（食品科学专业论文）产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究.pdf

产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶陛质的研究 摘要 本文以一株土壤来源的芽孢杆菌为出发菌，在以褐藻酸钠为唯一 碳源的培养基中驯化筛选后得到一株产胞外褐藻胶裂解酶的菌株s 1 ， 通过菌种鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌( 肋c j u ss u b t i j i s ) 。该菌 产酶的较适碳源为0 5 ( 质量分数) 的褐藻酸钠，较适氮源为蛋白 胨和尿素，在培养基初始p h 7 5 ，3 2 ，1 8 0 r m i n 摇床发酵8 4 1 0 8 h r 时，酶活最高可达1 8 7 9 u m l 。 以菌株s l 为出发菌株，进行复合诱变和选育，获得一株酶活力 显著提高，生物学性状稳定的突变株e m s - 5 0 ，其发酵液酶活力从1 8 9 4 u m l 提高到4 3 2 2 u m l ( d n s 法) 。 该酶为胞外诱导酶，甘露糖与褐藻酸钠均可诱导其合成褐藻胶裂 解酶，葡萄糖可促进以褐藻酸钠为诱导物时酶的合成。以蛋白胨+ 尿 素+ 酵母膏为氮源时产酶较好。通过正交实验，确定了其最佳发酵培 养基组成为：褐藻酸钠0 6 ，尿素0 6 ，蛋白胨0 6 ，葡萄糖0 2 ， 酵母膏0 。4 ，n a c 0 。5 ，k h 。p o 。0 4 。最佳培养条件为：3 0 0 m l 三角 瓶内装1 0 0 m l 发酵液，培养基初始p h 7 5 ，接种量4 ，培养温度3 0 、摇床转速1 8 0 r m i n 。在上述条件下，摇瓶培养9 6 h r 时发酵液的 最高酶活达到7 5 8 6 u m l 。 发酵液经硫酸铵沉淀后制得粗酶液，用于酶学性质的研究。该酶 的最适作用p h 为7 5 ，最适作用温度为4 0 。p h 在7 o - 8 0 范围内， 温度在2 0 4 0 0 时该酶具有较好的稳定性。一价金属离子n a + 、 k + 、 l i + 与二价金属离子m g ”对酶活性具有定的促进作用，其中m g2 + 对酶 活的影响较大。z n ”、c a “、m n ”、f e ”、f e2 + 对酶活产生了不同程度 的抑制作用，e d t a 对酶具有明显的抑制作用。该酶的米氏常数k m 为 0 3 9 m g m l 。 关键词：褐藻胶裂解酶：芽孢杆菌；诱变选育：酶学性质 t h es c r e e r i n ga n di n c u b a t i o n o fb a c i i l u ss p s t a in p r o d u c i n ga i g i n a t ei y a s ea n dr e s e a r c h e s 0 1 3i t s p r o p e r t i e s a b s t r a c t ab a c i l l u ss p ，s t a i ns c r e e n e df r o ms o i lw a sc u l t u r e da n ds c r e e n e di n t h es o l i dm e d i u mw i t ht h es o d i u ma l g i n a t ea st h es o l ec a r b o ns o u r c e f i n a l l yas t r a i ns1 w h i c hc o u l dp r o d u c et h ee x t r a c e l la l g i n a t el y a s ew a s c h o s e na st h ei n i t i a ls t r a i nf o rt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t t h es t r a i ns1 w a si d e n t if i e da sb a c i l l u ss u b t i l i s t h er e s e a r c hh a sf o u n dt h a tt h e o p t i m u mc o n d i t i o n so fp r o d u c i n ga l g i n a t el y a s e a r ea sf o l l o w s t h e n i t r o g e ns o u r c e sw e r ep e p t o n ea n du r e a t h eo p t i m a lc o n t e n to fs o d i u m a l g i n a t ew a so 5 0 6 t h ea l g i n a t el y a s ew a sw e l lp r o d u c e dw i t h i n i t i a l p h 7 5o fl i q u i dm e d i u mu n d e rt h et e m p e r a t u r e3 2 a n d r o t a t i o nr a t el8 0 r r a