) 通过对5 种固定化材料的研究，筛选出固定乙酰胆碱酯酶的合适材料为 硝酸纤维素膜，并对固定化的参数进行了探索和优化：载体材料浸泡4 8 h ，戊二醛 浓度o 0 0 5 ，牛血清白蛋白浓度0 5 ，缓冲液p h 值6 0 ，固定化温度4 c ，固定 化时间1 2 h ，最终酶活回收率可达到3 1 0 3 。每批次固定化酶活力变异系数均小 于4 0 4 ，各批次之间标准差为0 0 2 8 ，变异系数为4 1 6 。每批次及各批次间固 定化酶精密度良好，即该固定化方法重现性较好。 ( 3 ) 对硝酸纤维素膜固定化a c h e 酶的特性进行了研究，并与游离酶特性进 行了比较，结果表明：固定化乙酰胆碱酯酶对底物的最适反应温度为4 5 比游离 酶提高5 。c ，最适p h 为8 5 比游离酶提高了0 5 个p h 单位。对农药的灵敏度比游 离酶有所提高，保存期限比游离酶大大提高，4 c 保存一个月活力仅损失4 6 ，活 力保存率为相同条件下游离酶的4 3 倍。 ( 4 ) 建立了固定化乙酰胆碱酯酶目测法快速检测农药残留的方法，并自制了 显色片。操作步骤为：固定化酶片浸于提取液中，常温下抑制l o 分钟，取出酶片 置于载玻片上，同时放上对照酶片，在酶片之上放置显色片，并滴加底物5 吮l ， 放入叵温培养箱3 5 反应5 分钟，取出载玻片，置于白色滤纸上观察结果。对2 9 种常见农药的最低检测限在0 2 5 m g k g 之间。 ( 5 ) 建立了固定化乙酰胆碱酯酶的比色法，对水样中8 种农药在0 0 0 1 5 6 2 m g k g 浓度范围之间线性关系良好( r 0 9 5 8 4 ) ，对有机磷农药和氨基甲酸酯类农 药检测的灵敏度为0 0 0 6 2 5 0 0 6 2 5 m g k g ，远低于各农药对应的m r l 值。 ( 6 ) 用固定化乙酰胆碱酯酶进行了实际样品检测，目测法除对多菌灵、抗蚜 威之外，对其他农药残留均呈阳性：比色法回收率均高于8 5 ，变异系数在2 9 6 5 2 1 之间，本方法准确度、精密度均较好，且不受提取液颜色的影响。 ( 7 ) 两种检测方法与气相色谱进行比较，都拥有较好的符合率( 目测法为 7 5 ，比色法为1 0 0 ) ，且其操作简单、省时、不需要贵重的仪器，检测费用较低， 可用于现场的快速检测。 关键词：乙酰胆碱酯酶固定化有机磷氨基甲酸酯快速检测 s t u d i e so nt h em e t h o d so fa c h ei m m o b i l i z a t i o na n di t sa p p l i c a t i o n o n r a p i dd e t e c t i o no fo r g a n o p h o s p h o r u sa n dc a r b a m a t e p e s t i c i d e s n i u l e a b s t r a c t ：o r g a n o p h o s p h o r u s a n dc a r b a m a t ep e s t i c i d e sa r et w oc o m m o n p e s t i c i d e sw h i c ha r e s t i l lw i d e l yu s e di n a g r i c u l t u r ep r o d u c t i o n t h e yc a ni n h i b i t a c h ea c t i v i t yi nb o d ya n dc a u s ep o i s o n i n gs y m p t o m ，e v e ne n d a n g e rt h el i f eo fh u m a n b e i n g s o ，p e s t i c i d er e s i d u e si nf o o dh a v ep a y e dm o r ea t t e n t i o no v e rt h ew o r l d s o m e v i r u l e n tk i n d so fo r g a n o p h o s p h o m sa n dc a r b a m a t ep e s t i c i d e sa r es t i l lu s e dt ov e g e t a b l e s a n df r u i t si ns o m er e g i o n sa l t h o u g hi tf o r b i d d e nb yt h eg o v e r n m e n t ，t h et o x i c o s i s i n c i d e n t so fh u m a na n da n i m a lr e s u l t e df r o mt a k i n gf o o dw h i c hc o n t a i n sh i g hl