i na f t e rf e r m e n t a t i o nf o r8 4 1 0 8 h r t h e e n z y m e a c t i v i t yr e a c h e s18 7 9 u m lu n d e rt h ec o n d i t i o n sa b o v e a f t e ru va n de m sm u t a g e n i z i n go nt h es t r a i nsit h ea l g i n a t el y a s e s e c r e t e d b yt h em u t a n t s t r a i ne m s 一5 0w i t hp r e t t ys t a b l eb i o l o g i c a l c h a r a c t e r sr e a c h e d4 3 2 2 u m lh i g h e rt h a nt h eo r i g i n a lo n e ( 18 9 4 u m l ) t h ea l g i n a t el y a s ep r o d u c e db ye m s - 5 0i se x t r a c e l l u l a r i n d u c e d e n z y m e i tc o u l db ei n d u c e db ys o d i u ma l g i n a t ea n dm a n n o s ew h i l et h e l y a s ew a sp r o d u c e db e t t e ri nt h ep r e s e n c eo fg l u c o s e t h er e s u l t so f o r t h o g o n a lt e s ts h o w e dt h eo p t i m u ma l g i n a t el y a s ep r o d u c i n gm e d i u mi s t h a tw i t h0 6 s o d i u ma l g i n a t e ，o 6 u r e a ，o 6 p e p t o n e ，2 g l u c o s e ， 0 4 y e a s t e x t r a c t o 5 n a c ia n d 0 4 k h 2 p 0 4 a n dt h eo p t i m u m c u l t u r ec o n d i t i o n s c o n t a i n i n g t h ei n i t i a lm e d i u m p h ，a m o u n t o f i n o c u l a t i o n ，i n c u b a t i n gt e m p e r a t u r ea n dr o t a t i o nr a t ea r e7 5 ，4 ，3 0 。c a n di8 0 r m i n t h ee n z y m ea c t i v i t yo f 1o o m lf e r m e n t e db r o t hi s 7 5 8 6 u m lw h i l ei n c u b a t i n gi n3 0 0 m lf l a s ka t9 6 h r t h ec r u d ee n z y m ep r o d u c e db ye m s 一5 0w a sm a d ea f t e rp r e c i p i t a t i o n w i t h ( n h a ) 2 s 0 4 i t so p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hf o rd e c o m p o s i n gs o d i u m a l g i n a t ea r e4 0 a n d7 5r e s p e c t i v e l y t h ea l g i n a t el y a s ei ss t a b l ei nt h e r a n g eo f2 0 - 4 0 a n dp h 7 0 - 8 o t h ep r e s e n c eo fm e t a li o ns u c ha sn a + 、 k + 、l i + a n dm 9 2 + c a np r o m o t et h ee n z y m ea c t i v i t yw h i l ez n 2 + 、 c a 2 + 、 m n 2 + 、f e 3 + a n df e 2 + 。8 0c a u s ei n h i b i t i o na st h es a m ew i t he d t a a n d m 9 2 + 、z n 2 + a n df e ”h a v eg r e a ti n f l u e n c e t h ek i n e t i cp a r a m e t e r sk m i s 0 3 9 m g m l k e yw or d s ：a ig in a t e iy a 3 e b a c i i l u ss p 。m u r a tio n e n z y m o io g y pr o p er t ie s 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究 1 刖吾 1 1 立题依据及目的 自1 8 8 1 年英国化学家s t a n f o r d 从海藻中发现了褐藻胶以来，褐藻胶因 具有可食性、凝固性、成膜性、可溶性等多种独特的性质，被广泛地应用 于食品、医药、日化、印染、纺织等多种工业领域，成为世界上一项产值 大、用途广、效益高的畅销产品。近年来，随着褐藻胶应用领域的扩展及 寡糖降解和分离技术的发展，褐藻胶降解产物褐藻寡糖的生物活性受 到了人们的极大关注。研究发现，褐藻寡糖除了具有溶解性强、稳定性高 及安全无毒等理化特性外，还具有重要的生理活性，有文献报道褐藻寡糖 具有促进植物根系生长、抑菌、抗病毒活性、类肝素的抗凝、诱导人体单 核细胞释放细胞因子抑制癌细胞增殖等作用。因此，通过降解褐藻胶分离 得到寡糖片段，对开发具有特殊生物活性的新型酸性寡糖分子具有重要意 义。 制备纯度高、具有较高生物活性的褐藻寡糖的方法主要有化学物理降 解法与生物降解法，前者存在着反应条件不易控制、耗能高( 需高温高压) 、 速度慢、产物回收率低，目的产物不易分离、成本高、后处理过程造成的 环境污染严重等不易解决的问题，而酶解法反应条件温和，易控制，底物 特异性好，催化效率高。因此，以酶解法为代表的生物降解法取代传统的 化学降解法已逐渐成为一种趋势，因而褐藻胶裂解酶的研究开发具有着深 远的理论意义和应用价值。 目前对褐藻胶裂解酶的研究主要侧重于产酶菌种的调查和酶的提纯 及性质方面，在酶的分离纯化过程中，由于微生物的生存机制决定了其产 生的酶通常是一个酶系，并且褐藻胶裂解酶易与褐藻胶底物结合，分离纯 化困难，从而导致高纯度褐藻胶裂解酶迄今不能工业化生产，为褐藻胶裂 解酶的研究开发带来了机遇和挑战。 褐藻胶裂解酶在自然界中来源广泛，如海洋细菌“剖、真菌”，食藻的 海洋软体动物1 ( 海螺等) 、土壤微生物“7 、噬菌体阳1 等。在已报道的褐 藻胶降解细菌中，绝大多数是革兰氏阴性菌，如从马尾藻、海带等大型海 藻类筛选得到产胞外褐藻胶裂解酶的海洋弧菌( v i b r i os p ) 阳1 ，别单胞菌 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究 ( , 4 1 t e l o i l l o f l e t ss p ) “叫等，陆生革兰氏阳性菌的报道较少。本课题是以一 株土壤来源的芽孢杆菌w 1 为出发菌株，主要从以下几个方面进行研究。 ( 1 ) 菌种驯化实验 将菌株w 1 活化后，在以褐藻酸钠为唯一碳源的培养基中进行驯化培 养，通过传代筛选出可产褐藻胶裂解酶的菌株。 ( 2 ) 产酶条件的研究 研究不同培养条件对菌株产酶的影响，确定褐藻胶降解菌发酵产酶的 碳源、氮源、培养温度、时间、摇床转速、初始p h ，并研究其生长量与产 酶的关系。 ( 3 ) 诱变育种 以筛选出的酶活较高的菌株为出发菌株，经物理化学诱变处理后，计 算致死率，筛选出酶活提高较大的菌株，进行形态观察及菌种遗传稳定性 实验。 ( 4 ) 最佳产酶条件的确定 以诱变选育的菌株为出发菌，通过单因素试验及正交实验对培养基各 种营养成份及培养条件进行优化以确定其产酶的最佳条件。 ( 5 ) 酶活性质的研究 研究不同温度、p h 对酶活的影响，确定酶的最适温度和p h 值。研究 酶的热稳定性及金属离子等对酶活的影响，并测定酶的动力学参数。 通过以上研究以期获得褐藻胶裂解酶的高产菌株，从而为褐藻胶裂解 酶的应用提供新的菌种来源，同时也为新酶的研究和酶工程的发展提供资 源基础。 1 2 褐藻胶、 褐藻胶是一种来源丰富、用途广泛的多糖聚合物。广义上包括褐藻酸 盐和褐藻酸的有机衍生物，在商业上一般指的是褐藻酸钠盐，因褐藻酸及 褐藻酸盐溶液都具有胶粘性，故统称为褐藻胶。 1 ，2 1 褐藻胶的结构组成 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究 褐藻胶由a ( 1 ，4 ) 一l 一古罗糖醛酸( g ) 以及其c 5 差向异构体0 ( 1 ， 4 ) 一d - 甘露糖醛酸( m ) 随机组合形成的线性高分子量聚合物3 ，糖醛酸单 元以同聚单元( m m m 或g g g ) 中嵌以异聚单元( 二聚体m g 或g m ，三聚体 m m g 或g g m ) 的形式按序排布( 如图1 1 ) ，其g m 值大致处于1 ：2 至2 ： l 之间。 c ( ) 。h hhh m g ( a ) gmggmm ( b ) 4 ) 一d - 甘露糖醛酸( m ) ，o ( 1 ，4 ) - l - 古罗糖醛酸；( b ) 褐藻 胶结构 f i g 1 1( a ) s t r u c t u r eo fb ( 1 ，4 ) - d m a n n u r o n i ca c i da n da ( 1 ，4 ) - l - g u l u r o n i c a i c d ( b ) s t r u c t u r eo fa l g i h a t e 1 2 2 褐藻胶的来源 褐藻胶在藻体中含量较高，主要存在于海带、马尾藻、巨藻、泡叶藻、 墨角藻等藻体的细胞壁和细胞间质中。