e v e lo f p e s t i c i d er e s i d u e sa r eh a p p e n e du s u a l l y a l t h o u g hg ca n dh p l ch a v eh i g hv e r a c i t y a n d s e n s i t i v i t y f o r d e t e c t i n g p e s t i c i d e sr e s i d u e s ，b u tt h e yc a n ta d a p tt or a p i dd e t e c t i o ni nm a r k e ta n df i e l ds c e n ef o r i t se x p e n s i v ei n s t r u m e n t s ，p r o f e s s i o n a lp e r f o r m a n c e ，r i g o r o u so p e r a t i n ge n v i r o n m e n t a n dl o n gt i m ec o n s u m i n g t r a d i t i o n a lr a p i dd e t e c t i o nm e t h o dh a v es o m es h o r t c o m i n g s s u c ha st h ee n z y m e ( a c h e ) d i f f i c u l tt os t o r a g ea n dt h ec o l o ro fe x t r a c t i n gs o l u t i o nc a n a f f e c tt h ed e t e c t i o n ，w h i c hc a u s em u c hi n c o n v e n i e n c et oa p p l y s or e s e a r c har a p i d ， s e n s i t i v ea n dc o n v e n i e n tm e t h o df o rd e t e c t i o np e s t i c i d er e s i d u e si so u ri m p e r a t i v en e e d s ， i tw i l lp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei np r e v e n t i o nh i g hp e s t i c i d er e s i d u e sf a r mp r o d u c t sf r o m t h em a r k e t p l a c ea n dt or e d u c et h ei n c i d e n t so ff o o ds a f t y t h ea i mo ft h i ss t u d yi st os e a r c hac o n v e n i e n t ，r a p i d ，s e n s i t i v e ，c r e d i b l ea n d p r a c t i c a lm e t h o df o rd e t e c t i o nt h ep e s t i c i d er e s i d u e si nf r u i t sa n dv e g e t a b l e sa tm a r k e t s ， w h i c hc a na d a p tt ot h ep r o d u c ea n ds a l es t a t u so fa g r i c u l t u r ep r o d u c ti no u rc o u n t r y t h e r e s u l t sa r ea sf o l l o w ： ( 1 ) t h em e t h o do fa c t i v i t yd e t e r m i n a t i o no fa c h ew a so p t i m i z e d ，a n dt h ea c t i v i t y d e t e r m i n e dp a r a m e t e r so fd i s s o c i a t i v ee n z y m ea n di m m o b i l i z e de n z y m ew e r ei m p r o v e d t h ea c h ea c t i v i t yd e t e r m i n e ds y s t e ma r ea sf o l l o w s ：5 0 le n z y m es o l u t i o n ( o n e i m m o b i l i z e de n z y m ec a r d ) ，5 0 # lz y m o l y t ea s c h i ，5 0 m lv i s u a l i z a t i o nr e a g e n td t n b ， 2 9 m l p h 8 0p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) ( 3 9 5 m lf o r i m m o b i l i z e de n z y m e d e t e c t i o ns y s t e m ) ，a n di s d st e r m i n a t i o nr e a g e n tl m l ( n o n ef o ri m m o b i l i z e de n z y m e d e t e c t i o ns y s t e m ) ( 2 ) n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e ( n c m ) w a s s e l e c t e df r o mt h e5m a t e r i a l st oi m m o b i l i z e h i a c h e t h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sw a sa s f o l l o w s ：d i pt h en c mi np b sf o r4 8 h ， g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o nw a so 0 0 5 ，b o v i n es e f a ma l b u m i n ( b s a lc o n c e n t r a t i o n w a so 5 ，a n dt h ep h v a l u e ，t e m p e r a t u r ea n dt i m eo fi m m o b i l i z a t i o nw e r e6 0 4 a n d 1 2 hr e s p e c t i v e l y t h er e s u l ts h o w st h a tt h er e c o v e r yr a t eo fi m m o b i l i z e de n z y m e a c t i v i t yg e t st o3 1 0 3 ，t h ec vo fi m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t yw a sl o w e rt h a n4 0 4 a n d4 1 6 i ne a c hb a t c ha n da m o n g e v e r yb a t c hr e s p e c t i v e l y t h ep r e c i s i o no fe n z y m e a c t i v i t ys h o w st h ew e l lr e p e t i t i o no ft h i sm e t h o d ( 3 ) t h ec h a r a c t e r i s t i co fn c mi m m o b i l i z e de n z y m ew a sr e s e a r c h e da n dc o m p a r e d w i t hd i s s o c i a t i v ee n z y m e t h er e s u l ts h o w st h a tt h eb e s tr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f i m m o b i l i z e de n z y m ei s4 5 c ，5 h i g h e rt h a nd i s s o c i a t i v ee n z y m e ，t h eb e s tp hv a l u ei s 8 5 ，0 5h i g h e rt h a nd i s s o c i a t i v ee n z y m e t 1 l es e n s i t i v i t yt op e s t i c i d ea n ds t o r a g el i f ea r e b o t hb e t t e rt h a nd i s s o c i a t i v ee n z y m e t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m el o s to n l y 4 6 u n d e r4 。