我国生产的褐藻胶主要来源于海 带，欧美国家生产的褐藻胶则主要来源于巨藻。此外，某些微生物如假单 胞杆菌( p s e u d o m o n a d s ) 等“”1 、土壤微生物如固氮菌( a z o t o b a c t e ，) 等“1 产褐藻胶裂解酶芽孢秆茵的选育及其产酶性质的讲究 也能够分泌乙酰基修饰过的褐藻胶。 1 2 3 褐藻胶的性质” 1 2 3 1 水溶性和粘度 褐藻胶在水中的溶解性随p h 的增大而增加，在p h 5 8 - 7 5 时其水溶 液呈均匀透明状。根据其溶解性可将褐藻胶分为水溶性的褐藻酸盐和水不 溶性褐藻胶两大类型。水溶性的褐藻酸盐包括褐藻酸的一价盐( n a + ，k + ， n h 。+ ) ，镁盐，汞盐及其它一些衍生物：水不溶性褐藻胶包括褐藻酸及除镁 和汞外的二价盐和三价盐。通常所指的褐藻胶是褐藻酸的钠盐。褐藻酸钠 分子式为( c 6 h ，0 。n a ) n ，分子量在3 2 0 0 0 2 5 0 0 0 0 之间，一般为白色或淡黄 色粉末，无臭无味，不溶于乙醇、乙醚、氯仿和酸( p h 小于5 4 ) ，易溶 于碱水，吸水膨胀变软，成粘稠状胶体。 褐藻酸钠的1 水溶液粘度一般为1 0 - 2 0 0 0 厘泊，其粘度随浓度的增大 而增加。在p h 5 1 0 范围内，其粘度变化不大；在p h 4 5 以下时，粘度会 明显增大：p h 值小于3 时，即形成不溶性的褐藻酸。 1 2 3 2 凝胶特性与稳定性 褐藻胶在p h 3 o - 5 8 及p h 大于1 1 5 时，水溶性下降，逐渐形成凝胶。 褐藻胶不论是水溶液还是干品，都会发生不同程度的降解，其粘度不断降 低。在中性条件下，降解速率较低，p h 小于5 或大于1 0 时，其降解速率 明显加快，一般在6 0 以下比较稳定。 1 2 4 褐藻胶的应用 在食品工业方面，褐藻胶市场潜力很大。据统计。在世界范围内，褐 藻胶在食品工业中用量占总量的3 5 以上。褐藻酸钠可代替淀粉、明胶作 为稳定剂用于冰激凌等冷冻食品，可控制冰晶的形成，改善口感；也可用 于许多奶制品，如奶酪、奶油，干乳酪等的稳定剂：还可用于色拉调昧汁、 布丁、果酱及罐装制品的增稠剂，以提高制品的稳定性，减少液体渗出。 在面点中添加褐藻胶可改善制品组织的粘结性和均一性，增强韧度及持水 性。褐藻胶可做成各种凝胶食品，可保持良好的胶体形态，不发生渗液或 收缩。也可以用于水果、肉、禽类和水产品的保护层。延长贮藏时间。 在医药工业方面，利用褐藻胶的增稠作用和凝胶特性，可用于牙科印 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究 模的制作及药品各种剂型的添加剂。褐藻胶对某些元素具有的特殊的交换 能力，可以用于对有害金属( 如锶) 的排阻。同时，利用褐藻胶的高分子 线形结构可以将其制成各种剂型的止血剂。 在印纺工业方面，褐藻胶作为染浆料的增稠剂，大大提高了印染制品 的色泽和质量。 在农业方面，褐藻胶可作为种子处理、杀虫剂、抗病毒材料等进行应 用。 褐藻胶还应用于造纸、日用化工、铸造、树脂涂料、橡胶膏化剂、电 池隔极层以及水处理等方面。 近年来，褐藻胶的降解产物一褐藻寡糖的多种生物活性作用不断被揭 示，引起了人们极大关注。有关文献报道褐藻寡糖具有促进植物根系生长、 促进益生菌的生长、抑制有害菌、抗病毒、抗真菌、预防龋齿、增强免疫、 诱导人体单核细胞释放细胞因子抑制癌细胞增殖等作用。因此通过降解褐 藻胶分离得到寡糖片段，对开发具有特殊生物活性的新型酸性寡糖分子 具有重要意义。 1 3 褐藻胶的降解方法 褐藻胶的降解方法有化学降解法“7 。“，物理降解法“”2 ”和生物降解法 2 卜2 3 】 化学降解法包括氧化降解法，酸解法，碱解法。氧化降解法是在高温 或催化剂作用下，加入氧化剂如双氧水，次氯酸钠等使褐藻胶分解，生成 寡糖。此方法反应条件剧烈，对产物具有一定的破坏作用，且生成的副产 物较多。 酸解法是将褐藻胶加入酸( 如盐酸、硝酸，硫酸等) 在加压下降解成 寡糖，这种方法操作不易控制，耗时长，将褐藻胶降解到一定程度后，难 以继续降解，其目的产物浓度较低，生成的副产物较多，并且反应后不易 将酸除去。 碱解法是利用b 消除的作用，在碱性条件下，褐藻胶单体c 5 上的质 子易失去，由于羧基的诱导效应，c 4 位上的电子向c 5 位转移，使l 一40 产褐藻殷裂鹾两孽孢秆菌的选育庭其产酶性质的研究 糖苷键断裂，褐藻胶被降解。其缺点同酸解法。 物理降解法主要是辐射法，用c o ”产生的y 射线对褐藻胶进行辐射， 可将其降解为寡糖。 生物降解法主要是利用酶的特异性对褐藻胶进行降解。这种方法具有 反应条件温和，易控制，底物特异性高，产物得率高，催化效率高，副产 物生成量较少等优点，在褐藻胶的降解方面优于化学和物理降解，因此酶 解法具有取代化学和物理降解褐藻胶的趋势。 1 4 褐藻胶裂解酶 1 4 1 褐藻胶裂解酶的来源 褐藻胶裂解酶在自然界中分布广泛，主要来源于海洋和陆地的细菌、 海洋无脊椎动物、真菌、病毒等。如从海带、马尾藻等分离出可产褐藻胶 裂解酶的别单胞菌( 爿t e i o m o n a ss p ) “”1 ，弧菌( v i b r i os p ) 。2 ” 等：在一些食藻的海洋软体动物“2 ”( 如海螺、鲍鱼等) 与棘皮动物( 如 海胆等) 的内脏中也检测到了褐藻胶裂解酶的活性。