cf o ro n em o n t h a n dt h ea c t i v i t yr e t e n t i v er a t ew a sa s4 3t i m e st h a n d i s s o c i a t i v ee n z y m ea tt h es a m ec o n d i t i o n ( 4 ) t h em e t h o do fr a p i dd e t e c t i o np e s t i c i d er e s i d u e su s i n gi m m o b i l i z e da c h eb y e y e so b s e r v a t i o nw a se s t a b l i s h e da n dt h ev i s u a l i z a t i o nc a r d sw e r em a d e t h eo p e r a t i o n p r o c e s si s ：d i pt h ec a r di ne x t r a c t e ds o l u t i o nt oi n h i b i ta c h ef o r1 0 r a i nu n d e rr o o m t e m p e r a t u r e ，t h e np l a c et h et e s t e dc a r da n dc o n t r o lc a r do nt h eg l a s ss l i d ea n dp u t v i s u a l i z a t i o nc a r d so nt h e m ，a d d5 叽lz y m o l y t e ，r e a c ti ni n c u b a t o ra t3 5 f o r5 m i n ， f i n a l l y , o b s e r v e dt h e i rc o l o rc h a n g ew i t haw h i t eb a c k g r o u n dp a p e rb ye y e s t h el o w e s t d e t e c t i o nl i m i t so f2 8k i n d so fc o m m o np e s t i c i d e sh a v eb e e nd e t e c t e db yt h i sm e t h o d ( 5 ) u s i n gi m m o b i l i z e da c h e t od e t e c tt h ep e s t i c i d ef o rw a t e rs a m p l eb yc o l o r i m e t r y w a ss h o w e dw e l ll i n e a r i t y , t h ec o r r e l a t i v ec o e f f i c i e n t sw e r ea l la b o v e0 9 5 8 4 ，t h e s e n s i t i v i t yt oo r g a n o p h o s p h o m sa n dc a r b a m a t ep e s t i c i d e si sb e t w e e n0 0 0 6 2 5a n d 0 0 6 2 5 m g k g ，m u c hl o w e rt h a nt h e i rm r l ( 6 ) s o m ev e g e t a b l es a m p l e sw a su s e dt od e t e c tp e s t i c i d er e s i d u e sb yt h ei m m o b i l i z e d a c h e t h er e s u l ts h o w st h a tt h ep e s t i c i d e sc a nb e i ：l e t e c t e de x c e p t2k i n d so fp e s t i c i d e ( c a r b e n d a z o la n dp i r i m i c a r b ) b ye y e so b s e r v a t i o n ，a n dt h er e c o v e r yr a t e sw a sa l la b o v e 8 5 w i t ht h ec vb e t w e e n2 9 6 a n d5 2 1 b yc 0 1 0 r i m e t r yt e s t t h em e t h o dh a sg o o d p v e r a c i t ya n da c c u r a c y , a r i dc a na v o i dt h ee f f e c to ft h ec o l o ri ne x t r a c t e ds o l u t i o n ( 7 ) t h et w or a p i dd e t e c t i o nm e t h o d sw a sw e l la c c o r dw i t hg cr e s u l t ，a n dt h e yh a v e s o m ea d v a n t a g e ss u c ha sc o n v e n i e n ti nu s e ，r a p i df o rd e t e c t i o n ，h a v en oe x p e n s i v e i n s t r u m e n t s ，l o w e rc o s t s ，a n ds i m p l e ro p e r a t i o n ，s o ，i th a v ep o t e n t i a lt ob ea p p l i e df o r r a p i dd e t e c t i o ni nt h ef i e l d w o r k k e yw o r d s ：a c h e ；i m m o b i l i z a t i o n ；o r g a n o p h o s p h o r u s ；c a r b a m a t e ；r a p i d d e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e s v 学位论文独创性声明 江9 0 0 6 7 3 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：日期：商= 生 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利日的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名日期：丑： 文献综述 1 我国农药使用概况 农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生 物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其他天然物质 的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂【”。合理使用农药可使粮食、棉花、水 果等各种农作物增产；对控制农作物病、虫、草、鼠危害，促进产品高产优质 保证农业丰产丰收具有重要的作用。中国是一个农药生产和使用大国，年产量约 4 5 万t ，每年用量约2 5 万t 。其中杀虫剂约占总产量的7 0 ：杀菌剂占总产量的 1 3 ；除草剂占总产量的1 5 ，尚有少量的植物生长调节剂和杀鼠剂等【2 】。农药防 治面积达3 亿h m 2 左右，且每年以0 1 3 3 亿h m 2 的速度递增 3 1 。 农药的使用使得农业生产力大大提高，农药的发明和使用被认为是农业生产 的革命【4 j 。农药在保护农作物，防治病虫草害，改善人类生存环境，控制疾病方面 发挥了巨大作用。据权威人士估计，在世界范围内，如果不使用农药，病虫草害 将导致粮食总产量减少1 3 ，使用农药所带来的收益大体上为农药费用的4 倍瞪】。 由于使用农药，我国每年挽回的粮食损失约占总产量的7 ，以我国一年粮食总产 量4 5 0 0 亿k g + 计算，其中3 1 5 亿k g 的产量是使用农药挽回的损失1 6 i 。由此可见， 农药的使用给人们带来了巨大的经济效益和社会效益，对人类生存起到了重要作 用。 有机磷农药是人类最早合成而且至今仍在广泛使用的一类杀虫剂，是德国 g s c h r a d e v 在二十世纪三十年代首先发现的，距今已有七十多年历史1 7j 。也是目前 我国使用最主要的农药之一。按结构可分为磷酸酯、膦酸酯和磷酰胺及其相应的 硫代衍生物。有机磷农药早期发展的大部分是高效高毒品种，如对硫磷、甲胺磷、 毒死稗和甲拌磷等；而后逐步开发了许多高效低毒低残留品种，如乐果、敌百虫、 敌敌畏、马拉硫磷、二嗪磷和杀螟松等，成为农药的一大家族。有机磷农药发展 较快、品种多、使用广，至今已有6 0 余种 8 1 。由于有机磷农药具有药效高、品种 多、防治对象多、在环境中易降解等优点，在我国农业生产中得到大量应用，占 农药总使用量的7 7 7 6 一1 。 氨基甲酸酯类农药的结构特性是分子中含有一个n 甲基基团。多数氨基甲酸 酯类农药的纯品为白色结晶，难溶于水，易溶于丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈等 有机溶剂，在碱性和高温条件下容易分解。大多数氨基甲酸酯类农药的半衰期为 0 0 2 0 1 a ，在施用后不长时间内就会被降解为相应的代谢产物。其代谢产物通常 具有与母体氨基甲酸酯类农药相同或更强的生物活性【1 0 】。该类农药是一类以甲酸 酯为前体化合物发展而来的农药，具有分解快、残留期短、低毒、高效、选择性 强等特点。2 0 世纪7 0 年代以来，由于有机氯农药品种相继被不同国家禁用或限制 使用，以及抗有机磷农药的昆虫品种的日益增多，氨基甲酸酯类农药的使用量逐 年增加。