但海洋动物来源的褐 藻酸酶大多为复合酶，很难完全提纯。此外，从病毒心“圳中也发现了褐藻 胶裂解酶。而目前报道最多的则是微生物源的褐藻胶裂解酶，如黄杆菌 ( h a v o b a c t e r i u ms p ) 1 、固氮菌( a z o t o b a c r e 2 s p ) 1 、 克里伯氏 菌( k l e b s i e l l as p ) 。2 1 “、假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) “5 - 川、芽孢杆 菌( b a c i l l u ss p ) 。”、肠杆菌( e n t e r o b a c t e rs p ) ”83 等都检测到了褐 藻胶裂解酶。随着人们对自然界的不断探索，将会发现更多褐藻胶裂解酶 的新来源。 1 4 2 褐藻胶裂解酶的作用机理 褐藻胶裂解酶可利用b 消除作用催化褐藻胶降解，切割位点在单体间 的( 1 4 ) o - 糖苷键，于六元环上的c 4 与c 5 之间形成双键，4 一o 一糖苷键被 消除，褐藻胶被降解，同时在非还原性末端产生4 一脱氧一l 一异丙基4 一烯醇式 吡喃糖醛酸。g a c e s a 提出了一个褐藻胶裂解酶的催化机制“4 “，这种机 制可以同时解释褐藻胶的差向异构酶的作用机理，这种机制包括三步反 应，第一步，通过盐桥的电荷中和作用移去羧基阴离子上的负电荷；第二 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究 步，在广义碱的催化作用下从5 位碳上获得质子的基质催化反应：第三步， 羧基基团提供电子在c 4 与c 5 之间形成双键，导致4 0 一糖苷键0 消除反应。 在差向异构酶的作用机制中，第三步是c 5 上的质子置换反应( 即差向异 构化) 。 1 4 3 褐藻胶裂解酶的分类 根据褐藻胶裂解酶在褐藻胶上对m 段与g 段的作用方式“”，可以分为 3 类，即可裂解褐藻胶分子内的m m 键的b ( 1 ，4 ) 一d - 甘露糖醛酸( m ) 裂 解酶( e c 4 2 2 3 ) ，裂解褐藻胶分子内的g - g 键的q ( 1 ，4 ) - l - 古罗糖醛 酸( g ) 裂解酶( e c 4 2 2 1 1 ) 和既可以作用于m g 键又可以作用于g m 键 的无选择性的褐藻胶裂解酶。 1 4 。4 褐藻胶裂解酶活性的检测方法 褐藻胶裂解酶活性的检测包括两方面，一方面为了检验褐藻胶裂解酶 的存在和确定褐藻胶裂解酶的底物特异性，一般多用含褐藻胶的固体培养 基，根据菌落的水解圈大小来判断酶的活性。有研究表明用琼脂糖取代琼 脂，再加入高纯p o l y ( g ) 或p o l y ( m ) 的固体培养基可使分析结果更加直观。 如b a r o n 等“”在固体培养基中加入1 5 的琼脂糖和1 富集g 段的褐藻酸 钠用以检测一种吉罗糖醛酸( g ) 裂解酶，用9 5 的乙醇脱色后，可以清楚地 观察到透明水解圈。其它方法如在固体培养基中加入染色剂，木炭等以便 更好地观察透明圈。此外，k i t a m i k a d o 等1 提出了酶活的浊度检测法，其 原理是褐藻胶与牛血清在酸性溶液中形成白色混浊，褐藻胶裂解酶降解褐 藻胶阻止了混浊的形成。t o m o h i r oh 等“”在固体培养基中添加c a c l 。，通 过菌落周围透明圈的现象来检测褐藻胶裂解酶的底物特异性，如果产生的 是透明圈，则表明该酶是古罗糖醛酸( g ) 裂解酶：若产生白色晕圈则表明 该酶是甘露糖醛酸( m ) 裂解酶。这是因为甘露糖醛酸( m ) 裂解酶进攻褐藻胶 分子中的p o l y ( m ) 片段后留下的p o l y ( g ) 片段在c a ”存在时具有凝胶特性， 从而在平板上产生白色晕圈，而p o l y ( m ) 片段并无此特性。在研究不同褐 藻胶裂解酶的底物专一性时，还可应用n m r “”1 ，t l c “”，h p l c “”“和纸色 谱等技术。 另一方面，用以测定褐藻胶裂解酶活力大小的方法主要有：硫代巴比 产褐藻殷裂解酶芽孢杆菌的选青友其产馥性赓的霸究 妥酸法( t h i o b a r b i t u r i ca c i da s s a y ) ，苔黑酚法( o r c i n o la s s a y ) ，紫外吸 收法( u i t r o v i o l e ta b s o r p t i o na s s a y ) ，粘度法( v i s c o m e t r i ca s s a y ) 和还 原糖法( r e d u c i n gs u g a ra s s a y ) 。硫代巴比妥酸法”2 。“1 是一种比色法，可 以通过检测5 4 8 n m 的光吸收值来检测褐藻胶裂解酶解后的不饱和糖醛酸。 酶的单位可以定义为毫升酶液每分钟催化产生的b 一甲酰丙酮酸的微摩尔 数。苔黑酚法( 地衣二酚法) 是一种比色测定方法，利用的是未降解的褐 藻胶在碱液中短暂加热的稳定性“。这种方法灵敏性好，有特异性，受粗 酶液中存在的正常组分影响小，但在培养基中的某些物质( 如蔗糖，硫酸 铵等) 的产生一定的干扰，必须从光吸收值中减掉。紫外吸收法是利用褐 藻胶裂解酶作用于褐藻胶产生的不饱和糖醛酸在2 3 2 n m 或2 3 5 n m 有强吸收 来进行检测的“3 1 ”1 。