在我国，氨基甲酸酯杀虫剂也是一类很重要的杀虫剂，特别在种子处理 上得到广泛的应用。可以预计，在一定时间内，氨基甲酸酯类杀虫剂仍将是杀虫 剂领域中的一个重要组成部分。 2 农药的污染及危害 目前我国的农药结构很不合理，杀虫剂占农药总量7 0 ，在杀虫剂中，有机 磷杀虫剂占7 0 ，其中甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、氧化乐果、久效磷等高毒 杀虫剂又占7 0 ，这就是农药品种结构不合理的“3 个7 0 ” 1 1 i 。由于农药品种 结构不合理，剧毒、高毒农药品种居多，形成农药污染的源头。再加上使用方法 不当，以及对农药残留监管不力，过多过滥的使用农药等问题，导致生态环境和 农产品的污染日趋严重。国家质检总局2 0 0 1 年第三季度产品质量监督抽查结果表 明，蔬菜农药残留超标突出：是有机磷超标，二是种蔬菜中含有多种农药残 留的现象比较普遍。蔬菜中农药残留超标已成为近年威胁百姓餐桌安全的突出问 题。据农业植保部门抽样调查，叶菜上使用高浓度农药的菜农占种植户的3 2 8 。 尽管国家有关部门三令五申禁止在蔬菜中使用高毒、高残留农药，但全国不少地 区仍在使用甲胺磷、对硫磷、氧化乐果和呋喃丹等高毒高残留农药1 1 “。有调查显 示，农药中毒的主要类别是杀虫剂( 占8 6 0 2 ) ，其中的8 6 0 6 是有机磷杀虫剂 中毒，以甲胺磷、对硫磷和氧乐果等3 种高毒类有机磷中毒为主i l 。 黄诚等【1 4 】于2 0 0 2 年1 0 月至2 0 0 3 年7 月期间进行了调查，结果发现蔬菜中有 机磷农药残留量超标率3 0 1 ，检出甲胺磷的比率达18 2 。初步调查清楚农民使 用最多的农药是甲胺磷，而且往往大多同时使用多种农药于同一蔬菜上。蔬菜中 有机磷农药残留超标、超范围使用现象仍然较严重。孙胜龙等【1 5 j2 0 0 2 年秋季对长 春市9 个蔬菜批发市场的1 6 种蔬菜进行抽样检测，蔬菜中有机磷类和氨基甲酸酯 类农药平均超标率为1 1 0 5 ，残留的主要农药种类是甲胺磷、氧化乐果和敌敌畏。 检测1 6 种蔬菜中有9 种超标。2 0 0 3 年春季同样对9 个蔬菜市场的1 7 种蔬菜进行 抽样检测，农药残留平均超标率为1 1 0 ，残留的农药主要种类是甲基对硫磷、对 硫磷、甲拌磷、敌敌畏、氯氰菊酯和氰戊菊酯等，检测的1 7 种蔬菜中有3 种严重 超标。由此可见蔬菜中农药残留还是很严重的问题。何彩1 1 6 1 2 0 0 3 年从深圳市某农 产品批发市场随机抽取蔬菜样品2 0 6 份进行检测，有机磷农药残留量检出率为 2 1 6 5 ，超标率为1 6 0 。其中农药捡出率最高为毒性大的甲胺磷，占9 7 1 ；同 时检出2 种农药的有5 份，占1 4 7 。应加强对蔬菜种植销售环节的监测、监督， 特别是加大对高毒农药的禁用力度。陈伟等( 2 0 0 4 ) 在全市范围内抽检了叶( 花) 菜、根茎菜和瓜果菜3 类蔬菜2 8 5 份样品，不合格率为8 4 ，叶( 花) 菜和根茎 类蔬菜有机磷农药污染较严重。刘钧等【1 8 】( 2 0 0 5 ) 对济宁市蔬菜中有机磷、氨基 甲酸酯、菊酯类农药的污染情况进行调查，发现有机磷类农药在各类蔬菜中分布 较广，阳性率高，最高达4 1 9 ；氨基甲酸酯、菊酯类农药在四类蔬菜中均有不同 程度存在，以瓜茄类、叶菜类含量普遍，阳性率高达5 1 8 和4 1 9 。应加大措施 进行综合治理。胡正生等l l9 l ( 2 0 0 5 ) 对南昌市市售蔬菜有机磷农药残留超标情况 进行了系统调查，发现2 1 1 的样品中有机磷农药残留超标。并发现了农残监控不 够，市场入口把关不严，农药市场混乱，高毒农药易购等问题。白艳红等【2 0 1 ( 2 0 0 5 ) 采用随机与定点抽样的方法采集陕西省部分地区蔬菜与水果1 4 0 份食品样品，通 过气相色谱法测定其中8 种有机磷农药残留，蔬菜与水果食品中有机磷农药的检 出率分别为2 0 和1 7 ，其中蔬菜样品中对硫磷和水果样品中乐果的平均残留量 分别为6 2 孕g 1 【g 和3 0 犁g k g ，大大超过国家的限量标准。可见陕西省存在着有机 磷农药使用的不科学性，应加强管理，开展食品中农药残留的快速、常规监测， 将农药残留量高的食品杜绝在进入销售市场之前。段志敏等1 2 1 j ( 2 0 0 5 ) 对2 0 0 4 年 云南省蔬菜农药残留情况的监测发现，在4 2 件检出有农药的蔬菜中，有1 7 件样 品为农药残留量超标不合格的，占4 0 4 。李莉等【2 2 l ( 2 0 0 5 ) 经调查发现恩施市 市场农药残留合格率为7 0 ，但是蔬菜种植基地的合格率为9 5 ，可见加强管理 是降低农药残留率有效的办法。王保成等【2 3 】( 2 0 0 5 ) 检测了临沂市售蔬菜有机磷 农药的残留情况。在1 6 0 份样品中，2 6 份蔬菜检出残留有机磷农药，检出率为 1 6 2 5 ：2 4 份超标，超标率为1 5 0 0 ，仍需加强预防措施，防止中毒事故的发生。 张建新等【2 4 】( 2 0 0 5 ) 经检测发现，陕西省1 0 个蔬菜主产区的1 5 2 个蔬菜样品中有 9 9 个出现多菌灵超标，超标率达6 5 1 。由这些资料可以看出，我国目前果蔬中 农药残留问题还是相当严重的，有些菜农法律意识淡薄或是由于文化程度低而不 懂农药的安全间隔期，某些蔬菜生产基地也存在着制度混乱、操作不规范以及不 建立生产档案等问题【矧。各级有关部门应加强对菜农的安全意识教育，加大监督 检查力度，将农药残留超标不合格的产品杜绝在市场之外。 有机磷农药通过抑制血液和组织中的乙酰胆碱酯酶的活性，导致神经递质乙酰 胆碱大量蓄积，引起一系列神经症状，轻者会出现头疼、头晕、恶心、呕吐、无 力、胸闷、视力模糊等中毒症状，重者肌肉抽搐、痉挛、昏迷、呼吸困难，最后 呼吸麻痹而死亡。人长期摄入有机磷农药可表现肝功能下降、血糖升高、白细胞 吞噬功能减退等一系列病理变化，并有致畸、致癌、致突变作用【2 6 】。氨基甲酸酯 类农药的中毒机理和症状与有机磷农药相似。2 0 0 2 年江苏省发生了由于食用了有 机磷农药超标的韭菜而导致2 8 人急性中毒的事故【2 7 | 。2 0 0 4 年1 1 月溧阳市报告了 1 起因食用残留有机磷农药的青菜而引起的全家4 人食物中毒的事故，经分析显示 为甲胺磷残留严重超标【2 8 1 。 我国加入w t o 后，农产品的出口不断增加，但出口所受的阻力也在不断增加， 如拒收、退货、索赔、终止合同等现象经常发生，其中最主要的原因就是农产品 的农药残留过高。近几年新闻媒体报道的陕西苹果、浙江茶叶、山东蔬菜等问题 都是因农药残留超标而出口受阻。发达国家为了本国的利益，设罱越来越多的技 术壁垒，最明显的就是农药残留限量标准越来越多，要求越来越高，禁用的农药 越来越多。 因此，控制农药残留量，提高农产品的质量是关系到人民身体健康和我国农 产品在国内外市场竞争力的大事。这就对我国农药残留的检测技术提出了很高的 要求。 3 农药残留的检测技术 3 1 农药残留的前处理技术 食物样品组成复杂，基质成分对所要测定的目标物干扰较大，而且食物中农 药残留水平一般在m g k g - t g k g 之间，因此要求分析方法灵敏度高、特异性强。食 物样品的净化要尽可能除去与目标物同时存在的杂质，以减少色谱图中的干扰峰， 同时避免杂质对色谱柱和检测器的污染。食物样品的净化，一直是分析工作者研 究的重点【2 9 1 。在很长时间内，一直沿用经典的索氏提取、液液分配、硅胶、f l o r i s i l 、 硅藻土、氧化铝柱色谱及共沸蒸馏等技术，9 0 年代后，样品净化技术有了较快发 展，最受普遍重视的有固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 、超临界流体萃取 ( s f e ) 、基质固相分散萃取技术( m s p d e ) 等。 3 1 1 固相萃取技术( s p e ) 固相萃取技术根据液相分离、解析、浓缩等原理，使样品溶液混合物通过柱 子后，样品中某一组份保留在柱中，通过再选择合适的溶剂把保留在柱中的组分 洗脱下来，从而达到分离、净化的目的。固相萃取的主要分离模式可分为正相、 反相、离子交换和吸附，其作用机理包括氢键、偶极作用、疏水性相互作用和静 电吸引力等。此技术己被广泛应用于农药残留检测工作，它克服了液- 液分配和 一般柱层析的缺点，具有高效、简便快速、安全、重复性好、便于前处理自动化 等优点。李建科等【3 1 】( 2 0 0 5 ) 建立了s p e g c 测定苹果及浓缩苹果汁中敌敌畏、 d 甲胺磷、氧化乐果、马拉硫磷、对硫磷的分析方法。采用c 。8 固相萃取柱净化萃取 液气相色谱测定，5 种有机磷农药在0 2 4 0 m k k g 水平的回收率范围为8 0 8 2 1 0 7 0 4 ，变异系数为2 0 0 5 1 1 ，最低检测限为0 0 1 0 0 5 m 啦g ，该方法是 测定苹果及浓缩苹果汁中有机磷农药残留比较理想的方法。李英等【3 2 】( 2 0 0 5 ) 采 用乙腈提取，氨基固相萃取柱分离净化，反相分配色谱梯度洗脱，对1 2 种氨基甲 酸酯类农药及3 种代谢物进行分离，通过柱后衍生化，荧光检测器定性定量测定4 种蔬菜、水果中1 2 种氨基甲酸酯类农药及3 种代谢物( 涕灭威亚砜、涕灭威砜、 杀线威、灭多威、3 羟基克百威、涕灭威、抗蚜威、速灭威、残杀威、克百威、 恶虫威、甲萘威、异丙威、灭虫威、仲丁威) 的残留量。1 2 种农药及3 种代谢物 在3 5m i n 内可得到很好的分离，检出限为0 0 0 1 - - 0 0 0 5 m k k g ，方法回收率为 7 2 o 1 1 0 1 。 3 1 2 固相微萃取技术( s p m e ) 在s p e 的基础上，出现了固相微萃取( s p m e ) 和基质固相分散萃取( m s p d e ) 。 