这种方法简单而灵敏，通常不受中等浓度的硫酸铵 和蔗糖的影响。粘度法“”1 借助粘度计来检测酶解前后褐藻胶祜度来测定 酶的活性，这种方法虽灵敏但检测较困难。还原糖法( d n s 法) ”6 们利用 d n s 与还原糖发生氧化还原反应，生成的3 一氨基一5 一硝基水杨酸在煮沸条 件下显色，其颜色深浅与还原糖含量成比例关系。利用此原理可测定酶解 后产生的还原糖的含量，进而检测酶活。 i 4 5 褐藻胶裂解酶的性质 各种不同来源的褐藻胶裂解酶在分子量、产酶位置、底物专一性及金 属离子的影响等方面具有很大的不同，特别是金属离子对其影响的差异较 大，在此，仅对细菌来源的褐藻胶裂解酶的性质作介绍。 一般来说海洋细菌来源的褐藻胶裂解酶大多为诱导型“例，只有少 数为组成型。这些酶大部分是跑外酶或分布在细胞周质中，且表现为外切 p o l y ( m ) 活性，但也有小部分为内切p o l y ( g ) 酶“。其分子量为2 4 1 1 0 k d a ， 在p h6 o 1 1 0 范围内比较稳定，酸性条件下不稳定。最适p h 在7 5 8 5 ， 大多数等电点较低，p i4 3 - 6 7 ，少数可达p i7 8 。酶的最适温度为2 5 5 0 。 l g ”、n a + 、k + 等对酶活具有促进作用，其中高浓度的n a c l 对酶的活性 有时是必须的，这可能是因为n a c l 能去除褐藻胶分子附着的水分子从而 使其暴露出来，或是因为改变了褐藻胶一酶复合物的电荷数量h “。z n ”、h g ” 等两价离子对酶活具有抑制作用，这可能是由于z n ”、h g ”等二价离子改变 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质台勺研究 了酶分子的构象，从而降低了酶的活性。部分海洋细菌来源的褐藻胶裂解 酶如表1 1 所示。 表1 1 一些海洋细菌来源的褐藻胶裂解酶的性质 t a b 1 1 t h ec h a r a c t e r so fa l g i n a t el y a s e sp r o d u c i n gb ys o m em a r i n eb a c t e r i a 陆地来源的褐藻胶裂解酶产生菌主要是由从土壤或沟渠中分离出来 的，其中由革兰氏阳性菌如芽孢杆菌等产生的褐藻胶裂解酶大多为胞外 酶，分子量为2 8 6 - 5 8 k d a ，最适p h 在5 8 - 8 2 ，酶的耐热性较好，最适 温度为3 7 - 5 5 ，c a ”，m g ”对酶活有促进作用，这与海洋来源的褐藻胶裂 解酶不同。产褐藻胶裂解酶的革兰氏阴性菌一般在细胞内或细胞周质中产 酶，大多为内切酶，分子量为2 3 9 0 k d a ，最适p h 为6 0 - 8 5 ，最适温度 为2 0 7 0 。c ，c a ”，m g ”，k + ，n a + 对酶活具有维持或激发作用。部分土壤细 菌来源的褐藻胶裂解酶的性质如表1 2 所示。 产褐藻胶袭解酶芽孢杆菌的选育霹纂产酶性质囟嵇茺 表1 2 一些土壤细菌来源的褐藻胶裂解酶的性质 t a b 1 2t h ec h a r a c t e r so fa l g i n a t e1 y a s e sp r o d u c i n gb ys o m es o i l b a c t e l i a 1 4 6 褐藻胶裂解酶的研究进展 自1 9 3 1 年，大岛等从鲍鱼( h a i o t u s g j g a n t e u s ) 的内脏中首次发现了 褐藻胶裂解酶( a l g i n a s e ) 以来，人们对褐藻胶裂解酶的研究大致经历了三 个阶段。 早期褐藻胶裂解酶的研究主要针对的是产酶菌种的初步鉴定及酶解产 物的分析。1 9 6 1 年y a s h i k a w a 等用海洋细菌褐藻胶液化假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sa l g i n o l y q u e f a c i e n s ) 分泌出的褐藻胶裂解酶分解褐藻胶， 用纸色谱法可检测出单糖、二糖和三糖，并证明在非还原末端上有不饱和 键。1 9 6 8 年n is iz a w ak 等o ”从d o l a b e l l a 的肝胰腺中发现了甘露糖醛酸 ( l i ) 裂解酶，这种酶降解褐藻胶的产物为d p 2 3 的寡聚甘露糖。 7 0 - 8 0 年代，随着生物技术的发展，在海洋中发现了许多褐藻胶裂解酶 的新来源，如从海洋软体动物、海藻、海洋细菌中检测到了褐藻胶裂解酶 的活性，其中微生物源的褐藻胶裂解酶受到了广泛的重视，人们对褐藻胶 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究 裂解酶的生化特性及其作用机理方面有了深入的研究。1 9 7 7 年，d a v i d s o n 等o 町报道了固氮菌产生的褐藻酸裂解酶对聚甘露糖醛酸有专一性，可用于 分析大分子的结构。通过凝胶色谱、电泳等技术分离纯化酶，得出此酶的 最适p h 为7 7 ，分子量3 5 k d a 左右。1 9 8 4 年，j e f f r e y 等“3 1 以褐藻酸钠为唯一 碳源，从海水和土壤中分离出产褐藻酸裂解酶的芽孢杆菌，革兰氏阴性 产生胞外酶，表现出明显的内切甘露糖醛酸裂解酶的性质，酶的分子量 约4 0 k d a 。1 9 8 9 年，m a n a b uk i t a m i k a d o 等”从海水中分离出了两株产褐 藻胶裂解酶的弧菌( v i b r i os p ) ，研究表明0 3 m 0 1 l 的n a g l 都能使其酶 活提高。 九十年代至今，分子生物学的发展将褐藻胶裂解酶的研究推向了高潮， 从海洋到陆地又发现了许多褐藻胶裂解酶，一些褐藻胶裂解酶得到纯化， 基因得到了克隆和测序。应用n m r 、t l c 、h p l c 和纸色谱技术，人们对底 物专一性的褐藻胶裂解酶有了更深的了解。1 9 9 3 年，t a k e s h i t a ，s 等。” 从一种红鲷肠内分离出一种海洋细菌可产生胞外古罗糖醛酸裂解酶，该酶 最适p h 为8 5 ，p h 6 1 0 较稳定。耐热性好，酶活在8 0 丧失，但冷却后 酶活又可以恢复，1 0 0 时酶活可保持4 5 。经变性剂3 s d s 或4 m 尿素处 理后仍具有活性。1 9 9 4 年，d y r s e t 等”63 研究发现克里伯氏菌( k i e b s i e l i a p n e u m o n a e ) 可产生古罗糖醛酸( g ) 裂解酶，以氨水为氮源，以蔗糖为主要 碳源，以低浓度褐藻胶作为酶诱导剂，在最适培养液中( 每升溶液含1 2 5 克褐藻胶与5 8 7 5 克蔗糖) ，酶的最终活性达到1 3 3 0 u l 。1 9 9 6 年，h e y r a u d 等似”用核磁共振和高效液相色谱对鲍鱼( h a l i o t i st u b e r c u a t a ) 酶的降解 作用进行了研究，表明该酶对( m ) n 具有较高的亲和力，可以降解褐藻胶糖 链中的m m 和g m 键，而g g 和m g 不能够被裂解。应用各种不同的寡聚物进 行的动力学研究发现，该酶的催化位点最适容纳甘露糖的五聚物。1 9 9 8 年 m a t s u b a r a 等”们从棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) 培养基的上层纯化得到 一种聚古罗糖醛酸裂解酶，应用s d s p a g e 和凝胶色谱，得其分子量为2 7 k d a ，等电点为7 3 ，最适温度和最适p h 分别为5 5 。c 和p h 7 0 ，金属化合 物m n c l ：和n i c i 。可以增强酶的活性。1 9 9 8 年，n a k a g a w a ，a 等1 从经褐藻 酸钠预处理了三个月的土壤中有效分离出一株产褐藻酸酶的菌株 产褐藻媵裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性蓐哟旃究 a t b 1 0 1 5 ，经鉴定为芽孢杆菌( 如c j j - u ss p ) ，可降解聚甘露糖醛酸与聚 古罗糖醛酸，其产生的胞外酶经s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳与s - 2 0 0h r 柱 层析测得分子量约为4 1 k d a ，酶反应的最适p h 为7 5 左右，最适温度为 3 7 ，褐藻酸钠作底物时的k m 值为0 1 7 。发酵液中的酶活为8 o u m l 。 l m o l l 的e d t a 可完全抑制酶活，当加入2 m m o l lc a c i ：几乎可使失去的酶 活完全复原。酶活不受0 o l m o l 几s d s 或l m m o l l 尿素等蛋白质变性剂的 影响。2 0 0 1 年，1 w a m o t o 等从日本九州大牟田海湾的海泥中分离得到一 株海洋菌2 7 2 ，经鉴定为埃氏单胞菌( a 1 t e r o m o n a ss p ) ，可以产生一种褐 藻酸胞内裂解酶，其分子量经s e p h a d e xg i 0 0 柱层析和s d s 聚丙烯酰胺 凝胶电泳分别为2 3k d a 和3 3 9k d a ，等电点为3 8 。该酶在p h 7 5 - 8 0 活性最大，p h 5 一1 1 较稳定。在磷酸缓冲液( p h 7 0 ) 中的热稳定性比在 t r i s h c l ( p h 7 0 ) 缓冲液中的热稳定性好，金属离子对酶活的影响较小， 该酶可以作用于褐藻酸分子内的聚n ( 1 ，4 ) 一l - 古罗糖醛酸和聚p ( 1 ， 4 ) 一d - 甘露糖醛酸，但是不能降解少于4 个古罗糖或4 个甘露糖聚合物， 通过酶动力学分析发现该酶对聚古罗糖有更高的活性。 此外，某些褐藻酸酶的基因得到克隆和测定该酶的基因序列。如 p s e u d o m o n a ss p o s a l g 一9 、p s e u d o m o n a sa l g i n o v o r a 、k l e b s y e l l a p n e u m o n i a e “”、p s e u d o m o n a sa e r u g n o s a “等菌种的褐藻酸裂合酶基因已 被测定序列并克隆到大肠杆菌中，用于生产褐藻酸裂合酶、甘露糖醛酸裂 合酶和古罗糖醛酸裂合酶。通过将褐藻酸酶的基因克隆到适于工业化生产 的宿主细胞中，可使褐藻酸酶的生产效率大幅度地提高。