s p m e 实际上是s p e 的微型化。固相微萃取装置由手柄和萃取头两部分组成，萃 取头是一根涂有不同固定相或吸附剂的熔融石英纤维，将萃取头插入气相色谱仪 进行分析。当用s p m e 处理蔬菜水果样品时，要求先用丙酮等溶剂萃取样品，以 获得好的结果【3 3 】。王龙一等【刈( 2 0 0 5 ) 以溶胶凝胶方法制备的聚甲基苯基乙烯基 硅氧烷羟基硅油复合涂层的固相微萃取探头联用气相色谱测定了有机磷农药，同 时对固相微萃取的最佳条件进行了优化，该探头较商用探头有更高的萃取能力。a ls i m p l i c i o i ”】等( 1 9 9 9 ) 用聚二甲基硅烷p d m s 作填料，在室温下对含有有机磷 农药的样品淋洗2 0 m i n ，然后在2 5 0 下洗脱2 m i n ，最后用g c f p d 进行检测，检 出限为o 3 1 ，4 “g k g 。 3 1 3 基质固相分散萃取技术( m s p d e ) m s p d e 是一种新的提取净化技术，其基本操作是将水果蔬菜样品直接与适量 的固体基质( 硅胶，f l o f i s i l ，c 1 8 ，c 8 等) 研磨，混匀制成半固态，装柱，选择合 适的溶剂淋洗。m s p d e 将样品的提取和净化一步完成，避免了样品均化、转溶、 乳化、浓缩造成的待测农药组分的损失f 3 “。一般情况下，萃取液可以直接进行分 析检测【3 7 1 。a l f o n s od im u e c i 0 1 3 8 1 等( 1 9 9 7 ) 使用c 1 8 作填料，利用m s p d e 分离后， 对蔬菜水果中的1 3 种氨基甲酸酯类农药进行了l c m s 检测，平均回收率为6 4 1 0 6 ，平均检出限为o 0 0 1 - - 0 0 1 m g k g 。李建科等【3 9 1 ( 2 0 0 5 ) 建立了苹果浓缩汁 中5 种有机磷农药( 敌敌畏、甲胺磷、氧化乐果、马拉硫磷、对硫磷) 残留的基 质固相分散萃取气相色谱( m s p d g c ) 多残留分析方法。0 1 m g k g 标准溶液回收 率9 6 ，1 0 m g k g 标准溶液回收率8 7 ；相对标准偏差分别为1 4 9 9 ， 2 8 8 5 ：最低检出限为0 0 0 7 0 0 2 5 m g k g 。该方法比液液萃取快速、经济、 省时、省力。奉夏平等【柏】( 2 0 0 5 ) 用基质固相分散从蔬菜水果中提取、净化三种 类型3 1 种常用农药残留( 包括1 1 种有机氯、5 种拟除虫菊酯、1 5 种有机磷) ，3 1 种农药的回收率在8 0 4 1 1 2 7 之间，相对标准偏差小于1 0 。表明本方法适 用于各种新鲜蔬菜水果样品的农药残留分析。 3 1 4 超临界流体萃取( s f e ) 技术 超临界流体萃取( s f e ) 技术是9 0 年代出现的新技术，这种分离手段已经应 用于各个方面。它是以超临界状态的二氧化碳作为萃取剂，其特点是粘度低，流 动性、渗透性好1 4 ”。常规分析时，需要用有机溶剂提取样品，提取的样品量为5 0 1 0 0 9 ，在进行溶剂浓缩的过程中，可造成易挥发的农药损失或使某些农药降解。 s f e 的样品用量少，样品提取在低温下进行，避免了农药的损失及降解，大大提 高了分析方法的可靠性，并使得分析时间缩短，排除了有机污染。流出液中的二 氧化碳在常压下挥发，待测物用溶剂溶解后可直接进行分析检测。s f e 具有选择 性好、前处理简单、分离时间短、完全避免了有毒有机溶剂的使用等优点。其缺 点是实验条件的选择和优化比较困难，萃取体系的可选择性差，仪器价格昂贵i “。 l e h o t a y 等报道了在水果和蔬菜中提取西维因、呋哺丹等约4 0 种农药残留分 析的s f e 方法m 删，m i c h e l a n g e l oa n a s t a s s i a d e s 等【4 5 】( 1 9 9 8 ) 利用s f e 萃取一些 蔬菜水果中的农药残留，然后用g c m s 和h p l c d a d 进行检测，获得了令人满 意的结果。与传统的提取净化方法相比，s f e 有着巨大的发展潜力。但是，目前 它只在固体类农作物的农药残留分析中有应用，由于蔬菜水果的含水量较高，在 蔬菜水果的农药残留分析中应用有很大的限制。 3 2 农药残留的常规仪器检测技术 常规仪器检测法是指用精密仪器检测样品中的农药残留量，检测的过程是： 对样品进行提取、净化和浓缩，再用色谱或色谱与质谱联用等技术手段进行定性、 定量测定。该方法的特点是：灵敏度高、准确性好、检测范围广，能进行农药残 留定性和定量检测，检测结果可以作为法律仲裁的依据。但常规仪器检测法的样 品提取、净化过程复杂，检测所需时间长，检测成本高，技术要求严格，不适于 在生产和销售现场进行，只能在仪器设备齐全的实验室中进行。 3 2 1 气相色谱及气质联用检测技术 气相色谱法( o c ) 是农药残留分析