1 9 9 9 年， k r a i w a t t a n a p o n g 等“33 将假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p o s a l g 一9 ) 的褐藻酸 酶a l yi i 的基因在大肠杆菌内克隆、定序、表达。经研究其分子量为7 9 k u ， 等电点为8 3 ，最适温度和p h 分别为3 0 。c 和7 o 。溶液内存在h g ”时，活 性可被完全抑制。这种酶可以专一性地降解聚b ( 1 ，4 ) 一d - 甘露糖醛酸， 当与来自相同菌株的聚1 3 ( 1 ，4 ) - d 一甘露糖褐藻酸裂解酶a l y 相结合时， 表现出更强的活性。 目前对褐藻酸酶的大多数研究侧重于产酶菌种的调查和酶的提纯及性 质方面。在酶的分离纯化过程中，由于微生物的生存机制决定了其产生的 产褐藻胶裂解酶芽孢杆菌的选育及其产酶性质的研究 酶往往不止种，并且褐藻胶裂解酶容易与褐藻胶底物结合，分离纯化困 难，从而导致高纯度褐藻胶迄今不能工业化生产，给我们的研究工作带来 了机遇和挑战。 1 4 7 褐藻胶裂解酶的应用及前景 ( 1 ) 褐藻胶裂解酶在医学上的应用及前景 研究发现铜绿假单胞杆菌等许多病原菌可以分泌胞外褐藻多糖形成 生物膜”，从而对抗生素产生耐药性，褐藻多糖裂解酶可降解胞外褐藻 多糖恢复病原菌对抗生素的敏感性，用于治疗纤维化囊肿( c f ) 患者肺部 感染。2 1 ”。但从铜绿假单胞杆菌中得到的聚甘露糖裂解酶由于c f 患者痰中 c a ”与z n ”的存在对裂解酶有抑制作用，使其对降低体内痰液黏度的效果不 够理想。1 9 9 4 年，m r s n y ，f u c h s 等。“”3 研究发现在一些痰样中加入褐藻 胶裂解酶和人的脱氧核糖核酸( g n a s e ) 酶的复合物时，可以明显降低痰 液黏度。利用褐藻胶裂解酶降解褐藻多糖黏液层后，可以增强铜绿假单胞 杆菌对巨噬细胞和抗生素治疗的敏感性“”。将褐藻胶裂解酶同其他化学治 疗手段相结合，如同d n a s e 和抗生素结合等，可能对c f 患者的治疗效果 更加显著，因此利用这种途径治疗c f 患者及其他铜绿假单胞杆菌感染等 具有良好的研究开发前景。 ( 2 ) 褐藻胶裂解酶在海藻工程中的应用及前景 早在2 0 世纪7 0 年代，褐藻胶裂解酶就用于分析研究褐藻多糖的精细结 构”。不同的褐藻胶裂解酶可以作用于褐藻胶的不同位点，形成不同的糖 片段或寡糖，经过分离、纯化，应用电泳、色谱、质谱、核磁共振等方法 可以确定糖链的结构、组成及取代基的位置。随着对褐藻胶裂解酶的进 一步研究，将会有更多具有底物专一性的酶被发现，其性质也会得到研究， 应用于海藻多糖的逐步降解，通过检测技术分析酶解后的固定产物，用以 测定多糖的序列结构，从而推动糖生物学与糖工程的发展。 在海藻遗传工程方面，由于用于高等植物的细胞解壁酶对于海藻细胞 分离往往难以奏效，使有活性的海藻单细胞和原生质体很难获得，从而阻 碍了海藻遗传工程的发展。利用褐藻胶裂解酶解决了海藻解壁酶的问题。 褐藻胶裂解酶可以作为高效、可靠的工具酶用于海藻单细胞、原生质体、 产褐藻蕊爨躲酶芽孢杆菌的选育瑟冀产馥性质的研究 d n a 和胞内活性物质的制备。韩宝芹等“”“发现褐藻胶降解菌埃氏交替单 胞菌( 月t e r o m o n a se s p e j j a 门a ) 菌株a 1 0 2 经发酵产生的裂解酶能使海带 和裙带菜藻体明显软化，胞间质松弛，对酶解产物轻轻摇动即可形成大量 的单细胞和原生质体。海藻单细胞在海藻养殖工业中具有重要的科研和应 用价值，并可作为单细胞饵料用于扇贝养殖，可明显促进亲贝的性腺发育 和成熟，促进幼体的发育“”1 。因此有理由相信，褐藻胶裂解酶将会在海藻 遗传工程研究中发挥重大作用。 ( 3 ) 褐藻胶裂解酶降解产物的应用 利用褐藻胶裂解酶降解褐藻胶得到的寡聚糖具有多种生理活性和广 泛的应用价值。在医学方面，由别单胞菌( 彳t e l n m o n a ss p ) 合成的褐藻 胶裂合酶降解褐藻胶，得到分子量小于1 0 0 0 的褐藻胶寡糖，可用作人表皮 角质化细胞的激活剂；聚合度卜9 的聚甘露糖醛酸或聚古罗糖醛酸用于制 作矿物吸收促进剂；由微生物褐藻胶裂合酶降解褐藻胶得到的寡糖具有抑 菌作用，可用作补牙材料以防止牙根炎，制作真皮溃疡治疗剂，用于外科 手术，烧伤，溃疡等。管华诗院士以褐藻胶寡糖为基础研制出的p s s 系列”1 ， d 一聚甘酯“等药物用于心血管疾病的治疗。在农业应用方面，研究发现 褐藻胶寡糖对植物的生长具有促进作用，如1 9 9 3 年m u r a t a “”1 等报道了用于 未脱壳的谷种和烟草愈伤组织的褐藻胶降解物可分别提高发芽率与延长 发芽期，可用作农作物的生化肥料。1 9 9 4 年n a t s u m e “1 等发现由一种别单 胞菌( 月t e r o m o n a sm a c e o d j y ) 产生的褐藻胶裂解酶的降解产物可以促 进植物( 大麦) 根系的生长。褐藻胶降解产物还可应用于化工行业，如作 为印染材料的成分；还可添加到墨水中提高喷墨和打印质量“”1 。另外，研 究发现富含m 段的平均分子量为2 0 0 0 的寡糖可以促进双歧杆菌的生长“”。 利用具有底物专一性的褐藻胶裂合酶产生m 段和g 段的纯品可以用于其它 来源的褐藻胶裂合酶的